ITAR940022A1 - Dispositivo e metodo per la raccolta e l'analisi di un campione di sangue - Google Patents

Description

TITOLO

Dispositivo e metodo per la raccolta e l'analisi di un campione di sangue.

RIASSUNTO

La presente invenzione riguarda un dispositivo ed un metodo per il dosaggio di analiti presenti in un campione di sangue. Il dispositivo è costituito da un supporto solido in cui è disposto un canale capillare che accoglie una quantità controllata di campione e io veicola al centro di uno strato di materiale adsorbente, che a causa delle proprie intrinseche caratteristiche o in seguito a trattamento chimico ha la capacità di drenare, distendere il campione e separare il plasma dal sangue. Tale strato è in intimo contatto con un elemento analitico costituito da una o più membrane che ricevono il plasma o una parte di esso. Le membrane contengono o supportano sostanze chimiche e reattivi utili alla determinazione degli analiti presenti nel campione ematico, tramite reazioni che forniscono sviluppo di colore o altre reazioni che vengono comunque rivelate all'esterno. Il dispositivo descritto nella presente invenzione trova la sua principale applicazione nel dosaggio di analiti contenuti in campioni di sangue intero ottenuti per digitopuntura.

STATO DELLA TECNICA

Nella maggior parte dei casi l'analisi di campioni ematici con sistemi chimici a secco supportati su membrane al fine di determinare la identità e la quantità di sostanze in essi presenti, quali ad esempio la concentrazione di glucosio e colesterolo, viene condotta tramite l'applicazione di una goccia di sangue, il cui volume non è noto e comunque varia fra applicazioni diverse, su una striscia reattiva. In quest’ultima sono presenti miscele di reattivi che danno luogo a reazioni con sviluppo di colore e permettono il riconoscimento di uno o più componenti sotto analisi. Le strisce sono generalmente costituite da un supporto di plastica che su una piccola parte della propria superfìcie presenta i reattivi inglobati in membrane porose e/o in polimeri inerti di varia natura, in gel o matrici organiche stratificate. I problemi relativi all'uso di simili sistemi di analisi sono molteplici. Spesso, ad esempio, l'operatore è costretto a rimuovere la parte del campione che contiene gli eritrociti rimasti addensati tramite una pulizia manuale dello strato reattivo o un brusco scuotimento della striscia stessa. Queste procedure possono facilmente condurre ad un danneggiamento del dispositivo, a contaminazione dello strumento di rivelazione della reazione, ad inquinamento reciproco di campioni diversi tra loro e soprattutto causare l'infezione dello stesso operatore.

Molti di questi dispositivi, utilizzati per analisi rapide decentrate, che possono essere effettuate anche dal paziente stesso, si basano sulla applicazione di una goccia di sangue direttamente sulla membrana che possiede tutti o alcuni dei reagenti. Qualora gli utilizzatori siano persone con difficoltà di visione, inferme o molto giovani, l'applicazione può avvenire in una posizione non corretta rispetto a quella ottimale richiesta dal fabbricante per effettuare il test; altre volte il campione può essere in quantità insufficiente e dare così luogo ad una parziale bagnatura delle membrane reattive ed a uno sviluppo parziale di colore. Ambedue questi inconvenienti conducono a risultati errati nella valutazione dell'analita. Per una corretta esecuzione dell'analisi e l'ottenimento di dati affidabili diventa di fondamentale importanza, nell'utilizzo di simili dispositivi, deporre una quantità considerevole e riproducibile di campione (una o più gocce di sangue) che non è sempre facile ottenere tramite la digitopuntura.

