ES2583135T3

ES2583135T3 - Dispositivo integrado para la detección e identificación de ácidos nucleicos

Info

Publication number: ES2583135T3
Application number: ES12774413.4T
Authority: ES
Inventors: Marc DEJOHN; Robert B. Cary; Nathan J. Cobb
Original assignee: Mesa Biotech Inc
Current assignee: Mesa Biotech Inc
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2016-09-19
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: US20190330681A1; JP2014515611A; DK2699698T3; US20200216876A1; EP2699698A4; WO2012145725A2; KR101878889B1; US11999997B2; EP2699698B1; EP2699698B9; US20140045221A1; KR20140044323A; EP2699700A4; EP2699700B8; KR20140046415A; CA2853615A1; JP2016028589A; CN103649333B; US20160362725A1; KR101508670B1

Abstract

Una plataforma desechable para detectar un ácido nucleico diana, comprendiendo la plataforma desechable: una cámara de muestras para recibir una muestra que comprende el ácido nucleico diana; una cámara de amplificación conectada a través de un primer canal con dicha cámara de muestras y conectada a través de un segundo canal con un primer recinto de ventilación; una cámara de marcaje conectada a través de un tercer canal con dicha cámara de amplificación y conectada a través de un cuarto canal con un segundo recinto de ventilación; un subsistema de detección conectado con dicha cámara de marcaje a través de un quinto canal y conectado a través de un sexto canal con un tercer recinto de ventilación; una pluralidad de elementos de calentamiento resistivos y uno o más dispositivos medidores de la temperatura; caracterizada porque dichos recintos de ventilación se sellan cada uno a baja presión por un material termolábil localizada en la cercanía de uno de dichos elementos de calentamiento resistivos y opcionalmente en la que dicha cámara de marcaje es calentable usando uno de dichos elementos de calentamiento resistivos.

Description

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DESCRIPCION

Dispositivo integrado para la deteccion e identificacion de acidos nucleicos Antecedentes de la invencion

Campo de la invencion (Campo tecnico):

Las realizaciones de la presente invencion se refieren a un dispositivo integrado y a procedimientos relacionados para detectar e identificar acidos nucleicos. El dispositivo puede ser totalmente desechable o puede comprender una porcion desechable y una porcion reutilizable.

Antecedentes de la tecnica

Observese que la siguiente discusion hace referencia a una serie de publicaciones y referencias. La discusion de dichas publicaciones en la presente memoria se da para unos antecedentes mas completes de los principios cientificos, y no ha de considerarse como la admision de que dichas publicaciones son tecnica anterior con fines de determinacion de la patentabilidad.

A medida que ha aumentado el impacto sobre la salud publica y la concienciacion sobre enfermedades infecciosas emergentes, amenazas biologicas, enfermedades geneticas y reservorios ambientales de patogenos, la necesidad de ensayos rapidos mas informativos en el punto de uso, sensibles y espedficos ha aumentado la demanda de herramientas basadas en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). La prueba molecular basada en acido nucleico mediante procedimientos tales como amplificacion basada en PCR es extremadamente sensible, espedfica e informativa. Desgraciadamente, los ensayos de acido nucleico disponibles actualmente son inadecuados o de utilidad limitada para uso de campo debido a que requieren una instrumentacion elaborada y costosa, materiales de laboratorio especializados y/o multiples manipulaciones dependientes de la intervencion del usuario. Por consiguiente, la mayona de muestras para prueba molecular se envfan a laboratorios centralizados, dando como resultado tiempos de respuesta prolongados para obtener la informacion requerida.

Para enfrentarse a la necesidad de pruebas moleculares rapidas en el punto de uso, los esfuerzos anteriores se han centrado en disenos de producto que emplean un cartucho desechable y un instrumento asociado relativamente caro. El uso de instrumentacion externa para lograr el movimiento de fluido, control de la temperatura de amplificacion y deteccion simplifica muchos de los retos de ingeniena inherentes a la integracion de los multiples procesos requeridos para la prueba molecular. Desgraciadamente, la dependencia de una instrumentacion elaborada impone enormes barreras economicas para clmicas pequenas, agencias de gobiernos locales y estatales y cuerpos de seguridad. Ademas, la dependencia de un pequeno numero de instrumentos para hacer funcionar las pruebas podna causar retrasos innecesarios durante periodos de gran necesidad, como ocurre durante la sospecha de liberacion de un agente de guerra bacteriologica o una epidemia emergente. Es mas, el modelo de instrumento y cartucho de reactivo desechable presenta un cuello de botella potencialmente significativo cuando un brote demanda capacidad de reaccion y produccion aumentada. Adicionalmente, la dependencia de la instrumentacion complica la distribucion ad hoc de dispositivos de prueba en los sitios de despliegue cuando las limitaciones logfsticas impiden el transporte de equipos asociados voluminosos o estan ausentes requisitos de infraestructura (p.ej., fuentes de energfa fiables).

Se ha descrito la gravedad como un medio de movimiento de fluido en los dispositivos microflmdicos existentes. Sin embargo, el dispositivo tfpico no permite un control programable o electronico de dicho movimiento de fluido, ni la mezcla de mas de dos fluidos. Tambien algunos dispositivos utilizan una cafda de presion generada por una cafda de fluido inerte o preempaquetado para inducir un ligero vado y extraer los reactantes hasta camaras de procesamiento cuando estan orientadas verticalmente, lo que aumenta las complejidades de almacenamiento y transporte para asegurar la estabilidad de los fluidos preempaquetados. Los dispositivos existentes que ensenan a mover un fluido en una pluralidad de etapas discretas requieren sellos o valvulas fragiles entre camaras, lo que complica la operacion y fabricacion. Estos dispositivos no ensenan el uso de ventiladeros separados localizados remotamente para cada camara empleada en procedimientos de laboratorio estandares. La PCR u otras reacciones de amplificacion de acido nucleico tales como amplificacion mediada por bucle (LAMP), amplificacion de secuencia basada en acido nucleico (NASBA) y otros procedimientos de ciclacion isotermica y termica se realizan tipicamente en laboratorios de analisis e investigacion usando volumenes de reaccion de 5 a 100 microlitros. Estos volumenes de reaccion admiten volumenes de especimen de prueba suficientes para asegurar la deteccion de dianas de ensayo escasas en espedmenes diluidos. Los sistemas microflmdicos que reducen los volumenes de reaccion respecto a los empleados en las pruebas moleculares de laboratorio tradicionales reducen necesariamente tambien el volumen del especimen que puede anadirse a la reaccion. El resultado del menor volumen de reaccion es una reduccion de la capacidad de admitir un volumen de especimen suficiente para asegurar la presencia de cantidades detectables de diana en espedmenes diluidos o cuando las dianas de ensayo son escasas.

El documento US2008/124720 A1 da a conocer un procedimiento y un aparato para procesar y analizar muestras, particularmente muestras de ADN, en los que la muestra se introduce en un conducto, en que el conducto tiene al menos un reactivo de procesamiento de muestra encapsulado por un material hidrofobo solido o semisolido. Se aplica calor de modo que el material solido o semisolido se licue, lo que provoca que el reactivo de procesamiento

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de muestra se mueva a lo largo del conducto permitiendo que el reactivo de procesamiento de muestra entre en contacto con la muestra formando una mezcla de productos, seguido de la deteccion de la presencia y la concentracion de un cierto producto en la mezcla de productos. Se provoca el movimiento del reactivo de procesamiento de muestra a lo largo del conducto mediante la aplicacion de una presion aumentada o reducida al conducto.

Sumario de la invencion

Es una realizacion de la presente invencion una plataforma desechable para detectar un acido nucleico diana, comprendiendo la plataforma desechable una camara de muestras para recibir una muestra que comprende el acido nucleico diana; una camara de amplificacion conectada a traves de un primer canal con la camara de muestras y conectada a traves de un segundo canal con un primer recinto de ventilacion; una camara de marcaje conectada a traves de un tercer canal con la camara de amplificacion y conectada a traves de un cuarto canal con un segundo recinto de ventilacion; un subsistema de deteccion conectado con la camara de marcaje a traves de un quinto canal y conectado a traves de un sexto canal con un tercer recinto de ventilacion; una pluralidad de elementos de calentamiento resistivo y uno o mas dispositivos de medida de la temperatura; en la que los recintos de ventilacion se sellan cada uno a baja presion por una membrana termolabil localizada en la cercama de uno de los elementos de calentamiento resistivo. La plataforma desechable comprende opcionalmente ademas una etapa de preparacion de muestra que comprende una salida en conexion de fluido directa con una entrada de la camara de muestras. Las dimensiones de la superficie sustancialmente plana de la camara de amplificacion son preferiblemente aproximadamente las mismas que las dimensiones de la superficie sustancialmente plana del elemento de calentamiento resistivo en contacto termico con la camara de amplificacion. La camara de amplificacion preferiblemente no se enfna por un dispositivo de enfriamiento activo. La camara de amplificacion contiene opcionalmente una solucion de amplificacion, la camara de muestras comprende opcionalmente una mezcla reactiva de amplificacion lfquida o una mezcla reactiva de amplificacion liofilizada y/o la camara de marcaje comprende opcionalmente partfculas de deteccion. La camara de marcaje es preferiblemente calentable usando uno de los elementos de calentamiento resistivo. El subsistema de deteccion comprende una tira de flujo lateral que preferiblemente no comprende partfculas de deteccion. Las camaras, los canales y los recintos de ventilacion estan preferiblemente localizados sobre una capa de ensamblaje de fluido y los elementos electronicos estan preferiblemente localizados sobre una capa separada que comprende una placa de circuito impreso, con la capa separada unida a la capa de ensamblaje de fluido. El subsistema de deteccion esta preferiblemente localizado sobre la capa de ensamblaje de fluido u opcionalmente sobre una segunda capa de ensamblaje de fluido. El volumen de al menos una de las camaras esta preferiblemente entre aproximadamente 1 microlitro y aproximadamente 50 microlitros. La plataforma desechable comprende preferiblemente ademas un conector para acoplar la plataforma desechable con una unidad basica que no es un instrumento externo y que mantiene la plataforma desechable en orientacion vertical o inclinada.

Una realizacion de la presente invencion es un procedimiento para detectar un acido nucleico diana, consistiendo el procedimiento en disponer una muestra que comprende el acido nucleico diana en una camara de muestras de una plataforma desechable de la invencion; orientar la plataforma desechable verticalmente o inclinada; hacer reaccionar la muestra con una mezcla reactiva de amplificacion lfquida o anteriormente liofilizada; abrir a la atmosfera un primer recinto de ventilacion conectado con una camara de amplificacion, posibilitando asf que la muestra reaccionada fluya a la camara de amplificacion; amplificar el acido nucleico diana en la camara de amplificacion; abrir a la atmosfera un segundo recinto de ventilacion conectado con una camara de marcaje, posibilitando asf que el acido nucleico diana amplificado fluya a la camara de marcaje; marcar el acido nucleico diana amplificado usando partfculas de deteccion en la camara de marcaje; abrir a baja presion un tercer recinto de ventilacion conectado con un subsistema de deteccion, posibilitando asf que el acido nucleico diana marcado fluya al subsistema de deteccion, y detectar el acido nucleico diana amplificado. La etapa de amplificacion comprende preferiblemente amplificar el acido nucleico diana usando un elemento de calentamiento resistivo localizado dentro de la plataforma desechable en la cercama de la camara de amplificacion. El procedimiento comprende preferiblemente ademas enfriar pasivamente la camara de amplificacion. El procedimiento comprende preferiblemente ademas calentar la camara de marcaje durante la etapa de marcaje usando un elemento de calentamiento resistivo localizado dentro de la plataforma desechable en la cercama de la camara de marcaje. El subsistema de deteccion preferiblemente no comprende partfculas de deteccion. El procedimiento comprende preferiblemente ademas controlar la operacion de la plataforma desechable usando una estacion de acoplamiento que no es un instrumento externo.

Los objetos, ventajas y rasgos novedosos y el alcance adicional de la aplicabilidad de la presente invencion se expondran en parte en la descripcion detallada siguiente, tomada junto con los dibujos acompanantes, y en parte resultaran evidentes para los especialistas en la materia tras el examen de lo siguiente, o puede aprenderse mediante la practica de la invencion. Los objetos y ventajas de la invencion pueden realizarse y alcanzarse mediante instrumentaciones y combinaciones particularmente senaladas en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripcion de los dibujos

Los dibujos acompanantes, que se incorporan a y forman parte de la memoria descriptiva, ilustran realizaciones de la presente invencion y, junto con la descripcion, sirven para explicar los principios de la invencion. Los dibujos son solo con fines de ilustracion de ciertas realizaciones de la invencion y no han de considerarse como limitantes de la

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invencion. En los dibujos:

La FIG. 1 es un dibujo que ilustra las capas flmdica y electronica para una realizacion de la presente invencion. El fluido de muestra preparada entra en la camara de muestras, donde se mezcla con reactivos preferiblemente liofilizados. En orientacion vertical, la presion de la columna de fluido se equilibra con el volumen sellado de aire debajo de la misma. La capilaridad evita el escape de aire y el avance adicional de fluido. Cuando se rompe el sello de recinto apropiado debajo del correspondiente recinto de ventilacion, el fluido se mueve a traves del canal de salida a la siguiente camara para procesamiento adicional. El control de temperatura y fluido se consigue preferiblemente usando componentes de ensamblaje de circuito impreso (PCA) y tecnicas de ensamblaje estandares.

