JP2006521823A - 高密度リポタンパク質に関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイス中の多孔性および生物学的活性を保持する接着膜 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高密度リポタンパク質(HDL)関連コレステロールアッセイパッド、このパッドを用いる方法、およびこの方法を実施するための診断アッセイデバイスに関する。
血液中に存在するコレステロールの量は、冠状動脈疾患のリスクに関連していることが知られている。コレステロールは、主に、血液中を、タンパク質結合形態で循環する。コレステロールを輸送するタンパク質は、リポタンパク質であり、これらは、それらの密度を基に3つのクラスに分割される。非常に低い密度のリポタンパク質(VLDL)は、肝臓中で合成されそして最終的に低密度リポタンパク質(LDL)に変換されるトリグリセリドリッチのリポタンパク質であり、これは、ヒトにおいて大部分の血漿コレステロールを輸送する。高密度リポタンパク質(HDL)は、トリグリセリドリッチなリポタンパク質の異化、ならびに末梢組織からのコレステロールの除去および肝臓への輸送に関与しているリポタンパク質である。血清HDLレベルと冠状動脈疾患との間の逆の関係が確立されている。特に、HDLと関連する血清コレステロールの比率が低いと、冠状動脈疾患のリスクは増加する。
1つの局面では、本発明は、HDL試験パッドと試薬パッドを結合することによって形成されるアッセイパッドを含み、ここで、このアッセイパッドは、サンプルが、試薬パッドからHDL試験バッドに通過するに十分な多孔度を保持している。このアッセイパッドは、さらに、上記試薬パッドおよびHDL試験パッド上の試薬の生物学的活性を保持している。
(I.定義)
以下の用語は、他であることが示されなければ、以下の意味を有している。
本発明によるデバイスは図1〜3に示され、これらは、以下に論議される。便宜のため、類似の要素の番号付けは、同様の構造特徴を識別するためにすべての図1〜3で保持される。このデバイスは、代表的には10〜50μlの小容量の血液または血清サンプルを用い、特に、HDLに関連する血清コレステロール(HDL関連コレステロール、または単にHDLコレステロールとも称される)を決定するために設計されている。総コレステロール、トリグリセリド、グルコース、アラニントランスフェラーゼレベル(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、血中尿素窒素(BUN)、またはクレアチニンのようなその他のアッセイは、同じサンプルから同時に決定され得る。HDL関連コレステロールの決定はまた、単に、HDLの決定またはHDLアッセイとも呼ばれ得る。
図1に見られるように、1つの実施形態では、アッセイパッドは、実施例1〜3に記載されるように、試薬パッド74とHDL試験パッド64との間に接着層80を形成することにより調製される。接着層80によって接合され、試薬パッド74とHDL試験パッド64とは、アッセイパッドと称されるコンポジット構造体を形成する。この接着層は、例えば、周縁シールによって対向するパッドを固定するために十分であることのみが必要であるか、または対向するパッドの全体表面の上に延び得ることが認識される。
1つの実施形態では、アッセイパッドは、実施例6に記載のように、試薬パッドまたはHDL試験パッドの少なくとも1つを少なくとも部分的に溶融するに十分な温度で付与された熱を用いて、試薬を含む試薬パッド74をHDL試験パッド64に接着することにより調製される。この試薬パッドおよびHDLパッドは、本明細書に参考として援用される米国特許第6,596,112号に記載されるように、約65℃を超えて約220℃まで加熱される。好ましい実施形態では、試薬パッドおよびHDL試験パッドが約165℃を超えて加熱されるとき、これらパッドは、互いに接着するようになる。その他の好ましい実施形態では、試薬パッドおよびHDL試験パッドは、約93℃、121℃、148℃、165℃、200℃、または205℃を超えて加熱される。これらパッドは、上記のように配向される。HDL試薬は、試験パッドを試薬パッドに接着する前、または後にHDL試験パッド上に分与される。好ましい実施形態では、試験パッドが試薬パッドに接着した後、上記HDL試薬が、HDL試験パッド上に分与され、および/または非HDLコレステロールの沈殿のための化学薬品が、試薬パッド上に分与される。特に好ましい実施形態では、HDL試薬および沈殿のための化学薬品の両方が、試験パッドおよび試薬パッドが一緒に接着された後、HDL試験パッドおよび試薬パッド上にそれぞれ分与される。
別の実施形態では、食刻されたGravureシリンダーまたはAniloxシリンダーを取り込むプリントプロセスを用いて、1つ以上の試薬が予備積層された膜の対向する側面に付与される。この実施形態では、飽和容量より少ないHDL試薬および沈殿試薬が用いられる。非飽和容量を用いることにより、これら試薬は、それらの個々の膜に閉じ込められ得る。約80ml/1000インチ2(80ml/0.645m2)の容量が、代表的な飽和容量である。試薬の25〜55ml/1000インチ2(25〜55ml/0.645m2)の容量が適切であるが、1つの実施形態では、20ml/1000インチ2(20ml/0.645m2)の試薬が用いられる。沈殿試薬は、このHDL試薬の前または後に付与され得る。このプリンティングプロセスのその他の実施形態では、別個に維持されなければならない2つの成分を含むその他の試薬が、HDL試薬について記載されるのと同様の様式で付与され得る。あるいは、単一の試薬が、単一の積層されていない膜に付与され得る。