Per il dosaggio di un analita in un campione di sangue intero, è importante, nella maggior parte dei casi, allontanare i globuli rossi in modo tale che il colore che eventualmente si sviluppa nel corso della reazione di determinazione non risulti coperto dal colore del sangue e dell'emoglobina Bisogna inoltre considerare che nella determinazione di alcuni analiti, i livelli di questi presenti all'interno degli eritrociti ne compromettono il dosaggio nel plasma in presenza di lisi anche parziale. Questo problema, nei sistemi di analisi che fanno uso di membrane e chimica a secco, è stato affrontato in vari modi. Si potrebbe pensare che i globuli rossi possano essere separati in base alle loro dimensioni dato che sono abbastanza larghi (8 micrometri di diametro) e che quindi un filtro con pori di misura inferiore possa consentire di ottenete il plasma dal sangue. Applicando una goccia di campione su membrane secche con pori di dimensioni inferiori a 10 micrometri, il sangue viene assorbito così rapidamente che le cellule, sottoposte ad un'alta pressione idrodinamica, si rompono, e il contenuto, in particolare l'emoglobina, si riversa all1 esterno. Il plasma di conseguenza si colora di rosso compromettendo il dosaggio. Inoltre i frammenti cellulari finiscono per ostruire i pori della membrana, impedendo al campione o a parte di esso il passaggio. In conseguenza di ciò gli analiti più grandi dal punto di vista molecolare, ad esempio le lipoproteine, non riescono a raggiungere completamente i reattivi. Le membrane con pori di diametro inferiore a 3 micrometri se sono bagnate o umide tendono a comportarsi diversamente ed in genere evitano la lisi dei globuli rossi contenuti nel campione. Tuttavia in questo caso si hanno altri inconvenienti. Il loro uso prevede necessariamente un passaggio precedente all'applicazione del campione in cui l'utilizzatore bagna in qualche modo la membrana La presenza di liquido sulla membrana diluisce il campione utilizzabile per l'analisi e, poiché in alcune circostanze esso è già di volume estremamente ridotto, la sensibilità e l'accuratezza del test possono diminuire in modo inaccettabile. Inoltre gli analiti in una membrana bagnata non migrano col rapido avanzare di un fronte liquido ma diffondono lentamente nel suo spessore allungando così in modo considerevole il tempo di risposta del test diagnostico.

Un'altra soluzione è stata individuata nell'uso di sostanze osmoticamente attive (crenating agents) (più spesso NaCl) che seccate sulla membrana microporosa sono rapidamente solubili nel campione ematico rendendolo ipertonico. I globuli rossi diventano cosi sferici, compatti e comunque capaci di resistere ad elevate pressioni idrodinamiche. Alte concentrazioni di questi agenti, se da una parte riescono a evitare la lisi delle cellule ematiche, dall'altra spesso influiscono negativamente sulla solubilità delle altre sostanze, reattivi ed analiti, implicate nella determinazione. Esse possono, ad esempio, ridurre drasticamente l'attività di alcuni enzimi, e appaiono quindi di uso estremamente limitato. Inoltre, per l'effetto osmotico che causano, queste sostanze diluiscono il plasma e possono così ridurre in modo incontrollato la concentrazione piasmatica di alcuni analiti.

Per il dosaggio di glucosio con chimica a secco è stato adottato un sistema che evita la lisi dei globuli rossi imbevendo membrane polisulfoniche, oltre che con i reattivi necessari alla determinazione, con polimeri organici e gelatine. Dopo essiccazione queste sostanze chiudono i pori della membrana. Il campione, al suo arrivo, scioglie lentamente tali sostanze e si ottiene, come effetto finale, una considerevole riduzione della pressione a cui le cellule sono sottoposte con una pressoché totale eliminazione della lisi. Tuttavia l'uso di tali polimeri nella preparazione delle membrane è estremamente critico e questo riduce la possibilità pratica di utilizzare simili sistemi per la determinazione di altri analiti.

La difficoltà degli analiti caratterizzati da un ingombro molecolare più elevato a penetrare attraverso pori delle membrane per la loro determinazione è generalmente comune a tutti i metodi e i trattamenti finora descritti.

Le soluzioni tecniche che prevedono l'uso di filtri di considerevole spessore in aggiunta alle membrane reattive per la separazione del campione si sono anch'esse rivelate problematiche. Questi sono infatti di difficile collocamento in un dispositivo e hanno un’alta capacità di assorbimento che richiede volumi eccessivi di campione, senza evitare completamente i problemi di lisi e di otturazione dei pori. Una parziale eccezione può essere considerato l'uso di un filtro spesso di lana di vetro (U.S. 4.477.575). Anch'esso tuttavia, pur essendo in molti casi attivo nell'evitare la lisi, richiede raggiunta di quantità di campione eccessive ed obbligatoriamente misurate, e mostra la sua efficacia soprattutto nella separazione del plasma dai globuli rossi mediante migrazione laterale, fatto che costringe all'uso di sistemi analitici spesso di struttura molto complessa. La presente invenzione risolve in parte o completamente i problemi sopra esposti.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

