ES2317015T3 - Membranas adheridas que conservan porosidad y actividad biologica en dispositivo de ensayo para medir colesterol serico asociado con liproteinas de alta densidad. - Google Patents

Membranas adheridas que conservan porosidad y actividad biologica en dispositivo de ensayo para medir colesterol serico asociado con liproteinas de alta densidad. Download PDF

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Abstract

Un dispositivo de análisis para medir el colesterol sérico asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que también contiene lipoproteínas diferentes de las HDLs, comprendiendo el dispositivo: una matriz de distribución de muestra; una almohadilla de ensayo de HDL en la que se puede analizar la concentración de HDL; y una almohadilla de reactivos que contiene un reactivo de unión eficaz para unirse selectivamente y eliminar lipoproteínas que no son HDLs de la muestra de fluido, pegada a una barra de reacción que comprende medios de montaje; en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL y dicha almohadilla de reactivos se unen juntas mediante un enlace adhesivo de copolímero de etileno ácido acrílico; y en el que dichos medios de montaje son eficaces para (i) mantener el dispositivo en una posición de distribución de muestra, en la que dicha almohadilla de ensayo de HDL y almohadilla de reactivos unidas están separadas de dicha matriz, y (ii) transferir dicho dispositivo a una posición de ensayo en la que la almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos unidas están en contacto con dicha matriz de distribución de muestra.

Description

Membranas adheridas que conservan porosidad y actividad biológica en dispositivo de ensayo para medir colesterol sérico asociado con lipoproteínas de alta densidad.
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a un dispositivo de análisis de colesterol asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés), un método para usar dicho dispositivo y un dispositivo de análisis de diagnóstico para llevar a cabo el método.
2. Antecedentes de la invención
Se sabe que la cantidad de colesterol presente en la sangre está relacionada con el riesgo de arteriopatía coronaria. El colesterol circula en la sangre en la forma unida a proteína predominantemente. Las proteínas que transportan el colesterol son lipoproteínas, que se subdividen en tres clases basadas en su densidad. Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, por sus siglas en inglés) son lipoproteínas ricas en triglicéridos que se sintetizan en el hígado y en última instancia se convierten en lipoproteínas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés), que transportan la mayor parte del colesterol plasmático en seres humanos. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son lipoproteínas que están implicadas en el catabolismo de las lipoproteínas ricas en triglicéridos, y en la eliminación del colesterol de los tejidos periféricos y su transporte al hígado. Se ha establecido una relación inversa entre los niveles séricos de HDL y el riesgo de cardiopatía. En particular, si la proporción de colesterol sérico asociado con HDL es baja, el riesgo de cardiopatía aumenta.
En vista de la importancia de los niveles relativos de colesterol sérico en la gestión y evaluación del riesgo de enfermedad aterógena, se ha empleado un considerable esfuerzo cribando grandes poblaciones tanto de individuos de riesgo normal como de riesgo alto para niveles séricos de HDL, LDL, así como colesterol total y triglicéridos. Se ha seguido la eficacia de los tratamientos de individuos de riesgo alto mediante el análisis regular de los niveles séricos de colesterol en los diversos compartimentos de lipoproteínas.
Un método para el análisis específico del colesterol transportados por las HDL se basa en la precipitación selectiva de las lipoproteínas que no son HDL en suero mediante un compuesto polianiónico, tal como sulfato de dextrano, heparina, o fosfowolframato, típicamente en presencia de un catión del grupo II, tal como Mg2+, Mn2+, o Ca2+. La especificidad y el grado de precipitación dependen de una variedad de factores, que incluyen el tipo y concentración del reactivo precipitante. En general, el orden de precipitación de partículas de colesterol sérico, con el aumento de concentración de polianión, es VLDL, LDL, y HDL. Las HDL generalmente permanecen solubles a concentraciones de heparina o sulfato de dextrano que precipitan completamente las partículas de densidad más baja, aunque las especies de apoE menores de HDL pueden co-precipitar con las partículas de más baja densidad. Por precipitación selectiva de las partículas de densidad más baja, se pueden determinar los niveles séricos de colesterol transportado por las HDL.
En un procedimiento típico de análisis de lípidos, se extrae un pequeño volumen de sangre y se centrifuga para producir un fluido transparente de muestra de suero o plasma. A continuación el fluido de muestra se reparte en alícuotas en varios tubos de ensayo, para la determinación de (a) colesterol sérico total, (b) triglicéridos, y (c) colesterol transportado por las HDL. La muestra de HDL se precipita, como se ha mencionado anteriormente, y las partículas de densidad más baja se separan por filtración o centrifugación antes de la detección del colesterol. A continuación las muestras se hacen reaccionar con una mezcla de enzimas que contiene colesterol esterasa, colesterol oxidasa, peroxidasa, y un colorante que se puede oxidar a un producto de color claramente distinto en presencia de H2O2. Los tubos se pueden leer espectrofotométricamente, y determinar los valores deseados de colesterol total, transportado por las HDL y transportado por las LDL.
A pesar de la precisión y la fiabilidad que se puede lograr con el análisis de colesterol en fase líquida que se acaba de describir, el ensayo tiene varias limitaciones para su uso en una criba extensa. Primero, el método usa una muestra de sangre venosa, que requiere un técnico entrenado para extraer y fraccionar la muestra de sangre, y repartir en alícuotas la sangre tratada en tubos de ensayo individuales. Por lo menos uno de los tubos de muestra (para la determinación de HDL) se debe tratar con un agente de precipitación y procesar adicionalmente para eliminar el material precipitado. Aunque algunos de estos procedimientos se pueden automatizar, las máquinas analíticas diseñadas para este propósito son caras y no están ampliamente disponibles fuera de los grandes hospitales.
Las patentes de EE.UU. en copropiedad Nº 5.213.964, 5.213.965, 5.316.196 y 5.451.370, describen métodos y dispositivos de análisis que superan sustancialmente muchos de los problemas anteriormente mencionados asociados con los procedimientos de análisis en líquido para medir niveles séricos de colesterol. En una realización, el dispositivo está diseñado para medir la concentración de colesterol asociado a las HDL en una muestra de sangre que también contiene partículas de LDL y VLDL. El dispositivo incluye una matriz de tamizado capaz de separar las lipoproteínas solubles y precipitadas según una muestra de fluido migra a través de la matriz. Se diseña un reservorio asociado con la matriz para liberar un agente de precipitación soluble, para precipitar selectivamente las LDL y VLDL, según la muestra de fluido se extrae en y a través de la matriz. Esto permite la separación de las HDL de las lipoproteínas precipitadas, basada en la migración más rápida de las HDL a través de la matriz de tamizado. La muestra de fluido, así empobrecida en lipoproteínas que no son HDL, a continuación se transfiere a una superficie de análisis donde se analiza el colesterol.
Los dispositivos anteriormente referidos, si bien representan un avance sobre los análisis en fase líquida, presentan la posibilidad de contaminación del camino de transporte del flujo con los reactivos de precipitación. Tales reactivos podrían interferir con la cuantificación de las HDL, o con otros análisis químicos que tengan lugar en otras regiones de un dispositivo multi-ensayo. La presente invención aborda y supera estos problemas.