La FIG. 2A es una representacion esquematica de un mecanismo de ventilacion empleado en una realizacion de la presente invencion para lograr un movimiento de fluido controlado dentro de la capa flmdica. La FIG. 2B es un dibujo que ilustra la localizacion y construccion del ventiladero en una realizacion de la presente invencion. Una membrana mantiene la presion de la columna de fluido por encima de la ambiental. Cuando se aplica suficiente calor, se rompe la membrana y permite que se equilibre la presion. El fluido se mueve a lo largo del gradiente de presion hidrostatica. Las presiones pueden ser menores de unos pocos mbar.

La FIG. 3 muestra detalles adicionales del calentador resistivo de una realizacion de la presente invencion. Dos resistores (elementos de calentamiento) de dispositivo de montaje superficial (SMD) de pelmula gruesa de tamano 2512 flanquean un termistor (sensor de temperatura) de tamano 0402 sobre la placa de circuito impreso (PCB). Una capa fina de compuesto termico en la interfaz del resistor o resistores y la camara de amplificacion mantiene la conductividad termica con los calentadores y el sensor. Las dimensiones de la camara se eligen preferiblemente para maximizar la relacion de area/volumen.

La FIG. 4 representa realizaciones de la presente invencion que respaldan metodologfas de termociclacion o amplificacion de acido nucleico de base isotermica. La FIG. 4A muestra un PCA con cuatro pares de resistor/termistor. Cuatro resistores de montaje superficial sirven como cuatro calentadores controlables independientemente (flechas). La FIG. 4B muestra un ensamblaje flmdico enlazado con el PCA de la FIG. 4A consecuente con el detalle de calentador resistivo de la FIG. 3. La capa flmdica interacciona con los resistores de montaje superficial del PCA proporcionando camaras de reaccion para amplificacion de acido nucleico. La FIG. 4C muestra la electroforesis en gel de reacciones de amplificacion que producen un producto de ~150 pb (pares de bases) a partir de una maquina de PCR (LAB) o mediante una realizacion de la presente invencion (pHeater) por termociclacion. El carril mas a la izquierda es un patron de tamano. La FIG. 4D es una grafica de temperatura frente al tiempo en segundos para el fluido dentro de la camara de amplificacion de las presentes realizaciones. La lmea mas oscura indica la temperatura de la solucion en la camara de reaccion obtenida por termopar. La lmea mas clara es la temperatura medida por el termistor usado por el microcontrolador para el control de la temperatura. Pueden lograrse 40 ciclos de una reaccion PCR de dos temperaturas en menos de 20 minutos usando un volumen de reaccion de 20 pl. La FIG. 4E muestra la electroforesis en gel de reacciones de amplificacion isotermica basada en secuencias de acido nucleico (NASBA) que producen un producto de ~150 pb a partir de una maquina de PCR (control positivo) o mediante el uso de una realizacion de la presente invencion. Cuatro reacciones separadas indican tanto el ajuste del sensor de temperatura como el tratamiento de superficie particular aplicado al interior de la camara flmdica.

La FIG. 5 ilustra una realizacion de la presente invencion que comprende la tecnica de transportar fluido sin el uso de un ventiladero. Al calentar la camara debajo de la columna de fluido, el gas se expandira y se autopurgara a traves del canal de entrada. Tras enfriar, el gas en el volumen de la camara se contraera y se extraera un volumen de fluido proporcional al de gas purgado. El fluido cae al suelo de la camara. Sucesivas repeticiones de este ciclo pueden mover todo el volumen de reaccion. La operacion de esta tecnica depende del tamano del canal, la longitud, el tiempo y la temperatura de calentamiento, los volumenes de camara y las energfas superficiales de los componentes.

La FIG. 6 muestra el detalle y el funcionamiento de una camara de marcaje de una realizacion de la presente invencion. El fluido que contiene amplicon entra en la camara de marcaje a traves del canal de entrada y se pone en contacto con partmulas de deteccion. Se logra un mezclado suficiente calentando o hirviendo el fluido. Las burbujas nacientes nucleadas en el fondo y los lados de la camara, preferiblemente por un rasgo texturado tal como una lmea o serie de lmeas grabadas con laser, agitan preferiblemente la mezcla eficazmente. En esta realizacion, los componentes de SMD son los mismos que los usados en el calentador de amplificacion.

La FIG. 7 muestra los componentes de la capa flmdica de una realizacion de la presente invencion. Se une un componente de pared de grosor elegido por los dos lados con componentes de cara. En una realizacion, el componente de pared es acnlico cortado con laser de 0,5 mm y las caras son pelmula de poliester (PET) de 0,10 mm. Las piezas se unen preferiblemente entre sf con un adhesivo de transferencia de silicona. Las superficies interiores se tratan para controlar la humectacion. Los reactivos y el ensamblaje de flujo lateral se anaden durante la fabricacion. Se sella preferiblemente una membrana adhesiva sobre los recintos de ventilacion.

La FIG. 8 muestra el lado del PCA hacia el ensamblaje flmdico de una realizacion de la presente invencion en que

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los elementos de calentamiento son resistores de pelmula gruesa. El sensor de temperatura es un termistor de SMD pequeno colocado en estrecha proximidad de los calentadores. El PCA puede incorporar opcionalmente LED indicadores para monitorizar la progresion del ensayo, el calentamiento y la apertura de ventilacion.

La FIG. 9 es un dibujo que ilustra el modulo fluido unido al PCA con un relleno adhesivo de acuerdo con una realizacion de la presente invencion. El grosor del relleno puede ser importante para un distanciamiento y funcionamiento apropiados de los ventiladeros y calentadores.

La FIG. 10A muestra el PCA desechable de una realizacion de configuracion de la invencion semidesechable. El PCA contiene solo componentes electronicos que interaccionan con el ensamblaje flmdico desechable. Este incluye los elementos de calentamiento, sensores de temperatura y opcionalmente indicadores LED. Esta presente un conector para completar el circuito y opcionalmente para anadir soporte en la orientacion vertical.

La FIG. 10B muestra el PCA desechable/ensamblaje flmdico de la FIG. 10A en su sitio de una estacion de acoplamiento. La estacion de acoplamiento contiene la electronica de control y el suministro de energfa y es opcionalmente facilmente portatil y de mano. Se inserta la porcion desechable que contiene el PCA y los ensamblajes flmdicos en el conector, preferiblemente en una orientacion vertical. Puede estar opcionalmente presentes en algunas realizaciones una interfaz de usuario, que incluye LED indicadores, LCD y controles de usuario. La estacion de acoplamiento puede incluir botones para iniciar los procesos electronicos requeridos para el ensayo.

La FIG. 11A es un dibujo del lado frontal del PCA de una realizacion de configuracion de la invencion desechable. Este lado hace frente al ensamblaje flmdico. Estan presentes en esta realizacion elementos de calentamiento y sensores, asf como los componentes de interfaz de usuario tales como indicadores LED.

La FIG. 11 B es un dibujo que ilustra la disposicion del lado posterior del PCA de la configuracion de la invencion desechable de la FIG. 11A. Este lado de la PCB contiene los circuitos de control tales como microcontrolador, interruptores MOSFET y circuitos secundarios. En esta realizacion, estan presentes terminales para una bateffa de 9 V, asf como dispositivos de interfaz de usuario opcionales tales como interruptores tactiles utiles para la iniciacion del ensayo.

La FIG. 11C es un dibujo del PCA de la FIG. 11B con una pila de 9 V instalada. La carcasa de plastico no se muestra. La colocacion de la pila es preferiblemente como se muestra para reducir el centro de masa y para ayudar a prevenir la inclinacion o volcado del dispositivo durante la operacion.

La FIG. 12 es una ilustracion de una realizacion semidesechable de la presente invencion en la que un subsistema de preparacion de muestra interacciona con las capas flmdica y electronica de amplificacion y deteccion.

La FIG. 13 muestra los componentes de una realizacion de una capa flmdica multicapa incorporada a un ensayo desechable.

La FIG. 14 muestra una vista despiezada de un cartucho de ensayo desechable que incorpora la capa flmdica de la FIG. 13.

La FIG. 15 es una ilustracion del PCA desechable/ensamblaje flmdico ensamblados de la FIG. 14 en su sitio de una estacion de acoplamiento.

La FIG. 16 son fotograffas de las capas flmdicas de una realizacion de la presente invencion que respaldan la amplificacion y deteccion de acido nucleico basadas en termociclacion. Se anadio a la camara de muestras una solucion de reaccion que contema todos los reactivos necesarios para respaldar la amplificacion de acido nucleico. En la FIG. 16A, se anadieron las enzimas requeridas a la solucion de reaccion en forma ffquida. En la FIG. 16B, se suministraron las enzimas requeridas mediante la incorporacion de un aglomerado liofilizado a la camara de muestras. Se efectuo la amplificacion y deteccion de acido nucleico como se describe en el Ejemplo 1. La lmea superior del ensamblaje de tira de deteccion representa el control positivo, un oligonucleotido complementario de la sonda de deteccion. La lmea inmediatamente debajo del control positivo representa la lmea de captura, un oligonucleotido inmovilizado complementario de la misma hebra de producto de amplificacion que la sonda de deteccion.

Las FIG. 17A y 17B son fotograffas de un dispositivo de prueba de acido nucleico de muestra a resultado integrado fabricado haciendo interaccionar un subsistema de preparacion de muestra con la invencion. Las realizaciones de la presente invencion respaldan el aislamiento, amplificacion y deteccion de acido nucleico en un solo dispositivo integrado. Se efectuaron el aislamiento, amplificacion y deteccion de acido nucleico como se describe en el Ejemplo 2. La lmea superior del ensamblaje de flujo lateral representa el control positivo, un oligonucleotido complementario de la sonda de deteccion. La lmea inmediatamente debajo del control positivo representa la lmea de captura, un oligonucleotido inmovilizado complementario de la misma hebra de producto de amplificacion que la sonda de deteccion. El dispositivo se muestra despues de la terminacion del procesamiento de tejido de hoja macerado de un arbol cftrico que padece la enfermedad de enverdecimiento de los cftricos y ensayando los acidos nucleicos aislados mediante el sistema de preparacion de muestra integrado para Candidatus liberibacter, el agente etiologico del

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enverdecimiento de cftricos.

Descripcion detallada de la invencion

Las realizaciones de la presente invencion comprenden una plataforma desechable que integra medios de instrumentacion independientes para realizar todas las etapas necesarias de un ensayo molecular de acido nucleico y complementan los inmunoensayos rapidos de flujo lateral actuales con una nueva generacion de pruebas de acido nucleico que ofrecen analisis mas informativos y sensibles. Las realizaciones de la presente invencion facilitan un uso mas amplio de las pruebas de acido nucleico rapidas en clmicas pequenas y con ajustes austeros donde es mas probable que tengan un gran impacto enfermedades infecciosas, amenazas biologicas, pruebas agncolas y ambientales. Ciertas realizaciones de la presente invencion son completamente autocontenidas y desechables, lo que posibilita la “capacidad de respuesta” en momentos de demanda aumentada al permitir hacer funcionar pruebas paralelas sin cuellos de botella impuestos por la instrumentacion. Adicionalmente, en aquellas areas de aplicacion en que sea preferible un cartucho desechable de bajo coste acoplado con una estacion de acoplamiento economica alimentada a pilas o activada por un adaptador de CA, una realizacion de la invencion en que se emplea una estacion de acoplamiento sencilla reduce ademas los costes de la prueba al hacer los componentes reutilizables reutilizables y ademas economicos. La tecnologfa de plataforma dada a conocer en la presente memoria ofrece una sensibilidad similar a los procedimientos basados en la amplificacion de acido nucleico de laboratorio, unos mmimos intervencion del usuario y requisitos de formacion, especificidad de secuencia conferida tanto por amplificacion como deteccion, multiple capacidad, reactivos estables, compatibilidad con la fabricacion a gran escala de bajo coste, operacion con pilas para permitir el uso con ajustes austeros y una tecnologfa de plataforma flexible que permite la incorporacion de biomarcadores adicionales o alternativos sin rediseno del dispositivo.

Las realizaciones de la presente invencion proporcionan sistemas y procedimientos para la deteccion e identificacion de bajo coste de acido nucleico en el punto de uso adecuados para efectuar analisis en localizaciones remotas del entorno de laboratorio en que se efectuanan ordinariamente los ensayos. Ventajosamente, los volumenes de reaccion de amplificacion de acido nucleico pueden estar en el mismo intervalo de volumen usado comunmente en las pruebas de laboratorio tradicionales (p.ej. 5-100 pl). La reaccion realizada en realizaciones de la presente invencion es por tanto directamente comparable con los ensayos de laboratorio aceptados, y permite la admision de los mismos volumenes de especimen empleados tipicamente en las pruebas moleculares tradicionales.

