CN1740794B - 横向流动检测生物标本中特异性抗体的方法及其检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种横向流动检测生物标本中特异性抗体的方法及其检测装置,它是先将抗原体吸附在固相薄膜上被称为“捕获区”的范围内,然后将含有可与上述抗原体发生反应的相关抗体标本加在固相薄膜被称为“加样区”的部位,标本在膜上横向地流向并经过“捕获区”,再将足量的带色胶体结合物加于“加样区”的远端,并在膜上随标本之后与标本流向一致地作持续的横向流动,流过捕获区,使相关抗体标本与捕获区上的抗原体发生反应并使反应可视化。本发明具有能将IgG类抗体或IgM类抗体区分开来,简化了装置的制造,避免发生特定抗体被过量无关抗体淹没的问题的优点。
Description
技术领域:
本发明涉及一种生物抗体的检测方法及其检测装置。
技术背景:
带色胶体结合物与横向流动免疫层析法的结合应用在快速诊断领域内众所周知,许多据此制成的诊断试剂产品已经问市。这些产品的原理无非是将一特异的抗体或抗原吸附于某种固相薄膜上(薄膜有很多种,例如硝化纤维就是其中之一),当液相标本流经吸附有抗体或抗原的“捕获区”时,其含有的相应抗原或抗体即被固相薄膜上的抗体或抗原“捕获”;另一个与被捕获者能异性结合的生物试剂则结合到一种如胶体金之类的带色颗粒上。该结合物被用来显示被捕获者。通常,结合物呈固体并被置于“捕获区”与“加样区”之间的标本流经地。如此,当标本流过结合物时,结合物即被重新液化并与标本发生反应。
目前对于抗体的检测,有下列三种普通方法:
方法一是“双抗原夹心法”:抗原既被吸附在膜上、又被结合到带色颗粒上。被测到的特异抗体与这两个抗原相交联。此法优点是快速、敏感度高,且通常只需“加样”一个步骤(一步法)就可完成检测,毋须洗涤步骤。
缺点在于:
(1)有些抗原不易与带色颗粒结合,每一种抗原都须具有其独特的结合条件,使该抗原在结合成功后仍保持其免疫反应性。
(2)该方法不能鉴别IgG和IgM抗体。这对临床上鉴别初次感染很重要。
抗体检测的方法二为“抗体捕获法”:此法原理是将抗IgG或IgM抗体吸附在固相膜的“捕获区”内,抗原结合在带色颗粒上。标本内待检的抗体与抗原颗粒结合物反应并结合,继而在流经“捕获区”时,被其抗IgG或抗IgM抗体捕获。此法优点是可以鉴别IgG和IgM抗体。这类产品也可做到“一步法”,无需洗涤步骤。此法主要缺点是:其敏感度会随相关抗体的相对浓度降低而降低。相关抗体的相对浓度是指相关抗体浓度与标本中总抗体浓度之比。在此比例下降时,“捕获区”内有限的捕捉抗体会相应地被更多的非特异抗体占据,导致敏感度下降。这一情况在IgG的检测中会尤其明显。
抗体检测方法三是“第二抗体法”:此法原理是将抗原吸附在固相膜的“捕获区”。标本内的特异抗体在标本经过“捕获区”时被抗原捕获。结合有第二抗体(对IgG或IgM或对两者具有特异反应性的)的带色颗粒随之被加于固相膜上。当此试剂流经“捕获区”时,带色颗粒上的第二抗体与被捕获的相关抗体结合,并以现色的形式显现出结果。此法可通过采用不同的第二抗体(抗IgG或抗IgM)来鉴别所 测抗体是IgG还是IgM。
此法另一优点是抗原不需与带色颗粒结合。结合有第二抗体的带色颗粒可通用于多种基于不同抗原的测试,简化了试剂的生产程序。此法的操作按顺序进行:第一步加样(标本);第二步洗涤——以洗去多余的非特异(不相关的)抗体;第三步加带色颗粒结合物。如此操作可避免过多无关抗体对检测的干扰(过多无关抗体会消耗许多带色颗粒结合物,造成可与特异抗体结合的带色颗粒量不足,检测的敏感度因之降低)。此操作法的一大缺点是洗涤步骤一次到多次,造成操作繁琐。