操作においては、血液サンプルがウェル16中に配置され、そして篩パッド22を通って吸収され、そこで、赤血球細胞を含む大きな粒子が除去され、そしてそれから、サンプル分与アレイ26に入る。1つの実施形態では、これらのステップは、上記デバイスが、アッセイパッドが、サンプル分与アレイ、篩パッド、毛細導管、またはサンプルウェルと流体連通していないような、「サンプル分与」ステージにある間に起こる。
BTS−83ポリスルホン膜に、77μl/インチ2の充填容量でHDL試薬を充填し、そして連続ロールプロセスで20分間50℃で乾燥した。以下のHDL試薬を含む試験パッドを調製した:コレステロールオキシダーゼ36.5単位/ml、コレステロールエステラーゼ215単位/ml、ペルオキシダーゼ200単位/ml、4−アミノアンチピリン1.88mg/ml、およびTOOS(3−[エチル(3−メチルフェニル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)12.05mg/ml。例えば、100フィートの長さが、この様式で調製され得、そしてアッセイデバイスに適合するために切断され得る。
5.5%の濃度でEAA分散物を含む試薬水溶液を、浸漬タンク内でBTS−83ポリスルホン膜に付与し、そして連続ロールプロセスで20分間50℃で乾燥した。次いで、1〜5mg/mlの硫酸デキストラン(500,000MW)および35mMのMg(OAc)2を含む試薬水溶液を、上記膜の1つの表面上への試薬を計測するためにシリンジポンプを用いて、同じ膜上に分散した。例えば、100フィートの長さが、この様式で調製され得、そしてアッセイデバイスに適合するために切断され得る。
HDL試験パッドおよび試薬パッドを、それぞれ、実施例1および2に従って、調製した。これらパッドは配向されて、試薬パッドのピカピカの側面(小ポアサイズ)を有する層は、HDL試験パッドの鈍いまたは開放ポア側面に接触している。これら2つの膜は、これら膜を80℃に20秒間連続ロールプロセスで加熱した積層機械を通過させた。
代表的なアッセイを、本質的に実施例3に記載のように調製されたアッセイパッドを用い、LDX(登録商標)分析器中で実施した。接着されたパッドのセクションを、反応膜サイズに手で切断し、そして反応バーに接着した。あるいは、積層されたアッセイパッドは、超音波溶接を用いる連続ロールプロセスで反応バーに付与され得る。血清サンプルをサンプルウェル中に充填した。サンプル分与の後、反応バーを、血清がHDL試験パッドを充填するに十分な血清を移動させるに十分な時間である約4秒間、接着されたパッドと接触し、その後、このバーをその元の位置に戻した。色を3分間発色させ、そして反射率をLDX(登録商標)分析器でモニターした。
試薬パッド上のEAAの濃度を変動させて膜の多孔度を決定した。試薬パッドは、本質的に実施例2に従って調製した。EAAの系列希釈を、20%溶液で開始して試薬パッドに付与した。これら試薬パッドは、実施例3に従って、HDL試験パッドに接着した。試薬パッドの鈍い側面をEvans blueの希釈水溶液を用いて試験し、HDL試験パッドまで、この試薬パッドを通る着色溶液の透過および/または拡散を決定した。この溶液の容易な透過および/または拡散を可能にしたEAAの最高の濃度は、約10%EAAであった。
BTS83の2つの層を、付与される任意の試薬なしで、連続ロールプロセスで一緒に積層する。膜の配向は、実施例3について記載されるようである。硫酸デキストラン(50,000MW)およびMg(OAc)2の水溶液を、標準的なグラビアコーター(gravure coater)を用いてこの積層体の開放ポア側面上にコートする。このグラビアコーターは、非飽和容量の試薬をこの積層体の単一層上に分与するよう選択される。乾燥後、HDL試薬は、同様の様式で対向する膜に付与される。これら試薬は、実施例1および2に示されるレベルから濃縮され、付与される減少した容量を補償する。
Claims (30)
- 高密度リポタンパク質(HDL)以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のHDLと関連する血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスであって:
サンプル分与アレイ;
HDL濃度がアッセイされ得るHDL試験パッド;および
該血液サンプルから非HDLを選択的に結合し、かつ除去するに有効な結合試薬を含む試薬パッドを備え、ここで、該HDL試験パッドおよび該試薬パッドが接合されている、デバイス。 - 前記HDL試験パッドおよび該試薬パッドが、熱形成結合よって接合されている、請求項1に記載のデバイス。
- 前記HDL試験パッドおよび該試薬パッドが、アクリル酸コポリマー接着剤結合によって接合されている、請求項1に記載のデバイス。
- 前記アクリル酸コポリマーが、エチレンアクリル酸コポリマーである、請求項3に記載のデバイス。
- 前記HDL試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも1つがポリスルホン層から構成される、請求項1〜4のいずれかに記載のデバイス。
