BR112014030953B1 - dispositivo de diagnóstico, processo de fabricação de um dispositivo, uso de um dispositivo, processo de fenotipagem de grupos sanguíneos eritrocitários, processo de detecção de anticorpos multivalentes e processo de detecção de anticorpos antieritrocitários - Google Patents
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Abstract
DISPOSITIVO DE DIAGNÓSTICO, PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE UM DISPOSITIVO, USO DE UM DISPOSITIVO, PROCESSO DE FENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUÍNEOS ERITROCITÁRIOS, PROCESSO DE DETECÇÃO DE ANTICORPOS MULTIVALENTES E PROCESSO DE DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTIERITROCITÁRIOS. A presente invenção refere-se a um dispositivo de diagnóstico in vitro, a partir de uma amostra de sangue ou de um de seus componentes, para detectar reações entre antígenos eritrocitários e anticorpos dirigidos especificamente contra esses antígenos, ainda, a presente invenção trata igualmente dos usos desse dispositivo para a identificação e a determinação de grupos sanguíneos. O dispositivo (10) de diagnóstico in vitro, para a detecção de pelo menos uma reação entre um antígeno de fenótipo eritrocitário e um anticorpo dirigido especificamente contra esse antígeno, a partir de uma amostra de sangue ou de um de seus componentes compreende um suporte (12), e uma membrana porosa hidrófoba (14) com uma espessura compreendida entre 0,05mm e 1,5mm e cujos poros têm um diâmetro compreendido entre 2 e 30 micrometro, a qual membrana compreende pelo menos uma área reacional hidrófila (16) destinada a receber a referida amostra, e a superfície da área reacional hidrófila (16) é inferior à superfície da membrana porosa hidrófoba (14).
Description
[001] A presente invenção refere-se a um dispositivo de diagnóstico in vitro, a partir de uma amostra de sangue ou de um de seus componentes, para detectar reações entre antígenos eritrocitários e anticorpos dirigidos especificamente contra esses antígenos, ainda a presente invenção trata igualmente dos usos desse dispositivo para a identificação e a determinação de grupos sanguíneos.
[002] Os diagnósticos imuno-hematológicos têm por objetivo prevenir ou diagnosticar um ataque de glóbulos vermelhos por anticorpos. Para isso, é preciso dispor de ferramentas que permitam determinar os antígenos presentes na superfície dos glóbulos vermelhos, e sua presença ou sua ausência permitem definir o grupo sanguíneo, e também identificar se um sangue contém um ou mais anticorpos dirigidos contra os antígenos conhecidos dos glóbulos vermelhos, sendo que a presença de um anticorpo assinala a possibilidade de uma incompatibilidade.
[003] As técnicas habitualmente utilizadas consistem, portanto, em pesquisar e identificar a presença ou a ausência de antígenos de grupo sanguíneo na superfície dos eritrócitos e/ou em pesquisar e identificar a presença ou a ausência de anticorpos antiantígenos de grupo sanguíneo no plasma.
[004] Por exemplo, para o sistema ABO, a prova de Beth-Vincent permite determinar os antígenos portados pelos glóbulos vermelhos, e a prova complementar de Simonin-Michon ou contraprova sérica permite determinar os anticorpos que circulam no soro.
[005] Na prova de Beth-Vincent (os glóbulos vermelhos do indivíduo são colocados na presença de reagentes de anticorpos de especificidade conhecida. Geralmente, esse teste se torna visível por observação de aglutinação dos glóbulos vermelhos quando os anticorpos reconhecem os antígenos eritrocitários correspondentes.
[006] Na prova de Simonin, o plasma do indivíduo é colocado em presença de glóbulos vermelhos testes que pertencem, cada um, a um grupo antigênico preciso do sistema ABO. Trata-se de um teste de aglutinação de hemácias testes com o plasma do indivíduo. Para a pesquisa de anticorpos chamados de irregulares, trata-se de detectar a presença ou a ausência no sangue de um indivíduo de imunoglobulinas dirigidas contra diversos antígenos eritrocitários. No caso de uma pesquisa de autoanticorpos, são procurados diretamente os anticorpos já fixados in vivo no indivíduo no teste direto. No caso de uma pesquisa de alo-anticorpos, o objetivo é revelar a fixação dessas imunoglobulinas em glóbulos vermelhos testes cujos antígenos são conhecidos, com a técnica de Coombs indireto.
[007] Existe um grande número de processos e de dispositivos utilizados para a fenotipagem no campo da imuno-hematologia, mas as técnicas existentes de fenotipagem de grupos sanguíneos apresentam numerosos inconvenientes.
[008] As técnicas em microplaca, por exemplo, requerem uma fase de centrifugação seguida de uma etapa de agitação. A etapa de agitação é crítica, pois as reações múltiplas simultaneamente presentes no suporte não possuem a mesma cinética de recolocação em suspensão. Existe, portanto, o risco de desfazer as aglutinações fracas sem conseguir tornar a suspender aglutinações fortes. Elas precisam ser realizadas sob controle visual e é preciso estar particularmente atento aos fenômenos de aderência de certos reagentes.
[009] Da mesma forma, durante a realização de técnicas de filtração por gel-teste, existe igualmente um risco de não detecção de certas aglutinações, em particular durante a prova plasmática do grupo ABO por causa da dissociação por cisalhamento dos pequenos aglutinados durante sua passagem no gel.
[010] Além disso, todas essas técnicas apresentam um inconveniente primordial devido ao fato de que requerem uma etapa de centrifugação para decantar os glóbulos vermelhos ou fazê-los passar através do gel, etapa restritiva que aumenta consideravelmente o tempo e o custo da análise, e que implica no uso de centrífugas volumosas e difíceis de manipular.
[011] É também conhecido um método de imunofiltração, tal como descrito, por exemplo, no pedido EP-2.167.967, que consiste em capturar um analito presente em uma amostra durante sua passagem através de uma membrana porosa que porta um elemento de captura e em revelar sua presença por um elemento de revelação. Esse de dispositivo é constituído de uma área de depósito da amostra, de uma membrana porosa hidrófila sobre a qual é depositado um reagente de captura e sob a qual está disposta uma membrana absorvente. A realização de tal teste consiste em depositar uma amostra pura ou diluída na área de depósito da amostra, que atravessa a membrana porosa para terminar na membrana absorvente. Durante essa travessia por capilaridade na membrana porosa, se o analito que corresponde ao elemento de captura estiver presente na amostra, esta última é imobilizada pelo agente de captura. Em um segundo tempo, é preciso revelar a presença no spot de captura do analito preferido por meio de um agente de revelação capaz de detectar a presença no analito na área de captura e que porta um elemento que permite que ele seja detectado visualmente (produto colorido) ou revelado por um método físico ou químico.
[012] Todavia, esse método apresenta problemas de sensibilidade e de especificidade significativos, pois quando a amostra é depositada, ela se espalha e embebe a membrana porosa, e numerosos analitos se perdem no volume morto da membrana porosa ou passam fora da área de captura. Acontece o mesmo com a solução de revelação. É, portanto, preciso superdimensionar o sistema de absorção para poder depositar volumes maiores de amostras a ser testadas e de solução de revelação, o que impede a realização de testes miniaturizáveis cuja cinética é controlada, isentos de retorno de agentes de revelação e utilizáveis com um robô pipetador.