发明内容:
本发明的目的在于:提供一种操作简单、制作容易、敏感度高的横向流动检测生物标本中特异性抗体的方法及其检测装置,以克服现有技术的诸多问题。
本发明是这样实现的:它是先将抗原体吸附在固相薄膜上被称为“捕获区”的范围内,然后将含有可与上述抗原体发生反应的相关抗体标本加在固相薄膜被称为“加样区”的部位,标本在膜上横向地流向并经过“捕获区”,再将足量的带色胶体结合物加于“加样区”的远端,并在膜上随标本之后与标本流向一致地作持续的横向流动,流过捕获区,使相关抗体标本与捕获区上的抗原体发生反应并使反应可视化。
所述的带色胶体结合物是IgM抗体、IgG抗体、A蛋白或G蛋白与胶体金属,带色乳胶颗粒,胶体碳或胶体颜料其中一种的结合物, 抗体与胶体的用量比例为1:1。
所述的带色胶体结合物中含有表面活性剂,清洁剂和封闭非特异反应的蛋白,其中,表面活性剂占总量重量比为0.001~5%,清洁剂0.001~5%,封闭非特异反应的蛋白0.001~10%。
所述的表面活化剂可以为非离子活性剂Tween—20,清洁剂可以为三硝基甲苯X-100,蛋白可以为牛血清蛋白。
其检测装置由固相薄膜(1),底板(2),吸液材料(3)组成,其特征在于:固相薄膜(1)处于底板(2)上,其一端连接吸液材料(3);在固相薄膜(1)上的中间区域为捕获区(4),在吸液材料(3)远端的固相薄膜(1)区域为加样区(5)。
所述的固相薄膜(1)可以是硝化纤维;吸液材料(3)可以是玻璃纤维或聚酯纤维。
本发明与现有技术相比,具有以下优点:
1、能采用某种对这种抗体可反应而对另一种抗体不反应的不同结合物,将IgG类抗体或IgM类抗体区分开来。
2、由于抗原体无须和带色胶体相结合,一组通用的抗体(抗IgG抗体或抗IgM抗体)就可以用于不同的检测,这样就简化了装置的制造。
3、带色颗粒结合物制剂内含有前述的有效成份以洗去膜上过量的非特异抗体,同时过量制剂的加入又可确保对“捕获区”持续供应结合物,避免了由结合物被非特异的无关抗体消耗过多所造成的检测敏感度降低的情况。
附图说明:
附图1为本发明装置的示意图。
具体实施方式:
本发明的实施例:固相薄膜(1)用硝化纤维材料,贴于塑料底板(2)上,在其右端贴吸液材料(3),吸液材料(3)用玻璃纤维材料。在固相薄膜(1)上的中间区域为捕获区(4),在固相薄膜(1)的左端区域为加样区(5)。
实验时,先将抗原体萃取到捕获区(4)上,抗体生物标本加在加样区(5)中,足量的抗体—带色颗粒结合物被吸液材料(3)吸附,这样,在液体生物标本加入后,结合物便能和液体生物标本同方向流动,并恰好在其的后面。
足量的带色胶体结合物制剂中加入缓冲液、盐、去污剂(清洁剂)和表面活性剂(如Tween-20),以及阻断非特异反应的封闭蛋白(如牛血清蛋白),起洗去过量非特定抗体的作用,并且连续不断地为反应提供足够的结合物材料,以便系统不被非特定抗体淹没;因此冲洗步骤是和可视化步骤合并在一起的。
下面结合具体实验对本发明作进一步的说明:
1、Toxoplasma(毒性血清)gondii IgM抗体的检测:
此试剂制作的第一步是,将Toxo(毒性血清)抗原制剂萃取在已被粘附在一塑料板(2)上的8μ(微米孔径)的硝酸纤维膜(1)上。此区域即为“捕获区”(4)。抗原的包膜量为每5mm膜上吸附有100ng抗原。在此膜的一端,亦在同一塑料板(2)上,粘有一片吸液材料 (3)。此吸液材料与膜的边缘有足够接触,以致膜上的液体可被吸液材料吸收。而且此吸液材料的吸液能力和面积应足够大,以吸收所有来自膜的液体。制作好的膜在空气中干燥12小时。最后,上述的膜——吸液材料——塑料板的组合体被切成5mm宽的试条。另外,按常规方法制备抗人IgM抗体和红色胶体金的结合物,其比例为:1:1。其液态制剂内还加入0.5%的三硝基甲苯X-100、0.5%Tween-20和1%牛血清蛋白。
检测操作步骤:
第一步,将10ml生物标本(如人血清)加在位于吸液材料(3)另一端的“加样区”(5)(见图)。让标本液渗入膜内并从“加样区”向外流开,流向“捕获区”(4)。如此,三者的位置关系依次是:吸液材料——捕获区——加样区。
第二步,将与吸液材料端相反的试条端(“加样区”的更远端)插入预先制备好的抗人IgM抗体和红色胶体金的结合物制剂(液态)的诸如试管的容器中。插入时结合物制剂的液平面不得超过“加样区”。试条留在结合物制剂中20分钟。
第三步,看结果,如果标本中含有抗ToxoIgM抗体,则一条红线会出现于“捕获区”内;若无红线则表明未测到ToxoIgM抗体。
2、丙型肝炎抗体的检测:
制作过程与实例1类似,区别在于采用不同抗原:一种通过DNA重组工程制成的丙型肝炎组合基因蛋白,其中含有核心蛋白和非结构性3,4和5区(NS-3,4,5)蛋白。另外,采用的带色颗粒结合物是蛋 白A(ProteinA)和红色乳胶颗粒的结合物,操作步骤与实例1一样。
在结果判读中,如标本中含有抗丙型肝炎抗体,则一条红线会出现于“捕获区”中,无此线则表明未测到该抗体。
3、在同一试条上,同时测定抗一组不同抗原的抗体。本实例所测的是抗HIV(AIDS病毒)HCV(丙型肝炎病毒)和梅毒抗体。
制作工艺与前例一样。在膜的捕获区内以3条线分别萃取3种上述的抗原:
(1)HIV的gp41、p24、gp120基因重组蛋白;
(2)HCV的核心、NS-3,4,5基因重组蛋白
(3)梅毒的38KD、15KD和17KD基因重组蛋白。
采用的带色颗粒结合物是抗人IgG抗体与红色胶体碳的结合物,操作步骤同前述实例。
在结果判读时,“捕获区”中3条红线的出现与否分别表明在标本中是否有相应抗体(有线表明测到抗体,无线表明未测到抗体)。
Claims (3)
1.一种非诊断目的的横向流动检测生物标本中特异性抗体的方法,其特征在于:它是先将抗原吸附在固相薄膜上被称为“捕获区”的范围内,然后将含有可与上述抗原发生反应的相关抗体标本加在固相薄膜被称为“加样区”的部位,标本在膜上横向地流动并经过“捕获区”,再将足量的带色胶体结合物加于“加样区”的远端,并在膜上随标本之后与标本流向一致地作持续的横向流动,流过捕获区,使相关抗体标本与捕获区上的抗原发生反应并使反应可视化;所述的带色胶体结合物是IgM抗体、IgG抗体、A蛋白或G蛋白与胶体金属、带色乳胶颗粒、胶体碳或胶体颜料其中一种的结合物;其中带色胶体结合物的抗体与胶体的用量比例为1∶1。
2.按照权利要求1所述的一种非诊断目的的横向流动检测生物标本中特异性抗体的方法,其特征在于:所述的带色胶体结合物中含有表面活性剂,清洁剂和封闭非特异反应的蛋白,其中,表面活性剂占总量重量比为0.001~5%,清洁剂0.001~5%,封闭非特异反应的蛋白0.001~10%。
3.按照权利要求2所述的一种非诊断目的的横向流动检测生物标本中特异性抗体的方法,其特征在于:所述的表面活性剂为非离子活性剂Tween-20,清洁剂为三硝基甲苯X-100,蛋白为牛血清蛋白。
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