Métodos y dispositivos adicionales para medir el colesterol transportado por las HDL en muestras de sangre se describen en los documentos EP 0408223 y EP 0415298 (Rittersdorf et al.), que describen un método de análisis continuo llevado a cabo en una tira reactiva que comprende las siguientes etapas y elementos correspondientes. La muestra de sangre se aplica en una capa de separación para separar los constituyentes celulares de la sangre. Impulsada por fuerzas de capilaridad o la gravedad, la muestra fluye a través de un portador adicional que contiene los agentes de precipitación solubles, que, después de disolverse en la muestra de suero, precipitan las lipoproteínas que no son HDL contenidas en la muestra. En un portador adicional, los constituyentes precipitados, más arriba, se separan por filtración de la muestra de suero para evitar su interferencia con la cuantificación posterior de las HDL. En el mismo portador, la muestra se transporta a una posición adyacente al portador de la cuantificación de las HDL, y se almacena hasta que se vaya a empezar la etapa de cuantificación de las HDL, en la que se cuantifica el colesterol transportado por las HDL en la muestra de suero mediante una reacción enzimática.
Una desventaja de este diseño de análisis es que el portador que funciona como un reservorio permite la migración de los constituyentes precipitados o de los reactivos solubles en la muestra, lo que puede interferir con la cuantificación de las HDL. Además, durante el almacenamiento de la muestra de suero, las HDL pueden ser atrapadas adhiriéndose a las fibras del portador, los reactivos de precipitación pueden causar reacciones indeseables adicionales, y el portador puede llegar a obstruirse por la muestra de suero seca.
La patente de EE.UU. Nº 5.135.716 (Thakore) describe dispositivos y métodos adicionales para la cuantificación de las HDL en una muestra fluida de sangre. En estos dispositivos, la muestra de fluido fluye continuamente, a través de un camino ininterrumpido, desde un pocillo de entrada a un portador para la cuantificación de las HDL. Por consiguiente, la capacidad para controlar el volumen de muestra que entra en el portador del análisis de las HDL, y para controlar las condiciones ambientales para el análisis de las HDL, es limitada. Los dispositivos tampoco prevén el análisis simultaneo de diversos analitos a partir de una sola muestra de fluido.
Es por lo tanto el objeto de la presente invención proporcionar un dispositivo de análisis de las HDL que supere las desventajas de la técnica anterior anteriormente indicadas.
Compendio de la invención
En un aspecto, la invención incluye un dispositivo de análisis, en el que la almohadilla de análisis se forma uniendo una almohadilla de ensayo de HDL y una almohadilla de reactivos donde la almohadilla de análisis conserva la porosidad suficiente para que la muestra pase a través de la almohadilla de reactivos a la almohadilla de ensayo de HDL. La almohadilla de análisis mantiene además la actividad biológica de los reactivos en la almohadilla de reactivos y en la almohadilla de ensayo de HDL.
En otro aspecto, la invención incluye un dispositivo de análisis y el método para usar el dispositivo para medir colesterol sérico asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra fluida de sangre que contiene lipoproteínas distintas de las HDLs. El dispositivo incluye una matriz de distribución de muestra, una almohadilla de ensayo de HDL en la que se puede analizar la concentración de HDL; y una almohadilla de reactivos que contiene un reactivo de unión eficaz para unir y retirar selectivamente las lipoproteínas que no son HDLs de la muestra de fluido. La almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos se unen por una unión adhesiva de copolímero de EAA.
En aún otro aspecto, la invención proporciona métodos para preparar dispositivos de análisis que comprenden las almohadillas de ensayo de HDL y de reactivos unidas.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es una vista lateral de una realización del dispositivo de análisis multi-analito;
la Fig. 2 es una vista en perspectiva, en forma de despiece, de un dispositivo de análisis multi-analito construido según una realización de la invención; y
la Fig. 3 es una vista lateral parcial del dispositivo de análisis multi-analito según una realización de la invención.
Descripción detallada de la invención I. Definiciones
Los términos de más abajo tienen los siguientes significados a menos que se indique lo contrario.
Un elemento está en "comunicación fluida" con otro elemento cuando un fluido es capaz de viajar desde un elemento al otro vía la acción capilar y/o la gravedad. Los elementos no necesitan estar en contacto directo; es decir, pueden intervenir otros elementos a través de los cuales puede pasar dicho fluido.
Una "almohadilla", como se utiliza en el contexto de una "almohadilla de distribución de muestra", "almohadilla de análisis", "almohadilla de ensayo de HDL", y "almohadilla de reactivos" está destinado a una alfombrilla o cojín fino y plano, o un trozo de material absorbente. Las almohadillas pueden constar de cualquier material, tal como una membrana porosa o una tira fibrosa, que puede contener reactivos impregnados o inmovilizados y a través de la cual el fluido se puede mover vía la acción capilar y/o la gravedad.
II. Dispositivo de Análisis
El dispositivo según la invención se ilustra en la Fig. 1 que se discutirá más adelante. Por conveniencia, se mantiene una numeración similar de elementos en todas las Figs. 1-3 para identificar características estructurales similares. El dispositivo está diseñado concretamente para determinar el colesterol sérico asociado con HDL (también denominado como colesterol asociado a las HDL, colesterol transportado por las HDL o simplemente colesterol de las HDL) utilizando un volumen pequeño de sangre o una muestra de suero, típicamente entre 10-50 \muL. Otros análisis, tales como colesterol total, triglicéridos, glucosa, nivel de alanina-aminotransferasa (ALT), aspartato-amino-transferasa (AST), Nitrógeno Ureico en Sangre (BUN, por sus siglas en inglés), o creatinina se pueden determinar simultáneamente a partir de la misma muestra. La determinación del colesterol asociado a las HDL también puede ser denominada simplemente como determinación de HDL o un análisis de HDL.
Con referencia inicial a las Figs. 1-3, se ilustran diversas realizaciones del dispositivo de análisis de analito múltiple, con la Fig. 2 mostrada en formato de despiece. Como mejor se ve en la Fig. 1, el dispositivo 14 de análisis de analito múltiple incluye un cuerpo principal o soporte 15 que define un pocillo 16 dimensionado y de tamaño adecuado para recibir una cantidad de muestra de sangre, típicamente entre aproximadamente 25-50 \muL. El pocillo puede estar en contacto fluido con una almohadilla 22 opcional de tamizado, que se puede llevar en una región 20 de muesca formada en el borde superior del soporte. El contacto fluido puede ser directo, o como en el dispositivo mostrado en la Fig. 1, proporcionado por un conducto capilar 18 formado en la placa de la base del pocillo. El soporte es preferentemente una placa plástica, con el pocillo, la región de la muesca y/o el capilar formados por métodos de moldeo o mecanizado estándar.