[013] Para tentar resolver esse problema e concentrar o sinal, foi proposto no pedido CA1312265 ou WO02052263, interpor acima e abaixo da membrana porosa hidrófila, uma estrutura hidrófoba perfurada para forçar o fluxo a passar pelo spot de captura. Todavia, com esses dispositivos, continua a existir um problema de difusão centrífuga a partir do spot, e os elementos de revelação que passam pelo spot de captura e que não estão fixados neles vão poder difundir de forma centrífuga na membrana porosa hidrófila e ser armazenados na periferia do spot. Os elementos de revelação vão, então, escapar do enxágue que é também focalizado no spot. Existe, então, um fenômeno de retorno desse elemento de revelação na forma de um retorno por difusão centrípeta para o spot o que provoca uma recoloração do spot mesmo no caso da ausência do analito preferido. Esse fenômeno impede muito rapidamente a leitura do teste (geralmente entre 5 e 15 minutos), pois aparecem resultados falsamente positivos. Isso é muito problemático, pois esses dispositivos não permitem reinterpretar ulteriormente o dispositivo em caso de dúvida, erro humano ou perda de informação.
[014] Outra problemática primordial dos dispositivos de imunofiltração existentes atualmente é o controle da velocidade de passagem e, em certos casos, do tempo de pré-incubação. Esses tempos são significativos, pois a interação entre o elemento de captura e o analito, bem como entre o analito e o elemento de revelação possui uma certa cinética. Essa cinética descreve o número de interações realizadas em função do tempo. Assim, em função dos pares agente de captura analito e agente de revelação/analito, é preciso poder garantir um número suficiente de interações para cada um dos pares para obter um sinal suficiente. No caso em a interação agente de captura/analito é mais lenta, é preciso poder regular a velocidade da passagem da amostra através da membrana em função disso. No caso em que é a interação entre o elemento de revelação e o analito que é limitante, é preciso proceder a um tempo de pré-incubação em que o elemento de revelação e o analito são misturados acima do spot de captura. Sem um sistema particular, a passagem através de uma membrana hidrófila é rápida (500μl/min).
[015] Para controlar o fluxo, foi proposto usar um pistão, em particular no pedido US2008318342.
[016] Para controlar o tempo de pré-incubação, foi proposto no pedido WO03016902 usar um dispositivo em duas partes: uma parte superior que comporta uma área de coleta da amostra e uma membrana porosa, e uma parte inferior que comporta uma membrana porosa e uma membrana absorvente. Na posição inicial, esses dois blocos não se comunicam, o fluido não pode transitar por capilaridade. Após uma manipulação mecânica, as duas áreas estão em contato e o fluido pode escoar por capilaridade. Foi igualmente proposto depositar o elemento de captura sobre uma membrana hidrófoba e ativar a passagem por adição de um tensoativo.
[017] As abordagens mecânicas são difíceis de realizar utilizando um robô, pois requerem o desenvolvimento e o uso de sistemas dedicados. Elas expõem também os profissionais a eventuais projeções durante a manipulação.
[018] A adição de um tensoativo no momento da realização do teste para iniciar o sistema é muito prejudicial, pois interfere consideravelmente nas interações agentes de captura / analitos. Além disso, no caso específico da imuno-hematologia, os glóbulos vermelhos utilizados como agente de revelação não são compatíveis com os tensoativos em forma líquida, pois a membrana dos glóbulos vermelhos é dissolvida e são esvaziadas de sua hemoglobina.
[019] Outro método, descrito em EP0334015, consiste em usar uma membrana adicional subjacente à primeira para controlar o fluxo, mas o dispositivo proposto não permite resolver os problemas ligados à difusão da amostra e do elemento de revelação na membrana porosa hidrófila. Os testes de diagnóstico imuno-hematológicos existentes apresentam, portanto, de numerosos inconvenientes.
[020] Além disso, a presente invenção visa corrigir os inconvenientes da arte anterior propondo um dispositivo apropriado para o diagnóstico imuno-hematológico in vitro por capilaridade confiável, rápido, móvel e econômico, simples de fabricar e de usar, que possa ser miniaturizado e automatizado, e que apresente uma grande sensibilidade.
[021] Para atender a esse objetivo, a presente invenção propõe um dispositivo de diagnóstico in vitro para a detecção, a partir de uma amostra de sangue ou de um de seus componentes, de pelo menos uma reação entre um antígeno de fenótipo eritrocitário e um anticorpo dirigido especificamente contra esse antígeno que compreende: - um suporte, e - uma membrana porosa hidrófoba com uma espessura compreendida entre 0,05mm e 1,5mm e cujos poros têm um diâmetro compreendido entre 2 e 30 μm, a qual membrana compreende pelo menos uma área reacional hidrófila destinada a receber a referida amostra, e a referida área reacional possui uma superfície inferior à superfície da membrana porosa hidrófoba.
[022] A presente invenção visa igualmente o uso desse dispositivo, em particular dos processos de fenotipagem de grupos sanguíneos eritrocitários e de detecção de anticorpo, que utiliza esse dispositivo.
[023] Vantajosamente a presente invenção permite corrigir todos os inconvenientes encontrados nos testes de imunofiltração existentes atualmente, em particular permitindo: - evitar os retornos de agente de revelação responsáveis pelos falsos positivos - uma sensibilidade aumentada utilizando volumes mais baixos - uma miniaturização e uma automatização do sistema - um controle da cinética das reações sem necessidade de manipulação mecânica do dispositivo. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[024] Outras características e vantagens aparecerão na descrição a seguir da presente invenção, dada unicamente a título de exemplo, relação aos desenhos anexos nos quais: - a figura 1 representa um esquema de um modo particular de realização do dispositivo de acordo com a presente invenção visto em perspectiva, - a figura 2A representa a membrana porosa hidrófoba e a membrana absorvente do dispositivo de acordo com a presente invenção com uma primeira variante das áreas reacionais hidrófilas, - a figura 2B representa a membrana porosa hidrófoba do dispositivo de acordo com a presente invenção com uma segunda variante das áreas reacionais hidrófilas, - a figura 3A representa um esquema de um corte do dispositivo de acordo com a presente invenção com uma membrana porosa hidrófoba que corresponde à variante representada na figura 2 A, - a figura 3B representa um esquema de um corte do dispositivo de acordo com a presente invenção com uma membrana porosa hidrófoba que corresponde à variante representada na figura 2B, - a figura 4A representa os resultados obtidos após o uso do dispositivo de acordo com a presente invenção, em uma área reacional da membrana porosa hidrófoba representada na figura 2A e a parte da membrana absorvente subjacente, e - a figura 4B representa os resultados obtidos após o uso do dispositivo de acordo com a presente invenção, em uma área reacional da membrana porosa hidrófoba representada na figura 2B.
[025] O dispositivo 10 de acordo com a presente invenção é um dispositivo de diagnóstico in vitro para a detecção, a partir de uma amostra de sangue ou de um de seus componentes, de pelo menos uma reação entre um antígeno de fenótipo eritrocitário e um anticorpo dirigido especificamente contra esse antígeno.
[026] Trata-se de um dispositivo para o diagnóstico in vitro por capilaridade. Ele é particularmente apropriado para o diagnóstico imuno- hematológico in vitro.