- 前記血液サンプルから、細胞成分を、該サンプルが前記分与サンプルアレイに接触する前に除去するに有効な篩パッドをさらに備える、請求項1〜5のいずれかに記載のデバイス。
- 前記篩パッドを含むためのカセット本体をさらに備え、該カセット本体が、前記血液サンプルを含むための、かつ該篩パッドと流体連通するウェルを備える、請求項1〜6のいずれかに記載のデバイス。
- 前記カセット本体に反応バーを取り付けるために有効な取り付け手段を備える反応バーさらに備える、請求項1〜7のいずれかに記載のデバイス。
- 前記試薬が、結合性ポリアニオン試薬を含む、請求項1〜8のいずれかに記載のデバイス。
- 前記結合性ポリアニオン試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項9に記載のデハイス。
- 前記HDL試験パッドが、HDLコレステロールの存在下で検出可能な変化を生成する試薬を含む、請求項1〜10のいずれかに記載のデバイス。
- 前記変化が、光学的に検出され得る、請求項11に記載のデバイス。
- 前記HDL試験パッドが、バイオセンサーを備える、請求項1〜12のいずれかに記載のデバイス。
- 前記バイオセンサーが酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項13に記載のデバイス。
- 血清コレステロールを測定するために適したデバイスを調製する方法であって:
試薬パッド、および小ポア側面および開放ポア側面を有する非対称ポリスルホン膜から形成されたHDL試験パッドを提供する工程;
該試薬パッドを、HDL試験パッドと、該試薬パッドの小ポア側面が該HDL試験パッドの開放ポア側面と接触するように配向する工程;
該HDL試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程;および
該デバイスを形成するために、(i)該試験パッドにHDL試験試薬を、そして(ii)流体サンプルから非HDLを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程、を包含する、方法。 - 前記加熱が165℃を超える温度である、請求項15に記載の方法。
- 血清コレステロールを測定するために適切なデバイスを調製する方法であって:
試薬パッドをアクリル酸コポリマーで被覆する工程;
(i)HDL試験パッドにHDL試験試薬を、そして(ii)流体サンプルから非HDLを選択的に結合および除去するために有効な試薬を該試薬パッドに付与する工程;
該デバイスを形成するために、該HDL試験パッドと該試薬パッドとを接着するために加熱する工程;を包含する、方法。 - 前記アクリル酸コポリマーが、エレチンアクリル酸コポリマーである、請求項17に記載の方法。
- 前記エレチンアクリル酸コポリマーが、約4.0%〜約10.0%のエマルジョンである、請求項18に記載の方法。
- 前記被覆する工程の後に、前記試薬パッドを乾燥する工程をさらに包含する、請求項17から19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HDL試験パッドおよび試薬パッドの各々が、小ポア側面および開放ポア側面を有し;該HDL試験パッドと該試薬パッドを、該試薬パッドの小ポア側面が、該HDL試験パッドの開放ポア側面に面するように配向する工程をさらに包含する、請求項17から20のいずれかに1項に記載の方法。
- 前記加熱工程が、75℃と90℃との間の温度を付与することを包含する、請求項17から21のいずれか1項に記載の方法。
- 高密度リポタンパク質(HDL)以外のリポタンパク質を含む血液サンプル中のHDLに関連する血清コレステロールを測定する方法であって:
該サンプルを、(i)HDLコレステロールの検出可能インジケータを有するHDL試験パッド、(ii)該血液サンプルから非HDLを選択的に結合かつ除去するために有効な試薬を含む試薬パッドを含む積層体と接触させる工程を包含し、
ここで、該血液サンプルが、該積層体を、該積層体を通る毛細管作用および/または重力によって通過し、HDL濃度の測定を可能にする、方法。 - 前記篩パッドと、前記サンプル分与パッドと間の接触が、所望の量のサンプルが移動したとき断絶する、請求項23に記載の方法。
- 前記試薬が、スルホン化多糖を含む、請求項23または24に記載の方法。
- 前記HDL試験パッドまたは前記試薬パッドの少なくとも1つが、多孔性ポリマー膜を備える、請求項23から25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試薬パッドが複数のスタック層を備え、その少なくとも1つが非HDLを結合するに有効な試薬を含む、請求項23から26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HDL濃度の測定が光学的検出による、請求項23から27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記HDL試験パッドがバイオセンサーを備える、請求項23から28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記バイオセンサーが、酸素または過酸化水素の産生を電気化学的に測定するために有効である、請求項29に記載の方法。
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