ES2241911T3 - Dispositivo y procedimiento de ensayo para lipoproteinas de alta densidad. - Google Patents

Dispositivo y procedimiento de ensayo para lipoproteinas de alta densidad.

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Abstract

Dispositivo de ensayo (14) para medir el colesterol en suero asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que contiene también lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), comprendiendo dicho dispositivo a. una matriz de distribución de muestras (26) para distribuir la muestra de fluido sanguíneo en dicho dispositivo de ensayo (14); y b. un soporte de reactivos (74) que contiene un reactivo que resulta efectivo para eliminar, de forma selectiva, las lipoproteínas no de HDL de la muestra de fluido sanguíneo; y c. un elemento de ensayo de HDL (64) en el que se puede ensayar la concentración de HDL, en contacto directo con dicho soporte de reactivos (74); caracterizado porque d. dicho soporte de reactivos (74) está separado de dicha matriz de distribución de muestras (26) y puede ponerse en contacto fluídico con dicha matriz de distribución de muestras (26).

Description

Dispositivo y procedimiento de ensayo para lipoproteínas de alta densidad.
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la concentración de colesterol asociado con la lipoproteína (HDL) de alta densidad en una muestra de fluido sanguíneo y un dispositivo de ensayo de diagnóstico para realizar el procedimiento.
2. Antecedentes de la invención
La cantidad de colesterol presente en la sangre se conoce que está relacionada con el riesgo de arteriopatía coronaria. El colesterol circula en la sangre predominantemente en una forma ligada con la proteína. Las proteínas que transportan colesterol son las lipoproteínas, que están subdivididas en tres clases basadas en su densidad. Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) son lipoproteínas ricas en triglicéridos, que se sintetizan en el hígado y se convierten últimamente en lipoproteínas de baja densidad (LDL), que transportan la mayor parte del colesterol del plasma en los seres humanos. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son lipoproteínas que participan en el catabolismo de lipoproteínas ricas en triglicéridos y en la eliminación del colesterol desde los tejidos periféricos y su transporte al hígado. Se ha establecido una relación inversa entre los niveles de HDL en el suero y el riesgo de enfermedad coronaria. En particular, si la proporción del colesterol en suero asociado con HDL es baja, aumenta el riesgo de enfermedad coronaria.
En vista de la importancia de los niveles relativos de colesterol en suero en la evaluación del riesgo y gestión de la enfermedad aterogénica, se dedicó un esfuerzo considerable para seleccionar grandes poblaciones de personas normales y con alto riesgo a los niveles en suero de HDL, LDL así como del colesterol total y de los triglicéridos. La eficacia de los tratamientos en personas con alto riesgo fue controlada mediante pruebas periódicas de niveles de colesterol en suero en los diversos compartimentos de lipoproteínas.
Un procedimiento para la prueba específica del colesterol de HDL está basado en la precipitación selectiva de lipoproteínas no de HDL en el suero mediante compuestos polianiónicos, tales como sulfato de dextrano, heparina y fosfotungstato, en la presencia de un catión del Grupo II, tal como Mg^{2+}, Mn^{2+} y Ca^{2+}. La especificidad y grado de precipitación dependen de varios factores, entre ellos el tipo y la concentración del agente de polianión/metal. En general, el orden de precipitación de las partículas de colesterol en suero, con concentración creciente de polianión, es VLDL, LDL, y HDL. Las lipoproteínas HDL suelen permanecer solubles en concentraciones de heparina o sulfato de dextrano, que se precipitan completamente en partículas de más baja densidad, aunque especies apoE menores de HDL pueden ser co-precipitadas con partículas de más baja densidad. Mediante la precipitación selectiva de partículas de más baja densidad, se pueden determinar los niveles de colesterol en suero de HDL.
En un procedimiento de ensayo de lípidos típico, se extrae un pequeño volumen de sangre y se centrifuga para obtener un fluido de muestra de suero o plasma transparente. El fluido de muestra se mezcla en proporciones alícuotas en varios tubos de ensayo para determinación de (a) colesterol en suero total, (b) triglicéridos y (c) colesterol HDL. La muestra de HDL se precipita en la forma antedicha y las partículas de más baja densidad se eliminan mediante filtración o centrifugación antes de la detección del colesterol. Las muestras se hacen reaccionar a continuación con una mezcla de enzimas que contiene esterasa de colesterol, oxidasa de colesterol, peroxidasa y un colorante que se puede oxidar a un producto distintamente coloreado en la presencia de H_{2}O_{2} . Los tubos pueden ser objeto de lectura espectrofotométrica y determinarse los valores deseados de colesterol HDL y LDL total.
A pesar de la exactitud y fiabilidad que se puede conseguir con el ensayo del colesterol en fase líquida, que se acaba de describir, el ensayo tiene varias limitaciones para su uso en una amplia detección selectiva. En primer lugar, el procedimiento utiliza una muestra de sangre venosa, que exige que un técnico capacitado extraiga y fraccione la muestra de sangre y mezcle en partes alícuotas la sangre tratada para tubos de ensayo individuales. Al menos uno de los tubos de la muestra (para determinación de HDL) debe tratarse con un agente precipitante y procesarse a continuación para eliminar el material precipitado. Aunque algunos de estos procedimientos pueden ser automatizados, las máquinas analíticas diseñadas para esta finalidad son caras y no ampliamente disponibles fuera de los grandes hospitales.
Las patentes de posesión conjunta US nº 5.213.964, nº 5.213.965, nº 5.316.196 y nº 5.451.370 se refieren a procedimientos y dispositivos de ensayo que sustancialmente resuelven muchos de los problemas antes citados, asociados con los procedimientos de ensayo de fase líquida para medir los niveles de colesterol en suero. En una forma de realización, el dispositivo está diseñado para medir la concentración del colesterol asociado con HDL en una muestra de sangre que contenga también partículas de LDL y VLDL. Este dispositivo comprende una matriz esclava capaz de separar lipoproteínas solubles y precipitadas como una muestra de fluido que migra a través de la matriz A. un depósito asociado con la matriz está diseñado para liberar un agente precipitante, para precipitar de forma selectiva, LDL y VLDL, a medida que la muestra de fluido sanguíneo se extrae y pasa a través de la matriz. Esta operación permite la separación de HDL desde la lipoproteínas precipitadas, sobre la base de una migración de HDL más rápida a través de la matriz de detección selectiva. La muestra de fluido, así agotada de lipoproteínas no de HDL, efectúa luego una migración a una superficie de prueba donde se realiza un ensayo para la determinación del colesterol.
Se descubrió que el tratamiento de la sangre con reactivos utilizados en la precipitación selectiva de lipoproteínas de la sangre no de HDL daba lugar a un enlace de unión de una proporción de HDL presente en la muestra a fibras de vidrio no revestidas y que dicha unión de HDL a la fibra de vidrio, durante la operación de filtrado o transporte, suele dar lugar a valores de colesterol HDL espúreamente bajos. Este problema fue resuelto, en la patente US nº 5.451.370, recubriendo las fibras de vidrio, en la matriz utilizada para la precipitación/recubrimiento y transporte de la muestra filtrada con un reactivo derivatizante o polímero hidrofílico.
Además de la necesidad de dicho recubrimiento para reducir al mínimo la pérdida de HDL, los dispositivos antes citados presentan también la posibilidad de contaminación del recorrido de transporte del flujo con los reactivos precipitantes. Dichos reactivos podrían intervenir con otra química de ensayos que tenga lugar en otras zonas del dispositivos multiensayos. La presente invención aborda y supera estos problemas.
En los documentos EP-A-0 408 223 y EP 0 415 298 se dan a conocer otros procedimientos y dispositivos para medir el colesterol HDL en muestra de sangre. Similar a la enseñanza del documento EP-A-0 408 223, el documento EP 0 415 298 da a conocer un procedimiento continuo realizado en una banda de prueba que comprende las siguientes etapas y los elementos correspondientes.