Las realizaciones de la presente invencion pueden usarse para detectar la presencia de una secuencia o secuencias de acido nucleico diana en una muestra. Las secuencias diana pueden ser ADN tal como ADN cromosomico o ADN extracromosomico (p.ej., ADN mitocondrial, ADN de cloroplasto, ADN de plasmido, etc.) o ARN (p.ej., ARNr, ARNm, ARN pequenos y ArN vmco). De forma similar, pueden usarse realizaciones de la invencion para identificar polimorfismos de acido nucleico, incluyendo polimorfismos de un solo nucleotido, deleciones, inserciones, inversiones y duplicaciones de secuencia. Ademas, pueden usarse realizaciones de la invencion para detectar eventos de regulacion genica tales como regulacion positiva y negativa de genes al nivel de transcripcion. Por tanto, las realizaciones de la invencion pueden emplearse para aplicaciones tales como: 1) la deteccion e identificacion de acidos nucleicos patogenicos en muestras agncolas, clmicas, alimentarias, ambientales y veterinarias; 2) la deteccion de biomarcadores geneticos de enfermedad y 3) el diagnostico de enfermedad o estado metabolico mediante la deteccion de biomarcadores relevantes de la enfermedad o estado metabolico, tales como eventos de regulacion genica (regulacion positiva o negativa de ARNm o induccion de ARNm pequenos u otras moleculas de acido nucleico generadas o reprimidas durante una enfermedad o estado metabolico) en respuesta a la presencia de un patogeno, toxina, otro agente etiologico, estimulo ambiental o estado metabolico.

Las realizaciones de la presente invencion comprenden un medio de preparacion, amplificacion y deteccion de muestra de acido nucleico diana tras la adicion de una muestra de acido nucleico, que comprende todos los aspectos de control de fluido, control de temperatura y mezclado de reactivos.

En algunas realizaciones de la invencion, el dispositivo proporciona un medio para efectuar una prueba de acido nucleico usando un suministro de energfa portatil tal como una pila, y es totalmente desechable. En otras realizaciones de la invencion, funciona un cartucho de prueba de acido nucleico desechable junto con un componente electronico reutilizable sencillo que no efectua todas las funciones de una instrumentacion de laboratorio tfpica.

Las realizaciones de la presente invencion proporcionan un dispositivo de amplificacion y deteccion de acido nucleico que comprende, pero sin limitacion, una carcasa, una placa de circuito y una capa flmdica o microflmdica. En ciertas realizaciones, la placa de circuito puede contener una variedad de componentes montados en superficie tales como resistores, termistores, diodos emisores de luz (LED), fotodiodos y microcontroladores. La capa flmdica o microflmdica es responsable de mover los volumenes de reaccion acuosa y puede elaborarse a partir de una variedad de plasticos y mediante una variedad de tecnicas de fabricacion, incluyendo la union, fusion o laminacion de piezas cortadas con laser, cortadas con chorro de agua o moldeadas por inyeccion. Los componentes flmdicos y de placa de circuito se mantienen juntos y su acoplamiento termico puede potenciarse mediante materiales o compuestos termoconductores. La carcasa sirve preferiblemente como parte de un funda cosmetica y protectora, que esconde los componentes delicados de las capas microflmdica y de placa de circuito, y puede servir tambien para facilitar la entrada de muestra, la liberacion de tampon, la elucion de acido nucleico y la iniciacion de los

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procesos requeridos para la funcionalidad del dispositivo. Por ejemplo, la carcasa puede incorporar un puerto de entrada de muestra, un boton o rasgo mecanico similar para permitir la activacion del usuario, la liberacion de tampon, la iniciacion del flujo de muestra y/o la elucion de acido nucleico.

En algunas realizaciones de la invencion, la capa flmdica o microflmdica comprende preferiblemente cuatro camaras, incluyendo una camara de entrada de muestra, una camara de amplificacion, una camara de marcaje de acido nucleico y una camara de deteccion. La camara de entrada de solucion comprende preferiblemente un orificio de entrada de muestra en que puede anadirse una muestra que contiene acido nucleico, y un conducto de salida que conduce a la camara de amplificacion. La camara de entrada de muestra puede comprender tambien reactivos liofilizados que pueden incluir tampones adecuados, sal, desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, cebadores oligonucleotfdicos y enzimas tales como ADN polimerasa y transcriptasa inversa. Dichos reactivos liofilizados se solubilizan preferiblemente tras la adicion de la muestra de acido nucleico. La camara de amplificacion se situa preferiblemente alineada y en contacto termico con los elementos calentadores sobre la placa de circuito. De forma similar, los componentes electronicos presentes sobre la placa de circuito estan colocados en contacto ffsico o proximidad de los ventiladeros o estructuras de valvula de la capa flmdica para posibilitar el control electronico. La disposicion ffsica de la placa de circuito se disena para proporcionar el alineamiento con los elementos de la capa flmdica o microflmdica de tal modo que los elementos de calentamiento resistivo de la placa de circuito para amplificacion y/o control del flujo de fluido esten situados para formar contactos con los elementos del componente flmdico con los que interaccionan.

Otras realizaciones de la invencion comprenden un dispositivo de amplificacion y deteccion de acido nucleico que esta integrado con un dispositivo de preparacion de muestra. Las realizaciones que incluyen el dispositivo de preparacion de muestra proporcionan un medio para la comunicacion de fluidos entre los puertos o valvulas de salida del subsistema de preparacion de muestra y el puerto o puertos de entrada de los componentes flmdicos o microflmdicos del dispositivo.

A menos que se definan de otro modo, todos los terminos de la tecnica, notaciones y otra terminologfa cientffica usada en la presente memoria pretenden tener los significados entendidos comunmente por los especialistas en la materia a la que pertenece esta invencion. Las tecnicas y procedimientos descritos o referidos en la presente memoria son generalmente bien entendidos y comunmente empleados usando metodologfas convencionales por los especialistas en la materia tales como, por ejemplo, las metodologfas de clonacion molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 3a edicion (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausbel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. 2001. Segun sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos comercialmente disponibles se llevan a cabo generalmente de acuerdo con los protocolos y/o parametros definidos por el fabricante, a menos que se observe otra cosa.

Como se usan a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, los terminos “acido nucleico diana” o “acido nucleico molde” significan un fragmento o secuencia de ADN o ARN monocatenario o bicatenario que se pretende detectar.

Como se usan a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, los terminos “micropartfcula” o “partfcula de deteccion” significan cualquier compuesto usado para marcar un producto de acido nucleico generado durante una reaccion de amplificacion, incluyendo tintes fluorescentes espedficos de acido nucleico duplex, oligonucleotidos modificados fluorescentemente y puntos cuanticos conjugados con oligonucleotido o elementos en fase solida tales como poliestireno, latex o partfculas paramagneticas o microesferas.

Como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, el termino “camara” significa un compartimento flmdico donde reside el fluido durante cierto periodo de tiempo antes de dirigirse a otra camara. Por ejemplo, una camara puede ser la camara de muestras, camara de amplificacion, camara de marcaje o camara de deteccion.

Como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, el termino “recinto” significa un compartimento encima de un resistor u otro mecanismo que sirve como mecanismo de ventilacion. Por ejemplo, al contrario que las camaras flmdicas como se describen anteriormente, un recinto creado en la capa flmdica puede tener una cara abierta que se alinea con un resistor en el PCA. Esta cara abierta esta preferiblemente cubierta con una membrana fina, creando una cavidad sellada que se rompe facilmente al activar al resistor debajo.

Como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, el termino “canal” significa un conducto estrecho dentro del ensamblaje flmdico que conecta tfpicamente dos o mas camaras y/o recintos o combinaciones de los mismos incluyendo, por ejemplo, un canal de entrada, salida o ventilacion. En el caso de un canal de entrada o salida, la muestra de fluido migra a traves del canal. En el caso de un canal de ventilacion, el conducto permanece libre de fluido y conecta una camara flmdica con un recinto de ventilacion.

Como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, el termino “instrumento externo” significa un instrumento reutilizable que calienta y/o enfna un ensayo desechable y/o efectua una accion mecanica sobre un ensayo desechable incluyendo, pero sin limitacion, perforar paquetes de tampon y/o bombear o proporcionar

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activamente de otro modo una fuerza de transporte para fluidos.

Son realizaciones de la presente invencion dispositivos para una prueba de acido nucleico de bajo coste en el punto de uso adecuada para efectuar analisis en localizaciones remotas de un entorno de laboratorio en que la prueba se efectuana ordinariamente. Ciertos dispositivos comprenden componentes o capas flmdicas y electronicas, opcionalmente encerradas en una carcasa protectora. En realizaciones de la presente invencion, la capa flmdica esta compuesta por plastico y es una serie de camaras y recintos conectados por canales estrechos en que las camaras se orientan verticalmente entre sf durante la operacion. La capa flmdica esta encima o colocada de otro modo en contacto flsico con los componentes electronicos tales como una placa de circuito impreso que contiene dispositivos de montaje superficial (SMD) a la venta y controlados a traves de un microcontrolador. En algunas realizaciones del dispositivo, todo el ensamblaje es desechable. En otras realizaciones, las capas flmdica y electronica unidas ffsicamente son desechables, mientras que la unidad de control pequena y barata es reutilizable. En otra realizacion, la capa flmdica es desechable y la unidad basica de control pequena es reutilizable. Para todas las realizaciones, la presente invencion puede estar integrada con un dispositivo de preparacion de muestra de acido nucleico tal como se describe en la publicacion internacional n° WO 2009/137059 Al, titulada "Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control" (incorporada a la presente memoria como referencia) y/o en procedimientos de uso descritos en la misma.

Las realizaciones de la presente invencion comprenden un dispositivo de prueba de acido nucleico integrado que puede fabricarse economicamente con procesos de fabricacion establecidos. La invencion proporciona datos de pruebas moleculares reteniendo la simplicidad desde la perspectiva del usuario final de inmunoensayos de mano ampliamente aceptados, superando los retos de regulacion de las temperaturas de fluido dentro del dispositivo, transporte de pequenos volumenes de muestra en etapas secuenciales, mezclado de reactivos y deteccion de acidos nucleicos. Las realizaciones de la presente invencion estan excepcionalmente adaptadas para utilizar elementos a la venta que pueden construirse mediante tecnicas de ensamblaje estandares y no requieren piezas moviles. Ademas, el diseno de la capa flmdica posibilita el uso de plasticos y tecnicas de fabricacion facilmente disponibles. El resultado es un dispositivo economico, desechable y fiable capaz de aislamiento, amplificacion y deteccion de acido nucleico sin necesidad de una infraestructura de laboratorio dedicada.

Los dispositivos de prueba de acido nucleico existentes generalmente usan elementos de calentamiento sofisticados tales como calentadores de pelfcula depositada y dispositivos de Peltier que suman un coste significativo y/o requieren procedimientos de fabricacion especializados. En las realizaciones de la invencion, el calentamiento de la solucion de reaccion se logra preferiblemente mediante el uso de dispositivos de montaje superficial resistivos sencillos que pueden adquirirse por centimos o menos y que se ensamblan y ensayan mediante estandares de fabricacion comunes. Al poner camaras flmdicas sobre estos elementos resistivos y elementos sensores asociados, puede regularse convenientemente la temperatura de fluido de las soluciones de reaccion. El amplio uso de resistores de SMD en la industria electronica asegura que la presente invencion es susceptible de procedimientos de control de calidad bien establecidos. Muchas tecnicas de amplificacion de acido nucleico, tales como PCR, requieren no solo un calentamiento rapido de la solucion de reaccion, sino tambien un enfriamiento rapido. Las camaras de reaccion en la presente invencion se calientan preferiblemente por un lado y se usa la temperatura ambiente a traves de la cara opuesta para ayudar a reducir la temperatura del fluido. Ademas, la orientacion vertical de las realizaciones del dispositivo permite un enfriamiento mas rapido por conveccion pasiva que si el dispositivo se orientara horizontalmente, reduciendo por tanto el periodo de ciclo termico sin el uso de costosos ventiladores o dispositivos de Peltier.

El control de fluido es otro reto asociado a los disenos de dispositivo de prueba de acido nucleico de bajo coste. Los dispositivos conocidos en la materia emplean generalmente mecanismos de bombeo electromecanico, electrocinetico o piezoelectrico para manipular los fluidos durante la operacion del dispositivo. Estos elementos de bombeo aumentan tanto la complejidad como el coste del dispositivo. De forma similar, las valvulas que hacen uso de disenos micromecanicos elaborados o piezas moviles pueden aumentar los costes de fabricacion y reducir la fiabilidad debido a complicaciones tales como un fallo de la pieza movil o bioensuciamiento. Al contrario que los dispositivos de prueba de acido nucleico anteriormente descritos, las realizaciones de la presente invencion utilizan la presion hidrostatica bajo el control del microcontrolador junto con las fuerzas capilares y la tension superficial para manipular los volumenes de fluido. La orientacion vertical de algunas realizaciones de la presente invencion permite que la solucion de reaccion caiga en cascada de camara a camara bajo el control del microcontrolador para admitir las manipulaciones requeridas del ensayo. El fluido puede mantenerse en las camaras de reaccion individuales mediante un equilibrio de tamano de canal y tension superficial, en que la tension superficial evita el avance de fluido por desplazamiento de gas. La muestra avanza a la camara inferior preferiblemente solo despues de la activacion de un mecanismo de ventilacion sencillo bajo control del microcontrolador. Una vez abierta, el ventiladero permite que el fluido se mueva de una primera camara a una segunda camara al proporcionar una ruta para que el aire desplazado escape de la segunda camara a medida que entra fluido. Cada camara dentro de la capa flmdica se conecta preferiblemente con un recinto de ventilacion sellado a traves de un canal de ventilacion estrecho. El recinto de ventilacion esta preferiblemente sellado por una cara con una membrana de plastico fino que se rompe facilmente al calentar un resistor de montaje superficial pequeno debajo de la membrana. Una vez se abre el ventiladero de una camara inferior, prosigue el avance de fluido, incluso a bajas presiones hidrostaticas.