La almohadilla 22 de tamizado portada en la región 20 funciona para eliminar parcialmente materia de partículas grandes (incluyendo las células sanguíneas) según la muestra migra a través de la matriz de la almohadilla en una dirección de abajo a arriba como se muestra en la figura. La almohadilla 22 está preferentemente formada de una matriz de fibras de vidrio de material diseñado para drenar fluido acuoso por humectación superficial, y para retardar el movimiento de las células sanguíneas según la muestra de sangre es drenada a través de la matriz. Un ejemplo de almohadilla es un filtro de fibra de vidrio, tal como un filtro GF/D, PD008, o F145-02 disponibles de Whatman, que tiene una densidad de empaquetado de aproximadamente 0,16 g/cm^{3}, y un espesor de aproximadamente 1 mm. La almohadilla se dimensiona para absorber un volumen definido de fluido de muestra, preferentemente entre aproximadamente 15-25 \muL. La almohadilla 22 de tamizado puede contener adicionalmente reactivos de captura de células sanguíneas, tales como lectinas, anticuerpos específicos para las proteínas de la superficie de la membrana de los glóbulos rojos, trombina, o agentes de intercambio iónico. En una realización, la almohadilla puede contener reactivos para la eliminación de lipoproteínas que no son HDL, tal y como se describe más adelante.
La muestra entra en contacto con una tira alargada o matriz 26 de distribución de muestra. La almohadilla 22 de tamizado puede estar en contacto fluido con la matriz 26 entre el pocillo 16 y la matriz 26. En una realización preferida, la matriz 26 está formada de tres o más membranas separadas en comunicación fluida. En una realización en la que la matriz 26 está formada de tres membranas en comunicación fluida, como se ve en la Fig. 2, la membrana central 28 de aplicación de muestra distribuye el fluido de muestra a las membranas 30 y 32 de recolección de muestra. La matriz 26 puede comprender además una o más membranas de reactivos, no mostradas, dispuestas entre la membrana 28 de aplicación de muestra y la membrana 30 de recolección de muestra. La membrana de reactivos puede contener uno o más reactivos. En una realización, la membrana de reactivos puede contener uno o más reactivos para eliminar selectivamente LDL y VLDL como se describe más adelante. En otra realización, la membrana de reactivos puede funcionar como una mecha para extraer muestra para análisis múltiples. La matriz 26 también se puede soportar mediante cojines 27 de espuma u otros soportes, como se muestra en la Fig. 2. La matriz 26 es preferentemente de membranas múltiples formada por una matriz de fibras de vidrio. La densidad de empaquetado y espesor de la matriz son como para absorber y distribuir los volúmenes de fluido de muestra, por ejemplo 10-25 \muL, suministrados a la membrana de aplicación de muestra y a las membranas de recolección de muestra. La matriz tiene una densidad de empaquetado preferida entre aproximadamente 0,16 g/cm^{3} y 4,0 g/cm^{3}. Un ejemplo del material de la tira es un filtro de fibra de vidrio F-165-25A disponible en Whatman, que tiene una densidad de empaquetado de aproximadamente 0,2 g/cm^{3} y un espesor de aproximadamente 0,12 mm.
El dispositivo incluye además cuatro o más almohadillas 64, 66, 68, y 70 de ensayo, que son almohadillas absorbentes y humectables de ensayo de reacción, Cada almohadilla de ensayo utilizada en un análisis particular contiene reactivos dependientes del analito eficaces para producir un cambio dependiente del analito en la almohadilla que se puede detectar de una manera conocida, tal y como se describe más adelante. Todos o cualquier subconjunto integral de las almohadillas de ensayo se pueden emplear en un análisis particular.
Deseablemente, las almohadillas de ensayo son membranas porosas de polímero, que preferentemente tienen un espesor de aproximadamente 100-150 \mum y dimensiones laterales de aproximadamente 3 mm. el volumen de absorción de cada almohadilla está preferentemente entre aproximadamente 0,5-1,0 \muL. En una realización, alguna o todas las almohadillas de reacción son membranas asimétricas; es decir, membranas que tienen un gradiente de porosidad de un extremo al otro del espesor de la membrana.
En una realización, la almohadilla 64 de ensayo es una almohadilla de ensayo de HDL que contiene reactivos eficaces para producir un cambio en la almohadilla en respuesta a la presencia de HDL. En otra realización, la almohadilla 64 de ensayo de HDL es también una membrana polimérica, que contiene reactivos para analizar el nivel de HDL. Un ejemplo del material de la tira es una membrana asimétrica de polisulfona BTS-83 disponible en Pall Corporation (East Hills, NY). Si se desea, los reactivos de análisis de HDL, tales como la peroxidasa, se pueden inmovilizar en la membrana de la almohadilla de ensayo, según métodos bien conocidos para la inmovilización de enzimas (Véase por ejemplo la patente de EE.UU. Nº 4.999.287; patente de EE.UU. Nº 5.419.902; Blum, L. J. et al., Anal. Lett. 20(2):317-26 (1987); Kiang, S. W. et al., Clin. Chem. 22(8):1378-82 (1976); Guilbault, G. G., Ed., Modem Monographs in Analytical Chemistry, Vol. 2: Analytical Uses of Immobilized Enzymes (1984); Torchilin, V. P., Progress in Clinical Biochemistry and Medicine, Vol. 11: Immobilized Enzymes in Medicine (1991)).
Una almohadilla 74 de reactivos entra en contacto con la almohadilla 64 de ensayo de HDL y contiene las sustancias químicas para la precipitación del colesterol no transportado por las HDL. En una realización, la almohadilla de reactivos es del mismo material que la almohadilla de ensayo de HDL, es decir una membrana asimétrica de polisulfona. En una realización preferida, la almohadilla 74 de reactivos está compuesta de una membrana polimérica porosa, que tiene tamaños de poro de aproximadamente 1 \mum o menos. En el dispositivo mostrado en la Fig. 1, la almohadilla 74 de reactivos consiste en una sola membrana, sin embargo, la invención también contempla el uso de múltiples membranas apiladas, es decir hasta aproximadamente seis, donde por lo menos una y preferentemente cada membrana contiene reactivos para la unión a lipoproteínas que no son HDL.
La almohadilla de reactivos tiene preferentemente un espesor de aproximadamente 100-150 \mum, dimensiones laterales de aproximadamente 3 x 6 mm, y un volumen de absorción de aproximadamente 0,5-1,0 \muL. Contiene por lo menos un reactivo eficaz para eliminar selectivamente partículas de LDL y VLDL de la muestra de fluido. El reactivo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, o preferentemente un reactivo polianiónico de unión a LDL y VLDL. Tales reactivos, que son conocidos en la técnica, incluyen polisacáridos sulfonados, heparina, y fosfowolframato, en presencia o ausencia de un catión del grupo II, tal como Mg2+, Mn2+, o Ca2+. Un reactivo preferido es un polisacárido sulfonado, tal como sulfato de dextrano, que tiene un peso molecular típico de 50.000 a 500.000 daltons, opcionalmente en combinación con un cloruro o acetato de magnesio, opcionalmente tamponado para mantener el pH neutro. El reactivo puede ser un reactivo inmovilizado eficaz para enlazar, y eliminar de la muestra de fluido, lipoproteínas que no son HDL. La almohadilla de reactivos es eficaz para atrapar lipoproteínas que no son HDL enlazadas con la almohadilla de reactivos y evitar que entren en la almohadilla 64 de ensayo de HDL. En una realización, un reactivo, tal como la catalasa, que es eficaz para descomponer cualquier peróxido de hidrógeno generado que podría difundirse hacia abajo desde la almohadilla 64 de ensayo, se puede inmovilizar en la almohadilla 74 de reactivos.