La muestra de sangre se aplica a una capa de separación para separar los constituyentes celulares de la sangre. Impulsada por fuerzas capilares o de la gravedad, la muestra fluye a través de un soporte que contiene agentes precipitantes solubles. Después de disolverse al paso de dicha muestra de sangre, los agentes precipitan las lipoproteínas no de HDL contenidas en la muestra. En el siguiente soporte que permite el flujo pasante, se realizan cuidadosamente tres funciones diferentes al mismo tiempo. Dichos constituyentes precipitados son filtrados desde la muestra de la sangre para impedir su interferencia con la posterior cuantificación de HDL. Además, la muestra de sangre se transporta a una posición enfrente del soporte de cuantificación de HDL. Por último, dicha muestra de sangre se almacena en dicho soporte hasta que se inicie la etapa de cuantificación de HDL. Sobre la base de la forma de realización simultánea de estas funciones y su interferencia mutua, distintos inconvenientes están relacionados con este concepto que afecta a la posterior cuantificación de HDL. Dicho soporte que funciona como un depósito permite una migración adicional de los constituyentes precipitados para perturbar la cuantificación. Después del almacenamiento a largo plazo de las muestras de sangre, el HDL queda atrapado por las fibras de soporte y dicho soporte queda parcialmente ocluido por la muestra de sangre seca. Como consecuencia, los agentes precipitantes impregnados y los agentes de adición pueden causar reacciones adicionales basadas en el contacto con la sangre a largo plazo. Por último, dicha muestra de sangre se cuantifica mediante una reacción enzimática en una capa de cuantificación de HDL, donde se determinan los contenidos de lipoproteínas de HDL. Sobre la base de la configuración conceptual del procedimiento de prueba de HDL y el correspondiente y el correspondiente dispositivo que incluye el almacenamiento antes de la cuantificación de las muestras de sangre, los resultados de HDL son estimados de forma errónea.
Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es resolver dicho problema con un dispositivo de ensayo de HDL y un procedimiento que mejore la estimación de HDL en comparación con la técnica anterior.
3. Sumario de la invención
El anterior problema se resuelve mediante un dispositivo de ensayo según la reivindicación 1 así como un procedimiento, según la reivindicación 20, para la separación de lipoproteínas no de HDL a partir de líquidos biológicos como, por ejemplo, una muestra de sangre que realiza un concepto completamente distinto en comparación con la técnica anterior.
Dicho dispositivo de ensayo para medir el colesterol en suero asociado con las lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que contiene también lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), el dispositivo comprende una matriz de distribución de muestras para distribuir la muestra de fluido sanguíneo en dicho dispositivo de ensayo y un soporte de reactivos que contiene un reactivo efectivo para eliminar, de forma selectiva, las lipoproteínas no de HDL desde la muestra de fluido sanguíneo y un elemento de ensayo de HDL en el que se puede ensayar la concentración de HDL, en contacto directo con dicho soporte de reactivos; en el que dicho soporte de reactivos está separado de la matriz de distribución de muestras y puede llevarse a un contacto fluídico con la matriz de distribución de muestras.
En comparación con la técnica anterior se enseña un concepto completamente nuevo para evaluar el contenido en HDL en líquidos biológicos. Como principal característica, el líquido biológico, por ejemplo una muestra de sangre, se procesa lo más rápido posible. Para esta finalidad, el soporte de reactivos que contiene dicho reactivo para eliminar de forma selectiva las lipoproteínas no de HDL desde la muestra de fluido sanguíneo así como dicho elemento de ensayo de HDL para cuantificación de HDL están dispuestos en estrecha proximidad para limitar el contacto temporal de la muestra de sangre con los reactivos químicos presentes. Mediante esta disposición, el nuevo ensayo es calificado mediante una dinámica completamente distinta del flujo pasante de la muestra. Esta dinámica de flujo pasante garantiza un contacto optimizado entre la muestra y los reactivos químicos que es tan efectiva en el tiempo como se necesite. Además, dicho soporte de reactivos está adaptado, de modo óptimo, para soportar la eliminación, por ejemplo, precipitación y separación o unión, de los compuestos no de HDL. Aunque, se realiza una prueba de HDL efectiva en el tiempo, el procedimiento de prueba se puede adaptar a las condiciones medioambientales requeridas. Esto significa que el procedimiento de prueba se puede interrumpir después de la aplicación de la muestra y la preparación previa durante un tiempo deseado para, por ejemplo, ajustar la atmósfera circundante o adaptar la temperatura ambiental para soporte de las pruebas. Para cumplir este objetivo, la configuración de la matriz de distribución de muestras está diseñada para servir, además, como un depósito si fuera necesario.
Según otra forma de realización preferida de la presente invención, se enseña un dispositivo de ensayo para medir el colesterol en suero asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que contiene también lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), comprendiendo dicho dispositivo una matriz de distribución de muestras efectiva para distribuir una muestra de fluido sanguíneo desde una zona de aplicación de la muestra dentro de la matriz a una o más zonas de recogida de muestras dentro de la matriz; un elemento de ensayo de HDL, en el que se puede ensayar la concentración de HDL, separado de dicha matriz de distribución de muestras, un soporte de reactivos, dispuesto entre dicho elemento de ensayo de HDL y la matriz de distribución de muestras y separado de dicha matriz, el soporte de reactivos que contiene un reactivo efectivo para la eliminación selectiva de las lipoproteínas no de HDL desde la muestra de fluido sanguíneo y medios de montaje efectivos (a) para mantener dicho dispositivo en una posición de distribución de muestras, en el que dicho elemento de ensayo de HDL y soporte de reactivos están separados de la matriz y (b) para trasladar dicho dispositivo a una posición de prueba, en la que el elemento de ensayo de HDL está situado o mantenido en contacto con el soporte de reactivos y este último se lleva, al mismo tiempo o después de dicho contacto, a entrar en contacto con dicha matriz.
En otra forma de realización preferida, el dispositivo comprende una barra de reacción que está fijada por medios de montaje a dicho cuerpo principal para establecer un desplazamiento dicha barra de reacción entre una posición de distribución de muestras en la que dicho elemento de ensayo de HDL y dicho soporte de reactivos están separados de la matriz de distribución de muestras y una posición de ensayo en la que dicho elemento de ensayo de HDL, en contacto con el soporte de reactivos, se lleva a entrar en contacto con la matriz de distribución de muestras y soportes de ensayo adicionales unidos juntos con el soporte de reactivos y dicho elemento de ensayo de HDL a una superficie inferior de dicha barra de reacción, de modo que dichos soportes se lleven a un contacto fluídico con la matriz de distribución de muestras cuando dicha barra de reacción se traslade a una posición de ensayo y dicho contacto fluídico se interrumpa cuando la barra de reacción se desplace a dicha posición espaciada.
El anterior cuerpo principal o casete comprende una barra de reacción, que se puede desplazar desde una posición espaciada desde el soporte de ensayo (posición espaciante) en la posición de ensayo, por ejemplo, poniendo dicho dispositivo en un analizador correspondiente. Sobre la base de este desplazamiento desde la posición espaciada a la posición de ensayo, el elemento de ensayo de HDL así como el soporte de reactivos entran en contacto fluídico con dicha matriz de distribución de muestras, que contiene la muestra de sangre para iniciar dicha eliminación no de HDL así como dicha determinación de HDL durante el flujo pasante de la muestra de fluido sanguíneo a través del soporte de reactivos y del elemento de ensayo de HDL. A continuación, se completa automáticamente el ensayo.
Según una forma de realización preferida de dicho dispositivo de ensayo, una superficie inferior del elemento de ensayo de HDL está unida a una superficie superior del soporte de reactivos.
Sobre la base de esta configuración, se realiza un flujo pasante rápido de la muestra que limita el contacto temporal de la muestra de sangre con los reactivos correspondientes. Además, una disposición ahorradora de espacio está garantizada por no utilizar capas interpuestas entre dicho elemento de ensayo de HDL y dicho soporte de reactivos.
En otra forma de realización preferida de la invención, dicha matriz de distribución de muestras está unida a una matriz de cribado.
Esta disposición permite la provisión de un depósito de muestra de fluido sanguíneo apropiado por medio de dicha matriz de cribado y dicha matriz de distribución de muestras además de un filtro, corriente arriba, para filtrar dichos componentes celulares de la sangre por medio de la matriz de cribado.
Otra forma de realización preferida de la invención se refiere a un dispositivo que comprende un cuerpo principal que presenta un pocillo para contener la muestra de fluido sanguíneo, en comunicación fluídica con dicha matriz de cribado y dicha matriz de distribución de muestras a la que se transfiere la muestra de fluido sanguíneo.
