CN201331529Y - 丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸 - Google Patents

Abstract

本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别涉及一种丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸。包括上样垫(1)、紧密连接于上样垫一端的含有标记HCV混合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密连接的硝酸纤维素(NC)膜(3)和紧密连接于NC膜另一端的吸样垫(4)。NC膜包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，T线为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，C线为包被在NC膜上的抗HCV抗体。检测时将被检样品加在试纸条(卡)上样垫上，然后直接观察免疫反应结果，完成检测。具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸

技术领域

本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸。

背景技术

HCV是1989年由美国Choo等从受感染的黑猩猩血液标本中最初发现，主要由血液、体液传播，占输血后肝炎的70％。据世界卫生组织统计，全球估计约1.7亿人感染HCV。丙型肝炎慢性化率为50％-85％，其中又有20％可发展为肝纤维化，危害十分严重。我国HCV抗体携带者达4千万左右。到目前为止丙型肝炎既无有效疫苗，亦无有效的治疗方法，预防感染是唯一有效的方法。HCV抗体检查和乙肝表面抗原(HBsAg)、人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体及梅毒(TP)抗体检查是我国法定的四个血源性筛查项目，意义十分重要。

目前HCV抗体检测试剂主要检测HCV IgG。IgM检测只有为数不多的研究报道，集中于用酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行检测。对IgG检测不能说明患者是现症感染或既往感染，虽然IgM的检出率为IgG的50％-80％，但IgM检测阳性基本说明患者是现症感染。除此之外，IgM抗体和体内病毒复制即HCV RNA检出率相关；和体内体内肝炎发展程度、肝细胞坏死相关；在对HCV病人治疗过程中，IgM的变化亦提示治疗效果的好坏；另外IgM的出现和HCV的不同亚型感染相关，因而对HCV IgM检测具有积极的参考意义。

运用免疫层析胶体金技术检测HCV IgM尚无报道。免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，已得到较为广泛运用，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测(T)线，通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

发明内容

本实用新型的目的是提供一种HCVIgM抗体快速检测试纸，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

本实用新型提供一种HCVIgM抗体快速检测试纸。包括上样垫(1)、紧密连接于上样垫一端的含有标记HCV混合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密连接的硝酸纤维素(NC)膜(3)和紧密连接于NC膜另一端的吸样垫(4)，NC膜包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，上样垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料支撑板(7)上形成试纸条，试纸条亦可以装入塑料卡中形成卡式包装，其特征在于T线为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，胶体金垫为标记的HCV混合抗原构成。

所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的HCV混合抗原为重组表达HCV的核心抗原(Core)和非结构蛋白(NS)3抗原，亦可选择性再加入HCV的NS4、NS5、E1和E2区抗原。

所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。

所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的抗原的包被方法为：以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgM抗体配制成1mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以1ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在NC膜上部包被抗HCV抗体作为C线。划线后将NC膜在干燥间(温度20-25℃，湿度小于30％)干燥8-10小时。

所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的混合抗原标记胶体金颗粒的方法为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K₂CO₃调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入1mg HCV重组混合抗原，室温搅拌2小时，加入1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％聚乙二醇(PEG)20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml，按1ml溶液铺22cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间(温度20-25℃，湿度小于30％)干燥2-4小时，制成胶体金垫。

所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的试纸的装配方法为：在干燥室内(温度20-25℃，湿度小于30％)，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成检测卡。

所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，检测方法为：将被检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品，样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在30分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果

本实用新型的有益效果是：提供一种利用免疫层析胶体金技术检测HCVIgM的新型试纸。采用胶体金标记HCV抗原，包被抗人IgM实现对样品中HCV IgM的检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

附图说明：

图1HCV抗体快速检测试纸结构示意图。

附图符号说明：

1：上样垫        2：胶体金垫

3：NC膜          4：吸样垫

5：检测(T)线     6：质控(C)线

7：塑料支撑板

具体实施方式

实施例：制备HCV IgM抗体快速检测试纸

1主要材料

1.1HCV的CORE、NS3融合抗原：美国Biotech Atlantic Inc(BAI.)产品，用于胶体金标记；鼠抗人IgM，抗HCV抗体：军事医学科学院产品，用于NC膜包被；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜：Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇(PEG)20000，水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。

1.2临床血清由公司在相关医院或血站获得，HCV IgG抗体阳性血清80份，HCV抗体阴性血清300份。

1.3HCV IgM抗体检测ELISA试剂盒，美国Abbott产品。

2方法

2.1HCV重组抗原的胶体金标记氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K₂CO₃将溶液调到pH7.0、pH8.0和pH9.0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为0.1％的PEG2000和1％的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液(硼酸盐缓冲液，pH8.0，含BSA、羊血清，蔗糖和表面活性剂)中。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺22cm²的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫。

2.2鼠抗人IgM的包被用0.01M pH7.2PBS将鼠抗人IgM分别稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按1ul/cm进行划线包被，同时在NC膜上部包被抗HCV抗体，用于产品的质控，包被完成后将NC膜在在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥8-10小时。

2.3HCV IgM抗体快速检测试纸的组装在干燥室内(温度20-25℃，相对湿度＜30％)取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成HCV IgM抗体检测试剂卡。

2.4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品，若样品中含抗HCV IgM抗体，则和样品垫上的标记HCV抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到NC膜上进一步层析，当遇到包被在NC膜上T线处的鼠抗人IgM时，复合物则又和包被抗IgM抗体结合，被捕获在包被处，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T线；若血清中不含特异性抗体，则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在15、20、30和45分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。

2.5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合。

2.6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有HCV IgG阳性血清、阴性血清进行检测，阳性血清同时用Abbott IgM抗体检测ELISA试剂进行对照检测。

3结果

3.1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8.0；重组混合抗原的最佳标记量为1mg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为10mM硼酸酸盐缓冲液，pH8.0，含0.5％BSA、10％羊血清，2％蔗糖，0.2％Tween 20；最佳包鼠抗人IgM包被浓度为1mg/ml。检测结果的最佳判定时间为5-30分钟。

3.2临床血清检测以ELISA试剂为对照，80份HCV IgG阳性血清中ELISA检测出IgM阳性血清54份，本试剂检测出阳性为52份，灵敏度＝52/54＝96.3％；本试剂对300份阴性血清检出假阳性5份，特异性＝295/300＝98.3％。分析试剂性能和ELISA试剂相比无显著性差异。

Claims (3)

1、一种丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，包括上样垫(1)、紧密连接于上样垫一端的含有标记HCV混合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密连接的硝酸纤维素(NC)膜(3)和紧密连接于NC膜另一端的吸样垫(4)，NC膜包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，上样垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料支撑板(7)上形成试纸条，试纸条亦可以装入塑料卡中形成卡式包装，其特征在于T线为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，C线为包被在NC膜上的HCV混合抗原构成。

2、根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的HCV混合抗原为重组表达HCV的核心抗原(Core)和非结构蛋白(NS)3抗原，亦可选择性再加入HCV的NS4、NS5、E1和E2区抗原。

3、根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。

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