L'invenzione mette a disposizione degli utilizzatori un dispositivo e un metodo per misurare la concentrazione o l'attività di un analita in un campione di sangue intero. Il dispositivo è composto da un supporto solido in cui sono collocati un capillare ed una camera che alloggia uno strato di materiale adsorbente ed un elemento analitico. Il campione di sangue viene applicato sulla punta estrema del supporto solido da cui parte il canale capillare. Il capillare è costituito integralmente dal supporto stesso o altrimenti applicato su di esso. Il capillare, preferibilmente, mostra il proprio volume interno all'utilizzatore ed a questo fine può mancare della sua parete superiore cioè apparire sezionato orizzontalmente o altrimenti essere costituito da materiale trasparente. Il capillare possiede un suo proprio volume interno e, riempiendosi, permette il campionamento di una quantità esatta di sangue. Uno strato macroporoso di materiale adsorbente, situato all'estremo opposto a quello di campionamento, drena poi il campione, sottraendolo all'azione del capillare, lo distribuisce uniformemente, separa gli eritrociti e trasmette il plasma ad un elemento analitico sottostante. Lo strato adsorbente per le proprie caratteristiche chimico fisiche o per le proprietà che può acquistare mediante trattamento con sostanze chimiche di varia natura, per esempio anticorpi specifici, esercita, nonostante il suo spessore estremamente contenuto, una efficace azione di separazione della componente cellulare del campione. In casi particolari, se necessario, questo strato può anche contribuire alla eliminazione selettiva di sostanze o di finzioni di un analita che non si desidera sottoporre a dosaggio. L'elemento analitico è costituito da membrane microporose che contengono un sistema chimico di rivelazione. Questo si basa in genere su un metodo colorimetrico in cui l'analita o il prodotto della sua conversione reagiscono con un cromogeno generando un colore la cui intensità è proporzionale alla concentrazione o all'attività dell'analita stesso.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

La forma preferita del dispositivo dell'invenzione è rappresentata nei disegni.

La Figura 1 è una visione prospettica del dispositivo in cui sono raffigurati il supporto rigido (I), il canale capillare (3) e l'estremità del supporto (2) che serve ad effettuare il prelievo.

La Figura 2 è una sezione assiale del dispositivo in cui è ben raffigurato il supporto (1), il canale capillare (3), il punto di prelievo (2) e la camera (4) contenente lo strato adsorbente (5) e le membrane dell'elemento analitico (6).

La Figura 3 mostra una seconda configurazione preferita del dispositivo in cui il capillare (3) è un condotto integro nella sua lunghezza; la Figura 4 mostra la sezione assiale in cui è evidenziata la conformazione del condotto capillare (3).

Nella Figura 5 e 6 il dispositivo assume una terza configurazione preferita in cui il condotto capillare (3) è disposto verticalmente rispetto alla camera (4).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

La presente invenzione costituisce un dispositivo e un metodo che permette la raccolta di un campione di sangue intero, e il dosaggio di uno o più componenti dello stesso. Il dispositivo è composto dai seguenti elementi:

a. un supporto rigido ( 1 in Figura 1, 2, 3, 4, 5 e 6 );

b. un capillare adatto a ricevere il campione ( 3 in Figura 1, 2, 3, 4, 5 e 6 );

c. una camera nella cui volta superiore confluisce il suddetto capillare ( 4 in Figura 1 , 2, 3, 4, 5 e 6 ); d. uno strato macroporoso di materiale adsorbente adatto a ricevere il campione dal capillare (S in Figura 2, 4 e 6). Tale materiale per le proprie caratteristiche chimico fisiche distribuisce il campione, separa gli eritrociti e trasmette il plasma alla superficie opposta a quella di accoglienza;

e. un elemento analitico (6 in Figura 2, 4, e 6) costituito da uno o più strati di membrane reattive in intimo contatto con il precedente materiale e fra di loro, che permette la determinazione di analiti contenuti nel campione, preferibilmente con la formazione di composti rivelabili per via reflettometrica. Qualora l'elemento analitico sia costituito da due o più membrane, esse si trovano in contiguità spaziale tale che non si interrompa il flusso del liquido dall'una all'altra e sono disposte all’ interno della camera