El anterior dispositivo está, según una forma de realización preferida, alojado en un casete que forma el cuerpo principal. Dicho cuerpo presenta un pocillo para recibir, por ejemplo, la muestra de sangre en forma de goteo. Dicho pocillo coopera con la matriz de distribución de muestras, a través de la matriz de cribado, de modo que la muestra de sangre quede separada de sus componentes celulares. Además, se enseña alguna clase de un sistema de canales que transporta dicha muestra de sangre desde el pocillo a dicha matriz de distribución de muestras.
Según otra forma de realización preferida de la presente invención, dicha barra de reacción es ópticamente transparente, comprendiendo unas ventanas o aberturas ópticamente transparentes a través de las cuales son visibles los soportes de ensayo y dicho elemento de ensayo de HDL. En correspondencia, dicho elemento de ensayo de HDL contiene reactivos que, en la presencia de colesterol de HDL, producen un cambio en el elemento de ensayo de HDL que se puede detectar por medios ópticos. De este modo, el contenido en HDL en la muestra de sangre se evalúa, de forma preferible, utilizando reacciones de color que pueden evaluarse con facilidad.
Es preferible proporcionar dicho soporte de reactivos así como dicho elemento de ensayo de HDL como una membrana polimérica asimétrica que presenta, una superficie porosa más pequeña y una superficie porosa más grande opuesta, en la que la superficie porosa más grande de dicho elemento de ensayo de HDL está situada frente al soporte de reactivos.
Según otra forma de realización preferida de la presente invención, dicho reactivo para extraer, de forma selectiva, lipoproteínas no de HDL, desde la muestra de sangre, se inmoviliza para dicho soporte de reactivos.
En otra forma de realización preferida de la presente invención, el elemento de ensayo de HDL comprende un biosensor. Preferentemente, el biosensor es efectivo para medir, de forma electroquímica, la producción de oxígeno o peróxido de hidrógeno, lo que, a su vez, depende de la concentración de colesterol asociado con HDL dentro del fluido de la muestra. Elementos de ensayo adicionales pueden comprender, además, biosensores, efectivos para medir, de forma electroquímica la producción de oxígeno o peróxido de oxígeno, lo que, a su vez, depende de la concentración de analitos dentro del fluido de la muestra.
Además, la presente invención enseña un procedimiento para medir el colesterol en suero asociado con las lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que contiene también lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), que comprende las etapas siguientes: aplicar dicha muestra de fluido sanguíneo a una matriz de distribución de muestras; guiar dicha muestra de fluido sanguíneo a través de un soporte de reactivos que contiene un reactivo efectivo para extraer, de forma selectiva, lipoproteínas no de HDL desde la muestra de fluido sanguíneo y determinar el contenido de lipoproteínas de HDL en dicha muestra de fluido sanguíneo mediante un elemento de ensayo de HDL, en el que se puede ensayar la concentración de HDL; en el que dicho soporte de reactivos está separado de la matriz de distribución de muestras y el contacto fluídico se puede establecer, de forma selectiva, entre la matriz de distribución de muestras y dicho soporte de reactivos, que está unido al elemento de ensayo de HDL.
Como se explicó anteriormente, la presente invención realiza un concepto diferente comprado con la técnica anterior. Está calificada por las características esenciales de que la preparación de la muestra así como la evaluación de HDL se realizan en etapas separadas. La etapa de preparación garantiza que el líquido biológico, por ejemplo, la muestra de sangre, se prepare y adapte a la siguiente etapa de evaluación de HDL. La preparación de la muestra comprende, por ejemplo, la filtración de los componentes celulares de la sangre así como el almacenamiento de las muestras de sangre y la adaptación de dicha muestra a las condiciones/requisitos del ensayo, tales como temperatura, presión y atmósfera medioambiental. La etapa de evaluación de HDL realiza una extracción efectiva en el tiempo, es decir, precipitación o enlace, de constituyentes no de HDL y además, una cuantificación fiable del HDL. Mediante esta medida, se reduce el contacto temporal de las muestras de sangre con los diferentes reactivos y se evita cualquier interferencia química con la evaluación del HDL. Además, dicha muestra de sangre no se almacena en un soporte poroso pequeño adaptado para la filtración, puesto que la etapa de evaluación de HDL se realiza en un periodo corto.
Según otra forma de realización preferida de la presente invención, se enseña un procedimiento para medir el colesterol en suero asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido de sangre que contiene también lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), que comprende las etapas siguientes: entrada en contacto de la muestra con una matriz de distribución de la muestra absorptiva a través de la cual dicha muestra se distribuye a uno o más lugares de recogida de muestras; puesta en contacto con dicho lugar de recogida de muestra, una primera superficie de un soporte de reactivos, al que se transfiere dicha muestra, que contiene un reactivo efectivo para extraer, de forma selectiva, las lipoproteínas no de HDL desde la muestra de fluido, en el que una superficie opuesta de dicho soporte de reactivos está en contacto simultáneo con un elemento de ensayo de HDL, en el que se puede ensayar la concentración de HDL, de modo que volúmenes de muestra sucesivos que proceden de dicho soporte de reactivos pasan a dicho elemento de ensayo de HDL y determinar el nivel de colesterol de HDL en dicha muestra mediante detección óptica en dicho elemento de ensayo de HDL.
Según una forma de realización preferida de la presente invención, una etapa de ruptura de dicho contacto entre el lugar de recogida de la muestra y dicho soporte de reactivos se incorpora cuando se ha transferido una cantidad deseada de muestra.
Mediante las anteriores medidas, por una parte, se realiza una distribución de muestra efectiva y por otra parte, se impide una sobrecarga de muestras de los soportes correspondientes.
En otra forma de realización preferida, dicho soporte de reactivos y dicho elemento de ensayo de HDL comprenden una membrana polimérica asimétrica que presenta una superficie porosa más pequeña y una superficie porosa más grande opuesta, en el que dicho soporte de reactivos está orientado de modo que la superficie porosa más pequeña esté situada frente al elemento de ensayo de HDL. La superficie porosa más grande del elemento de ensayo de HDL está situada frente al soporte de reactivos.
En otra forma de realización preferida de la presente invención, se utiliza un biosensor para determinar el contenido en HDL de dicha muestra de fluido sanguíneo, que está comprendida en el elemento de ensayo de HDL, según se describió anteriormente.
Estos y otros objetivos y características de la invención se pondrán más claramente de manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada de la invención haciendo referencia a los dibujos adjuntos.
3. Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una vista lateral de un dispositivo de ensayo multianalitos construido de conformidad con una forma de realización de la invención;
La Figura 2 es una vista en perspectiva, en forma explosionada, de un dispositivo de ensayo de tipo multianalitos construido según una forma de realización de la invención; y
La Figura 3 es una vista en sección transversal de dos membranas asimétricas en contacto, para uso como soporte de reactivos precipitante y elemento de ensayo de HDL en una forma de realización de la invención, adoptando una orientación preferida.
4. Descripción detallada de la invención I. Dispositivo de ensayo
Las Figuras 1 y 2 ilustran dos formas de realización de un dispositivo de ensayo multianalitos 14 construido según la presente invención, con la Figura 2 ilustrada en formato explosionado. El dispositivo está diseñado, en particular, para determinar el colesterol en suero asociado con HDL (también referido como un colesterol asociado con HDL o simplemente colesterol de HDL) utilizando un pequeño volumen de muestra de sangre, normalmente entre 10 a 50 \mul de sangre. Otros ensayos, tales como los del nivel total de colesterol o triglicéridos, se pueden determinar simultáneamente a partir de la misma muestra. Demás, la determinación del colesterol asociado con HDL puede referirse a simplemente como determinación de HDL o de un ensayo de HDL.
El aparato comprende un soporte o cuerpo principal 15 que define un pocillo 16 dimensionado y con un tamaño adecuado para recibir una cantidad de una muestra de sangre, normalmente entre 25 y 50 \mul aproximadamente. El pocillo está en contacto fluídico con una matriz de cribado 22, que puede transportarse en una zona ranurada 20 formada en el borde superior del soporte. El contacto del fluido puede ser directo o, como en el dispositivo ilustrado en la Figura 1 provisto de un conducto capilar 18 formado en la placa en la base del pocillo. El soporte es preferentemente una placa de plástico, con el pocillo, zona ranurada y/o conducto capilar formados por procedimientos estándar de moldeo o mecanizado.