[027] Por antígeno de fenótipo eritrocitário ou antígeno de grupo eritrocitário ou antígeno de grupo sanguíneo, entende-se o conjunto das moléculas imunogênicas presentes na superfície dos glóbulos vermelhos que podem induzir, se for o caso, a produção de anticorpos dirigidos contra ele e/ou permitir o reconhecimento e, depois, a destruição dos glóbulos vermelhos pelo sistema imunológico.
[028] A reação entre um antígeno de fenótipo eritrocitário e um anticorpo dirigido especificamente contra esse antígeno é denominada reação antígeno-anticorpo no resto da descrição.
[029] Por amostra de sangue ou de um de seus componentes, entende-se o sangue total ou um de seus componentes escolhidos, em particular, entre a fração glóbulo vermelho, a fração glóbulo branco, o plasma ou o soro.
[030] Como representado na figura 1, o dispositivo 10 de acordo com a presente invenção compreende: - um suporte 12, e - uma membrana porosa 14 hidrófoba que compreende pelo menos uma área reacional 16 hidrófila destinada a receber a amostra a ser testada.
[031] A membrana porosa 14 possui uma espessura compreendida entre 0,05mm e 1,5mm, preferencialmente entre 0,1 e 1mm, mais preferencialmente ainda entre 0,4 e 0,8mm.
[032] O diâmetro dos poros está compreendido entre 2 e 30 μm, preferencialmente entre 7 e 12μm.
[033] A membrana porosa hidrófoba 14 pode ser constituída de qualquer material que não seja alterado pelos solventes aquosos. Esse material pode ser escolhido, em particular, entre polímeros naturais modificados quimicamente ou não, como por exemplo o polímero de nitrocelulose, a celulose ou entre polímeros sintéticos como por exemplo o polietileno, polietileno de alta densidade (HDPE) ou os polímeros fluorados tal como o PVDF. Essa material deve ser inicialmente hidrófobo ou tornado hidrófobo por um tratamento apropriado. Esses polímeros podem ser ou não funcionalizados com grupos reagentes capazes de criar ligações com os agentes de captura utilizados ulteriormente. A membrana porosa hidrófoba 14 compreende pelo menos uma área reacional 16 hidrófila. A área reacional 16 possui uma superfície inferior à superfície da membrana porosa hidrófoba 14, isto é, que a membrana 14 não pode ser inteiramente hidrofilizada.
[034] A ou as áreas reacional(ais) hidrófila(s) 16 da membrana porosa 14 foram preferencialmente tornadas(s) hidrófila(s) por adição de um detergente localmente, sem modificação das funções químicas do substrato poroso por um tratamento químico ou físico prévio da membrana porosa hidrófoba 14.
[035] Por detergente entende-se qualquer agente hidrofilizante, isto é, qualquer substância capaz de tornar hidrófila a membrana hidrófoba 14.
[036] O detergente utilizado pode ser escolhido entre os detergentes naturais, naturais quimicamente modificados ou obtidos por síntese química. Preferencialmente, trata-se de um tensoativo não iônico, por exemplo o Triton X-100, o Tween 20 ou a saponina.
[037] O detergente pode ser diluído em uma solução aquosa ou um solvente orgânico como o etanol, a uma concentração compreendida entre 0,01 e 5%. Preferencialmente, o detergente utilizado para tornar a membrana 14 hidrófila localmente é utilizado em uma dose compreendida entre 0,01 e 2% (peso/volume).
[038] A quantidade de detergente utilizada, correlacionada com outras características da membrana (porosidade e espessura em particular) permite controlar a velocidade de passagem dos fluidos que atravessam a membrana. É geralmente admitido que não se deve ultrapassar uma dose máxima de 0,1% para o TritonX-100 e 0,05% para o Tween para tornar hidrófila uma membrana destinada a receber um elemento de captura. Ora, devido a características particulares da membrana 14 de acordo com a presente invenção, os detergentes capazes de tornar essa membrana hidrófila localmente podem ser usados até 2%, em particular para o Triton X-100 ou o Tween-20, sem perturbar a reatividade da área, o que facilita a hidrofilização da membrana 14.
[039] ‘Uma mesma membrana hidrófoba 14 pode comportar várias áreas reacionais hidrófilas 16, desde que não haja intersecção dessas áreas.
[040] As áreas reacionais 16 podem se apresentar sob quaisquer formas geométricas, mais preferencialmente na forma de círculos ou spots de diâmetro compreendidos entre 0,3mm e 20mm.
[041] A área reacional 16 pode ser hidrófila sobre toda a espessura da membrana porosa 14 e/ou na superfície.
[042] A área reacional 16 pode apresentar um único grau de hidrofilização como representando nas figuras 2A, 3A e 4A. Essa configuração é particularmente apropriada à detecção da presença de anticorpo específico na amostra a ser analisada.
[043] De acordo com uma variante, a área reacional 16 pode comportar diversas áreas que apresentam graus de hidrofilização diferentes.
[044] Como representado na figura 2B, 3B e 4B, a área reacional 16 pode comportar duas áreas hidrófilas 16-1, 16-2 com um grau de hidrofilização maior no centro 16-1 da área reacional que na periferia 16-2. Essas áreas hidrófilas estão preferencialmente apenas na superfície da membrana 14.
[045] A área reacional 16 pode também comportar duas áreas hidrófilas com um grau de hidrofilização diferente, uma na superfície, a outra na espessura.
[046] No caso de uma área reacional 16 comportar duas áreas hidrófilas, a área reacional 16 foi tornada hidrófila com dois detergentes diferentes sem modificação das funções químicas do substrato poroso por um tratamento químico ou físico prévio da membrana porosa.
[047] Vantajosamente, a configuração da área reacional 16 com duas regiões que apresentam uma hidrofilização diferente, em particular na superfície, tal como representado nas figuras 2B, 3B e 4B, permite responder a uma preocupação particular dos profissionais da transfusão, isto é, distinguir a eventual coexistência de duas populações, sendo uma positiva e a outra negativa, fenômeno também chamado dupla população. Essa configuração é particularmente apropriada à detecção e à identificação de antígenos particulares na amostra a ser testada.
[048] A área reacional hidrófila 16 da membrana porosa 14 pode compreender agentes de captura. Os agentes de captura são absorvidos ou estão ligados de forma covalente à membrana 14.
[049] Por agentes de captura, entende-se qualquer elemento químico ou biológico fixado na área 16 capaz de reter o analito de interesse contido na amostra a ser testada, sozinho ou complexado com um agente de revelação.
[050] Quando o objetivo é identificar a presença de anticorpo particulares na amostra a ser testada, esses agentes de captura compreendem antígenos de fenótipo eritrocitário particulares. Pode se tratar de antígenos purificados ou não, de fragmentos ou membranas de células que portam os antígenos, células vazias ou não que portam os antígenos ou ainda proteínas recombinantes ou antígenos obtidos por síntese. Preferencialmente, os agentes de captures são hemácias desprovidas de hemoglobina, que portam os antígenos.
[051] Quando o objetivo é identificar a presença de antígenos particulares na amostra a ser testada, os agentes de captura são anticorpos.
[052] Os agentes de captura, quando estão presentes na área reacional 16, podem ser depositados ao mesmo tempo que o detergente que serve para hidrofilizar a membrana 14 para delimitar a área reacional 16, ou após a hidrofilização, independentemente do detergente.
[053] Os agentes de captura podem ser depositados a área reacional 16 em um tampão não desnaturante constituído de uma solução de pH estabilizada entre pH4 e pH 10, preferencialmente entre pH 6,5 e p H 7,8, mais preferencialmente ainda entre pH 7 e pH 7,5. Os agentes de captura podem ser absorvidos, ou então estar ligados de forma covalente.