Il supporto rigido (1 in Figura 1, 2, 3, 4, 5 e 6) è costituito da un pezzo unitario di materia plastica (sia essa polistirene, policarbonato, polipropilene, metacrilato, nylon, ecc.), metallo o vetro, nel quale sono ricavati il capillare e la camera di accoglienza. Preferibilmente il supporto possiede una lunghezza compresa tra 1 e 2,5 cm, larghezza tra 0,5 e 1,5 cm, e uno spessore tra 1 e 3 mm. La forma è preferenzialmente quella osservabile nella Figura 1, 2, 3, 4, 5 e 6 e mostra in particolare una parte appuntita in cui si affaccia l'estremità del capillare utilizzata per il prelievo del campione (2 in Figura 1, 2, 3, 4, 5 e 6 ). La forma e le dimensioni sono comunque molto variabili e dipendono anche dalla configurazione dello strumento di misura che è accoppiato all'uso del suddetto supporto. Il supporto può essere trattato con sostanze idrofile o idrofobe per favorire oppure inibire la bagnabilità della sua superficie.

Il capillare (3 in Figura 1, 2, 3, 4, 5 e 6), preferibilmente integrale al suddetto supporto, può essere di varia forma, di materiali diversi e variare le proprie dimensioni in ragione: a) del volume di sangue che si vuole raccogliere (può infatti contenere un volume di campione da pochi microlitri fino a qualche decina di microlitri); b) della velocità/forza con cui si vuole veicolare il campione: il capillare può essere più sottile o mostrare pareti molto ravvicinate se si vuole ottenere un prelievo rapido ed un più lento svuotamento dello stesso; può essere invece più largo per favorire un prelievo più lento e un facile svuotamento. La sezione trasversale del capillare può avere una geometria estremamente varia: circolare, triangolare, rettangolare, poligonale, o composizioni delle precedenti configurazioni. Il volume interno del capillare è pressoché pari al volume del prelievo di sangue che si vuole effettuare. La quantità di campione necessaria per l'uso del dispositivo oggetto della presente invenzione di preferenza varia tra 5 e 30 microlitri. Questa variazione è legata allo spessore dello strato di materiale adsorbente, al numero e allo spessore delle membrane utilizzate nell'elemento analitico e alla geometria che si sceglie per l'intero sistema £' inoltre opportuno che sostanze anticoagulanti siano presenti allo stato essiccato sulla superfìcie interna del capillare per evitare inconvenienti nel flusso legati alla indesiderata coagulazione del campione.

L'utilizzatore, nel corso del prelievo, può osservare il capillare per tutta la sua estensione e accorgersi del compimento del prelievo. Per facilitare questa operazione il capillare può essere un condotto capillare (3 in Figura 3, 4, 5 e 6) costituito in preferenza da materiale trasparente o, altrimenti, può essere un canale capillare (3 in Figura 1 e 2), cioè privo di una parte della parete rivolta verso l'utilizzatore che così ne osserva il volume interno ed il compiersi del suo riempimento. In quest'ultimo caso il capillare (3 in Figura 1 e 2) sul supporto è costituito da una sezione longitudinale di sé, ed appare come un canale aperto nella sua parte superiore. Da ora in poi è usato indifferentemente nella descrizione della presente invenzione il termine capillare, condotto capillare o canale capillare.

Il supporto espone l'estremità aperta del capillare (2 in Figura 1, 2, 3, 4, 5 e 6) in modo tale che l'utilizzatore possa facilmente effettuare il prelievo ematico dal dito ponendo la goccia di sangue in contatto con l'apertura del capillare e permettendone il riempimento. L'utilizzatore può visivamente seguire questo processo, o altrimenti essere avvertito del compiuto riempimento da un dispositivo presente nello strumento di lettura Solo ora il dito viene allontanato in modo da interrompere il contatto tra la goccia di sangue e la punta del canale capillare.

Il canale capillare serve inoltre a trasferire il campione all'interno della camera (4) che si trova nel corpo del supporto (1). II capillare é preferenzialmente disposto pressoché orizzontalmente sul supporto e stampato integralmente nel supporto stesso. La estremità opposta a quella che per prima giunge in contatto con il campione termina all' interno della camera, che nel corpo del supporto alloggia le membrane reattive. Il capillare che, grazie alla sua conformazione, ha caricato il campione, può a sua volta donarlo ad altri mezzi, preferenzialmente strati di materiale macroporoso e/o membrane porose, che esercitano un effetto drenante pari o superiore al suo. L'estremità che giunge all'interno della camera è necessariamente in contatto con i suddetti materiali.