La matriz de cribado 22 soportada en la zona 20 funciona para extraer, de forma parcial, materias en partículas grandes (incluyendo células sanguíneas) cuando la muestra sufre una migración a través de la matriz de soporte en una dirección de abajo-arriba según se ilustra en la Figura. La matriz de cribado 22 está preferentemente formada por una matriz de fibra de vidrio de material con un diseño adecuado para extraer fluido acuoso mediante humectación superficial y para retrasar el movimiento de las células sanguíneas cuando la muestra de sangre se extrae a través de la matriz. Es decir, el soporte sirve como un medio cromatográfico para separar partículas de tamaño celular desde los componentes en suero solubles sobre la base de diferentes velocidades de migración a través del medio de soporte. Un soporte ejemplar es un filtro de fibra de vidrio, tal como un filtro GF/D o PD008 suministrado por Whatman, que presenta una densidad empaqueta de aproximadamente 0,16 g/cm^{3}. El soporte está cortado a dimensiones laterales de aproximadamente 3 x 8 mm y un espesor aproximado de 1 mm. El soporte está dimensionado para absorber un volumen definido de fluido de muestra, preferentemente entre 15 a 25 \mul. La matriz de cribado 22 puede contener, además, reactivos de captura de hematíes, tales como lectina, anticuerpos específicos para proteínas de membrana de superficie de célula de sangre roja, trombina o agentes de intercambio de iones.
La matriz de cribado 22, a su vez, entra en contacto con una banda alargada o matriz de distribución de muestras 26, que se extiende a lo largo del borde superior de la placa 15. Esta banda puede soportarse también por almohadillas de espuma 27 u otros soportes, según se ilustra en la Figura 2. La matriz 26 sirve distribuir el fluido de muestra desde una zona de aplicación de la muestra central 28 de la banda, que está en contacto fluídico con el soporte 22, a las zonas de recogida de muestras opuestas 30, 32 situadas junto a las extremidades de la matriz. Preferentemente, la matriz está formada por fibras de vidrio. La densidad de empaquetamiento y el espesor de la matriz son tales que absorben y distribuyen volúmenes de fluido de muestra, por ejemplo, 10 a 25 \mul, suministrados a la zona de aplicación de la muestra de la banda a las zonas de recogida de muestras de la banda. La matriz presenta una densidad de empaquetamiento preferida entre 0,16 g/cm^{3} y 4,0 g/cm^{3} aproximadamente. Un material de banda ejemplar es un filtro de fibra de vidrio, F-165-25A disponible a través de Whalman, que presenta una densidad de empaquetamiento aproximada de 0,2 g/cm^{3}, una anchura aproximada de 3 mm, una longitud aproximada de 3 cm y un espesor aproximado de 0,12 mm.
Puesto que la muestra no está en contacto con las fibras de vidrio utilizadas para la matriz de cribado y la matriz de distribución de la muestra, en la presencia de reactivo de precipitación o de enlace, no se necesita un recubrimiento según se describe en la patente US nº 5.451.370 para impedir la adhesión de HDL. Sin embargo, si así se desea, las fibras de vidrio pueden recubrirse, por ejemplo, con alcohol de polivinilo al 5% en peso.
Además, el dispositivo 14 comprende una barra de reacción 60 constituida por un soporte alargado 62, soportes de ensayo de reacción absorbentes humectables múltiples 66, 68, 70 y un elemento de ensayo de HDL 64, dispuestos sobre la superficie inferior del soporte, en las posiciones infladas. El soporte 62 es transparente o tiene ventanas transparentes, por ejemplo, la ventana 76 (Figura 2) que permiten que los soportes y dicho elemento de ensayo de HDL puedan verse a través del propio soporte. Según otra forma de realización preferida de la presente invención, dicho soporte 62 tiene aberturas a través de las cuales pueden verse los soportes. Los soportes de ensayo de reacción, en la barra de reacción, están unidos al soporte por un material adhesivo transparente o translúcido o mediante soldadura sónica u otro método de unión adecuado. Cada soporte utilizado en un ensayo particular contiene reactivos dependientes de analitos efectivos para producir un cambio dependiente de los analitos en el soporte, que se pueden detectar por medios ópticos, bien sea visualmente, bien sea por un detector, en un modo conocido, según se describirá a continuación. La totalidad o cualquier subconjunto integral de los soportes se puede emplear en un ensayo particular.
En una forma de realización deseable, los soportes de ensayo de reacción son membranas poliméricas porosas, que presentan preferentemente un espesor aproximado de 100 a 150 \mum y dimensiones laterales de 3 mm aproximadamente. El volumen de absorción de cada soporte está, comprendido preferentemente entre 0,5 y 1,0 \mul. En una forma de realización preferida, los soportes de reacción, y en particular el elemento de ensayo de HDL 64 utilizado para el ensayo de HDL, son membranas asimétricas; es decir, membranas que presentan un gradiente de porosidad a través del espesor de la membrana, según se describe más adelante.
La barra de reacción está montada sobre el soporte 15 por unos medios de montaje efectivos para (a) mantener el dispositivo en una posición de distribución de muestras, en la que los soportes de ensayo y los soportes de reactivos están separados de la matriz y para (b) transferir el dispositivo a una posición de ensayo, en donde el elemento de ensayo de HDL está colocado (o mantenido, si los dos soportes están unidos juntos) en contacto con el soporte de reactivos y este último se lleva, al mismo tiempo o posteriormente a contacto con la matriz 26 en un lugar de recogida de muestra. Además, se pueden utilizar los medios de montaje para interrumpir dicho contacto después de que una cantidad deseada de muestra haya penetrado en los soportes de ensayo y dicho elemento de ensayo de HDL 64 y/o después de un tiempo de contacto determinado, trasladando el dispositivo desde la posición de ensayo a una posición en la que los soportes de ensayo, dicho elemento de ensayo de HDL 64 y dicho soporte de reactivos están separados de la matriz (que puede ser la misma que en la posición de "distribución de muestras"). Dicha transferencia se puede controlar supervisando el valor de la reflectancia en la superficie superior del soporte de ensayo, que refleja la magnitud de la humectación, según se describe en la patente US nº 5.114.350. Como alternativa, cuando se conocen la capacidad de absorción y la velocidad de admisión de la muestra de material de soporte, la cantidad de muestra se puede controlar con suficiente precisión simplemente utilizando un tiempo de contacto predeterminado.
Los medios de montaje pueden comprender, por ejemplo, un par de elementos elásticos, tales como bloques elastoméricos 71, 72 que actúúan para impulsar los soporte hacia una posición de no transferencia o de distribución de muestras, en la que los soportes están separados de la matriz de distribución de muestras con una separación que suele estar comprendida entre 0,5 a 1,0 mm aproximadamente. Mediante compresión o liberación de los elementos elásticos, se puede establecer y separar, de forma selectiva, el contacto entre la matriz de distribución de muestras 26 y el soporte de reactivos 74 y el elemento de ensayo de HDL 64. Los bloques de soporte podrían someterse a compresión por medio de resortes o una acción del tipo de pistón. Como alternativa, dispositivos mecánicos externos podrían acoplarse con el cuerpo principal 15 y/o soporte 62 y desplazarse uno hacia otros. Dichos dispositivos pueden comprender componentes convencionales tales como abrazaderas, pistones, motores paso a paso, engranajes sin fin o elementos similares. Un sistema ejemplo es el Cholestech LDX® Analyzer, un analizador automatizado autónomo conveniente para su empleo con dispositivos de ensayo según aquí se describe.
En una forma de realización preferida, dicho elemento de ensayo de HDL 64 colocado en una posición arbitraria y utilizado para el ensayo de HDL, presenta fijado un soporte de reactivos 74, según se ilustra en las Figuras. Como alternativa, dicho soporte de reactivos 74 puede soportarse en una posición sustancialmente coplanar entre el elemento de ensayo de HDL 64, con el que puede, o no, estar en contacto directo y una zona de recogida de muestras de la matriz 26. Por ejemplo, un elemento de soporte compresible podría mantener el soporte de reactivos por encima de la matriz, de modo que el movimiento de la barra de reacción hacia el cuerpo principal (o viceversa) llevaría primero dicho elemento de ensayo de HDL 64 en contacto con la superficie superior del soporte de reactivos 74 y a continuación, llevaría la superficie inferior del soporte de reactivos en contacto con la matriz de distribución de muestras. Preferentemente, el soporte de reactivos presenta un espesor aproximado de 100 a 150 \mum, dimensiones laterales de 3 mm y un volumen de absorción de 0,5 a 1,0 \mul aproximadamente.