Como se describe mas espedficamente a continuacion, el mecanismo de valvula flmdica o microflmdica usado en

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algunas realizaciones de la presente invencion emplea preferiblemente un elemento de calentamiento en contacto termico y (opcionalmente) ffsico con un sello termolabil para posibilitar el control electronico del movimiento de fluido mediante la ventilacion de una camara de menor elevacion, para permitir que un fluido de una camara de mayor elevacion fluya a la camara inferior. En una realizacion, se monta un resistor de montaje superficial sobre una placa de circuito integrado, usando procedimientos de fabricacion de electronica ampliamente usados y bien establecidos, y se coloca en contacto ffsico con un sello de canal compuesto por material termolabil. Cuando se activa, el resistor de montaje superficial genera suficiente calor para romper el sello, lo que da como resultado la ventilacion de la camara a menor presion, tal como a presion ambiental, permitiendo asf el movimiento de fluido de una camara de mayor elevacion a una camara de menor elevacion. Preferiblemente, no se emplea un sello directo entre las camaras de mayor y menor elevacion. El canal y el sello pueden localizarse remotamente de las camaras de fluido, facilitando asf la disposicion del dispositivo flrndico en configuraciones eficaces para fabricacion. El material de sello puede comprender cualquier material que pueda sellar el canal de ventilacion y romperse por calentamiento como se describe, por ejemplo una lamina de plastico fino. Este enfoque al control del movimiento de fluido en el aparato se beneficia de los bajos costes del material, idoneidad para fabricacion al usar tecnicas de laminacion y fabricacion de electronica establecidas, mientras que proporciona la capacidad de mover fluidos a traves de una serie de camaras bajo el control de circuitos de control electronicos tales como microprocesadores o microcontroladores. El uso de ventiladeros, un material termolabil para sellar los ventiladeros (y no sellar las camaras de fluido o microcanales de fluido mismos) y un medio electronico de romper dicho sello con calor proporciona un medio de control del flujo de fluido a traves del dispositivo para posibilitar el movimiento de fluido en momentos predeterminados o despues de la terminacion de eventos espedficos (por ejemplo, alcanzar una temperatura, un cambio de temperatura o una serie de cambios de temperatura, o la terminacion de un tiempo o tiempos de incubacion u otros eventos).

Ademas, el enfoque de ventiladero tiene una serie de ventajas frente al sellado de las camaras de fluido mismas. Los recintos de ventilacion pueden localizarse en cualquier lugar sobre la disposicion flrndica y simplemente se comunican con la camara que regulan a traves de un canal de ventilacion. Desde el punto de vista de la fabricacion, los recintos de ventilacion pueden localizarse de modo que se fije una unica membrana de sellado en la capa flrndica para todos los recintos de ventilacion (que puede comprender un colector de recintos de ventilacion), preferiblemente mediante procedimientos bien establecidos tales como adhesivos, laminacion termica, soldado por ultrasonidos, soldado por laser, etc. En contraposicion, el sellado directo de una camara de fluido requiere que el material de sello se coloque en diferentes localizaciones correspondientes a cada localizacion de camara, lo que es mas diffcil de fabricar. Esto presenta una situacion mas exigente durante la fabricacion en comparacion con un solo colector de recintos de ventilacion sellado con una sola membrana. Ademas, el material de sellado localizado en la camara entrara probablemente en contacto con la solucion mantenida en la camara. Esto requiere el uso de un material que (i) no interfiera con las reacciones realizadas en la camara y (ii) no se afecte por la solucion. Dada la sensibilidad de las reacciones bioqmmicas a los inhibidores qrnmicos y las temperaturas elevadas usadas tanto para amplificacion como marcaje antes de la deteccion, la lista de materiales aceptables se vuelve limitada. Ademas, la proximidad ffsica de material termosensible asociado directamente a camaras de reaccion usadas para realizar reacciones a temperaturas elevadas presenta el reto significativo de asegurar el aislamiento termico del material sellante de valvula de las temperaturas elevadas empleadas durante las reacciones, ademas de prevenir que la solucion se caliente cuando se funde el material sellante. Para evitar el fallo de valvula, el material termosensible debe estar localizado remotamente respecto a la fuente de calor o el material termosensible debe activarse a temperaturas muy por encima de la temperatura maxima empleada en las reacciones. Localizar remotamente los sellos directamente asociados a las camaras en un dispositivo miniaturizado impone limitaciones a las disposiciones flrndicas que impiden el uso de disenos ffsicos compactos. Y el uso de temperaturas mayores para accionar valvulas localizadas en el sitio de la camara de reaccion puede ser nocivo para los componentes bioqmmicos, que pierden estabilidad ligeramente por encima de las temperaturas de reaccion empleadas. Finalmente, si las camaras de sellan directamente, el material sellante fundido puede permanecer en los canales entre camaras, bloqueando el flujo. La viscosidad del material sellante puede requerir mas presion en la columna de fluido que la obtenida en un aparato impulsado por la gravedad miniaturizado.

En realizaciones de la presente invencion, el mezclado de reactivos no requiere mas complejidad que otros sistemas. Los reactivos necesarios para la amplificacion de acido nucleico, tales como tampones, sales, desoxirribonucleotidos, cebadores oligonucleotfdicos y enzimas, preferiblemente se incorporan establemente mediante el uso de aglomerados o tortas liofilizados. Estos reactivos liofilizados, sellados en una camara flrndica, pueden solubilizarse facilmente tras contacto con solucion acuosa. En el caso de requerir mezclado adicional, la orientacion vertical de las realizaciones de la presente invencion ofrece oportunidades para procedimientos novedosos de mezclado de soluciones. Al utilizar calentadores bajo las camaras flrndicas, puede calentarse el gas, suministrando burbujas a la solucion de reaccion en la camara superior cuando la solucion contiene componentes termosensibles. Como alternativa, los calentadores pueden usarse para calentar directamente una solucion al punto en que ocurre la ebullicion, en el caso de que la solucion no contenga componentes termosensibles. La aparicion de burbujas de aire es a menudo indeseable en los dispositivos flrndicos y microflmdicos anteriormente dados a conocer, ya que pueden acumularse en las camaras y canales flrndicos y desplazar las soluciones de reaccion o impedir el movimiento de fluido dentro del dispositivo. El diseno vertical de las realizaciones de la invencion presentado en la presente memoria permite tambien que las burbujas suban hasta la superficie del fluido, dando como resultado un desplazamiento de fluido solo mmimo y transitorio, y mejorando eficazmente cualquier impacto desventajoso de las burbujas sobre el sistema flrndico o microflmdico. El mezclado por ebullicion es tambien

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conveniente con este diseno vertical, ya que el fluido desplazado durante el proceso simplemente vuelve a la camara flmdica original por gravedad despues de desconectar los elementos calentadores.

En realizaciones de la invencion, se usa una tira de deteccion colorimetrica para detectar los acidos nucleicos amplificados. Se usan comunmente ensayos de flujo lateral en pruebas de inmunoensayo debido a su facilidad de uso, fiabilidad y bajo coste. La tecnica anterior contiene descripciones del uso de tiras de flujo lateral para la deteccion de acidos nucleicos usando materiales porosos como zona receptora de muestra que esta en o cerca de la zona de marcaje, que tambien comprende un material poroso y esta dispuesta en o cerca de un extremo del dispositivo de ensayo de flujo lateral. En estas invenciones anteriores, los restos de marcaje estan en la zona de marcaje. El uso de materiales porosos que comprenden la zona receptora de muestra y la zona de marcaje da como resultado la retencion de algo de solucion de muestra asf como de partfculas de deteccion en los materiales porosos. Aunque pueden usarse en realizaciones de la presente invencion zonas de marcaje que comprenden materiales porosos que tienen restos inmovilizados reversiblemente requeridos para la deteccion, las realizaciones de la presente invencion utilizan preferiblemente partfculas o restos de deteccion mantenidos en una region del dispositivo distinta de la zona receptora de muestra de la tira de flujo lateral y que comprende materiales no porosos con bajas caractensticas de retencion de fluido. Este enfoque permite marcar muestras que contienen acido nucleico diana antes de la introduccion en los componentes porosos del extremo receptor de muestra del componente de flujo lateral del dispositivo, y elimina asf la retencion y/o perdida de material de muestra y partfculas de deteccion en una zona de marcaje porosa. Este procedimiento posibilita ademas el uso de diversos tratamientos de la muestra en presencia de restos de deteccion, tales como tratamiento a altas temperaturas para lograr la desnaturalizacion de dianas bicatenarias o de estructuras secundarias dentro de una diana monocatenaria sin preocupacion por el impacto de la temperatura sobre los materiales porosos de la zona receptora de muestra o de marcaje o los materiales de la tira de deteccion de flujo lateral. Adicionalmente, el uso de una zona de marcaje no en contacto de flujo lateral con la zona receptora de muestra, sino sometida al control de los componentes flrndicos tales como ventiladeros o valvulas, permite que diana y marcaje permanezcan en contacto durante periodos de tiempo controlados por los sistemas de control de flujo de fluido. Por tanto, las realizaciones de la presente invencion pueden ser diferentes a las tiras de prueba de flujo lateral tradicionales en las que los tiempos y condiciones de interaccion de muestra y partfcula de deteccion se determinan por las propiedades de transporte capilar de los materiales. Mediante la incorporacion de las partfculas de deteccion a una camara de temperatura regulada, es posible la desnaturalizacion de acido nucleico duplex, permitiendo una deteccion eficaz basada en la hibridacion. En realizaciones alternativas, se usa la fluorescencia para detectar la amplificacion de acido nucleico usando una combinacion de LED, fotodiodos y filtros opticos. Estos sistemas de deteccion optica pueden usarse para efectuar una deteccion y cuantificacion de acido nucleico instantaneas durante la amplificacion y una deteccion de punto final despues de la amplificacion.

Las realizaciones de la invencion comprenden proporcionar un sistema en el punto de uso de bajo coste en el que una muestra de acido nucleico puede amplificarse y detectarse selectivamente. Realizaciones adicionales incluyen la integracion con un dispositivo de preparacion de muestra de acido nucleico tal como el descrito en la publicacion internacional n° WO 2009/137059 A1, titulada "Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control". Una realizacion del dispositivo comprende preferiblemente tanto un componente flrndico plastico como un ensamblaje de circuito impreso (PCA), y se encierran opcionalmente en una carcasa que protege a los componentes activos. La regulacion de temperatura, mezclado de fluido y reactivos se coordinan preferiblemente mediante un microcontrolador. El modulo de reaccion se orienta y hace funcionar preferiblemente verticalmente de modo que la presion hidrostatica, fuerzas capilares y tension superficial, junto con las ventiladeros accionados por microcontrolador, controlen el movimiento de fluido dentro del dispositivo.

Con respecto al esquema representativo de la FIG. 1, se anade una muestra de acido nucleico a la camara de muestras 10. La muestra de acido nucleico puede derivar de un proceso de preparacion de acido nucleico en lmea (concretamente, subsistema de preparacion de acido nucleico integrado), separado (tal como uno de muchos procedimientos comercialmente disponibles, p.ej. columnas de centrifugacion) seguido de la adicion del acido nucleico purificado al dispositivo por pipeta, o de una muestra que contiene acido nucleico no procesado. Esta preferiblemente ya presente en la camara de muestras, o como alternativa se anade despues, una mezcla reactiva que puede estar en forma lfquida o seca, que contiene todos los componentes necesarios para la reaccion de amplificacion, tales como agentes de tamponacion, sales, dNTP, rNTP, cebadores oligonucleotidicos y/o enzimas. En algunas realizaciones, la mezcla reactiva se liofiliza formando reactivos liofilizados 20. La introduccion de la muestra en la camara de muestras causa que los reactivos y muestras se combinen de tal modo que los reactivos actuen sobre la muestra. Puede efectuarse opcionalmente una etapa de mezclado por burbujas opcional para mezclar adicionalmente la muestra con los reactivos o resuspender los reactivos. Se dirige entonces preferiblemente el fluido a traves del canal de entrada 40 a una o mas camaras de amplificacion 30 que residen debajo de la camara de muestras cuando el dispositivo esta en orientacion vertical. El canal de salida 45 conecta la camara de amplificacion 30 con la camara posterior. Para facilitar pruebas multiples, en las que se generan multiples amplicones, puede lograrse la amplificacion multiple mediante la deposicion de multiples conjuntos de cebadores dentro de las camaras de amplificacion. Adicionalmente, placas de circuitos y disenos fimdicos en que se incorporan multiples camaras de amplificacion y deteccion al dispositivo respaldan multiples reacciones de amplificacion paralelas que pueden ser reacciones individuales o multiples. Este enfoque reduce o elimina las complicaciones conocidas por los especialistas en la materia que son el resultado de la amplificacion multiple usando multiples pares

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de cebadores en la misma reaccion. Ademas, el uso de multiples camaras de reaccion de amplificacion permite la amplificacion simultanea en diferentes reg^enes de temperatura para admitir los requisitos para una amplificacion optima, tales como las diferentes temperaturas de fusion o reasociacion requeridas para diferentes secuencias de diana y/o cebador.