La camera (4 in Figura 1, 2, 3, 4, 5 e 6) può essere di varia grandezza e forma. Essa si costituisce nel processo di stampaggio o di fabbricazione del supporto ed è preferenzialmente cilindrica. Il suo asse centrale è coincidente con il centro dell'estremità del canale capillare che giunge al suo interno nella sua volta o parete superiore. Il capillare può essere disposto sullo stesso piano o su un pi

alto rispetto a quello della volta della camera (Figura 1 e 2), oppure entrare nella camera con angoli diversi, anche perpendicolarmente (Figura 5 e 6 ). La camera è aperta nella sua feccia inferiore in modo da ricevere e alloggiare lo strato adsorbente e le membrane, e mostrare la superficie inferiore dell' ultima di esse ad un osservatore esterno ed in particolare a un sistema di rivelazione. La camera riceve il campione di sangue dall'estremità del capillare che giunge nella sua volta. Le pareti laterali della camera offrono il sostegno atto a mantenere le membrane nella loro giusta posizione. Lo strato di materiale adsorbente e le membrane sono preferibilmente inserite nella camera con un sistema meccanico ad incastro; altrimenti esse possono essere bloccate da un anello rigido che si incastra nelle pareti laterali della camera, oppure saldate, oppure incollate.

La forma e le dimensioni preferite della camera (4) sono mostrate nelle figure 2, 4 e 6; tipicamente essa misura da 0,4 a 0,8 centimetri di diametro ed la sua altezza varia da 0,3 a 1,5 millimetri.

Lo strato macroporoso di materiale adsorbente ( 5 in Figura 2, 4 e 6 ) è posto all'interno della camera in intimo contatto con estremità del capillare. In ragione del numero e della dimensione dei pori che lo costituiscono, questo materiale esercita una maggiore o minore forza drenante sul campione che dal capillare passa al suo interno. Esso presenta caratteristiche chimico-fìsiche del tutto particolari. Qualora si faccia infatti passare attraverso di questo un campione di sangue si ottiene la separazione per adsorbimento degli elementi figurati dal plasma. Ponendo in intimo contato con la superfìcie inferiore del materiale adsorbente, che lascia passare il plasma, altre membrane reattive che lo accolgono, è possibile determinare alcuni analiti in esso contenuti. Il setto poroso di materiale adsorbente assicura dunque il verificarsi di importanti finizioni: lo svuotamento del capillare ad opera delle proprietà drenanti che derivano dalla sua conformazione macroporosa; la separazione della componente cellulare del sangue dal plasma; la capacità di spandere il campione in modo uniforme sulla sua superfìcie; la possibilità di accogliere al suo interno sostanze chimiche e reattivi. Quest’ultima possibilità risulta particolarmente utile qualora si vogliano modificare le sue proprietà adsorbenti e/o pretrattare in qualche modo il campione. E ad esempio possibile, mediante l'aggiunta di tensioattivi, inibire la separazione del plasma dagli elementi cellulari fino a giungere alla lisi degli stessi. Altrimenti, qualora si renda necessario, il suddetto materiale può permettere di evitare ogni ulteriore preparazione del campione, come nel caso di determinazioni di analiti che normalmente prevedono uno stadio preliminare di eliminazione delle sostanze interferenti. Per esempio, se tale separazione viene effettuata tramite una reazione di precipitazione, una sostanza precipitante può essere inclusa nello strato macroporoso di materiale adsorbente così che il plasma che raggiunge le membrane sottostanti risulta libero da interferenti. Questo sistema di precipitazione può essere utilizzato ad esempio nel dosaggio del colesterolo HDL. Normalmente la determinazione di questo analita richiede la preventiva precipitazione del colesterolo legato alle proteine a bassa e molto bassa densità tramite l'uso di reattivi come il tungstato di magnesio, il destrano-solfato o il polietilene glicole. Con l'uso del sistema descritto dalla presente invenzione è possibile applicare sangue non precedentemente trattato e ottenere la precipitazione degli interferenti ponendo il reattivo precipitante nello strato poroso di materiale adsorbente.