El soporte de reactivos 74, preferentemente en contacto con dicho elemento de ensayo de HDL 64, contiene un reactivo utilizado para extraer, de forma selectiva, partículas de LDL y VLDL desde la muestra de fluido. Dichos reactivos, que son conocidos en esta técnica como reactivos precipitantes, comprenden compuestos polianiónicos, tales como polisacáridos sulfonados, heparina o fosfotungstato, en la presencia de un catión del Grupo II, tal como Mg^{2+}, Mn^{2+} y Ca^{2+}. Un reactivo preferido es un polisacárido sulfonado, tal como sulfato de textrano, que tiene un peso molecular típico de 50.000 a 500.000 daltons, en combinación con acetato de magnesio o cloro, en una solución tamponada para mantener el pH neutro.
El soporte de reactivos es efectivo para atrapar las lipoproteínas no de HDL, ligadas o precipitadas, dentro del soporte de reactivos y evitar que penetren en el elemento de ensayo de HDL 64. Aunque se puede utilizar un filtro de fibras de vidrio para dicha finalidad, dichas fibras de vidrio deben recubrirse para impedir la aglutinación de HDL en la presencia de los reactivos, según se describe en la patente US nº 5.451.370 anteriormente citada. En una forma de realización preferida, el soporte de reactivos 74 está constituido por una membrana polimérica porosa, según se describe más adelante.
El soporte de reactivos contiene reactivos para la extracción selectiva de lipoproteínas no de HDL, según se describió anteriormente. En una forma de realización, una membrana es impregnada con dichos reactivos. Por ejemplo, una membrana asimétrica polisulfonada según se describe más adelante, es impregnada con una solución acuosa que contiene sulfato de dextrano y una sal de magnesio, tal como acetato de magnesio y a continuación se seca. Un procedimiento ejemplar para preparar dichas membranas para su incorporación en el dispositivo se describe en el ejemplo 1. En este caso, los reactivos precipitantes solubles son liberados en la solución de muestra cuando penetra en la membrana.
En otra forma de realización, los reactivos están inmovilizados a la membrana. Preferentemente, el reactivo negativamente cargado, por ejemplo, sulfato de dextrano, está inmovilizado por fuerzas electrostáticas y/o de manera covalente a una membrana que presenta grupos superficiales con cargas positivas. Un material de ejemplo para esta finalidad es una membrana de nylon que presenta grupos amónicos cuaternarios en la superficie, tales como la membrana AM080 proporcionada por Cuno Corp (Meridian, CT).
En este caso, la membrana actúa como un medio de separación de afinidad, de modo que las lipoproteínas no de HDL se unen al reactivo fijado a la membrana en lugar de su precipitación y de este modo, se separan del fluido de la muestra.
Otras membranas poliméricas comerciales, que presentan una superficie catiónica, comprenden Immobilion-Ny+^{TM} (Millipore Corp., Bedford MA), Zetabind® (también a través de Cuno Corp.), GeneScreen® (NEN/DuPont, Boston, MA), Hybond N+ (Amersham, Piscataway, NJ) y Posidyne® (Pall Corp., Glen Cove, NY). La patente US nº 5.543.054 (Charkoundian et al.) describe un procedimiento para enlazar de forma covalente carbohidratos con cargas negativas a una membrana que presenta mitades moleculares reactivas en proximidad a mitades moleculares con cargas positivas sobre su superficie. Esta membrana es, por ejemplo, un polímero poroso, v.g., politetrafluoroetileno, fluoruro de polivinilideno, poliéster, poliamida, policarbonato, polipropileno, polimetilmetacrilato, polimetacrilato, polisulfona o poliestireno, recubierto con el producto Hercules R-4308^{TM}, una resina de poliamido-poliamina epiclorohidrina.
En otra forma de realización, el soporte de reactivos 74 está constituido por una membrana asimétrica; es decir, una membrana que presenta un gradiente de tamaños de poros a través de su espesor. Una membrana asimétrica es preferida, en particular, para su empleo con reactivos precipitantes incorporados en la membrana en forma soluble, para una captación óptima del precipitado. La preparación de membranas asimétricas se describe, por ejemplo, en las patentes US nº 4.629.563, nº 5.171.445, nº 5.886.059, nº 5.536.408, nº 5.562.826 y nº 4.774.192; en D.R. Lloyd "Materials Science of Synthetic Membranes", ACS Symposium 269: 1-21 (1985). Están comercialmente disponibles en una amplia gama de tamaños de poros y relaciones de tamaños de poros. Materiales de fabricación comprenden polisulfonas, polietersulfonas, poliamidas, amidas de poliéter, poliuretanos, acetatos de celulosa, polivinilpirrolidona, poliestirenos y poliestirenos modificados, así como mezclas, copolímeros y compuestos laminares. Una membrana asimétrica ejemplar es una membrana de polisulfona o polietersulfona, tal como membrana de FILTERITE^{TM} proporcionada por USF Filtration and Separations (San Diego, CA). Los tamaños de poros mínimos suelen variar desde 0,01 a 1,0 \mum con relaciones de tamaños de poros máxima/mínima de hasta 100 o más. El espesor suele ser de 100 a 150 \mum.
La membrana asimétrica está preferentemente orientada con su superficie porosa más grande situada frente a la zona de aplicación de la muestra; es decir, mirando hacia abajo en las Figuras 1 y 2 y su superficie porosa más pequeña situada frente, y preferentemente en contacto con, un soporte de ensayo de reacción, por ejemplo un elemento de ensayo de HDL 64, que contiene reactivos para el ensayo del nivel de HDL, según se describe a continuación. Esta orientación permite el acceso libre de la muestra en el soporte a través de los poros más grandes e impide el paso del material precipitado, formado cuando la solución entra en contacto con un agente precipitante soluble, a través de los poros más pequeños, que suelen tener un diámetro de 1 \mum o menor. Este tamaño de poros es también preferido para las membranas no asimétricas.
En otra forma de realización, el soporte de reactivos 74 consiste en una membrana única. Además, la invención contempla la posibilidad de utilizar membranas apiladas múltiples, es decir, hasta aproximadamente seis, en donde al menos una, y preferentemente cada membrana, contiene reactivos para el enlace o precipitación de lipoproteínas no de HDL, para el soporte de reactivos 74. Pueden contener un reactivo inmovilizado, según se describió anteriormente, o pueden estar impregnadas con un reactivo soluble. En este último caso, las membranas asimétricas son preferidas y están preferentemente orientadas de modo que la superficie porosa más pequeña de la membrana superior esté situada frente al elemento de ensayo de HDL 64 y la superficie porosa más grande de la membrana inferior esté situada frente a la zona de aplicación de la muestra.
En una forma de realización preferida, dicho elemento de ensayo de HDL 64 es también una membrana polimérica, que contiene reactivos para el ensayo del nivel de HDL y puede ser una membrana asimétrica según se describió anteriormente. Para presentar la superficie más uniforme para la exploración óptica y la cuantización de los resultados del ensayo, una membrana asimétrica empleada para dicho elemento de ensayo de HDL 64 está orientada con la superficie porosa más pequeña situada hacia arriba y la superficie porosa más grande situada frente al soporte de reactivos 74.
Como alternativa, una membrana asimétrica empleada para dicho elemento de ensayo de HDL 64 puede orientarse con su superficie porosa más grande mirando hacia arriba y su superficie porosa más pequeña situada frente al soporte de reactivos 74. Esta orientación es más adecuada para ensayos en los que ha de realizarse una lectura visual cualitativa desde la superficie superior.