El movimiento de fluido desde una primera camara a una segunda camara del dispositivo se logra preferiblemente mediante la apertura de un ventiladero conectado con la segunda camara como se muestra en las FIG. 1-2. Una realizacion del ventiladero comprende dos componentes, el recinto de ventilacion 50, una cara del cual comprende una membrana tal como poliolefina y esta en contacto con un resistor montado en el ensamblaje de placa de circuito impreso (PCA) 75, y el canal de ventilacion 60, que conecta el recinto de ventilacion 50 con el compartimento microflmdico bajo su control. Cuando se anade en primer lugar fluido al sistema en la camara de muestras, se sella el ventiladero conectado con la camara siguiente, y el fluido no pasara a traves del canal que conecta las dos camaras. Un microcontrolador es responsable de enviar una corriente electrica a un elemento calentador, tal como el resistor 70, localizado en o cerca de la membrana que comprende una cara del recinto de ventilacion 50. El calor producido por el resistor activado rompe la membrana fina 80, abriendo por tanto el ventiladero. Una vez abierto, el ventiladero permite que el fluido caiga desde la primera camara a la segunda camara mediante la provision de una ruta para que el aire desplazado escape de la segunda camara a medida que entra fluido. Otras realizaciones del recinto de ventilacion pueden comprender sellos distintos de una membrana termosensible, y pueden utilizar otros procedimientos de ruptura de los sellos, tales como puncion, desgarro o disolucion.

La camara de amplificacion esta preferiblemente en contacto con elementos calentadores para proporcionar un medio para la regulacion de temperatura necesario para respaldar la amplificacion de acido nucleico. En algunas realizaciones de la invencion, la camara de amplificacion puede contener oligonucleotidos sobre al menos una porcion de la superficie interior. Como se muestra en las FIG. 1-3, una realizacion del dispositivo comprende el canal de entrada 30 que conduce desde la camara de muestras 10 a la camara de amplificacion 30, el canal de salida 45 que conduce preferiblemente desde la camara de amplificacion 30 a la camara de marcaje 90 y el canal de ventilacion 60 que conduce al recinto de ventilacion 50 como se describe anteriormente. En la interfaz entre la pared de la camara de amplificacion 95 y el elemento o elementos calentadores 100, puede ser ventajoso colocar un material termoconductor tal como una grasa o compuesto termico. Un microcontrolador modula preferiblemente la corriente al elemento o elementos de calentamiento resistivo, preferiblemente mediante transistores de efecto de campo semiconductor de oxido metalico (MOSFET), basandose en los datos recogidos por el sensor de temperatura 110, preferiblemente usando procedimientos de control de la temperatura de encendido/apagado o derivados integrales proporcionales (PID) u otros procedimientos de control algontmico de la temperatura conocidos por los especialistas en la materia.

Los sistemas existentes emplean dispositivos de calentamiento y enfriamiento activos localizados en un instrumento reutilizable para lograr el control de la temperatura para la amplificacion de acido nucleico que tiene lugar en un cartucho desechable, lo que requiere necesariamente un instrumento de suficiente precision que sea capaz de formar fiablemente un contacto termico reproducible con un cartucho desechable extrafble. Esto da como resultado un coste y complejidad instrumentales aumentados, asf como una fiabilidad reducida de la interfaz termica entre el subsistema de control de la temperatura del instrumento y el subsistema flmdico del cartucho desechable. Al contrario que estos sistemas, las realizaciones de la presente invencion comprenden preferiblemente elementos de calentamiento resistivo para el control de la temperatura colocados sobre la porcion desechable del aparato, tales como los ilustrados en la FIG. 11 y como se describen anteriormente. Colocar los elementos de calentamiento y los correspondientes sensores de temperatura sobre el componente desechable posibilita la fabricacion de un acoplamiento termico altamente reproducible entre el subsistema de control de la temperatura y las camaras de amplificacion y deteccion con las que interaccionan. Este enfoque posibilita un medio altamente fiable de acoplamiento del subsistema flmdico con el subsistema de control termico electronico al formar la interfaz termoconductora durante la fabricacion. El contacto termico superior resultante entre los elementos de control electronico de la temperatura y el subsistema flmdico da como resultado un rapido equilibrado de la temperatura, y por lo tanto ensayos rapidos.

Las realizaciones de la camara de amplificacion comprenden preferiblemente materiales capaces de soportar un calentamiento y enfriamiento repetidos a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 110 °C. Aun mas preferiblemente, la camara de amplificacion comprende materiales capaces de soportar un calentamiento y enfriamiento repetidos a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 30 a aproximadamente 110 °C a una velocidad de cambio de temperatura del orden de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 °C por segundo. La camara de amplificacion es preferiblemente capaz de mantener las soluciones en la misma a temperaturas adecuadas para protocolos de ciclacion termica (FIG. 4A-D) o amplificacion isotermica (FIG. 4E), dependiendo de la programacion del microcontrolador. En algunas aplicaciones de amplificacion de acido nucleico, es deseable proporcionar una incubacion inicial a temperatura elevada, por ejemplo una temperatura entre aproximadamente 37 y aproximadamente 110 °C, durante un periodo de 1 segundo a 5 minutos, para desnaturalizar el acido nucleico diana. Posteriormente, se vana la temperatura de la solucion de reaccion entre al menos dos temperaturas que incluyen, pero sin limitacion, una temperatura que da como resultado la desnaturalizacion de acido nucleico duplex y una temperatura adecuada para la reasociacion de cebador mediante hibridacion con la diana y la extension del cebador mediante polimerizacion de acido nucleico catalizada

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por polimerasa. La duracion de las incubaciones a cada temperatura necesaria en un regimen de termociclacion puede variar con la composicion de secuencia del acido nucleico diana y la composicion de la mezcla de reaccion, pero esta preferiblemente entre aproximadamente 0,1 segundos y aproximadamente 20 segundos. Se efectua tipicamente el calentamiento y enfriamiento repetidos durante aproximadamente 20 ciclos a aproximadamente 50 ciclos. En realizaciones que implican procedimientos de amplificacion isotermica, se mantiene la temperatura de la solucion de reaccion a temperatura constante (en algunos casos despues de una incubacion inicial a temperatura elevada) durante entre aproximadamente 3 minutos y aproximadamente 90 minutos, dependiendo de la tecnica de amplificacion usada. Una vez se completa la reaccion de amplificacion, se transporta la solucion de reaccion de amplificacion, abriendo el ventiladero que esta en comunicacion con la camara de marcaje, a la camara de marcaje que se localiza debajo de la camara de amplificacion.

En algunas realizaciones, pueden realizarse reacciones bioqmmicas adicionales en la camara de amplificacion antes, durante o despues de la reaccion de amplificacion. Dichos procesos pueden incluir, pero sin limitacion, transcripcion inversa en la que se transcribe ARN a ADNc, multiplexacion en la que multiples pares cebadores amplifican simultaneamente multiples acidos nucleicos diana, y amplificacion instantanea, en la que se detectan productos de amplificacion durante el proceso de reaccion de amplificacion. En el ultimo caso, la camara de amplificacion puede no contener una valvula o canal de salida, y la camara de amplificacion comprendena preferiblemente una ventana optica o configurada de otro modo para posibilitar el examen de la concentracion de amplicon durante el proceso de reaccion de amplificacion. En una realizacion de amplificacion instantanea, se monitoriza, en oligonucleotidos marcados fluorescentemente complementarios del acido nucleico diana o en tintes fluorescentes espedficos de ADN duplex, la intensidad de fluorescencia mediante una fuente de luz de excitacion tal como LED o laser o laseres de diodo y un detector tal como un fotodiodo y componentes opticos apropiados incluyendo, pero sin limitacion, filtros opticos.

En realizaciones alternativas de la invencion, se facilita el movimiento de fluido usando calentamiento resistivo para expandir gases dentro de las camaras de dispositivo (FIG. 5). Por ejemplo, al calentar la camara de amplificacion 30, se expandira el gas dentro de la camara y escapara a traves del canal ventilado, en este caso el canal de entrada 40, en forma de burbujas 120. En algunas realizaciones de la invencion, dicho calentamiento de la camara mas abajo puede usarse para generar burbujas suficientes para mezclar los reactivos presentes en el volumen de fluido de una camara mas arriba, tal como la camara de muestras 10. Una vez se desconecta el elemento de calentamiento, el gas dentro de la camara de amplificacion 30 se enfriara y contraera, extrayendo el fluido 125 de la camara de muestras 10 superior a la camara de amplificacion 30. Al repetir el proceso varias veces, todo el volumen de fluido puede dirigirse desde una camara a otra. En realizaciones alternativas de la invencion, puede usarse dicho mecanismo junto con un mecanismo de ventilacion con resistor para desplazar volumenes de fluido.

Las realizaciones de la camara de marcaje proporcionan preferiblemente el marcaje espedfico de acidos nucleicos diana amplificados generados en la camara de amplificacion, que funciona junto con la camara de deteccion proporcionando los resultados analtticos de la prueba. Como se muestra en la FIG. 6A, la camara de marcaje 90 puede contener partfculas de deteccion 130 que estan secadas, liofilizadas o presentes en al menos una porcion de la superficie interior en forma de una mezcla secada de partfculas de deteccion en un portador tal como un polisacarido, detergente, protema u otro compuesto conocido por los especialistas en la materia por facilitar la resuspension de las partfculas de deteccion. La camara de marcaje esta preferiblemente conectada con el canal de entrada 135 que conduce desde la camara de amplificacion 30, el canal de salida 140 que conduce a la camara de deteccion y el canal de ventilacion 150 que conduce a un recinto de ventilacion como se describe anteriormente. El canal de entrada 135 es tfpicamente el mismo canal que el canal de salida 45 de la camara de amplificacion 30. En la interfaz con el PCA, se coloca preferiblemente una capa fina de material termoconductor tal como grasa termica entre una cara de la camara de marcaje y un elemento de calentamiento resistivo.

Las partfculas de deteccion adecuadas incluyen, pero sin limitacion, tintes fluorescentes espedficos de acido nucleico duplex, oligonucleotidos modificados fluorescentemente o micropartfculas tintadas conjugadas con oligonucleotido u oro coloidal. La deteccion de amplicon implica un “oligonucleotido de deteccion” u otra “sonda de deteccion” que es complementario o capaz de otro modo de unirse espedficamente al amplicon para detectar. La conjugacion de un oligonucleotido de deteccion con una micropartfcula puede ocurrir mediante el uso de partfculas recubiertas con estreptavidina y oligonucleotidos biotinilados, o mediante la qrnmica de carbodiimida mediante la que se activan partfculas carboxiladas en presencia de carbodiimida y se hacen reaccionar espedficamente con aminas primarias presentes en el oligonucleotido de deteccion. La conjugacion del oligonucleotido de deteccion con el resto detectable puede ocurrir internamente o en el extremo 5' o 3'. Los oligonucleotidos de deteccion pueden enlazarse directamente a la micropartfcula o, mas preferiblemente, a traves de un resto espaciador tal como etilenglicol o polinucleotidos.

En el caso de un producto de amplificacion de ADN duplex, calentar la solucion de reaccion despues de la introduccion en la camara de deteccion facilita la deteccion. Fundir el ADN duplex y enfriar entonces en presencia del oligonucleotido de deteccion da como resultado un marcaje espedfico de secuencia del acido nucleico diana amplificado. El elemento resistivo debajo de la camara de deteccion puede usarse para calentar el volumen de fluido durante aproximadamente 1 a aproximadamente 120 segundos para iniciar la fusion del ADN duplex. A medida que la solucion se deja enfriar a temperatura ambiente, el acido nucleico diana amplificado puede hibridar espedficamente con micropartfculas de deteccion. El volumen de reaccion se dirige preferiblemente entonces a una

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region de la camara de deteccion debajo de la camara de marcaje abriendo el ventiladero de la camara de deteccion.

Para que ocurra un marcaje eficaz, se mezclan preferiblemente bien las partmulas de deteccion solubilizadas con la solucion de reaccion. En realizaciones de la invencion, puede emplearse un segundo procedimiento de mezclado que implica calentadores resistivos durante el marcaje para tanto desnaturalizar acido nucleico diana bicatenario como mezclar suficientemente las micropartmulas de deteccion en la solucion de reaccion. El calentamiento de la solucion en la camara de marcaje por encima del punto de ebullicion puede usarse para inducir turbulencia y mezclado en solucion. Las burbujas nacientes nucleadas en el fondo y los lados de la camara por un rasgo texturado tal como una lmea grabada con laser 132, mostrada en la FIG. 6B (o una serie de dichas lmeas), preferiblemente agitan eficazmente la solucion. Este efecto se ha demostrado que funciona a muchas altitudes, independientemente de las correspondientes variaciones de la temperatura de ebullicion. Cualquier solucion desplazada a las camaras superiores por la ebullicion preferiblemente fluye de vuelta abajo a la camara de marcaje durante el posterior enfriamiento. En algunas realizaciones de la invencion, las regiones de la cara interna o las paredes de la camara de marcaje pueden texturizarse o tratarse de otro modo para localizar la ebullicion de nucleacion en una pared o cara de la camara espedfica. En otras realizaciones, pueden colocarse una o mas perlas de ebullicion en la camara de marcaje para localizar la ebullicion de nucleacion en un punto o puntos espedficos.