[054] Os agentes de captura podem receber a adição de adjuvantes destinados a manter sua estabilidade microbiológica tais como a azida de sódio, antibióticos e sua estabilidade conformacional tais como açúcares (sucrose, dextrose, trehalose), bem como qualquer outro agente conhecido do técnico no assunto para realizar essas funções. Os agentes de captura podem estar presentes em toda a área 16 ou em uma parte apenas.
[055] O detergente e/ou os agentes de captura se apresentam preferencialmente na forma de soluções que podem ser depositadas por meio de pipetadores robotizados ou manuais. Vantajosamente, essas soluções podem também ser facilmente depositadas por meio de agulhas que retêm por capilaridade o volume desejado. Essas agulhas podem ser feitas de quaisquer materiais, mas são mais particularmente metálicas, e apresentar ou não um revestimento hidrófobo. Suas extremidades podem ser chatas ou apresentar um entalhe de um volume determinado.
[056] O depósito das soluções de detergente e/ou de agentes de captura, deve ser seguido de uma secagem da membrana, e a duração da secagem depende da temperatura aplicada: pelo menos 4 horas à temperatura ambiente, pelo menos uma hora a 37°C.
[057] O dispositivo de acordo com a presente invenção pode compreender uma membrana absorvente 18 sob a membrana porosa 14. Essa membrana 18 permite absorver os líquidos depositados no nível das áreas reacionais 16, que não são retidos pela membrana 14, em particular quando a área reacional 16 é hidrófila em toda a espessura da membrana 14.
[058] A membrana 18 pode ser constituída de um material que permite uma absorção passiva por capilaridade como papel absorvente, celulose, etc., ou feito de polímeros absorventes. A título de exemplo, podem ser citados os seguintes produtos: • Millipore C048, C068, C083, C248 • Whatman CF3, CF4, CF10, Grade 470, CF5, CF6, CF7, Grade 900, Grade 300 • Ahlstrom Grades 601, 642, 631, 238, 237, 222, 243, 320 • Pall Grades 111, 113, 133, 165, 197, 8975, 8964, 8301, Accuwik® Ultra • Cleanis Gelmax superabsorbant pad • Algodão
[059] A composição da membrana absorvente 18 e suas dimensões devem ser escolhidas de forma a poder absorver a totalidade das soluções utilizadas durante o teste (total em μl). Como cada membrana ser caracteriza por uma capacidade de absorção (C em μl/cm2), a membrana e suas dimensões (D em cm 2) são escolhidas para satisfazer à seguinte equação: D > Vtotal/C.
[060] De modo alternativo, o líquido pode ser absorvido por um diferencial de pressão entre a área acima da membrana e a área abaixo dela. Por exemplo usando um sistema de aspiração com vácuo parcial.
[061] A membrana 14 e eventualmente a membrana 18, estão dispostas em um suporte 12.
[062] O suporte 12 do dispositivo 10 de acordo com a presente invenção é preferencialmente um suporte rígido. Ele pode ser, por exemplo, de preferência, um invólucro.
[063] De forma preferida, o suporte é constituído de material rígido que não pode deixar escapar líquido. Pode se tratar, em particular, de matérias plásticas, tais como o polipropileno, o polietileno, o poliestireno, a acrilonitrila o butadieno estireno, polietileno tereftalato, o policarbonata, a poliamida, o cloreto de polivinila, o polimetacrilato de metila.
[064] O suporte 12 comporta preferencialmente pelo menos uma abertura 20, cada abertura 20 é perpendicular a cada área reacional hidrófila 16 da membrana porosa 14. Essa abertura 20 corresponde à área de coleta da amostra depositada na área reacional hidrófila 16. A área hidrófila 16 pode ser de tamanho idêntico à do fundo da abertura, menor ou maior, desde que duas áreas hidrófilas estejam sempre separadas por uma área hidrófoba sobre a membrana 14.
[065] As aberturas 20 podem ter bordas transparentes que permitem, se for o caso, visualizar os sinais subjacentes.
[066] A área de coleta deve ser de uma dimensão tal que possa conter pelo menos o volume máximo de amostra a ser testada depositado sobre a membrana reacional 16.
[067] A independência de cada área reacional 16 é obtida pela barreira constituída pela membrana hidrófoba entre as áreas reacionais. Essa independência permite realizar vários diagnósticos diferentes sobre um mesmo dispositivo que comporta uma única membrana. De acordo com uma variante, essa independência pode também ser eventualmente ser concretizada segmentando o suporte 12 em unidas fisicamente independentes separadas por divisórias que contêm cada uma sua própria membrana.
[068] Além disso, é possível melhorar o contato entre as membranas 14 e 18 realizando em torno da abertura 20 uma sobre-espessura, e no fundo da abertura um domo diante da abertura da referida abertura 20.
[069] O suporte 12 pode ser um invólucro que apresenta várias aberturas 20, de dimensões compatíveis com o padrão SBS/AINSI em duas dimensões externas.
[070] O dispositivo 10 de acordo com a presente invenção pode ser utilizado na determinação da presença ou a ausência de um analito em um fluido biológico, em particular no sangue ou um de seus constituintes por capilaridade. Esse analito pode ser um antígeno de fenótipo eritrocitário ou um anticorpo dirigido contra esse antígeno. O dispositivo 10 pode ser utilizado em particular para: - a fenotipagem de glóbulos vermelhos, isto é, a determinação dos antígenos em sua superfície. - a prova chamada de Simmonin que identifica a presença de anticorpo anti-A ou anti-B. - a pesquisa ou a identificação de anticorpos dirigidos contra antígenos celulares, em particular eritrocitários no âmbito da pesquisa de alo- anticorpos, de auto-anticorpos ou ainda de aglutininas frias.
[071] De forma específica, o objetivo da presente invenção é, portanto, o uso de um dispositivo 10 para identificar e determinar grupos sanguíneos ABO, a fenotipagem Rhesus estendida, a pesquisa de aglutinina irregular, a pesquisa de auto-anticorpos, a pesquisa de antiglobulina fria e/ou a validação cruzada, partir de uma amostra de sangue ou de um de seus componentes.
[072] O uso do dispositivo 10 de acordo com a presente invenção requer o uso de um agente de revelação. Preferencialmente trata-se de hemácias. essas hemácias: - são hemácias de fenótipo conhecido, denominadas hemácias testes, para o uso do dispositivo para a pesquisa de anticorpos ou a prova de Simmonin, - são as contidas na amostra a ser testada para o uso do dispositivo para o fenotipagem.
[073] Em função do analito cuja presença se pesquisa na amostra a ser testada, é preciso fazer variar a natureza do agente de captura, a natureza do agente de revelação, a método de hidrofilização (simples ou múltiplo, na espessura ou na superfície) e o protocolo seguido.
[074] Em todos os casos, antes do depósito da amostra a ser testada na área reativa, é possível proceder a uma hidratação da área reacional 16 por meio de uma solução tampão. Esse tampão pode ser constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH 7,8, em particular entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (Tween 20 0,01 a 0,05% m/v), agentes de saturação (BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno- anticorpo.