Si así se desea, reactivos de ensayo de HDL, tal como peroxidasa, pueden inmovilizarse a dicha membrana del elemento de ensayo de HDL, según procedimientos bien conocidos para la inmovilización de enzimas. (ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.999.287; nº 5.419.902; Blum L.I. et al. Anal. Lett. 20 (2): 317-26 (1987); Kiang S.W. et al, Clin. Chem 22 (8): 1378-82 (1976); Guilbault. G.G., Ed., Modern Monographs in Analytical Chemistry, Vol. 2; Analytical Uses of Immobilized Enzymes (1984); Torchilin, V. P., Progress in Clinical Biochemistry and Medicine, Vol. 11; Immobilized Enzymes in Medicine (1991)). En otra forma de realización, un reactivo, tal como catalasa, que es efectivo para descomponer cualquier peróxido de hidrógeno generado que podría difundirse hacia abajo desde dicho elemento de ensayo de HDL 64 puede incluirse en el soporte de reactivos 74.
En una forma de realización preferida, donde dos membranas poliméricas unidas se emplean para dicho elemento de ensayo de HDL 64 y el soporte de reactivos 74, respectivamente, los reactivos adecuados son impregnados o inmovilizados y las membranas se procesan como una capa de dos membranas para su incorporación en el dispositivo de ensayo durante la fabricación. Una capa de dos membranas ejemplo comprendiendo dos membranas asimétricas se ilustra en sección transversal en la Figura 3, con la orientación preferida ilustrada, con los poros mayores en 78 y los poros más pequeños en 80.
En otra forma de realización, el elemento de ensayo de HDL 64 comprende un biosensor, según se describe, por ejemplo, en PTC nº de publicación WO 9958966 (Dobson et al). Este documento enseña un dispositivo biosensor a microescala, que comprende una superficie conductora, una capa de material dieléctrico que se superpone a la superficie conductora y una pluralidad de poros que se extienden a través de la capa de dieléctrico. Cada uno de los poros puede actuar como un microelectrodo, convirtiendo una respuesta química en una señal eléctrica, en virtud de un biopolímero situado dentro del poro en contacto con la superficie conductora. En condiciones de uso, un fluido que contiene un analito objeto de ensayo se aplica a los poros de modo que entren en contacto con el biopolímero. En el dispositivo de ensayo de HDL actual, esto puede conseguirse colocando el soporte de reactivos 74 en contacto fluídico con el elemento de ensayo de HDL 64; es decir, la superficie que contiene poros del biosensor.
Un contraelectrodo está provisto en contacto eléctrico con la superficie conductora a través del fluido de la muestra. Una tensión ha de aplicarse entre el contraelectrodo y la superficie conductora y se mide la intensidad de la corriente que circula entre ambos elementos. La corriente medida es indicativa de la cantidad de un analito elegido en el fluido objeto de ensayo.
Preferentemente, los microelectrodos funcionan como biosensores amperométricos. En resumen, un biosensor amperométrico funciona mediante la generación de una corriente cuando se aplica un potencial entre dos electrodos. Un ejemplo es el electrodo de oxígeno de Clark, que mide la intensidad de la corriente producida mediante reducción de oxígeno u oxidación de peróxido de hidrógeno.
La dependencia de dichos biosensores de la concentración de oxígeno disuelto se puede superar mediante el uso de "mediadores" que transfieren los electrones directamente al electrodo, eludiendo la reducción del co-sustrato de oxígeno. Los ferrocenos representan una familia de mediadores de frecuente uso.
El biopolímero dentro de los poros de microelectrodos suele ser una enzima, tal como para la medición del colesterol asociado con HDL, que es la oxidasa de colesterol. El colesterol se oxida por la oxidasa de colesterol a la correspondiente cetona, liberando el peróxido de hidrógeno que luego puede convertirse en agua y oxígeno por la peroxidasa de enzimas. A continuación, la peroxidasa de hidrógeno u oxígeno se mide por medios electroquímicos en el sensor.
II. Procedimiento de ensayo
En condiciones de funcionamiento, una muestra de sangre se coloca en el pocillo 16 y se embebe mediante acción capilar a través de la matriz de cribado 22, donde las partículas grandes, incluyendo los hematíes, se extraen y se llevan luego a la matriz de distribución de muestras 26. Estas operaciones tienen lugar mientras el dispositivo está en una posición de "distribución de muestras" de modo que la matriz de distribución de muestras no entre en contacto con los soportes de ensayo o de reactivos o el elemento de ensayo de HDL. Cuando la muestra de suero llega a los lugares de recogida de muestra, tales como los lugares 30 y 32 situados juntos a las extremidades de la matriz 26, el dispositivo se ajusta a una posición de ensayo, preferentemente moviendo la barra de reacción 60 para colocar los soportes de ensayo 66, 68 y 70 y el soporte de reactivos/elemento de ensayo de HDL 74/64 (en la forma de realización ilustrada en las Figuras) en contacto con la matriz. En esta posición, el fluido de muestra en la matriz se extrae hacia cada soporte en contacto mediante flujo capilar, produciéndose el movimiento del fluido en una dirección normal a las superficies de los soportes. La placa se mantiene en esta posición hasta que se consigue un grado deseado de humectación de los soportes. A continuación, la placa se desplaza, si así se desea, para interrumpir el contacto entre la matriz de distribución de muestras y los soportes de ensayo/elementos de ensayo de HDL y los soportes de reactivos, cuando una cantidad deseada de fluido de la muestra se ha introducido en los soportes de ensayo/elemento de ensayo de HDL y/o después de un tiempo de contacto apropiado, por ejemplo, según se describe en el ejemplo 2
siguiente.
En formas de realización del dispositivo en las que el soporte de reactivos 74 no está fijado al elemento de ensayo de HDL 64, el movimiento respectivo de la barra de reacción y del cuerpo principal entre sí, normalmente moviendo la barra de reacción hacia abajo, coloca primero el elemento de ensayo de HDL 64 en contacto con el soporte de reactivos 74, para aproximar la disposición de elementos ilustrada en las Figuras y a continuación, un nuevo movimiento coloca el soporte de reactivos en contacto con la matriz de distribución de muestras. El contacto se mantiene hasta que se consigue un grado deseado de humectación, según se describió anteriormente. En otra forma de realización preferida del dispositivo, el soporte de reactivos 74 está en contacto directo con dicho elemento de ensayo de HDL 64. Dicho soporte de reactivos 74 y dicho elemento de ensayo de HDL 64 se llevan a ponerse en contacto con dicha matriz de distribución de muestras 26 moviendo correspondientemente dicha barra de reacción 60 hacia la matriz de distribución de muestras 26.
El suero de la muestra que entra en el soporte de reactivos 74 se pone en contacto con el agente precipitante o de enlace contenido en la membrana, de modo que las lipoproteínas no de HDL son, de forma selectiva, precipitadas y retenidas por filtración, en el caso de reactivo soluble o ligadas a la membrana, en el caso de reactivo inmovilizado. La membrana es así efectiva para captar lipoproteínas no de HDL, mientras que permite el paso de suero que contiene HDL en fase líquida al elemento de ensayo de HDL 64. El elemento de ensayo de HDL 64 contiene reactivos para la cuantificación del colesterol asociado con HDL. Preferentemente, estos reactivos comprenden esterasa de colesterol, para liberar el colesterol libre desde HDL, oxidasa de colesterol para producir H_{2}O_{2} mediante reacción con colesterol libre, peroxidasa y un sistema de colorantes acoplados que se convierte, en la presencia de peroxidasa y H_{2}O_{2}, en un producto de reacción de señal distintivamente coloreado.
Durante la operación, a medida que el fluido de la muestra pasa a través del recorrido de ensayo de HDL, que comprende los soportes 64 y 74, su borde de ataque pasa en una dirección ascendente a través del soporte 74, donde las lipoproteínas no de HDL reaccionan y son atrapadas, y directamente al soporte de ensayo adyacente 64, donde las lipoproteínas HDL reaccionan con los reactivos de ensayo allí contenidos para la medición del colesterol asociado con HDL. Además, partes de las muestras continúan estado en contacto con el soporte 74 durante este tiempo y prosiguen desde el soporte 74 al 64 desde una manera similar, hasta que se alcance la capacidad de absorción del soporte 64. En consecuencia, la cuantificación del colesterol asociado con HDL en el elemento de ensayo de HDL 64 se produce al mismo tiempo que tiene lugar la reacción de precipitación o de enlace en el soporte de reactivos 74. preferentemente, el volumen de fluido de muestra transferido al recorrido de ensayo de HDL (comprendiendo el soporte 74 y el elemento 64) desde la matriz de distribución de muestras es igual o mayor que la capacidad de absorción del elemento de ensayo de HDL 64 y menor o igual a la capacidad de absorción combinada del elemento de ensayo de HDL 64 y el soporte de reactivos 74.