La almohadilla 64 de ensayo de HDL y la almohadilla 74 de reactivos se adhieren juntas utilizando solo calor, como se describe en el Ejemplo Comparativo 6, o un copolímero de ácido acrílico EAA que se puede fundir como un adhesivo termoactivado, como se describe en los Ejemplos 1-3. La almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos combinadas se denomina almohadilla de análisis.
El dispositivo 14 también incluye una barra 60 de reacción, que es un soporte alargado, que puede ser transparente o tener ventanas, por ejemplo la ventana 76 (Fig. 2). La(s) ventana(s) permite(n) que se vea(n) las almohadillas 64, 66, 68 y 70 de ensayo a través del soporte. Estas ventanas pueden ser de material transparente o simplemente aperturas en el soporte. Las almohadilla de ensayo y la almohadilla de análisis se unen a la barra de reacción mediante un material adhesivo transparente o translúcido, por soldadura sónica, u otros métodos de unión adecuados.
La barra de reacción se monta sobre el soporte 15 mediante medios de montaje eficaces para (a) mantener el dispositivo en una posición de distribución de muestra, en la que las almohadillas de ensayo y la almohadilla de análisis están separadas de la matriz de distribución de muestra, la almohadilla de tamizado o el pocillo, y para (b) transferir el dispositivo a una posición de ensayo, en la que las almohadillas de ensayo y la almohadilla de análisis están en comunicación fluida con la matriz de distribución de muestra, la almohadilla de tamizado y el pocillo. Los medios de montaje también se pueden utilizar para romper dicha comunicación fluida después de que una cantidad deseada de muestra haya entrado en la almohadilla de análisis y/o en las almohadillas de ensayo, y/o después de un tiempo de contacto determinado, transfiriendo el dispositivo desde la posición de ensayo a una posición en la cual la almohadilla de análisis y/o las almohadillas de ensayo no están en comunicación fluida con el pocillo de muestra (que puede ser la misma que la posición de "distribución de muestra"). Tal transferencia se puede controlar vigilando la reflectancia en la superficie superior de las almohadillas de ensayo, que refleja la extensión de la humedad, como se describe en la patente de EE.UU. en copropiedad Nº 5.114.350. Alternativamente, cuando se conocen la capacidad de absorción y velocidad de absorción de muestra de los materiales de la almohadilla, la cantidad de muestra se puede controlar con suficiente precisión simplemente utilizando un tiempo de contacto predeterminado.
Los medios de montaje pueden incluir, por ejemplo, un par de miembros flexibles, tales como los bloques 71, 72 de elastómero, que actúan para desviar la almohadilla de análisis hacia una posición de no transferencia o distribución de muestra, en la que las almohadillas están separadas de la matriz de distribución de muestra, la almohadilla de tamizado, el conducto capilar o el pocillo de muestra. Por compresión o liberación de los miembros flexibles, se puede selectivamente establecer o separar la comunicación fluida entre la almohadilla de análisis, como se muestra en la Fig. 3. La comunicación fluida puede ser vía contacto directo o a través de un elemento intermedio. Los bloques de soporte se podrían comprimir por medio de muelles o una acción de tipo pistón. Alternativamente, dispositivos mecánicos externos podrían engranar el cuerpo principal 15 y/o la barra 60 de reacción y mover el uno hacia el otro. tales dispositivos pueden incluir componentes convencionales tales como abrazaderas, pistones, motores de velocidad gradual, engranajes de tornillo sin fin, o similares. Un ejemplo de sistema es el analizador Cholestech LDX® Analizer, un analizador automático y auto-contenido ventajoso por su uso con dispositivos de análisis tales como se describen en la presente memoria.
En una realización adicional, la almohadilla de ensayo de HDL comprende un biosensor, como se describe, por ejemplo, en la publicación PCT Nº WO 99/58966 (Dobson et al.). Este documento describe un dispositivo biosensor a microescala, que comprende una superficie conductora, una capa de material dieléctrico que recubre la superficie conductora, y una pluralidad de poros que se extienden a lo largo de la capa dieléctrica. Cada uno de los poros contiene u biopolímero en contacto con la superficie conductora, y puede actuar como un microelectrodo, convirtiendo una respuesta química en una señal eléctrica. En la práctica, se aplica un fluido que contiene un analito que se va a analizar a los poros de manera que esté en contacto con el biopolímero. En el dispositivo de análisis de HDL presente, esto se consigue cuando al almohadilla 64 de ensayo de HDL está en comunicación fluida con la muestra, es decir la posición de ensayo según se muestra en la Fig. 3.
El biopolímero dentro de los poros del microelectrodo es típicamente una enzima, tal como, para la medida de colesterol asociado a HDL, colesterol oxidasa. El colesterol se oxida por la colesterol oxidasa a la cetona correspondiente, liberando peróxido de hidrógeno, que a continuación se puede convertir en agua y oxígeno por la enzima peroxidasa. El oxígeno o el peróxido de hidrógeno se pueden medir después electroquímicamente. Los métodos electroquímicos que se pueden que se pueden utilizar incluyen métodos amperométricos, como en el electrodo de oxígeno de Clark, que mide la corriente producida por la reducción del oxígeno o la oxidación del peróxido de hidrógeno, o métodos voltamétricos. Se ha descrito el uso de la voltametría cíclica en microelectrodos para la medida de diversos analitos (véase por ejemplo R. J. Forster, Chem. Soc. Rev. 289-297 (1994)), tales como dopamina (Pihel et al., Anal. Chem. 68(13):2084-9 (1996)) y fulerenos (Soucaze-Guillous et al., Anal. Chem. 65(6):669-72 (1993)) así como peróxido de hidrógeno (Horrocks et al., Anal. Chem. 65(24):3605-14 (1993); Nowall et al., Electroanalysis 9(2):102-9 (1997); Dequaire et al., J. Am. Chem. Soc. 124(2):240-53 (2002)).
III. Preparación de la Almohadilla de Análisis Utilizando una Capa Adhesiva
Como se ve en la Fig. 1, según la invención la almohadilla de análisis se prepara formando una capa 80 adhesiva entre la almohadilla 74 de reactivos y la almohadilla 64 de ensayo de HDL, según se describe en los Ejemplos 1-3. Unidos por la capa 80 adhesiva de copolímero de EAA, la almohadilla 74 de reactivos y la almohadilla 64 de ensayo de HDL forman una estructura compuesta denominada como la almohadilla de análisis. Se apreciará que la capa adhesiva necesita ser suficiente solamente para asegurar las almohadillas opuestas, por ejemplo, mediante un sello periférico, o puede extenderse sobre la totalidad de las superficies de las almohadillas opuestas.