[075] Da mesma forma, para poder ler os resultados, é preciso utilizar um tampão de enxágue. Esse tampão de lavagem é preferencialmente constituído de PBS, TBS ou solução salina de pH compreendido entre 2 e 10, preferencialmente entre 5 e 9. A osmolaridade do tampão deve ser controlada para evitar a hemólise dos glóbulos vermelhos. O tampão deve ser escolhido para não destacar(separar) os agentes de revelação ou os analitos coloridos fixados direta ou indiretamente aos agentes de captura. De forma surpreendente, para o uso do dispositivo de acordo com a presente invenção, é preferível usar soluções de lavagem ligeiramente hiperosmóticas (isto é, entre 300mOsm e 800 mOsm) obtidas pela presença de agentes salinos como o NaCI ou de osmólitos não iônicos como, por exemplo, a glicina ou a taurina. Esse tampão pode ser colorido com cores que contrastam com a cor do agente de revelação. Por exemplo, se os agentes de revelação forem hemácias, a solução tampão de lavagem pode ser colorida de azul ou verde. É também possível adicionar uma pequena dose de tensoativo à solução de lavagem para eliminar o ruído de fundo. Esses tensoativos são preferencialmente tensoativos não iônicos, em particular os ésteres de açúcar, em particular os ésteres de sorbitano polioxietilênicos (Tween).
[076] Durante o uso do dispositivo 10, os depósitos de líquidos podem ser feitos, em particular, por meio de um sistema pipetador ou por meio de um sistema de replicação por capilaridade.
[077] Vantajosamente, o dispositivo de acordo com a presente invenção não requer centrifugação, nem agitação, nem colocação sob vácuo, nem dispositivo ad hoc. Ele pode tanto ser usado manualmente de forma totalmente autônoma, quanto ser facilmente automatizado em robôs. As diferentes características da membrana 14 permitem controlar a velocidade de passagem e obter tempos de passagens suficientemente longos para permitir a reação antígeno-anticorpo, apesar dos tamanhos de porosidade da membrana 14 que são, porém, grandes.
[078] De acordo com uma primeira variante, o objetivo da presente invenção é o uso do dispositivo 10 para a fenotipagem dos glóbulos vermelhos.
[079] O objetivo é a pesquisa dos antígenos na superfície de glóbulos vermelhos. Nesse caso, são utilizados como agente de captura um anticorpo ou uma mistura de anticorpos, capazes de reconhecer especificamente a o antígeno em questão ou um variante de um antígeno. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal purificado ou semi purificado, um sobrenadante de cultura que contém o anticorpo monoclonal (ver Tabela 1) ou um anticorpo policlonal, um antissoro. Podem também ser usadas aglutininas ou lectinas.
[080] De forma não exaustiva, podem ser citados os seguintes anticorpos monoclonais: TABELA 1
[081] De acordo com um modo de realização particular, o objetivo da presente invenção é um processo de fenotipagem de grupos sanguíneos eritrocitários, a partir de uma amostra de glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos puros ou sangue total), que permite a detecção simultânea de uma população de fenótipo positivo e de uma população de fenótipo negativo (população dupla), que compreende as seguintes etapas: - depositar uma solução para hidratar a membrana porosa 14 no centro da área reacional de um dispositivo 10 de acordo com a presente invenção, sendo que a referida área reacional 16 comporta duas áreas hidrófilas 16-1, 16-2 com um grau de hidrofilização maior no centro 16-1 da área reacional que na periferia 16-2, e comporta no centro agentes de captura que compreendem anticorpos; a solução para a hidratação da membrana é uma solução conhecida por ser propícia às reações imuno-hematológicas que contém eventualmente aditivos como, por exemplo, um tampão constituído de uma solução de pH estabilizada entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH 7,8, em particular entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (em particular, Tween 20 de 0,01 a 0,05%m/v), agentes de saturação (por exemplo BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno-anticorpo. Esse tampão pode eventualmente apresentar uma atividade proteásica, por exemplo obtida pela adição de enzimas tais como a papaína ou a bromelain. Esse tampão pode eventualmente conter agentes policatiônicos como o polibreno ou a polilisina, que permitem potencializar a reação e de manter por mais tempo os glóbulos em contato com o elemento de captura; - diluir os glóbulos vermelhos a ser fenotipados em uma solução tampão, ou seja, uma solução tampão conhecida por ser propícia às reações imuno-hematológicos que contém eventualmente aditivos como, por exemplo, um tampão constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e p H7,8, em particular entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (em particular, Tween 20 de 0,01 a 0,05%m/v), agentes de saturação (por exemplo BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno-anticorpo. Esse tampão pode eventualmente apresentar uma atividade proteásica, por exemplo obtida pela adição de enzimas tais como a papaína ou a bromelain. Esse tampão pode eventualmente conter agentes policatiônicos como o polibreno ou a polilisina, que permitem potencializar a reação e de manter por mais tempo os glóbulos em contato com os elementos de captura; - adicionar essa solução que contém os glóbulos vermelhos a ser fenotipados no centro da área reacional 16-1; - incubar, preferencialmente a uma temperatura compreendida entre 15 e 40°C, em particular entre 18°C e 25°C, por uma duração de 60 segundos a 15min, em particular durante 2min a 10 min; - depositar uma solução de enxágue sobre a área reacional; a qual solução de enxágue é uma solução conhecida por não ser prejudicial para as reações antígenos-anticorpo, mantendo a integridade dos glóbulos vermelhos e capaz de desfazer as interações não específicas como, por exemplo, um tampão constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH6 e pH8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH 7,8, em particular entre p H7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (em particular, Tween 20 de 0,01 a 0,05% m/v), agentes de saturação (por exemplo BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno-anticorpo. No caso de uso prévio de agente policatiônico, esse tampão deverá ser fortemente iônico, por exemplo, ele deverá conter mais de 100 mM de NaCI para poder desfazer as interações não específicas provocadas por esse tipo de aditivo.
[082] A amostra a ser depositada pode ser glóbulos vermelhos ou sangue total. A amostra pode ser diluída um tampão constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH6,5 e pH7,8, em particular entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (em particular, Tween 20 de 0,01 a 0,05% m/v), agentes de saturação (por exemplo BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno- anticorpo. Esse tampão pode eventualmente apresentar uma atividade proteásica por exemplo obtida pela adição de enzimas tais como a papaína ou a bromelain.
[083] A hidrofilização das áreas reacionais 16 da membrana 14 do dispositivo 10 utilizado para a realização desse processo é preferencialmente uma hidrofilização em superfície.
[084] A hidrofilização pode, por exemplo, ser realizada por meio de uma solução de Tween 20 no etanol a uma concentração compreendida entre 0,1%m/v e 1%m/v, preferencialmente 0,2%m/v e 1%m/v de volume compreendido entre 2μl e 40μl e preferencialmente entre 5μl e 20μl no centro da qual é criada uma área de hidrofilização na espessura realizada por meio de uma solução aquosa de Triton X100 de concentração compreendida entre 0,1%m/v e 2%m/v, preferencialmente 0,5%m/v e l%m/v de volume compreendido entre 25nl e 15μl e preferencialmente entre 100 nl e 10 μl.