Las realizaciones de la camara de deteccion de la presente invencion proporcionan la deteccion espedfica de acidos nucleicos diana amplificados que se han marcado en la camara de marcaje. En ciertas realizaciones de la invencion, se logra la deteccion mediante imbibicion capilar de la solucion que contiene amplicon marcado mediante una tira absorbente que comprende un material poroso (tal como celulosa, nitrocelulosa, polietersulfona, poli(fluoruro de vinilideno), nailon, nailon modificado con carga o politetrafluoroetileno) estampado con lmeas, puntos u otros elementos visualmente discernibles que comprenden un resto de union capaz de unirse espedficamente al amplicon marcado directa o indirectamente. En algunas realizaciones, el componente de tira absorbente del dispositivo comprende hasta tres sustratos porosos en contacto ffsico: una almohadilla de tensioactivo que comprende reactivos anfipaticos para potenciar la imbibicion, una zona de deteccion que comprende un material poroso (tal como celulosa, nitrocelulosa, polietersulfona, poli(fluoruro de vinilideno), nailon, nailon modificado con carga o politetrafluoroetileno) en el que se inmoviliza al menos un resto de union capaz de union selectiva con el amplicon marcado y/o una almohadilla absorbente para proporcionar una capacidad absorbente adicional. Al contrario que los dispositivos de deteccion de flujo lateral anteriormente descritos, las partmulas de deteccion preferiblemente no se incorporan a los materiales porosos de flujo lateral en la camara de deteccion, sino que en lugar de ello se mantienen mas arriba en la camara de marcaje, en que pueden realizarse manipulaciones para potenciar sustancialmente la formacion de complejos de union entre el amplicon y las partmulas de deteccion, tales como calentamiento/ebullicion, antes de la introduccion de los acidos nucleicos marcados resultantes en los componentes porosos del dispositivo.

Se inmoviliza preferiblemente un “oligonucleotido de captura” o “sonda de captura” en el elemento de tira de deteccion del dispositivo mediante cualquiera de una variedad de medios conocidos por los especialistas en la materia, tales como irradiacion UV. Se disena la sonda de captura para capturar el acido nucleico marcado a medida que la solucion que contiene el acido nucleico marcado se embebe a traves de la zona de captura, dando como resultado una concentracion aumentada del marcaje en el sitio de inmovilizacion de la sonda de captura, produciendo por tanto una senal detectable indicativa de la presencia del amplicon o amplicones de acido nucleico diana marcado. Puede estamparse una sola tira de deteccion con una o multiples sondas de captura para posibilitar la deteccion multiple de multiples amplicones, la determinacion de la secuencia del amplicon y el control de calidad del ensayo (controles positivos y negativos).

Capa de subensamblaje fluidico

Los componentes de realizaciones del subensamblaje flrndico comprenden preferiblemente plastico tal como acnlico, policarbonato, PETG, poliestireno, poliester, polipropileno y/u otros materiales similares. Estos materiales estan facilmente disponibles y pueden fabricarse mediante procedimientos estandares. Como se ilustra en las FIG. 3 y 7, los subensamblajes flrndicos comprenden tanto camaras como canales. Las camaras flrndicas comprenden paredes, dos caras 160, y se conectan con uno o mas canales tal como una entrada, salida o ventiladero. Los canales pueden conectar dos camaras flrndicas y comprenden paredes y dos caras. El diseno de la camara flrndica maximiza preferiblemente la relacion de area superficial a volumen para facilitar el calentamiento y enfriamiento. El volumen interno de la camara esta preferiblemente entre aproximadamente 1 pl y aproximadamente 50 pl. El area de la cara de camara 160 en contacto con la solucion corresponde preferiblemente al area con el que los elementos de calentamiento interaccionan para asegurar una temperatura de fluido uniforme durante el calentamiento. La forma de las camaras flrndicas puede seleccionarse para coincidir con los elementos de calentamiento y para proporcionar geometnas favorables para la entrada y salida de solucion. En algunas realizaciones, el volumen de la camara puede ser mayor que el volumen de fluido para proporcionar un espacio para las burbujas que aparecen en el transcurso de la operacion del dispositivo. Las camaras flrndicas pueden tener extensiones ampliadas que conducen a canales de ventilacion, para asegurar que el fluido no invade el canal por accion capilar o bloquea de otro modo el mecanismo de ventilacion. Las porciones de aquellas camaras con las que se comunican los canales de ventilacion pueden incluir opcionalmente una o mas caras no humectantes o hidrofobas para reducir adicionalmente la invasion de fluido en el canal de ventilacion.

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En algunas realizaciones, cada subensamblaje flmdico comprende tres laminas de plastico laminado, donde un componente 200 forma las paredes de las camaras flmdicas y los otros dos componentes de cara 210 y 220 se laminan con la primera formando las caras. El componente de cara 210 puede comprender opcionalmente los orificios 212 para ver los indicadores LED 214. El componente de cara 220 comprende preferiblemente los reactivos liofilizados 20, las partfculas de deteccion 130 y el ensamblaje de tira de deteccion 230, y preferiblemente interacciona con la PCB 75 a traves de un relleno adhesivo 222, que puede incluir una membrana con borde adhesivo 224. En realizaciones alternativas, cada subensamblaje flmdico puede comprender dos componentes de plastico, en que un componente forma las paredes y una cara y el otro componente se lamina con el primero sellando la camara y formando la segunda cara. En realizaciones de la presente invencion, los componentes de plastico del subensamblaje flmdico pueden fabricarse mediante procesos industriales de corte con laser o chorro de agua, punzon o troquel y moldeo por inyeccion.

En algunas realizaciones de la invencion, el grosor de las camaras flmdicas y de las paredes de canal esta en el intervalo de aproximadamente 0,025 mm a aproximadamente 1 mm, y preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 0,5 mm. Este grosor satisface preferiblemente los requisitos tanto de integridad estructural de la capa flmdica como de respaldo del sellado de la camara cerrada a altas temperaturas y presiones asociadas. El grosor de las paredes del canal, particularmente de las paredes del canal de ventilacion, es preferiblemente menor del de las camaras y en el intervalo de aproximadamente 0,025 mm a aproximadamente 0,25 mm. La anchura de los canales de entrada y salida se elige preferiblemente para potenciar la capilaridad. Un canal de ventilacion estrecho confiere una rigidez mejorada a la capa flmdica sin efecto adverso sobre la ventilacion a presion atmosferica. El plastico que forma las caras de la capa flmdica es preferiblemente mas fino que el que forma las paredes para maximizar la transferencia de calor. Roturas termicas opcionales 170 atraviesan algunos componentes de la capa flmdica y rodean las camaras de amplificacion y deteccion, contribuyendo al aislamiento termico de las camaras de temperatura controlada.

Los plasticos usados en el ensamblaje de la capa flmdica, tales como acnlico y poliester, comprenden preferiblemente materiales hidrofobos. En realizaciones de la invencion, los componentes de la capa flmdica pueden tratarse para potenciar la humectabilidad (concretamente, disminuir la hidrofobicidad). Dichos tratamientos aseguran un control de fluido apropiado junto con las dimensiones del canal flmdico. En algunas realizaciones, puede aplicarse un tensioactivo biocompatible tal como Triton X-100 a materiales no recubiertos. El tratamiento de descarga de plasma es otro tratamiento opcional para alterar la hidrofobicidad de las superficies en contacto con fluido.

En algunas realizaciones de la invencion, puede usarse pelfcula adhesiva de doble cara para sellar los diversos componentes de la capa flmdica. Se aplica pelfcula adhesiva, tal como aquella que comprende el relleno adhesivo 222 o la membrana 224, a los lados del componente interior en el caso de una capa flmdica de tres componentes, o a un lado en el caso de una capa flmdica de dos componentes. Antes de anadir el componente de cara 220 a las demas capas, pueden incorporarse componentes adicionales de la capa flmdica tales como el ensamblaje de tira de deteccion 230, las partfculas de deteccion 130 y los reactivos liofilizados 20. En algunas realizaciones, los componentes pueden laminarse aplicando presion para asegurar una buena adhesion. Los adhesivos conocidos por afectar o que se encuentra que afectan negativamente el rendimiento de las reacciones de amplificacion de acido nucleico deben evitarse. Los adhesivos basados en acnlico o silicona se han usado exitosamente en la invencion. Es una pelfcula adhesiva preferida SI7876 suministrada por Advanced Adhesives Research. Pueden usarse otros adhesivos si se encuentra que son qmmicamente compatibles con los tampones, plasticos y qmmicas de reaccion empleados mientras que proporcionan un sellado robusto a las temperaturas encontradas durante la operacion del dispositivo.

Con respecto a la FIG. 2 y 3, los recintos de ventilacion se diferencian preferiblemente de otras camaras en su construccion. Despues de la construccion de la capa flmdica como se describe anteriormente, los recintos de ventilacion poseen una cara abierta por el lado de la capa flmdica que se junta con la capa de PCA 75. Para formar el recinto de ventilacion, se lamina un componente plastico adicional para sellar la camara, preferiblemente que comprende una membrana termolabil fina 80 con una cara adhesiva para aplicacion al lado de la capa flmdica adyacente al resistor de ventilacion 70 del PCA. La membrana 80 comprende poliolefina de entre aproximadamente 5 pm y aproximadamente 200 pm de grosor, aunque pueden usarse otras pelfculas similares. Esta membrana fina es bien adecuada tanto para sellar el recinto de ventilacion como para permitir una facil perforacion y, por tanto, la ventilacion a la atmosfera cuando se pasa corriente a traves del resistor de ventilacion, generando un rapido aumento de temperatura.

Componentes adicionales de la capa flmdica

Como se describe anteriormente, se incorporan preferiblemente varios componentes adicionales a la capa flmdica de la presente invencion antes de la laminacion y sellado finales. Los reactivos, incluyendo tampones, sales, dNTP, cebadores oligonucleotidicos y enzimas tales como ADN polimerasa y transcriptasa inversa, pueden liofilizarse en aglomerados o tortas antes del ensamblaje del dispositivo. La liofilizacion de reactivos es bien conocida en la materia e implica la deshidratacion de alfcuotas de reactivos congeladas mediante sublimacion bajo vacfo aplicado. Al anadir formulaciones espedficas de lioprotectores tales como azucares (disacaridos y polisacaridos) y polialcoholes a los reactivos antes de congelar, puede conservarse la actividad de las enzimas y puede aumentarse

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la velocidad de rehidratacion. Los aglomerados o tortas de reactivos liofilizados se fabrican mediante procedimientos estandares y, una vez formados, son razonablemente duraderos y pueden colocarse facilmente en camaras espedficas de la capa flmdica antes de laminar la cara final.

En algunas realizaciones de la invencion, las micropardculas de deteccion son otro componente adicional de la capa flmdica. En algunas realizaciones, estas micropardculas pueden liofilizarse como se describe para los reactivos de reaccion anteriores. En otras realizaciones, las micropartfculas en tampon lfquido pueden aplicarse directamente a la cara interior de una camara flmdica y secarse antes de sellar. El tampon lfquido que contiene micropardculas preferiblemente comprende tambien azucares o polialcoholes que ayudan a la rehidratacion. La incorporacion de micropartfculas al tampon acuoso directamente en la capa flmdica antes de secar puede simplificar y reducir el coste final de fabricacion, y puede requerir el calentamiento o ebullicion de nucleados como se describe anteriormente tanto para mezclar adecuadamente las micropartfculas con la solucion de reaccion como para desnaturalizar el producto de acido nucleico bicatenario para hibridacion con las partfculas de deteccion.

En algunas realizaciones de la presente invencion, se incorpora tambien un ensamblaje de tira de deteccion de flujo lateral a la capa flmdica. La tira de deteccion comprende preferiblemente un ensamblaje de membrana que comprende al menos un componente poroso y opcionalmente puede comprender una almohadilla absorbente, una membrana de deteccion, una almohadilla de tensioactivo y una pelfcula de soporte. La membrana de deteccion esta compuesta por nitrocelulosa, celulosa, polietersulfona, poli(fluoruro de vinilideno), nailon, nailon modificado con carga o politetrafluoroetileno, y puede soportarse en una pelfcula de plastico. Como se describe anteriormente, la sonda de captura puede depositarse e inmovilizarse irreversiblemente sobre la membrana de deteccion en lmeas, puntos o cualquier patron que pueda visualizarse por el ojo humano a simple vista. Los oligonucleotidos depositados pueden inmovilizarse permanentemente mediante irradiacion UV de la membrana de deteccion despues de la deposicion de la sonda de captura. La almohadilla de tensioactivo puede comprender un sustrato poroso, preferiblemente con una union a acido nucleico y propiedades de retencion de fluido mmimas que permitan la migracion sin trabas del producto de acido nucleico y las micropartfculas de deteccion. La almohadilla de tensioactivo puede comprender materiales tales como fibra de vidrio, celulosa o poliester. En realizaciones de la invencion, se secan formulaciones que incluyen al menos un reactivo anfipatico sobre la almohadilla de tensioactivo para permitir una migracion uniforme de muestra a traves de la membrana de deteccion. La almohadilla absorbente puede comprender cualquier material absorbente, y ayuda a inducir la imbibicion de muestra mediante el ensamblaje de membrana de deteccion. Usando una pelfcula de soporte adhesiva, tal como una pelfcula adhesiva de doble cara, como base, se ensambla el componente de membrana de deteccion colocando en primer lugar la membrana de deteccion, seguida de la almohadilla absorbente opcional y/o la almohadilla de tensioactivo en contacto ffsico con la membrana de deteccion con un solapamiento de entre aproximadamente 1 mm y aproximadamente 2 mm.

Capa de subensamblaje electronico

En algunas realizaciones, la placa de circuito impreso (PCB) comprende un material laminado chapado con cobre FR4 de 1,57 mm de grosor estandar, aunque pueden usarse otros materiales de placa y grosores estandares. Los componentes electronicos tales como resistores, termistores, LED y microcontroladores comprenden preferiblemente dispositivos de montaje superficial (SMD) a la venta y se colocan segun la metodologfa estandar en la industria.