La capa adhesiva está formada por un copolímero de Etileno-Acido Acrílico. El copolímero tendrá típicamente, pero no necesariamente, un punto de fusión por debajo de la temperatura de desnaturalización de los reactivos de análisis de HDL utilizados o por debajo de una temperatura que esté dañando de otra manera a los reactivos de análisis de HDL. El EAA está disponible como dispersiones de tamaños de partícula diferentes en Michelman (Cincinnati OH, P/N MP 4990R con un punto de fusión de aproximadamente 75ºC). Un tamaño de partícula preferido es 30-500 nm, con un tamaño de partícula medio de aproximadamente 90 nm. Otros polímeros, que incluyen polietilenglicol, politereftalato de etileno, y alcohol polivinílico, también pueden encontrar uso como capa adhesiva. Estos copolímeros pueden ser reticulados y pueden adicionalmente copolimerizarse con un segundo polímero diferente. En otra realización, la capa adhesiva está formada por un adhesivo sensible a la presión o una emulsión de cera.
La almohadilla de análisis compuesta se prepara típicamente disolviendo el copolímero en un disolvente adecuado, a menudo una disolución acuosa. Se aplica una capa de la disolución o emulsión del copolímero a la almohadilla 74 de reactivos. Se puede utilizar cualquier método adecuado para recubrir la almohadilla, incluyendo sumergir las almohadillas en la emulsión o disolución, recubrir por pulverización la almohadilla o aplicar la disolución del polímero a la almohadilla con una mecha. La almohadilla se puede recubrir solo por un lado o por ambos lados. La almohadilla se seca durante un tiempo adecuado, es decir durante aproximadamente 20 minutos a 50ºC. A continuación se dispensa el reactivo de precipitación sobre el lado (mate) de poro grande de la membrana asimétrica.
Cuando la almohadilla de reactivos y la almohadilla de ensayo de HDL están ambas formadas por una membrana asimétrica, la almohadilla de reactivos y la almohadilla de ensayo de HDL se orientan de tal manera que el lado (brillante) de poro pequeño de la almohadilla de reactivos esté en contacto con el lado (mate) de poro abierto de la almohadilla de ensayo de HDL.
La capa adhesiva de copolímero entre la almohadilla 64 de ensayo de HDL y la almohadilla 74 de reactivos se forma aplicando calor a la almohadilla 74 de reactivos recubierta y a la almohadilla 64 de ensayo de HDL, mediante el cual el copolímero forma un enlace con el material adyacente de la almohadilla. Las almohadillas pueden calentarse utilizando cualquier dispositivo adecuado que proporcione calor a la temperatura y presión requeridas. Una temperatura preferida para calentar las almohadillas es aproximadamente 80ºC. Puede utilizarse cualquier máquina de laminación
adecuada.
La concentración de copolímero en la almohadilla de reactivos debe ser tal que la almohadilla de análisis conserve la porosidad para que la muestra fluya desde la almohadilla de reactivos a la almohadilla de ensayo de HDL. Las concentraciones adecuadas de copolímero para proporcionar adhesión son aproximadamente 4,0% a aproximadamente 10,0% de emulsión. La concentraciones preferidas de recubrimiento de polímero son 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% y 10%. Una emulsión preferida es una emulsión de EAA al 5,5%.
El reactivo de HDL se puede dispensar sobre la almohadilla 64 de ensayo de HDL mediante cualquier método adecuado antes o después de adherir la almohadilla de ensayo a la almohadilla de reactivos.
IV. Preparación de la Almohadilla de Análisis Utilizando Calor
La almohadilla de reactivos y la almohadilla de HDL se calientas por encima de aproximadamente 65ºC a aproximadamente 220ºC como se describe en la patente de EE.UU. Nº 6.596.112. En una realización preferida, cuando la almohadilla de reactivos y la almohadilla de ensayo de HDL se calientan por encima de aproximadamente 165ºC, las almohadillas se adhieren una a otra. En otras realizaciones preferidas, la almohadilla de reactivos y las almohadillas de ensayo de HDL se calientan por encima de aproximadamente 93ºC, 121ºC, 148ºC, 165ºC, 200ºC, o 205ºC. Las almohadillas están orientadas como se ha descrito más arriba. El reactivo de HDL se dispensa sobre la almohadilla de ensayo de HDL antes o después de adherir la almohadilla de ensayo a la almohadilla de reactivos. En una realización preferida, el reactivo de HDL se dispensa sobre la almohadilla de ensayo de HDL y/o las sustancias químicas para precipitar el colesterol transportado por lipoproteínas que no son HDL se dispensan sobre la almohadilla de reactivos después de adherir la almohadilla de ensayo a la almohadilla de reactivos. En una realización particularmente preferida, tanto el reactivo de HDL como las sustancias químicas para la precipitación se dispensan sobre la almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos, respectivamente, después de que la almohadilla de ensayo y la almohadilla de reactivos se adhieran juntas.
V. Dispensación de Reactivos sobre la Almohadilla de Análisis Utilizando Procedimiento de Impresión
En otra realización, uno o más reactivos se aplican a lados opuestos de una membrana pre-laminada utilizando un procedimiento de impresión que incorpora un cilindro grabado Gravure o Anilox. En esta realización, se utilizan menos de un volumen de saturación del reactivo de HDL y del reactivo de precipitación. Utilizando volúmenes de no saturación, los reactivos se pueden confinar en sus respectivas membranas. Un volumen de aproximadamente 80 ml/1000 pulgada^{2} (80 ml/0,645 m^{2}) es un volumen de saturación típico. Son adecuados volúmenes de reactivo en el intervalo de 25 a 55 ml/1000 pulgada^{2} (25 a 55 ml/0,645 m^{2}), sin embargo, en una realización, se utilizan 20 ml/1000 pulgada^{2} (20 ml/0,645 m^{2}) de reactivo. El reactivo de precipitación se puede aplicar antes o después del reactivo de HDL. En otras realizaciones de este procedimiento de impresión, otros reactivos que contienen dos componentes que deban ser mantenidos separados se pueden aplicar de modo semejante a como se ha descrito para los reactivos de HDL. Alternativamente, se puede aplicar un único reactivo a una única membrana sin laminar.
VI. Método de Análisis
En la operativa, una muestra de sangre se coloca en el pocillo 16, y se absorbe a través de la almohadilla 22 de tamizado, donde se eliminan las partículas grandes, incluyendo los glóbulos rojos, y desde ahí a la matriz 26 de distribución de muestra. En una realización, estas etapas tienen lugar mientras el dispositivo está en una fase de "distribución de muestra", de tal manera que la almohadilla de análisis no está en comunicación fluida con la matriz de distribución de muestra, la almohadilla de tamizado, el conducto capilar, o el pocillo de muestra.