[085] Se os glóbulos vermelhos presentes na amostra portarem o antígeno reconhecido pelo elemento de captura, os glóbulos vermelhos permanecem imobilizados no centro da área reacional 16 da membrana 14 apesar do enxágue e a área reacional central 16-1 permanece vermelha. Se os glóbulos vermelhos presentes na amostra não portarem o antígeno reconhecido pelo elemento de captura, os glóbulos vermelhos são expulsos pelo enxágue: a área central 16-1 permanece branca e um anel vermelho é formado na área periférica 16-2. Se a amostra contiver duas populações diferentes, são observados ao mesmo tempo um centro vermelho 22-1 e um anel periférico vermelho 22-2.
[086] A leitura dos resultados pode ser visual ou automática.
[087] De acordo com outro modo de realização particular, a presente invenção tem por objeto um processo de fenotipagem de grupos sanguíneos eritrocitários, a partir de uma amostra de glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos puros ou sangue total), que não permite a detecção de populações duplas, que compreende as seguintes etapas: - depositar uma solução para hidratar a membrana porosa 14 no centro da área reacional de um dispositivo 10 de acordo com a presente invenção, a qual área reacional 16 comporta uma única área hidrófila e que comporta agentes de captura que compreendem anticorpos; a solução para a hidratação da membrana é uma solução conhecida por ser propícia às reações imuno-hematológicos que contêm eventualmente aditivos como, por exemplo um tampão constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH 7,8, em particular entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (em particular, Tween 20 de 0,01 a 0,05%m/v), agentes de saturação (por exemplo BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno-anticorpo. Esse tampão pode eventualmente apresentar uma atividade proteásica, por exemplo obtida pela adição de enzimas tais como a papaína ou a bromelain. Esse tampão pode eventualmente conter agentes policatiônicos como o polibreno ou a polilisina, que permitem potencializar a reação e de manter por mais tempo os glóbulos vermelhos em contato com os elementos de captura; - eventualmente diluir os glóbulos vermelhos a ser fenotipados em uma solução tampão, ou seja, uma solução tampão conhecida por ser propícia às reações imuno-hematológicos que contêm eventualmente aditivos como, por exemplo, um tampão constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH7,8, em particular entre p H7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (em particular, Tween 20 de 0,01 a 0,05%m/v), agentes de saturação (por exemplo BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno-anticorpo. Esse tampão pode eventualmente apresentar uma atividade proteásica, por exemplo obtida pela adição de enzimas tais como a papaína ou a bromelain. Esse tampão pode eventualmente conter agentes policatiônicos como o polibreno ou a polilisina, que permitem potencializar a reação e de manter por mais tempo o glóbulos em contato com o elemento de captura; - adicionar essa solução que contém os glóbulos vermelhos a ser fenotipados no centro da área reacional, - incubar, preferencialmente a uma temperatura compreendida entre 15 e 40°C em particular entre 18°C e 25°C, por uma duração de 2 segundos a 15min e em particular durante 1min a 10 min. - depositar uma solução de enxágue sobre a área reacional a solução de enxágue que é uma solução conhecida por não ser prejudicial para as reações antígenos-anticorpo, mantendo a integridade dos glóbulos vermelhos e capaz de desfazer as interações não específicas, como por exemplo um tampão constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH 7,8, preferencialmente entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (em particular, Tween 20 de 0,01 a 0,05%m/v), agentes de saturação (por exemplo BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno-anticorpo. No caso de uso prévio de agente policatiônico, esse tampão deverá ser fortemente iônico, por exemplo, ele deverá conter mais de 100mM de NaCI para poder desfazer as interações não específicas provocadas por esse tipo de aditivo.
[088] A hidrofilização das áreas reacionais 16 da membrana 14 do dispositivo 10 utilizado para a realização desse processo pode ser uma hidrofilização na espessura. É preciso que o dispositivo 10 compreenda igualmente um sistema de absorção subjacente à membrana 14, por exemplo uma membrana absorvente 18.
[089] A hidrofilização pode ser realizada por meio de uma solução aquosa de Triton X100 de concentração compreendida entre 0,l%m/v e 2%m/v, preferencialmente 0,5%m/v e 1%w/v de volume compreendido entre 25nl e 15μl e preferencialmente entre 100nl e 10μl.
[090] Se os glóbulos vermelhos presentes na amostra portarem o antígeno reconhecido pelo elemento de captura, os glóbulos vermelhos permanecem imobilizados no centro 22 da área reacional 16 da membrana 14 apesar do enxágue e a área reacional 16 permanece vermelha. Se os glóbulos vermelhos presentes na amostra não portarem o antígeno reconhecido pelo elemento de captura, os glóbulos vermelhos são expulsos pelo enxágue e a área reacional 16 permanece branca. A membrana absorvente 18 absorve (área 24) tudo que não estiver fixado sobre a membrana 14.
[091] A leitura dos resultados pode ser visual ou automática.
[092] De acordo com uma segunda variante, o objetivo da presente invenção é o uso do dispositivo 10 para a detecção de anticorpos multivalentes no sangue ou prova de Simonin.
[093] O objetivo é procurar anticorpos específicos. O elemento de captura compreende, portanto, o antígeno contra o qual o anticorpo preferido é dirigido.
[094] Os antígenos imobilizados podem ser antígenos sintéticos acoplados ou não a um polímero ou a uma estrutura proteica. Pode se tratar também de proteínas recombinantes que contêm uma ou mais sequências do antígeno ou de uma mistura de antígeno de variantes preferidas. Os antígenos imobilizados podem estar também sobre células ou fragmentos de células. Em particular fragmentos membranares ou células esvaziadas de seu conteúdo citoplásmico. Essas células podem ser, em particular, glóbulos vermelhos esvaziados de seu citoplasma que são também denominadas “ghosts”.
[095] Se a amostra possuir anticorpos dirigidos contra a o antígeno em questão, estes permanecerão capturados na superfície da membrana 14 no nível da área reacional 16.
[096] É preciso usar um elemento de revelação para revelar a presença desses anticorpos, quer reconhecendo sua natureza de anticorpo (anti-IgG, anti-IgM), quer, se o anticorpo utilizado for multivalente (capaz de detectar vários antígenos simultaneamente), um elemento de revelação que porta também antígeno em questão pode ser utilizado. TABELA 2 EXEMPLOS REFERENTES À PESQUISA DE ANTICORPOS NO CAMPO DA IMUNO- HEMATOLOGIA
[097] Outro objetivo da presente invenção é, portanto, um processo de detecção dos anticorpos multivalentes presentes no sangue, a partir de uma amostra de plasma, de soro ou de sangue total, que compreende as seguintes etapas: - depositar a amostra ser testada sobre a área reacional 16 de um dispositivo 10, a qual área reacional comporta agentes de captura que compreendem antígenos, - adicionar hemácias testes de fenótipo conhecido, que comportam os mesmos antígenos que os agentes de captura, - deixar a mistura passar através da área hidrófila, a qual área hidrófila apresenta características que permitem um tempo de passagem compreendido entre 1 e 45 minutos, preferencialmente entre 3 e 15 minutos, - depositar uma solução de enxágue sobre a área reacional, como por exemplo um tampão constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH 7,8, em particular entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (em particular, Tween 20 de 0,01 a 0,05%m/v), agentes de saturação (por exemplo BSA).
[098] A amostra a ser depositada pode ser plasma, soro ou sangue total diluído ou não em um tampão constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH 7,8, em particular entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (por exemplo Tween 20 0,01 a 0,05%m/v), agentes de saturação (em particular, BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno-anticorpo. Esse tampão é preferencialmente de salinidade inferior a 100mM em NaCI.