En realizaciones alternativas, el PCA podna integrarse con la pared del modulo y comprender un circuito de plastico flexible. Pueden usarse materiales de circuito flexibles tales como PET y poliimida. El uso de circuitos de plastico flexible es bien conocido en la materia. En otra realizacion, los elementos de calentamiento y sensores de temperatura pueden serigrafiarse sobre la capa flmdica plastica con tecnologfa desarrollada por compares tales como Soligie, Inc.

En algunas realizaciones de la invencion, el grosor de PCB, asf como la cantidad y colocacion del cobre en las regiones que rodean los calentadores resistivos, se adaptan para la gestion termica de la solucion de reaccion en la capa flmdica. Esto puede lograrse mediante el uso de tecnicas de fabricacion estandares ya mencionadas.

Se muestran ensamblajes de calentador resistor ejemplares en la FIG. 2 y la FIG. 3. En algunas realizaciones de la invencion, el resistor es un paquete de pelfcula gruesa 2512, aunque pueden usarse otros resistores. Las camaras de calentamiento en la capa flmdica son preferiblemente de dimensiones similares a las del resistor para asegurar un calentamiento uniforme a lo largo de la camara. Un solo resistor de este tamano es suficiente para calentar aproximadamente 15 pl de solucion, suponiendo un grosor de capa flmdica de 0,5 mm. El esquema de la FIG. 3 muestra dos resistores 100 que forman un calentador suficiente para calentar aproximadamente 30 pl de solucion, suponiendo una capa flmdica de 0,5 mm de grosor. En este caso, los resistores son cada uno preferiblemente de 40 ohmios y dispuestos en configuracion paralela.

En algunas realizaciones de la invencion, el sensor de temperatura 110 comprende preferiblemente un termistortal como un dispositivo 0402 NTC, que tiene una altura similar al paquete resistor 2512. El termistor se alinea preferiblemente adyacentemente a o entre los calentadores del resistor en el caso de disposicion de un resistor o dos resistores, respectivamente; vease por ejemplo la FIG. 8. Al alinear estrechamente estos elementos electronicos, solo se da como resultado un hueco de aire muy fino entre ellos. Ademas, la aplicacion de un

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compuesto termico antes de ensamblar la capa flmdica con la electronica asegura un buen contacto termico entre capa flmdica, resistor y termistor.

En algunas realizaciones de la invencion, el resistor de ventilacion 70 es un paquete de pelfcula gruesa 0805, aunque pueden usarse resistores similares.

En algunas realizaciones de la invencion, el microcontrolador es un AVR Atmega32. El microcontrolador esta preferiblemente emparejado con la complejidad del sistema flmdico. Por ejemplo, con multiplexacion, el numero de ventiladeros y calentadores individuales es proporcional al numero de lmeas de E/S del microcontrolador. El tamano de memoria puede elegirse para admitir el tamano del programa.

En ciertas realizaciones de la invencion, se usan MOSFET de canal N del paquete SOT-23 que operan en modo ENCENDIDO-APAGADO para modular la carga de corriente a ventiladero y resistores calentadores. Las senales de modulacion se envfan a traves del microcontrolador. En realizaciones alternativas, podna usarse un esquema de modulacion de la anchura de pulso y/u otros algoritmos de control para una gestion termica mas avanzada de la flmdica. Esto se manejana tfpicamente por el microcontrolador y puede requerir hardware y/o aplicaciones de software adicionales conocidos por los especialistas en la materia.

Ensamblaje de dispositivo final

El ensamblaje final de componentes flmdicos, electronicos y de carcasa en un dispositivo acabado empieza preferiblemente mediante la laminacion de la capa o capas flmdicas 250 y la capa electronica 75 para asegurar un buen contacto termico entre los elementos de calentamiento de PCA y las camaras y/o recintos presentes en la capa flmdica. Como se muestra en la FIG. 9, el relleno adhesivo 222 une conjuntamente las dos capas y asegura el nivel de contacto entre la capa flmdica plana y los componentes electronicos topograficamente elevados presentes en el PCA. Puede colocarse compuesto o grasa termica sobre los elementos de calentamiento antes de la laminacion para mejorar adicionalmente el contacto termico. Despues del ensamblaje de las capas flmdica y electronica, puede fijarse una carcasa de plastico protectora para dar como resultado el dispositivo final.

Dependiendo de la aplicacion, pueden ser de la mayor utilidad diferentes realizaciones de la invencion. Algunas realizaciones comprenden un dispositivo en que una unidad basica de control pequena dirige una unidad desechable menor que contiene los sistemas de amplificacion y deteccion de acido nucleico. Esta realizacion particular ayuda a reducir el coste de una prueba de diagnostico individual. Se muestra en la FIG. 10 un dispositivo representativo disenado con este fin. Como se describe anteriormente, las funciones electronicas de dicho dispositivo se dividen preferiblemente en dos subensamblajes separados. El subensamblaje desechable 260 comprende el conector de clavijas 270 u otro conector electronico similar y componentes electronicos de bajo coste tales como elementos de calentamiento de la camara de amplificacion 100, elementos de calentamiento de la camara de marcaje 265, elementos de calentamiento del ventiladero 70, sensores de temperatura tales como termistores y opcionalmente indicadores LED 214, incluyendo aquellos componentes que interaccionan directamente con los componentes del sistema flmdico. El conector 270 proporciona preferiblemente corriente a los calentadores resistivos junto con una lmea de energfa y senal al termistor o termistores. El subensamblaje reutilizable o unidad basica 280 incorpora preferiblemente componentes reutilizables tales como microcontrolador, MOSFET, interruptores, suministro de energfa o toma de alimentacion 275 y/o pila, ventilador de enfriamiento opcional, interfaz de usuario opcional y el conector 272 compatible con el conector 270 del subensamblaje desechable 260. Cuando los subensamblajes se emparejan a traves de los conectores 270 y 272, la unidad basica 280 respalda preferiblemente el subensamblaje desechable 260 en una orientacion sustancialmente vertical o casi vertical. Aunque es preferible una orientacion sustancialmente vertical en algunas de las realizaciones descritas en la presente memoria, pueden obtenerse resultados similares si el dispositivo funciona inclinado, especialmente si se recubren ciertas rutas para reducir el angulo de humectacion de las soluciones usadas.

Otra realizacion comprende un dispositivo en que todo el ensamblaje es desechable, como se muestra en la FIG. 11. En esta realizacion, hay un solo ensamblaje electronico que esta alimentado por una pila de 9 voltios 305 preferiblemente enlazado con el lado posterior del dispositivo a traves de las terminales 307, como se muestra en la FIG. 11C. El microcontrolador 300, el circuito de acondicionamiento de energfa 302 y los MOSFET 310 se localizan preferiblemente tambien en el lado posterior del dispositivo mostrado en la FIG. 11 B, mientras que el lado opuesto, que esta en contacto con la capa flmdica y se muestra en la FIG. 11A, comprende los elementos de calentamiento de la camara de amplificacion 100, los elementos de calentamiento de la camara de marcaje 265, los elementos de calentamiento del ventiladero 70 y sensores de temperatura. El dispositivo representado en la FIG. 11 esta disenado para incorporar camaras y otros componentes requeridos para realizar dos reacciones, las reacciones de amplificacion y marcaje, en paralelo para aplicaciones multiples. Esta realizacion particular es ideal para aplicaciones en que se efectua la prueba en localizaciones remotas. El dispositivo puede alimentarse como alternativa por un adaptador de pared u otra pila o pilas con suficiente capacidad.

Para proporcionar una prueba molecular de muestra a resultado completa, puede hacerse interaccionar cualquiera de las realizaciones anteriores de la invencion con un sistema de preparacion de muestra 320 que proporciona acidos nucleicos como salida a la camara de muestras 10 a traves del canal 325. Esto se ha demostrado usando la tecnologfa de preparacion de muestra descrita en la publicacion internacional n° WO 2009/137059 A1, titulada

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“Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control”. Se ilustra una realizacion del dispositivo integrado resultante en la FlG. 12.

Subensamblaje fluidico con multiples componentes de pared

En algunas realizaciones, tales como la ilustrada en la FIG. 7, el subensamblaje flmdico puede comprender tres laminas de plastico laminadas, en que una lamina forma las paredes de las camaras flmdicas y los otros dos componentes se laminan con la primera formando las caras. En realizaciones alternativas, el subensamblaje fluidico puede comprender dos componentes plasticos, en que un componente forma las paredes y una cara y el otro componente se lamina con el primero para sellar la camara y formar la segunda cara. En realizaciones de la presente invencion, los componentes plasticos del subensamblaje fluidico pueden fabricarse mediante procesos industriales de corte por laser o chorro de agua, punzon o troquel y moldeo por inyeccion. En otras realizaciones alternativas, el subensamblaje fluidico puede comprender capas laminadas de tal modo que la camara de deteccion se situe en una capa separada del dispositivo de modo que se disponga delante de la capa que comprende las camaras de amplificacion y marcaje. Esta configuracion ffsica reduce la anchura del dispositivo confiriendo tambien una funcionalidad adicional. Espedficamente, esta realizacion coloca una tira de deteccion en la camara de deteccion de tal modo que este situada sobre la camara de marcaje, permitiendo usar los elementos calentadores debajo de la camara de marcaje (durante la etapa de deteccion de un ensayo) para el control de la temperatura en la camara de deteccion. El control de la temperatura de la camara de deteccion posibilita el uso de temperaturas elevadas durante la hibridacion con la tira de deteccion. La modulacion mediada por la temperatura del rigor de hibridacion durante la deteccion basada en hibridacion puede usarse para conseguir una especificidad de hibridacion potenciada que es de utilidad, por ejemplo, en la discriminacion de secuencias de acido nucleico estrechamente relacionadas (p.ej. polimorfismo de un solo nucleotido).

La FIG. 13 muestra los componentes de un ensamblaje de modulo fluidico multicapa 290 de una realizacion de la presente invencion tal como se describe inmediatamente antes. El primer componente de pared 300 comprende la camara de deteccion 302 para admitir la tira de deteccion 305 y la porcion 304 de la camara de muestras. El segundo componente de pared 310 comprende otra porcion 306 de la camara de muestras, la camara de amplificacion 314, la camara de marcaje 316, los recintos de ventilacion 318 y los correspondientes canales. Tres componentes de cara, 330, 335 y 340, forman las camaras, recintos y canales. El componente de cara 335 actua como cara trasera del componente de pared 300 y cara frontal del componente de pared 310 y comprende la abertura 303 para formar la camara de muestras y la abertura 345 para que la solucion que comprende acidos nucleicos diana marcados se transfiera de la camara de marcaje 316 a la camara de deteccion 302. Las capas componentes se unen preferiblemente entre sf con un adhesivo de transferencia de silicona. Las superficies interiores se tratan preferiblemente para controlar la humectacion. Se anaden preferiblemente durante la fabricacion los reactivos, el ensamblaje de flujo lateral que comprende la tira de deteccion 305 y las valvulas de ventilacion termoplasticas termofusibles 320. Se sella preferiblemente una membrana adhesiva sobre los recintos de ventilacion.

La FIG. 14 muestra una vista despiezada de un cartucho de ensayo desechable 350 que incorpora la capa flmdica 290 de la FIG. 13. El cartucho de ensayo 350 comprende cubierta frontal, ensamblaje de modulo microflmdico 290, cinta adhesiva 360, placa de circuito 370 y cubierta posterior 380. La FIG. 15 es una ilustracion del PCA desechable/ensamblaje fluidico 350 en su sitio de la estacion de acoplamiento 400. Se anade muestra a la camara de muestras a traves del puerto de muestra 390. La estacion de acoplamiento contiene preferiblemente la electronica de control y el suministro de energfa y puede incluir botones para iniciar los procesos electronicos requeridos para el ensayo.

Ejemplo 1: Procedimiento de amplificacion y deteccion de un acido nucleico diana para el diagnostico de infeccion por Candidatus liberibacter en citricos

Se empleo una realizacion de la invencion en la que un componente desechable interacciona con un acoplamiento reutilizable para ensayar en tejido de hoja de cftrico la presencia de Candidatus Liberibacter asiaticus, el agente etiologico del enverdecimiento cftrico.

Se construyo un dispositivo parcialmente desechable como se describe anteriormente. La unidad reutilizable comprendfa una PCB recubierta con cobre estandar de 42,5 g. Los componentes del circuito inclman un microcontrolador ATmega328, MOSFET de canal N de 0,5 A, resistores de SMD y componentes acondicionadores de energfa. Una cubierta de plastico formada por estereolitografta (SLA) cubna la placa y los interruptores tactiles. Se monto un conector de clavija hembra en la superficie superior para permitir una conexion vertical con el PCA desechable. El PCA desechable comprendfa una PCB similar junto con resistores de peftcula gruesa, el termistor 0402 y LED 0603. Se coloco un conector de clavija macho en el angulo correcto en un extremo de la placa para permitir la orientacion vertical cuando se insertaba en el enchufe hembra de la unidad reutilizable.