La muestra de plasma viaja desde la membrana 28 de aplicación de la muestra a las membranas 30 y 32 de recolección de muestra. Cuando la muestra de plasma alcanza las membranas de recolección de muestra, el dispositivo se ajusta a una posición de ensayo, por ejemplo como la mostrada en la Fig. 3, preferentemente moviendo la barra 60 de reacción, para poner la almohadilla de análisis en comunicación fluida con la matriz de distribución de muestra. En esta posición, el fluido de muestra en la matriz de distribución de muestra se extrae a dentro de la almohadilla de reactivos mediante flujo capilar. El fluido de muestra se extrae posteriormente a dentro de la(s) almohadilla(s) de ensayo de HDL mediante flujo capilar. La barra de reacción se mantiene en esta posición hasta que se alcanza un grado de humectación deseado de la(s) almohadilla(s) de ensayo. A continuación la barra se mueve, si se desea, para romper la comunicación fluida entre la matriz de distribución de muestra y la almohadilla de análisis, cuando una cantidad deseada de fluido de muestra haya entrado en la(s) almohadilla(s) de análisis, y/o después de un tiempo de contacto apropiado.
Antes de entrar en contacto con la almohadilla 64 de ensayo de HDL, el plasma de muestra entra en contacto con un reactivo de precipitación o de unión, que está contenido en una almohadilla 74 de reactivos separada, de tal manera que las lipoproteínas que no son JDL se unen al respectivo portador. El dispositivo es así eficaz para eliminar lipoproteínas que no son HDL del suero, al tiempo que permite el paso del fluido de muestra que contiene HDL en la fase líquida a la almohadilla 64 de ensayo de HDL con estos elementos (por ejemplo Fig. 2). Una ventaja de esta realización es que la matriz de distribución de muestra y los elementos corriente arriba no contienen reactivos de unión a lipoproteínas que no son HDL; tales reactivos están presentes solamente en la almohadilla 74 de reactivos. Por lo tanto, se elimina la posibilidad de interferencia de estos reactivos, en análisis de analitos distintos de HDL.
Durante la operación, en realizaciones tales como las ilustradas en las Figs. 1-3, según el fluido de muestra pasa a través de la almohadilla de análisis de HDL, que comprenden las almohadillas 74 y 64, su borde de ataque pasa en una dirección ascendente a través de la almohadilla 74, donde las lipoproteínas que no son HDL reaccionan y son atrapadas, y directamente a la almohadilla 64 de ensayo adyacente, donde las HDL reaccionan con los reactivos de análisis en la misma, para la medida del colesterol asociado a HDL. Porciones adicionales de la muestra continúan estando en contacto con la almohadilla 74 durante este tiempo, y avanzan desde la almohadilla 74 a la almohadilla 64 de una manera similar, hasta que se alcanza la capacidad de absorción de la almohadilla 64. En consecuencia, la cuantificación del colesterol asociado a HDL en la almohadilla 64 de ensayo se da concurrentemente con la reacción de unión que tiene lugar en la almohadilla 74 de reactivos. Preferentemente, el volumen de fluido de muestra transferido a la almohadilla de análisis de HDL (que comprende las almohadillas 74 y 64) desde la matriz de distribución de muestra es igual o mayor que la capacidad de absorción de la almohadilla 64 de ensayo, y menor que o igual a la capacidad de absorción combinada de la almohadilla 64 de ensayo y la almohadilla 74 de reactivos.
En estas realizaciones, cuando el fluido de muestra entra en contacto con la almohadilla 74 de reactivos que contiene los reactivos de unión, esta última está en contacto directo con la almohadilla 64 de ensayo de HDL, limitando así el contacto temporal de la muestra de sangre con los reactivos de unión antes de la reacción de análisis de HDL. Así, la preparación de la muestra y la evaluación de las HDL se llevan a cabo en etapas separadas, en las que la preparación de la muestra incluye, por ejemplo, la separación por filtración los componentes celulares de la sangre y, opcionalmente, el almacenamiento temporal de la muestra de sangre y la adaptación de la muestra de sangre a requerimientos o condiciones de ensayo tales como temperatura, presión y atmósfera del entorno. Debido a que se reduce el contacto temporal de la muestra de sangre con los diferentes reactivos, se evita cualquier interferencia química con la evaluación de las HDL. Si se desea, el análisis puede interrumpirse durante un tiempo deseado después de la aplicación de la muestra y eliminación de los componentes celulares, pero antes de entrar en contacto con los reactivos de unión, por ejemplo para ajustar la atmósfera circundante o adaptar la temperatura ambiental para apoyar el ensayo. Esto se consigue manteniendo el dispositivo en la posición de distribución de muestra. A este fin, se diseña la matriz de distribución de muestra para servir adicionalmente como reservorio, si se necesita.
La almohadilla de ensayo de HDL contiene reactivos para la cuantificación del colesterol asociado con HDL. Preferentemente, estos incluyen colesterol esterasa, para liberar colesterol libre a partir de las HDL, colesterol oxidasa, para producir H2O2 por reacción con el colesterol libre, peroxidasa, y un sistema de colorante acoplado que se convierte, en presencia de peroxidasa y H2O2, en un producto de reacción de señal distintivamente coloreada. La almohadilla de ensayo también puede comprender un biosensor eficaz para cuantificar electroquímicamente H2O2 y/o O2, según se ha descrito más arriba.
Las restantes almohadillas 66, 68, y 70 de ensayo también contienen reactivos de análisis que producen un cambio en la almohadilla, que se puede detectar ópticamente, o visualmente o por un detector, de una manera conocida. En realizaciones preferidas del dispositivo y método actuales, los reactivos de unión a lipoproteínas que no son HDL están localizados en la almohadilla 74 de reactivos, y no en la matriz de distribución de muestra o en la almohadilla de tamizado. En esta realización, se elimina la posibilidad de interferencia de estos reactivos, en análisis de analitos distintos de HDL.
Preferentemente, cada una de las almohadillas de ensayo contiene componentes reactivos para producir H2O2 vía reacción del analito con una enzima; el H2O2 posteriormente convierte un reactivo sustrato en un producto de reacción de señal coloreada, o se mide electroquímicamente, como se ha descrito más arriba. Las reacciones enzimáticas coloreadas que emplean una variedad de oxidasas específicas para el sustrato, para la generación enzimática de H2O2, y posterior oxidación de un colorante para formar un producto de reacción coloreado, son bien conocidas.
Se puede utilizar un dispositivo que tenga cuatro o más almohadillas de ensayo para medir simultáneamente colesterol transportado por HDL (HDL), glucosa, colesterol total (TC), lípidos triglicéridos (TRG), ALT, AST, BUN, y/o creatinina. Cada almohadilla contiene los componentes de la ruta común descritos anteriormente (peroxidasa y un sistema de colorante acoplado) de tal manera que el H2O2 generado da lugar a un producto de reacción de señal coloreada. La almohadilla de ensayo del colesterol total, que se expone al suero sin exposición a un reactivo de unión o de precipitación, y las almohadillas de ensayo de HDL incluyen, además de los componentes de la ruta común, colesterol esterasa, para liberara el colesterol esterificado en forma de colesterol libre a partir de las lipoproteínas séricas, que incluyen partículas de HDL, LDL, y VLDL, y colesterol oxidasa, para producir H2O2 por reacción con el colesterol libre en el fluido de muestra, como se ha descrito más arriba. La almohadilla de análisis de glucosa incluye glucosa oxidasa, además de los componentes de la ruta común. La almohadilla de triglicéridos incluye, además de los componentes de la ruta común, lipasa, L-glicerol cinasa, y L-glicerol-3-fosfato oxidasa, para generar H2O2 a partir del triglicérido, vía el L-glicerol-3-fosfato intermedio. La muestra de suero drenada dentro de la almohadilla de TRG no se expone a reactivos de unión o de precipitación, y contiene así todas las lipoproteínas séricas, así la señal de TRG representa los triglicéridos séricos totales.