Lo strato macroporoso separa per adsorbimento il plasma dagli eritrociti. Questo compito può essere svolto utilizzando un principio chimico. In questo caso il risultato sarà raggiunto sfruttando il legame che si stabilisce tra due elementi che costituiscono una coppia di affinità. Uno di essi è naturalmente presente sulla superficie esterna della membrana eritrocitaria, l'altro viene introdotto a tale scopo nello strato adsorbente. Si possono ad esempio utilizzare emoagglutinine, per esempio miscele di lectine, che riconoscendo la porzione glicidica delle proteine di membrana, con buona efficienza provocano l'agglutinazione degli eritrociti. In alternativa possono essere utilizzati anticorpi rivolti in generale contro antigeni di superficie presenti sulla membrana eritrocitaria, ed in particolare contro la glicoforina e la banda tre del canale degli anioni. Lo strato macroporoso deve essere in questo caso capace di legare proteine, lectine ed anticorpi, ed è quindi costituito preferenzialmente da fibre di poliammide, polipropilene, polietilene, poliestere, cellulosa e derivati della cellulosa. E' spesso sufficiente trattare questi materiali con soluzioni acquose delle suddette sostanze e, dopo essiccazione, è possibile ottenere una efficace emoagglutinazione degli eritrociti. Uno dei materiali preferenzialmente utilizzati a questo scopo è uno strato macroporoso di poliestere fibroso, per esempio il prodotto denominato Leucosorb della Pali Co.

Altrimenti l'adsorbimento degli eritrociti può avvenire grazie alle interazioni deboli che si instaurano tra particolari gruppi chimici e le cellule. Questo fenomeno può essere definito adsorbimento fisico. Particolarmente adatti a svolgere una interazione di questo tipo sono i stianoli presenti in una matrice macroporosa di fibre di silice (SiOj) pura. In particolare lo strato adsorbente utilizzato nella presente invenzione è preferibilmente costituito da Tissuquartz (Pali Europe Ltd., Portsmouth England) di spessore compreso tra SO e 800 micrometri. Il Tissuquartz possiede la proprietà di separare i globuli rossi dal sangue rapidamente in direzione del proprio spessore utilizzando una quantità estremamente ridotta di sangue. L'adozione di materiali fibrosi, che adsorbono gli eritrociti direttamente, come il Tissuquartz, o che diventano capaci di farlo dopo trattamento con anticorpi o lectine, come il Leucosorb, è un elemento essenziale e caratterizzante il metodo e il dispositivo che sono oggetto della presente invenzione.

L'elemento analitico (6 in Figura 2, 4, e 6) è costituito dalla/e membrana/e microporose disposte sotto lo strato di materiale adsorbente che vengono utilizzate per la determinazione dell’analita presente nel campione. Esse preferenzialmente hanno una forma circolare che permette loro di disporsi facilmente all'interno della camera Tipicamente le membrane sono costituite da fogli ottenuti da polimeri naturali o sintetici con pori aperti alla superfìcie. I pori consentono l'entrata del campione liquido che si distribuisce all'interno della membrana attraversandola. Nel suo passaggio il campione incontra i reattivi necessari alla determinazione dell'analita in esso contenuto. I pori della membrana posseggono una misura compresa tra 0,04 e 10 micrometri, preferibilmente tra 0,5 e 8 micrometri. La membrana può essere costituita da vari tipi di polimeri, per esempio cellulosa, nitrocellulosa ed altri derivati della cellulosa, poliammide, polimeri di polivinilidene, polisulfone, polialchilene, poliacrilati e polimetacrilati, politetrafluoroetileni e simili. I suddetti polimeri possono da soli costituire un foglio o essere stratificati su un supporto, in genere un tessuto di nylon, che ne aumenti la resistenza meccanica. In generale è fondamentale che le suddette membrane presentino pori che permettono loro di accogliere il campione liquido in modo che quest'ultimo possa essere soggetto all'azione dei reattivi in precedenza essiccati nelle stesse. Tipicamente le membrane hanno uno spessore che varia tra 50 e 500 micrometri, preferibilmente tra 100 e 200 micrometri.