[099] A hidrofilização das áreas reacionais 16 da membrana 14 do dispositivo 10 utilizado para a realização desse processo é preferencialmente realizada em espessura, É, portanto, preciso que o dispositivo 10 compreenda igualmente um sistema de absorção subjacente à membrana 14, por exemplo uma membrana absorvente 18.
[0100] A hidrofilização pode ser realizada por meio de uma solução aquosa de Triton X100 de concentração compreendida entre 0,3%m/v e 2%m/v, preferencialmente 0,5%m/v e 1%w/v de volume compreendido entre 25nl e 15μl e preferencialmente entre 100nl e 10μl. Os agentes de captura podem ser depositados sobre a membrana, misturados ao detergente, ou após hidrofilização das áreas reacionais 16.
[0101] Se o plasma testado contiver anticorpos dirigidos contra o antígeno presente no agente de captura e no agente de revelação (hemácias testes), um centro vermelho 22 aparece na área reacional 16. Um centro branco assinala a ausência no plasma testado anticorpos dirigidos contra o antígeno presente ao mesmo no agente de captura e no agente de revelação (hemácias testes). A membrana absorvente 18 absorve (área 24) tudo que não estiver fixado sobre a membrana 14.
[0102] A leitura dos resultados pode ser visual ou automática.
[0103] De acordo com uma terceira variante, um objeto da presente invenção é o uso do dispositivo 10 para a pesquisa de aglutinina irregular no sangue.
[0104] O objetivo é identificar a presença de hemácias sensibilizadas por anticorpos plasmáticos da amostra ou por uma ativação do complemento subsequente.
[0105] Nesse formato, ou não há um agente de captura, ou este é um agente de agregação como um polímero policatiônico.
[0106] Depois de ter incubado um painel de hemácias teste com o plasma, um agente capaz de agregar de forma reversível os glóbulos vermelhos é adicionado à mistura. Esse agente de agregação reversível pode ser escolhido entre os polímeros policatiônicos como por exemplo o polibreno, a polilisina ou a polietilenoimina. As hemácias ficam então retidas e formam um botão de glóbulos, pois o tamanho dos agregados formados é muito grande para permitir que eles atravessem a membrana. Os glóbulos são enxaguados do excesso de globulinas não específicas por meio de uma solução que contém também um agente de agregação a fim de evitar a desestabilização do botão. Depois de ter enxaguado esses glóbulos retidos, um reagente de Coombs multivalente é adicionado para realizar uma reticulação das células do botão se elas estiverem sensibilizadas. A adição de um tampão salino e que contém uma dose baixa de tensoativo permite romper os agregados de células não sensibilizadas e manter os agregados de células sensibilizadas reticuladas. TABELA 3 LISTA NÃO EXAUSTIVA DOS ANTICORPOS UTILIZÁVEIS NA PESQUISA DE AGLUTININAS IRREGULARES
[0107] Para a realização desses processos, a hidrofilização das áreas reacionais 16 da membrana 14 do dispositivo 10 utilizado para a realização desse processo é preferencialmente realizada em espessura. É, portanto, preciso que o dispositivo 10 compreenda igualmente um sistema de absorção subjacente à membrana 14, por exemplo uma membrana absorvente 18.
[0108] A hidrofilização pode ser realizada por meio de uma solução aquosa de Triton X100 de concentração compreendida entre 0,3%m/v e 2%m/v, preferencialmente 0,5%m/v e 1%w/v de volume compreendido entre 25nl e 15μl e preferencialmente entre 100nl e 10μl. Um agente de agregação reversível pode vantajosamente ser adicionado, escolhido preferencialmente entre os polímeros policatiônicos como, por exemplo, o polibreno, a polilisina ou a polietilenoimina.
[0109] De acordo com essa terceira variante, outro objeto da presente invenção é, portanto, um processo de detecção dos anticorpos anti- eritrocitários presentes no sangue, de validação cruzada ou de pesquisa de auto-anticorpos ou de aglutinina fria, a partir de uma amostra de plasma, de soro ou de sangue total, que compreende as seguintes etapas: - para a pesquisa de alo-anticorpos, incubar previamente a amostra ser testada com um tampão, hemácias testes de fenótipo conhecido e um agente capaz de agregar os glóbulos vermelhos a uma temperatura compreendida entre 15 e 40°C preferencialmente a 37°C aproximadamente, por uma duração compreendida entre 3 e 60 minutos, preferencialmente entre 5 e 30 minutos; o tampão é um tampão de baixa força iônica, tal como tampão LISS (por exemplo que contém menos de 50 mM de NaCI); para a pesquisa de autoanticorpos, usar simplesmente a amostra que contém as hemácias da amostra sem incubação prévia; adicionar a essa mistura um agente capaz de agregar os glóbulos, por exemplo uma solução de brometo de hexadimetrina; após um período preferencialmente compreendido entre 15 segundos e 5 minutos, depositar a mistura sobre a área reacional 16 de um dispositivo 10 de acordo com a presente invenção, e deixar fluir; um botão de células é formado acima do spot, - depositar uma solução que contém o agente capaz de agregar os glóbulos vermelhos sobre a área reacional, o agente capaz de agregar os glóbulos vermelhos pode ser, por exemplo, uma solução de brometo de hexadimetrina, preferencialmente com uma concentração de brometo de hexadimetrina na solução compreendida entre 0,01 e 2% (m/v), mais preferencialmente ainda entre 0,05 e 0,5%; esse agente permite realizar um enxágue das proteínas não específicas mantendo ao mesmo tempo a integridade do botão de células; - depositar um reagente de Coombs, de antiglobulina humana ou de anticomplemento sobre a área reacional, e - depositar uma solução de enxágue sobre a área reacional como por exemplo uma solução salina hipertônica de pH estabilizado entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH 7,8, preferencialmente entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 300mOsm e 800mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (por exemplo Tween 20 0,01 a 0,05%m/v) e um colorante de uma cor que contrasta com o vermelho (azul ou verde).
[0110] A amostra a ser depositada pode ser plasma, soro ou sangue total diluído ou não em um tampão constituído de uma solução de pH estabilizado entre pH 6 e pH 8,5, preferencialmente entre pH 6,5 e pH 7,8, em particular entre pH 7 a pH 7,5 e de osmolaridade compreendida entre 250mOsm e 800mOsm, preferencialmente entre 300mOsm e 600mOsm. Essa solução pode eventualmente conter detergentes em baixa concentração (por exemplo Tween 20 0,01 a 0,05%m/v), agentes de saturação (em particular, BSA) e/ou agentes capazes de potencializar as reações antígeno-anticorpo. Esse tampão é preferencialmente de salinidade inferior a 50mM em NaCI.
[0111] Se o plasma testado contiver anticorpos dirigidos contra o antígeno presente no agente de revelação (hemácias testes) ou se as hemácias da amostra já estiverem sensibilizadas in vivo, um centro vermelho 22 aparece na área reacional 16. Um centro branco assinala a ausência ou uma dose não detectável de anticorpos dirigidos contra a o antígeno presente no agente de revelação (hemácias testes). A membrana absorvente 18 absorve (área 24) tudo que não estiver fixado sobre a membrana 14.
[0112] A leitura dos resultados pode ser visual ou automática.
[0113] O dispositivo 10 de acordo com a presente invenção pode ser fornecido de acordo com uma faixa que agrupa sobre uma mesma carta os testes complementares apropriados(correspondentes) efetuados na maior parte das vezes simultaneamente pelos profissionais, e todos os testes são efetuados e interpretados de modo similar.