También pueden emplearse almohadillas estándar de referencia, véase, por ejemplo, el sistema descrito en la patente de EE.UU. en co-propiedad Nº 5.114.350.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran pero no tienen en modo alguno la intención de limitar la invención.
Ejemplo 1 Preparación de la Almohadilla de Ensayo de HDL
Una membrana de polisulfona BTS-83 se cargó con reactivo de HDL a un volumen de carga de 77 \mul/6,45 cm^{2} (77 \mul/in2) y se secó durante 20 minutos a 50ºC en un proceso de rollo continuo. Se prepararon las almohadillas de ensayo que contenían los siguientes reactivos de HDL: 36,5 Unidades/ml de colesterol oxidasa, 215 Unidades/ml de colesterol esterasa, 200 Unidades/ml de peroxidasa, 1,88 mg/ml de 4-aminoantipirina, y 12,5 mg/ml de TOOS (ácido 3-[etil(3-metilfenil)amino]-2-hidroxi- propanosulfónico). Pueden prepararse longitudes de por ejemplo 30,48 m (100 pies) de esta manera y cortarse para encajar en los dispositivos de análisis.
Ejemplo 2 Preparación de la Almohadilla de Reactivos con Reactivo de Unión
Se aplicó una disolución acuosa de reactivo que contenía la dispersión de EAA a una concentración de 5,5% a la membrana de polisulfona BTS-83 en un tanque de inmersión y se secó durante 20 minutos a 50ºC en un proceso de rollo continuo. Luego, se dispensó una disolución acuosa de reactivo que contenía 1-5 mg/ml de sulfato de dextrano (PM 500.000) y Mg(OAc)2 35 mM sobre la misma membrana utilizando una bomba de jeringa para dosificar el reactivo sobre una superficie de la membrana. Pueden prepararse longitudes de por ejemplo 30,48 m (100 pies) de esta manera y cortarse para encajar en los dispositivos de análisis.
Ejemplo Comparativo 3
Preparación de la Almohadilla de Análisis
Se prepararon una almohadilla de ensayo de HDL y una almohadilla de reactivos según los Ejemplos 1 y 2, respectivamente. Las almohadillas se orientaron con las capas que tenían el lado brillante de la almohadilla de reactivos (tamaño de poro pequeño) en contacto con el lado mate o de poro abierto de la almohadilla de ensayo de HDL. Las dos membranas se pasaron a través de una máquina de laminación que calentó las membranas a 80ºC durante 20 segundos en un proceso de rollo continuo.
Ejemplo 4 Procedimiento de Análisis Representativo
Se llevó a cabo un análisis típico en un analizador LDX®, utilizando una almohadilla de análisis, preparada esencialmente como se describe en el Ejemplo 3. Se cortaron a mano secciones de las almohadillas pegadas al tamaño de la membrana de reacción y se unieron a la barra de reacción. Alternativamente, se pueden aplicar almohadillas de análisis laminadas a barras de reacción en un proceso de rollo continuo utilizando soldadura ultrasónica. Se cargó una muestra de suero en el pocillo de muestra. Después de la distribución de la muestra, se hizo entrar en contacto a la barra de reacción con las almohadillas adheridas durante aproximadamente 4 segundos, un tiempo suficiente para transferir suficiente suero para llenar la almohadilla de ensayo de HDL, después de lo cual la barra se devolvió a su posición original. Se dejó desarrollar el color durante 3 minutos y se controló la reflectancia mediante el analizador LDX®.
Ejemplo 5 Concentración del Copolímero de Etileno Ácido Acrílico en la Almohadilla de Reactivos
Se varió la concentración de EAA en la almohadilla de reactivos para determinar la porosidad de la membrana. La almohadilla de reactivos se preparó esencialmente como en el Ejemplo 2. Se aplicaron diluciones seriadas de EAA a la almohadilla de reactivos empezando con una disolución al 20%. Las almohadillas de reactivo se adhirieron según el Ejemplo 3 a una almohadilla de ensayo de HDL. El lado mate de la almohadilla de reactivos se probó con una disolución acuosa diluida de azul de Evan para determinar la penetración y/o difusión de la disolución coloreada a través de la almohadilla de reactivos y dentro de la almohadilla de ensayo de HDL. La concentración más alta de EAA que permitió fácilmente la penetración y/o difusión de la disolución fue aproximadamente 10% de EAA.
Ejemplo Comparativo 6
Preparación de la Almohadilla de Análisis Utilizando Calor
Se laminaron juntas dos capas de BTS 83, sin ningún reactivo aplicado, en un proceso de rollo continuo. La orientación de las membranas es como la descrita para el Ejemplo 3. Una disolución acuosa de sulfato de Dextrano (PM 50.000) y Mg(OAc)2 se recubre sobre el lado de poro abierto del laminado utilizando una máquina de recubrimiento con rodillos de huecograbado estándar. La máquina de recubrimiento con rodillos de huecograbado se selecciona para dispensar un volumen de no saturación del reactivo sobre una única capa del laminado. Después del secado, se aplica el reactivo de HDL a la membrana opuesta de una manera similar. Los reactivos se concentran desde los niveles mostrados en el Ejemplo 1 y 2 para compensar la reducción del volumen que se va a aplicar.

Claims (33)

1. Un dispositivo de análisis para medir el colesterol sérico asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que también contiene lipoproteínas diferentes de las HDLs, comprendiendo el dispositivo:
una matriz de distribución de muestra;
una almohadilla de ensayo de HDL en la que se puede analizar la concentración de HDL; y
una almohadilla de reactivos que contiene un reactivo de unión eficaz para unirse selectivamente y eliminar lipoproteínas que no son HDLs de la muestra de fluido, pegada a una barra de reacción que comprende medios de montaje;
en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL y dicha almohadilla de reactivos se unen juntas mediante un enlace adhesivo de copolímero de etileno ácido acrílico;
y
en el que dichos medios de montaje son eficaces para (i) mantener el dispositivo en una posición de distribución de muestra, en la que dicha almohadilla de ensayo de HDL y almohadilla de reactivos unidas están separadas de dicha matriz, y (ii) transferir dicho dispositivo a una posición de ensayo en la que la almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos unidas están en contacto con dicha matriz de distribución de muestra.
2. El dispositivo según cualquier reivindicación precedente, en el que por lo menos una de dicha almohadilla de ensayo de HDL o dicha almohadilla de reactivos se compone de una capa de polisulfona.