Γ reattivi necessari al dosaggio sono applicati alle membrane bagnando le stesse in una soluzione che li contiene. Essi penetrano all'intemo dei pori e poi tramite evaporazione del solvente rimangono inglobati ed essiccati nella membrana. All'arrivo del campione liquido i reattivi tornano rapidamente in soluzione nel mezzo proprio del campione. E' di particolare importanza che l'interazione tra il campione fluido e i reattivi essiccati sulla membrana, per esempio un enzima, avvenga con estrema facilità in modo che si liberi rapidamente il prodotto della reazione, per esempio perossido di idrogeno, che reagisce con un altro componente, per esempio o-tolidina, per generare un colore che viene osservato sulla faccia della membrana esposta verso l'esterno. Il dispositivo e metodo della presente invenzione è applicabile preferibilmente a dosaggi di campioni ematici sui quali si vuole determinare la concentrazione di glucosio, colesterolo, urea e di altri analiti. E’ inoltre possibile sfruttare la presente invenzione per il dosaggio di enzimi, antigeni, anticorpi, o altre proteine specifiche. Il suo uso è comunque estendibile alla determinazione di analiti i più vari, a campioni di natura diversa quali gli altri tipi di liquidi biologici (per esempio urina) o altri campioni liquidi di origine naturale o manifatturiera.

ESEMPI

Gli esempi seguenti confermano l'efficacia della presente invenzione:

1) Un dispositivo, come quello mostrato in Figura 1, 2, 3, 4, 5 e 6, è costruito in modo che il supporto possiede un canale capillare del volume interno di circa 10 microlitri, di sezione rettangolare. Il materiale utilizzato è plastica, per esempio polistirene. L'estremità del capillare che entra nella camera è in intimo contatto con il centro di un disco di Tissuquartz del diametro di 4,9 mm e dello spessore di 0,4 mm. Tale disco è inserito per primo nella camera del supporto. In contatto con esso è posto l'elemento analitico rivolto alla determinazione della concentrazione di glucosio ematico e costituito da una membrana, anch'essa in forma di disco, preferenzialmente di nylon, per esempio Biodyne B 045 ( Pali Co.), in precedenza trattata con i seguenti reagenti:

a. Bagno del colorante

o-tolidina.HCl 200 mg

etanolo 7 ml

acqua 3 ml

La soluzione viene agitata fino a completa scioglimento della tolidina. Quindi la membrana viene bagnata con detta soluzione, eliminando l'eccesso di liquido e infine asciugata in ventilazione forzata.

b. Bagno enzimatico

mutarotasi 200 U

glucosio ossidasi 1000 U

perossidasi da rafano 100 U

tampone fosfato pH 6,8 5 ml

La membrana viene bagnata e l'eccesso di reattivo viene rimosso con cura. Quindi la membrana viene asciugata in ventilazione forzata. Il Tissuquartz e la membrana che costituisce il sistema di rivelazione sono introdotte meccanicamente nella camera interna del supporto.

II sangue viene prelevato toccando la goccia che si forma sul dito dopo la digito puntura con l'estremità esterna del canale capillare. Questo si riempie veicolando una quantità determinata di sangue all' interno della camera e depositandolo sulla superficie del Tissuquartz. Il campione, attraversando lo strato macroporoso di Tissuquartz, si separa in frazione cellulare che rimane all'interno e plasma che viene trasmesso all'elemento analitico. In questa membrana il glucosio reagisce con sviluppo di colore. L'intensità del colore prodotto sulla superficie esterna dell'elemento analitico viene quindi determinata mediante l'impiego di un reflettometro operante nella regione del visibile, tra 600 e 640 nm, o nella regione dell' infrarosso, tra 900 e 960 nm.

2) Tutto come nell'esempio 1, eccetto che l'elemento analitico è rivolto alla determinazione della concentrazione ematica di urea. La membrana è dunque trattata con la seguente soluzione:

etanolo 5 ml

acqua 5 ml

ureasi 1,7 KU

rosso fenolo 10 mg

Triton XI 00 0,2 ml

glicerolo 0,5 ml

Dopo il trattamento la membrana è lasciata asciugare in ventilazione forzata, ed un pezzo di essa è disposto sotto il materiale adsorbente all'interno della camera. All'arrivo del plasma contenente l'urea si produce nell’elemento analitico un incremento di colore proporzionale alla concentrazione di ammoniaca che si sviluppa in seguito alla idrolisi dell’urea.

3) Tutto come nell'esempio 1 eccetto che l'elemento analitico è rivolto alla determinazione della concentrazione ematica di colesterolo. La membrana che costituisce l'elemento analitico è posta sotto Io strato di materiale adsorbente, possiede pori di 1-8 micrometri di diametro ed è trattata con la seguente soluzione :

colesterolo esterasi 300 U/ml

tampone MES pH 6,5 100 mM

colesterolo ossidasi 150 U/ml

eparìna (0,1%) 50 μl/ml

perossidasi 500 U/ml

dopo essiccazione la membrana viene nuovamente bagnata con una soluzione satura di tetrametilbenzidina in 50% acetonitrìle. Dopo l’applicazione del campione, intensità del colore che si sviluppa sulla superficie esterna dell’elemento analitico è proporzionale alla concentrazione ematica di colesterolo.