Los restantes soportes de ensayo contienen también reactivos de ensayo que producen un cambio en el soporte que se puede detectar por medios ópticos, bien sea visualmente, bien sea por un detector, de una manera conocida. Una ventaja del dispositivo y procedimiento actuales es que el recorrido de distribución de muestras no contiene ningún reactivo precipitante o de enlace no de HDL; dichos reactivos están presentes solamente en el soporte de reactivos 74. Por lo tanto, se elimina la posibilidad de interferencia de estos reactivos en ensayos de analitos que no sean de
HDL.
Preferentemente, cada uno de los soportes de ensayo contiene unos componentes de reactivos para convertir H_{2}O_{2} en un producto de reacción de señal coloreado. Dichos componentes comprenden peroxidasa y un sistema de colorantes acoplados que se convierten por la peroxidasa, en la presencia de H_{2}O_{2}, a un producto de reacción de señal distintivamente coloreado. Las reacciones de coloraciones enzimáticas, que emplean una amplia gama de oxidasas específicas del sustrato, para la generación enzimática de H_{2}O_{2} y posterior oxidación de un colorante para formar un producto de reacción coloreado, son bien conocidas.
Preferentemente, según otra forma de realización de la presente invención, cada uno de los soportes de ensayo y el elemento de ensayo de HDL contiene componentes de reactivos para producir H_{2}O_{2} mediante la reacción del analito con una enzima; posteriormente, el H_{2}O_{2} convierte un reactivo de sustrato en un producto de reacción de señal coloreado o se mide por medios electroquímicos, según se describió con anterioridad.
Un dispositivo que presenta cuatro o más soportes de reacción se puede utilizar para medir simultáneamente colesterol de HDL (HDL), glucosa, colesterol total (TCh) y lípido de triglicéridos (TG). Cada soporte contiene los componentes de recorrido común anteriormente descritos (peroxidasa y un sistema de colorantes acoplados) de modo que el H_{2}O_{2} generado produce un producto de reacción de señal distintivamente coloreado. El soporte de ensayo de colesterol total, que está expuesto al suero sin exposición a un reactivo precipitante o de enlace, y el elemento de ensayo de HDL 64 comprenden cada uno, en adición a los componentes de recorrido común, esterasa de colesterol, para liberar colesterol esterificado en forma de colesterol libre desde las lipoproteínas del suero, que comprenden partículas de HDL, LDL y VLDL, y la oxidasa de colesterol, para producir H_{2}O_{2} mediante reacción con colesterol libre en el fluido de muestra, según se describió anteriormente. El soporte de ensayo de glucosa comprende oxidasa de glucosa, además de los componentes de recorrido común. El soporte de triglicéridos comprende, además de los componentes de vía de acceso común, lipasa, L-glicerol kinasa y L-glicerol-3-fosfato oxidasa, para generar H_{2}O_{2} desde los triglicéridos, a través del L-glicerol-3-fosfato intermedio. La muestra de suero extraída en el soporte de TG no está expuesta a reactivos precipitantes o de enlace y por lo tanto, contiene la totalidad de las lipoproteínas del suero, por lo que la señal de TG representa los triglicéridos del suero totales.
También se pueden utilizar soportes patrón de referencia, véase, por ejemplo, el sistema descrito en la patente US nº 5.114.350.
Como se indicó anteriormente, una ventaja del dispositivo y procedimiento actuales es que la matriz de distribución de muestras no contiene reactivos ligantes o precipitantes no de HDL; dichos reactivos están presentes solamente en el soporte de reactivos 74. Por lo tanto, la posibilidad de interferencia por estos reactivos, en ensayos de analitos tal como colesterol en suero total y triglicéridos totales es eliminada.
Ejemplo 1 Preparación de membrana de reactivos con precipitante soluble y membrana de ensayo de HDL
Para preparar una membrana de reactivos con precipitante soluble, se dispensa una solución acuosa que contiene 1 mg/ml de sulfato de dextrano (500.000 MW) y 12,5 mM Mg (OAc)_{2} en una membrana asimétrica polisulfonada de una anchura de 5,58\cdot10^{-3} m (0,22 pulgadas). El espesor de la membrana es 127 \pm 5 \mum, con un punto de burbujeo de 5,86 \pm 0,35 bares (85 \pm 5 psi). El reactivo se dispensa a un régimen de 653,54 \mul/m (16,6 \mul/pulgada) y la membrana se seca durante 20 minutos a una temperatura de 50ºC en un proceso de laminado continuo. Longitudes de, por ejemplo, 30,48 m (100 pies) se preparan de esta manera y se cortan para fijar los dispositivos de ensayo.
Para preparar una membrana de reacción de HDL, se impregna una membrana de polisulfona asimétrica similar con la siguiente formulación acuosa: oxidasa de colesterol en 36,5 unidades/ml, esterasa de colesterol en 215 unidades/ml, peroxidasa en 200 unidades/ml, 4-aminoantipirina en 1,88 \mum/ml y TOOS (3-[etil(3-metilfenil) amino]-2-hidroxi ácido propanosulfónico) en 12,5 \mum/ml. El régimen de dispensación y el tiempo de secado son como para la membrana de reactivos anterior.
Las dos membranas pueden unirse por separado (de forma secuencial) a la barra de reacción mediante soldadura electrónica o pueden unirse simultáneamente con una etapa de soldadura ultrasónica única.
Ejemplo 2 Procedimiento de ensayo
Los siguientes ensayos fueron realizados en un analizador LDX®, utilizando soportes de reactivos y elementos de ensayo de HDL preparados esencialmente según se describe en el Ejemplo 1. La muestra (35 \mul de suero o sangre completa) fue aplicada al pocillo de las muestras y se le dejó distribuirse a través de la matriz de distribución de muestras durante 2 minutos. A continuación, la barra de reacción se puso en contacto con la matriz durante 3 segundos, un tiempo suficiente para transferir bastante suero para rellenar el soporte de reactivos y probar el elemento de ensayo de HDL/soporte (capacidad combinada aproximada de 1,5 \mul) después de lo cual la barra fue devuelta a su posición original. Se tomaron lecturas de la reflectancia desde la superficie superior del elemento de ensayo de HDL cada 3 segundos durante 150 segundos para controlar el progreso de la reacción del ensayo de HDL. El valor de la reflectancia mínima alcanzado fue convertido luego a mg/dL de colesterol de HDL según una curva de calibración previamente establecida.
Los valores de concentración siguientes (mg/dl) son de cinco muestras de suero analizadas según se describió anteriormente y en un analizador de referencia de Beckman, que muestran una excelente correlación.
Muestra nº Ensayo HDL Referencia Beckman
A010904 23,8 24,5
10906 43,0 41,9
10502 61,5 59,6
10801 80,6 78,7
10805 92,4 87,2

Claims (30)

1. Dispositivo de ensayo (14) para medir el colesterol en suero asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que contiene también lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), comprendiendo dicho dispositivo
a.
una matriz de distribución de muestras (26) para distribuir la muestra de fluido sanguíneo en dicho dispositivo de ensayo (14); y
b.
un soporte de reactivos (74) que contiene un reactivo que resulta efectivo para eliminar, de forma selectiva, las lipoproteínas no de HDL de la muestra de fluido sanguíneo; y
c.
un elemento de ensayo de HDL (64) en el que se puede ensayar la concentración de HDL, en contacto directo con dicho soporte de reactivos (74); caracterizado porque
d.
dicho soporte de reactivos (74) está separado de dicha matriz de distribución de muestras (26) y puede ponerse en contacto fluídico con dicha matriz de distribución de muestras (26).
2. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 1, caracterizado porque:
a.
dicha matriz de distribución de muestras (26) resulta efectiva para distribuir una muestra de fluido sanguíneo desde una zona de aplicación de la muestra, en el interior de dicha matriz de distribución de muestras (26), hasta una o más zonas de recogida de muestras (30, 32) en el interior de dicha matriz de distribución de muestras (26);
b.
dicho elemento de ensayo de HDL (64) está separado de dicha matriz de distribución de muestras (26),
c.
dicho soporte de reactivos (74) está dispuesto entre el elemento de ensayo de HDL (64) y la matriz de distribución de muestras (26), y
d.
dicho dispositivo de ensayo (14) comprende además unos medios de montaje (71, 72) efectivos (a) para mantener dicho dispositivo (14) en una posición de distribución de muestras, en el que dicho elemento de ensayo de HDL (64) y dicho soporte de reactivos (74) están separados de dicha matriz (26) y (b) para transferir dicho dispositivo (14) a una posición de ensayo, en el que el elemento de ensayo de HDL (64) se pone o se mantiene en contacto con el soporte de reactivos (74) y dicho soporte de reactivos (74), al mismo tiempo o después de dicho contacto, entra en contacto con la matriz (26).
3. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende además una barra de reacción (60) que está fijada gracias a unos medios de montaje (71, 72) a dicho cuerpo principal (15) para establecer un desplazamiento de dicha barra de reacción (60) entre una posición de distribución de muestras en la que dicho elemento de ensayo de HDL (64) y dicho soporte de reactivos (74) están separados de la matriz de distribución de muestras (26) y una posición de ensayo en la que dicho elemento de ensayo de HDL (64), en contacto con el soporte de reactivos (74), entra en contacto con dicha matriz de distribución de muestras (26); y
unos soportes de ensayos adicionales (66, 68, 70) unidos entre sí con dicho soporte de reactivos (64) y dicho elemento de ensayo de HDL (74) a una superficie inferior de dicha barra de reacción (60), entrando dichos soportes (66, 68, 70) en contacto fluídico con dicha matriz de distribución de muestras (26) cuando la barra de reacción (60) se traslada a una posición de ensayo y porque dicho contacto fluídico se interrumpe cuando la barra de reacción (60) se desplaza hacia dicha posición espaciada.
4. Dispositivo de ensayo (14) según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque una superficie inferior del elemento de ensayo de HDL (64) está unida a una superficie superior del soporte de reactivos (74).
5. Dispositivo de ensayo (14) según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha matriz de distribución de muestras (26) está conectada a una matriz de cribado (22).
6. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 5, caracterizado porque comprende además un cuerpo principal (15) que presenta un pocillo (16) para contener dicha muestra, en comunicación fluídica con dicha matriz de cribado (22) y dicha matriz de distribución de muestras (26) a la que se traslada dicha muestra de fluido sanguí-
neo.
7. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 6, caracterizado porque dicha barra de reacción (60) es ópticamente transparente o comprende unas ventanas o aberturas ópticamente transparentes a través de las cuales son visibles dichos soportes de ensayo (66, 68, 70)/elemento de ensayo de HDL (64).
8. Dispositivo de ensayo (14) según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho reactivo comprende un polisacárido sulfonado.
9. Dispositivo de ensayo (14) según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho elemento de ensayo de HDL (64) contiene unos agentes que, en la presencia de colesterol de HDL, produce un cambio en dicho elemento de ensayo de HDL (64) que se puede detectar por medios ópticos.
10. Dispositivo de ensayo (14) según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho soporte de reactivos (74) comprende una membrana polimérica porosa.
11. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho soporte de reactivos (74) es una membrana polimérica asimétrica, que presenta una superficie porosa más pequeña y una superficie porosa más grande en posición opuesta.
12. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 11, caracterizado porque dicha membrana está orientada de tal modo que su superficie porosa más pequeña esté dispuesta frente al elemento de ensayo de HDL (64).
13. Dispositivo de ensayo (14) según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho elemento de ensayo de HDL (64) es una membrana polimérica porosa.
14. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 13, caracterizado porque dicho elemento de ensayo de HDL (64) es una membrana polimérica asimétrica, que presenta una superficie porosa más pequeña y una superficie porosa más grande en posición opuesta.
15. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 14, caracterizado porque dicha membrana está orientada de tal modo que su superficie porosa más grande esté dispuesta frente al soporte de reactivos (74).
16. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 15, caracterizado porque cada uno de dichos elementos de ensayo de HDL (64) y dicho soporte de reactivos (74) es una membrana polimérica asimétrica y porque dichas membranas están laminadas de tal modo que la superficie porosa más pequeña del soporte de reactivos (74) entre en contacto con una superficie porosa más grande del elemento de ensayo de HDL (64).
17. Dispositivo de ensayo (14) según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho reactivo está inmovilizado en dicho soporte de reactivos (74).
18. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho elemento de ensayo de HDL (64) comprende un biosensor.
19. Dispositivo de ensayo (14) según la reivindicación 18, caracterizado porque dicho biosensor (64) resulta efectivo para medir la producción de oxígeno o peróxido de hidrógeno que depende de la concentración de colesterol asociado con HDL en el interior de dicho elemento (64).
20. Procedimiento para medir el colesterol en suero asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que contiene también lipoproteínas de baja densidad (LDL) o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), que comprende las etapas siguientes:
a.
aplicar una muestra de fluido sanguíneo a una matriz de distribución de muestras (26);
b.
guiar dicha muestra de fluido sanguíneo a través de un soporte de reactivos (74) que contiene un reactivo que resulta efectivo para extraer, de forma selectiva, lipoproteínas no de HDL de la muestra de fluido sanguíneo; y
c.
determinar el contenido de lipoproteínas de HDL en dicha muestra de fluido sanguíneo mediante un elemento de ensayo de HDL (64), en el que se puede ensayar la concentración de HDL, conectado a dicho soporte de reactivos (74); caracterizado porque
d.
dicho soporte de reactivos (74) está separado de dicha matriz de distribución de muestras (26) y porque el contacto fluídico se puede establecer, de forma selectiva, entre dicha matriz de distribución de muestras (26) y dicho soporte de reactivos (74).
21. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque comprende además las etapas siguientes:
a.
poner en contacto la muestra con dicha matriz de distribución de muestras (26) absorbente a través de la cual dicha muestra se distribuye a uno o más sitios de recogida de muestras (30, 32);
b.
poner en contacto con dicho elemento de recogida de muestras (30, 32), una primera superficie de dicho soporte de reactivos (74), a la cual se transfiere dicha muestra, que contiene un reactivo que resulta efectivo para extraer, de forma selectiva, lipoproteínas no de HDL de la muestra de fluido, en el que una superficie opuesta de dicho soporte de reactivos (74) está en contacto simultáneo con dicho elemento de ensayo de HDL (64), en el que se puede ensayar la concentración de HDL, de modo que los volúmenes de muestras sucesivos procedan desde dicho soporte de reactivos (74) hasta dicho elemento de ensayo de HDL (64); y
c.
determinar el nivel de colesterol de HDL en dicha muestra mediante detección óptica en dicho elemento de ensayo de HDL (64).
22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque comprende además la etapa de romper dicho contacto entre la matriz de distribución de muestras (26) y dicho soporte de reactivos (74), cuando se haya transferido una cantidad deseada de muestra.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado porque dicho soporte de reactivos (74) comprende una membrana polimérica asimétrica, que presenta una superficie porosa más pequeña y una superficie porosa más grande en posición opuesta.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha membrana está orientada de modo que su superficie porosa más pequeña está dispuesta frente a dicho elemento de ensayo de HDL (64).
25. Procedimiento según la reivindicación 24, caracterizado porque dicho elemento de ensayo de HDL (64) es una membrana polimérica asimétrica, que presenta una superficie porosa más pequeña y una superficie porosa más grande en posición opuesta.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque dicha membrana está orientada de modo que su superficie porosa más grande esté dispuesta frente a dicho soporte de reactivos (74).
27. Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque cada uno de dichos elementos de ensayo de HDL (64) y dicho soporte de reactivos (74) es una membrana polimérica asimétrica y dichas membranas están laminadas de tal modo que la superficie porosa más pequeña del soporte de reactivos entre en contacto con una superficie porosa más grande del elemento de ensayo de HDL (64).
28. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque dicho reactivo que resulta efectivo para extraer, de forma selectiva, lipoproteínas no de HDL está inmovilizado a dicho soporte de reactivos (74).
29. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque dicho elemento de ensayo de HDL (64) comprende un biosensor.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, caracterizado porque dicho biosensor (64) resulta efectivo para medir la producción de oxígeno o de peróxido de hidrógeno que depende de la concentración de colesterol asociado con HDL en el interior de dicho elemento (64).
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