[0114] Em cada uma das cartas, diversos analitos dispostos em coluna para várias amostras (doadores ou pacientes) dispostas em linha podem ser detectados. Pode se tratar, por exemplo, de uma carta: - de grupagem sanguínea ABO-D, - de grupagem Rhesus-Kell, - de pesquisa de aglutinina irregular (3 fenótipos eritrocitários), - de identificação das aglutininas irregulares (10 fenótipos eritrocitários), - de fenotipagem estendida, - de controle direto com antiglobulina, - de prova de compatibilidade direta.
[0115] O dispositivo 10 de acordo com a presente invenção pode ser apresentado em um kit que compreende igualmente os reagentes necessários à realização de pelo menos um dos processos de utilização do referido dispositivo.
Claims (23)
1. DISPOSITIVO (10) DE DIAGNÓSTICO in vitro, para a detecção de pelo menos uma reação entre um antígeno de fenótipo eritrocitário e um anticorpo dirigido especificamente contra esse antígeno, a partir de uma amostra de sangue ou de um de seus componentes, caracterizado por compreender: um suporte (12), e uma membrana porosa hidrófoba (14) com uma espessura compreendida entre 0,05mm e 1,5mm e cujos poros têm um diâmetro compreendido entre 2 e 30 μm, a qual membrana compreende pelo menos uma área reacional hidrófila (16) destinada a receber a referida amostra, e a superfície da área reacional hidrófila (16) é inferior à superfície da membrana porosa hidrófoba (14).
2. DISPOSITIVO (10), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela área reacional hidrófila (16) da membrana porosa (14) ser tornada hidrófila com um detergente sem modificação das funções químicas do substrato poroso por um tratamento químico ou físico prévio da membrana porosa.
3. DISPOSITIVO (10), de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo detergente ser um tensoativo não iônico.
4. DISPOSITIVO (10), de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo detergente ser utilizado a uma dose compreendida entre 0,01 e 2% (peso/volume).
5. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela membrana porosa (14) ser disposta no suporte (12) e pelo suporte (12) comportar pelo menos uma abertura (20), e cada abertura (20) é perpendicular a cada área reacional hidrófila (16) da membrana porosa.
6. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo suporte (12) ser um suporte de plástico rígido.
7. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender ainda uma membrana absorvente (18) disposta sob a membrana porosa (14).
8. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela área reacional hidrófila (16) da membrana porosa (14) compreender ainda agentes de captura.
9. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelos agentes de captura compreenderem antígenos de grupo/fenótipo eritrocitário.
10. DISPOSITIVO (10), de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelos agentes de capturas serem hemácias desprovidas de hemoglobina.
11. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelos agentes de captura serem anticorpos.
12. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelos agentes de captura serem polímeros policatiônicos.
13. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pela área reacional (16) ser hidrófila em toda a espessura da membrana porosa.
14. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pela área reacional (16) ser hidrófila na superfície da referida área reacional.
15. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela área reacional (16) compreender duas áreas hidrófilas (16-1, 16-2) com um grau de hidrofilização maior no centro (16-1) da área reacional do que na periferia (16-2).
16. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela área reacional (16) compreender duas áreas hidrófilas com um grau de hidrofilização diferente, uma na superfície, a outra na espessura.
17. DISPOSITIVO (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 16, caracterizado pela área reacional (16) ser tornada hidrófila com dois detergentes diferentes sem modificação das funções químicas do substrato poroso por um tratamento químico ou físico prévio da membrana porosa.
18. PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE UM DISPOSITIVO (10), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por compreender as seguintes etapas: - hidrofilização de uma membrana porosa hidrófoba (14) com uma espessura compreendida entre 0,05mm e 1,5mm e cujos poros têm um diâmetro compreendido entre 2 e 30 μm, sobre pelo menos uma área (16) da referida membrana, por meio da adição de um detergente localmente; - depositar eventualmente uma solução de agente de captura; - secagem; e - junção da membrana porosa (14) e eventualmente de uma membrana absorvente (18) disposta sob a membrana porosa (14) com um suporte (12).
19. USO DE UM DISPOSITIVO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por ser para identificar e determinar grupos sanguíneos ABO, a fenotipagem estendida, a pesquisa de aglutinina irregular, a pesquisa de anticorpos, a pesquisa de antiglobulina fria e/ou a validação cruzada, partir de uma amostra de sangue ou de um de seus componentes.
20. PROCESSO DE FENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUÍNEOS ERITROCITÁRIOS, a partir de uma amostra de glóbulos vermelhos, para a detecção da presença de duas populações diferentes de antígenos, caracterizado por compreender as seguintes etapas: - depositar uma solução para hidratar a membrana porosa (14) no centro da área reacional de um dispositivo (10) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo que a referida área reacional (16) comporta duas áreas hidrófilas (16-1, 16-2) com um grau de hidrofilização maior no centro (16-1) da área reacional que na periferia (16-2), e comporta no centro agentes de captura que compreendem anticorpos; - diluir os glóbulos vermelhos que serão fenotipados em uma solução tampão; - adicionar essa solução que contém os glóbulos vermelhos que serão fenotipados no centro da área reacional; - incubar; e - depositar uma solução de enxágue sobre a área reacional.
21. PROCESSO DE FENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUÍNEOS ERITROCITÁRIOS, a partir de uma amostra de glóbulos vermelhos, caracterizado por compreender as seguintes etapas: - depositar uma solução para hidratar a membrana porosa (14) no nível da área reacional (16) de um dispositivo (10) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, a qual área reacional (16) comporta uma única área hidrófila e comporta agentes de captura que compreendem anticorpos; - diluir eventualmente os glóbulos vermelhos que serão fenotipados em uma solução tampão; - adicionar essa solução que contém os glóbulos vermelhos que serão fenotipados no centro da área reacional; - incubar; e - depositar uma solução de enxágue sobre a área reacional.
22. PROCESSO DE DETECÇÃO DE ANTICORPOS MULTIVALENTES presentes no sangue, a partir de uma amostra de plasma, de soro ou de sangue total, caracterizado por compreender as seguintes etapas: - depositar a amostra ser testada sobre a área reacional (16) de um dispositivo (10) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, a qual área reacional (16) comporta agentes de captura que compreendem antígenos; - adicionar hemácias testes de fenótipo conhecido, que comportam os mesmos antígenos que os agentes de captura; - deixar a mistura passar através da área hidrófila; e - depositar uma solução de enxágue sobre a área reacional.
23. PROCESSO DE DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTIERITROCITÁRIOS presentes no sangue, de validação cruzada ou de pesquisa de anticorpos ou de aglutinina fria, a partir de uma amostra de plasma, de soro ou de sangue total, caracterizado por compreender as seguintes etapas: - incubar a amostra a ser testada com um tampão e hemácias testes de fenótipo conhecido; - adicionar s essa mistura um agente capaz de agregar os glóbulos vermelhos, depositar a mistura sobre a área reacional (16) de um dispositivo (10) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; - depositar uma solução que contém um agente capaz de agregar os glóbulos vermelhos sobre a área reacional; - depositar um reagente de Coombs, de antiglobulina humana ou de anticomplemento sobre a área reacional; e depositar uma solução de enxágue sobre a área reacional.
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