Bisogna qui sottolineare che le specifiche fornite e gli esempi riportati sono utilizzati a scopo dimostrativo e non costituiscono una limitazione della presente invenzione.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un dispositivo per ottenere plasma da sangue intero e dosare gli analiti in esso contenuti, che comprende: a) un supporto rigido di materia plastica, in cui è ricavato b) un capillare di volume interno compreso tra 5 e 30 microlitrì, che serve a prelevare il campione da una goccia di sangue ottenuta per digitopuntura II capillare permette il prelievo di una quantità riproducibile di sangue e il trasferimento di questo all' interno di c) una camera che contiene d) uno strato macroporoso di materiale adsorbente che, drena il sangue sottraendolo al capillare, adsorbe gli eritrociti e produce plasma. Il plasma è accolto da e) un elemento analitico costituito da membrane trattate con reattivi adatti al dosaggio per via reflettometrica degli analiti contenuti nel campione.
2. 2. Un dispositivo come quello descrìtto nella rivendicazione 1, ma nel quale il capillare è privo di parte della parete rivolta verso l'utilizzatore che ne può osservare il volume interno, e appare quindi come un canale.
3. 3. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 1, ma nel quale il capillare è un condotto ricavato nel supporto e l’utilizzatore può osservarne il volume interno grazie alla trasparenza del materiale che costituisce i supporto stesso.
4. 4. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 1, ma nel quale il capillare è disposto su un piano parallelo e molto prossimo a quello che passa per la volta della camera che accoglie lo strato adsorbente e l'elemento analitico.
5. 5. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 1, ma nel quale il capillare è disposto su un piano perpendicolare a quello che passa per la volta della camera che accoglie lo strato adsorbente e l'elemento analitico.
6. 6. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 2, ma con il capillare disposto come nelle rivendicazioni 4 e 5.
7. 7. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 3, ma con il capillare disposto come nelle rivendicazioni 4 e 5.
8. 8. Un dispositivo come quello descritto nelle rivendicazioni 6 e 7, ma nel quale lo strato macroporoso di materiale adsorbente separa dal campione di sangue intero gli eritrociti per adsorbimento fisico e produce plasma utilizzabile dall'elemento analitico.
9. 9. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 8, ma nel quale lo strato macroporoso di materiale adsorbente è costituito da silice pura fibrosa, ed in particolare da uno strato di spessore compreso tra 0,1 e 0,8 mm di Tissuquartz (Pali, Co.).
10. 10. Un dispositivo come quello descritto nelle rivendicazioni 6 e 7, ma nel quale lo strato macroporoso di materiale adsorbente separa dal campione di sangue intero gli eritrociti per adsorbimento chimico e produce plasma utilizzabile dall'elemento analitico.
11. 11. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 10, ma nel quale lo strato macroporoso di materiale adsorbente è costituito da polimeri organici fibrosi di poliammide, polietilene, polipropilene, poliestere, cellulosa e derivati della cellulosa trattati con una miscela di lectine al fine di adsorbire chimicamente gli eritrociti e produrre plasma.
12. 12 Un dispositivo come quello descritto nelle rivendicazioni 11, in cui lo strato macroporoso di materiale adsorbente è costituito da Leucosorb (Pall Co).
13. 13. Un dispositivo come quello descritto nelle rivendicazioni 10, ma nel quale lo strato macroporoso di materiale adsorbente è costituito da polimeri organici fibrosi di poliammide, polietilene, polipropilene, cellulosa e derivati della cellulosa trattati con anticorpi contro le proteine maggiormente rappresentate sulla superficie esterna della membrana itegli eritrociti al fine di adsorbirli chimicamente e produrre plasma.
14. 14. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 9, in cui il dosaggio del glucosio ematico utilizza mutarotasi, glucosio ossidasi, perossidasi e tolidina.
15. 15 Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 14, in cui il cromogeno formato dalla ossidazione della tolidina viene rivelato mediante reflettometria utilizzando radiazioni elettromagnetiche nella regione infrarossa, in particolare tra 900 e 960 nm.