3. El dispositivo según cualquier reivindicación precedente, que además comprende una almohadilla de tamizado eficaz para eliminar los componentes celulares de la muestra de fluido sanguíneo antes de que la muestra entre en contacto con dicha matriz de distribución de muestra.
4. El dispositivo según la reivindicación 3, que además comprende un cuerpo casete para contener dicha almohadilla de tamizado, comprendiendo dicho cuerpo casete un pocillo para contener dicha muestra de fluido sanguíneo en comunicación fluida con dicha almohadilla de tamizado.
5. El dispositivo según una cualquiera de la reivindicaciones 3 o 4, que además comprende una barra de reacción que comprende medios de montaje eficaces para unir dicha barra de reacción con dicho cuerpo casete.
6. El dispositivo según cualquier reivindicación precedente, en el que dicho reactivo comprende un reactivo de unión polianiónico.
7. El dispositivo según la reivindicación 6, en el que dicho reactivo de unión polianiónico incluye un polisacárido sulfonado.
8. El dispositivo según cualquier reivindicación precedente, en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL contiene reactivos que producen un cambio detectable en presencia de colesterol transportado por HDL.
9. El dispositivo según la reivindicación 8, en el que dicho cambio se puede detectar ópticamente.
10. El dispositivo según cualquier reivindicación precedente, en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL comprende un biosensor.
11. El dispositivo según la reivindicación 10, en el que dicho biosensor es eficaz para medir electroquímicamente la producción de oxígeno o peróxido de hidrógeno.
12. Un método de preparar un dispositivo adecuado para medir colesterol sérico que comprende:
proporcionar una almohadilla de reactivos y una almohadilla de ensayo de HDL, estando formada por lo menos la almohadilla de reactivos de una membrana asimétrica de polisulfona que tiene un gradiente de porosidad desde poros más pequeños a poros más grandes;
unir dicha almohadilla de ensayo de HDL a dicha almohadilla de reactivos mediante un enlace adhesivo de copolímero de etileno ácido acrílico; y
aplicar (i) reactivos de ensayo de HDL a dicha almohadilla de ensayo de HDL, y (ii) un reactivo eficaz para unirse selectivamente y eliminar las lipoproteínas que no son HDLs de una muestra de fluido a dicha almohadilla de reactivos para formar dicho dispositivo.
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13. El método según la reivindicación 12, en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL y dicha almohadilla de reactivos se calientan a una temperatura de 65ºC a 220ºC.
14. Un método de preparar un dispositivo adecuado para medir colesterol sérico que comprende:
recubrir una almohadilla de reactivos con un copolímero de etileno ácido acrílico;
aplicar (i) reactivos de ensayo de HDL a una almohadilla de ensayo de HDL, y (ii) un reactivo eficaz para unirse selectivamente y eliminar las lipoproteínas que no son HDLs de una muestra de fluido a dicha almohadilla de reactivos;
calentar para adherir dicha almohadilla de ensayo de HDL a dicha almohadilla de reactivos para formar una unión porosa que conserve una porosidad adecuada para que una muestra de fluido fluya desde la almohadilla de reactivos a la almohadilla de ensayo de HDL para formar dicho dispositivo.
15. Un método según la reivindicación 14, en el que el copolímero de etileno ácido acrílico es una emulsión del 4,0% al 10,0%.
16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, que además comprende la etapa de secar dicha almohadilla de reactivos después de dicha etapa de recubrimiento.
17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que cada una de dichas almohadilla de ensayo de HDL y almohadilla de reactivos están formadas por una membrana asimétrica que tiene un gradiente de porosidad de tamaño de poro desde poros más pequeños a más grandes; que además comprende la etapa de orientar la almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos de tal manera que el lado de poros más pequeños de la almohadilla de reactivos se enfrenta al lado de poros más grandes de la almohadilla de ensayo de HDL.
18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que dicha etapa de calefacción comprende aplicar una temperatura de entre 75ºC y 90ºC.
19. Un método de medir colesterol sérico asociado con lipoproteínas de alta densidad (HDL) en una muestra de fluido sanguíneo que también contiene lipoproteínas diferentes de HDLs, que comprende:
poner en contacto un reservorio de muestra que contiene la muestra con un laminado que comprende (i) una almohadilla de ensayo de HDL que tiene un indicador detectable de colesterol transportado por HDL, (ii) una almohadilla de reactivos que contiene un reactivo eficaz para unirse selectivamente y eliminar las lipoproteínas que no son HDLs de la muestra de fluido;
en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL y dicha almohadilla de reactivos se unen juntas mediante un enlace adhesivo de copolímero de etileno ácido acrílico;
y
en el que dicha muestra de fluido sanguíneo pasa a través de dicho laminado por la acción capilar y/o de la gravedad para permitir la medida de la concentración de HDL.
20. El método según la reivindicación 19, en el que el contacto entre dicho laminado y dicho reservorio de muestra se rompe cuando una cantidad deseada de muestra se ha transferido al laminado.
21. El método según la reivindicación 19 o 20, en el que dicho reactivo comprende un polisacárido sulfonado.
22. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que por lo menos una de dichas almohadillas de ensayo de HDL o dicha almohadilla de reactivos comprende una membrana polimérica porosa.
23. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que dicha almohadilla de reactivos comprende capas múltiples apiladas, al menos una de las cuales contiene un reactivo eficaz para unirse a lipoproteínas que no son HDLs.
24. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en el que dicha medida de la concentración de HDL es vía detección óptica.
25. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en el que dicha almohadilla de ensayo de HDL comprende un biosensor.
26. El método según la reivindicación 25, en el que dicho biosensor es eficaz para medir electroquímicamente la producción de oxígeno o peróxido de hidrógeno.
27. El método según la reivindicación 12, en el que cada una de dicha almohadilla de ensayo de HDL y dicha almohadilla de reactivos está formada por una membrana asimétrica de polisulfona que tiene un gradiente de porosidad de tamaño de poro desde poros más pequeños a más grandes, comprendiendo dicho método además:
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antes de dicha calefacción, orientar la almohadilla de reactivos con la almohadilla de ensayo de HDL de tal manera que el lado de poro más pequeño de la almohadilla de reactivos entra en contacto con el lado de poro más grande de la almohadilla de ensayo de HDL.
28. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que dicha unión se extiende a lo largo de la periferia de por lo menos una de la almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos.
29. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que dicha unión se extiende a lo largo de toda la superficie de por lo menos una de la almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos.
30. El método de la reivindicación 12, en el que la periferia de por lo menos una de la almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos se calienta.
31. El método de la reivindicación 12, en el que toda la superficie de por lo menos una de la almohadilla de ensayo de HDL y la almohadilla de reactivos se calienta.
32. El método de la reivindicación 14, en el que la periferia de la almohadilla de reactivos se recubre con el copolímero de etileno ácido acrílico.
33. El método de la reivindicación 14, en el que toda la superficie de la almohadilla de reactivos se recubre con el copolímero de etileno ácido acrílico.
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