La capa flmdica comprendfa dos componentes de cara, un componente de pared y una membrana fina. Los componentes de cara estaban compuestos por poliester (PET) de 0,10 mm. Los componentes de pared estaban compuestos por acnlico de 0,5 mm que se laminaba con peftcula de transferencia de silicona de 0,05 mm de Advanced Adhesives, Inc. La membrana de ventilacion estaba compuesta por poliolefina de 0,01 mm con adhesivo

acnlico resistente a disolventes de 0,10 mm de 3M, Inc. Se cortaron los componentes individuales a su forma usando un cortador laser VersaLaser 3.5 de Universal Laser Systems, Inc. Antes del ensamblaje, se colocaron todos los componentes flmdicos plasticos cortados con laser, excepto el componente de membrana, en un bano sonicador que contema hidroxido de sodio 100 mM y dodecilsulfato de sodio al 0,1 %, y se sonicaron durante 30 minutos para 5 retirar cualquier desecho, acidos nucleicos contaminantes o nucleasas. Se lavaron finalmente los componentes plasticos limpiados con agua libre de nucleasa. Se laminaron en primer lugar los componentes de pared y cara (orientados a PCA) aplicando una presion de 34,5 MPa. Se depositaron perlas de poliestireno conjugadas con el oligonucleotido de deteccion en sacarosa 500 mM en la camara de marcaje y se secaron a vado. Despues de secar, se coloco un trozo de cinta de doble cara en la camara de deteccion y se ensamblo el componente de membrana de 10 deteccion usando una tira de membrana de nitrocelulosa, una almohadilla de tensioactivo Accuflow-P y papel secante para servir como almohadilla absorbente. En algunos casos, se anadio a la camara de muestras una perla liofilizada compuesta por enzimas de reaccion y excipientes. Finalmente, se sello la capa flmdica con el otro componente de cara y se lamino el componente de membrana de ventilacion para sellar los recintos de ventilacion. Se aplico ligeramente compuesto termico de silicona (Radio Shack, Inc.) a los resistores de amplificacion y marcaje, 15 y se laminaron las capas flmdica y electronica usando un relleno adhesivo.

Despues de la terminacion del ensamblaje del dispositivo, se anadieron 28 pl de una mezcla de reaccion a la camara de muestras. Dependiendo del experimento, se anadieron las enzimas necesarias para la amplificacion a esta mezcla de reaccion en forma lfquida (FIG. 16A) o presentes en una torta liofilizada incorporada a la camara de muestras de la capa flmdica (FIG. 16B). En ambos casos, se extrajo el molde de acido nucleico usado de tejido de 20 planta infectada usando un QlAshredder y kit de columna de centrifugacion (Qiagen, Inc.). Se usaron los cebadores hyvl_For y hyvl_Rev para amplificar una secuencia de acido nucleico de 139 pb que diagnostica la presencia de la bacteria patogenica vegetal Candidatus liberibacter asiaticus. Se efectuo la qmmica de reaccion de amplificacion registrada usando un tampon de amplificacion preelaborado (10X) que comprende Tris-HCl 400 mM (pH 8,4), sulfato de amonio 10 mM, cloruro de potasio 100 mM y Triton X-100 al 0,25 %. Cada 20 pl de solucion de reaccion 25 conteman:

9,4 pl de agua

2.0 pl de tampon de amplificacion 10x

2.0 pl de DMSO

0,4 pl de cloruro de potasio (2 M)

30 0,5 pl de cloruro de magnesio (100 mM)

0,5 pl de ditiotreitol (100 mM)

0,5 pl de dNTP (10 mM)

2.0 pl del conjunto de cebadores hyvl_For y hyvl_Rev (8 pM cada uno)

0,5 pl de ARN polimerasa VentR (exo) (2 U/pl)*

35 0,2 pl de Et SSB, protema de union a monocatenario extremadamente termoestable (500 pg/ml)*

2.0 pl de ADN extrafdo de tejido sano o infectado por C. liberibacter (17,2 ng/pl)

*incluido en solucion, o en el caso de usar enzima liofilizada, sustituido por agua

Se logro la ventilacion de la camara de amplificacion y la iniciacion del programa de amplificacion y deteccion apretando un interruptor tactil sobre la unidad reutilizable que sirve como boton de inicio. Despues de la ventilacion, 40 la solucion de reaccion entro en la camara de amplificacion, donde se calento la solucion a 85 °C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de: 76 °C durante 10 segundos y 60 °C durante 25 segundos. Despues de completar la ciclacion termica, se permitio fluir la reaccion en la camara de marcaje mediante ventilacion iniciada por microcontrolador. La camara de marcaje contema microesferas de deteccion de poliestireno tenidas de azul secadas por la cara interior de la camara de marcaje en presencia de sacarosa 500 mM. El oligonucleotido de deteccion 45 conjugado con las microesferas tenidas era complementario de la hebra codificante del producto de amplificacion de acido nucleico. Se calento la camara de marcaje a 105 °C durante 2 minutos y se mantuvo entonces a 90 °C durante 30 segundos, para inducir la ebullicion y mezcla completa de las perlas de poliestireno y desnaturalizar el producto de ADN bicatenario. Despues de calentar, se permitio enfriar durante 2 minutos la solucion de reaccion en la camara de marcaje. Se ventilo la camara de deteccion, causando que la solucion fluyese desde la camara de marcaje a la 50 camara de deteccion y sobre el ensamblaje de tira de deteccion. Se inmovilizaron tres lmeas de captura sobre la membrana de flujo lateral; desde el fondo del dispositivo eran: un oligonucleotido de control negativo no complementario de ninguna diana ensayada; sonda de captura complementaria del producto de amplificacion y oligonucleotido de control positivo complementario de la sonda de deteccion. Como puede observarse claramente en la FIG. 16, la invencion amplificaba y detectaba exitosamente el acido nucleico diana sin hibridacion cruzada

5

10

15

20

25

30

35

40

45

detectable con la lmea de control negativo.

Las secuencias de los cebadores de amplificacion usados fueron: hyvl_For

ggc-c-gtttta acacaaaaga tgaatatcat agatggggta gtcaa (SEQ ID NO 1)

hyvl_Rev

cggccatttt agataaatca atttgttcta gtttagatac at- caatttgt t (SEQ ID NO 2)

Las secuencias de los oligonucleotidos de captura y deteccion usados fueron:

Captura

tcgtttgagt age-tag atcc nnnnnnnnnn nt (SEQ ID NO 3)

Deteccion

/5AmMC12/ aattgatgga tgacgtgata gtttacgaec aacatctt/3Phos/ (SEQ ID NO 4)

Puede encontrarse una descripcion mas completa del proceso de amplificacion en la solicitud de patente provisional de EE.UU. de propiedad comun con la presente n° de serie 61/477.437, titulada “Oscillating Amplification Reaction for Nucleic Acids", incorporada a la presente memoria como referencia. Este proceso posibilita el uso de volumenes de solucion mayores con mayores sensibilidades, y no requiere un enfriamiento activo para efectuar el ciclamiento termico. Debido a que el proceso requiere solo enfriamiento pasivo, un intervalo estrecho de temperatura de ciclamiento y no se afecta sustancialmente por tolerancias de temperatura mas amplias que las usadas tfpicamente en PCR, pueden usarse elementos de calentamiento resistivo sencillos, posibilitando por tanto que el dispositivo sea compacto y economico. Ademas, es conseguible un superior acoplamiento termico debido a que la camara de amplificacion es preferiblemente plana en el lado adyacente al resistor de calentamiento, proporcionando por tanto un buen contacto termico. Esta interfaz termica puede potenciarse mediante el uso de un compuesto adhesivo termoconductor.

Ejemplo 2: Procedimiento de aislamiento, amplificacion y deteccion de un acido nucleico diana para el diagnostico de infeccion por Candidatus liberibacter en citricos

Se construyo un dispositivo parcialmente desechable como se describe anteriormente. La unidad reutilizable comprendfa una PCB recubierta con cobre estandar de 42,5 g. Los componentes de circuito inclrnan un microcontrolador ATmega328, MOSFET de canal N de 0,5 M, resistores de SMD y componentes de acondicionamiento de energfa. Una cubierta de plastico formada por estereolitograffa (SLA) cubre la placa y los interruptores tactiles. Se monto un conector de clavija hembra en la superficie superior para permitir una conexion vertical con el PCA desechable. El PCA desechable comprendfa una PCB similar junto con resistores de pelfcula gruesa, el termistor 0402 y LED 0603. Se coloco un conector de clavija macho en el angulo correcto en un extremo de la placa para permitir la orientacion vertical cuando se insertaba en el enchufe hembra de la unidad reutilizable.

La capa flrndica comprendfa dos componentes de cara, un componente de pared y una membrana fina. Los componentes de cara comprendfan poliester de 0,10 mm. Los componentes de pared comprendfan acnlico de 0,5 mm que se laminaba con pelfcula de transferencia de silicona de 0,05 mm de Advanced Adhesives, Inc. Para admitir la integracion de la capa flrndica con el subsistema de preparacion de muestra, se fabricaron los componentes de pared y cara para proporcionar una abertura y un canal situados de tal modo que, cuando se laminaran con el subsistema de preparacion de muestra, los acidos nucleicos purificados se comunicanan con la camara de muestras de la invencion durante la fase de elucion del proceso de preparacion de muestra. La membrana de ventilacion estaba compuesta por poliolefina de 0,01 mm con adhesivo acnlico resistente a disolvente de 0,10 mm de 3M, Inc. Se cortaron los componentes individuales a su forma usando un cortador laser VersaLaser 3.5 de Universal Laser Systems, Inc. Antes del ensamblaje, se colocaron todos los componentes fluidicos plasticos cortados con laser, excepto el componente de membrana, en un bano sonicador que contema hidroxido de sodio 100 mM y dodecilsulfato de sodio al 0,1 %, y se sonicaron durante 30 minutos para retirar cualquier desecho, acidos nucleicos contaminantes o nucleasas. Se lavaron finalmente los componentes plasticos limpiados con agua libre de nucleasa. Se laminaron en primer lugar los componentes de pared y cara (orientados a pCa) aplicando una presion de 34,5 MPa. Se depositaron perlas de poliestireno conjugadas con el oligonucleotido de deteccion en sacarosa 500 mM en la camara de marcaje y se secaron a vado. Despues de secar, se dispuso un trozo de cinta de doble cara en la

19

camara de deteccion y se ensamblo el componente de membrana de deteccion usando una tira de membrana de nitrocelulosa, una almohadilla de tensioactivo Accuflow-P y papel secante para servir como almohadilla absorbente. En algunos casos, se anadio a la camara de muestras una perla liofilizada compuesta por enzimas de reaccion y excipientes. Finalmente, se sello la capa flmdica con el otro componente de cara y se lamino el componente de 5 membrana de ventilacion para sellar los recintos de ventilacion. Se aplico ligeramente compuesto termico de silicona (Radio Shack, Inc.) a los resistores de amplificacion y marcaje, y se laminaron las capas flmdica y electronica usando un relleno adhesivo.

Se fabrico el subsistema de preparacion de muestra, con el que interaccionaba la capa flmdica de la invencion, a partir de acnlico cortado por laser laminado para formar reservorios de tampon y soportes flsicos para los 10 componentes de material absorbente del subsistema. Se corto una estructura de intercambio pasivo de tampon con una geometna descrita en la publicacion internacional n° WO 2009/137059 A1, titulada "Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control". Se uso nailon no tejido como material intercambiador de tampon. Se empleo filtro de fibra de vidrio Whatman GF/B como matriz de afinidad de acido nucleico. Se uso gasa de algodon como almohadilla absorbente, proporcionando un sumidero absorbente de 15 capacidad adecuada.

Se molio brevemente tejido vegetal, espedficamente cuatro punciones de biopsia de 1,5 mm recogidas de la vena media de hoja de dtrico cerca del peciolo, en un tubo de microcentnfuga con 150 pl de tampon de extracto (tiocianato de guanidinio 4 M, Tris 25 mM, pH 6,4). Se introdujo el extracto bruto resultante en el reservorio de muestra del subsistema de preparacion de muestra inmediatamente despues de la adicion de 200 pl de tampon de 20 lavado 1 (tiocianato de guanidinio 2 M, 30 % de etanol, Tris 25 mM, pH 7,4) y 800 pl de tampon de lavado 2 (NaCl 400 mM, 50 % de etanol, Tris 50 mM, pH 6,4) a sus reservorios respectivos. 15 minutos despues de la adicion de muestra, se “punciono” la matriz de union a acido nucleico del componente de preparacion de muestra en la camara de elucion inferior y se eluyeron los acidos nucleicos con 50 pl de tampon de reaccion. Se logro la puncion e inyeccion del tampon de reaccion empujando una jeringuilla de tuberculina de 1 cm3 (sin aguja) a traves del orificio 25 por encima de la matriz de afinidad para desplazar la matriz a la camara de elucion de debajo. Se conecto la camara de elucion con la camara de muestras de la invencion mediante un canal en la capa flmdica especialmente disenado. Apretar el embolo de la jeringuilla dio como resultado la elucion del acido nucleico capturado, que flma a traves de dicho canal a la camara de muestras.

Con la excepcion de las enzimas, el tampon de elucion contema todos los reactivos necesarios para la amplificacion 30 de diana mediante una tecnica de amplificacion registrada, incluyendo los cebadores hyvl_For y hyvl_Rev, que amplifican selectivamente una secuencia de 139 pb que diagnostica la presencia de la bacteria patogenica vegetal Candidatus Liberibacter asiaticus. Se preelaboro el tampon de amplificacion (10X) y contema Tris-HCl 400 mM (pH 8,4), sulfato de amonio 10 mM, cloruro de potasio 100 mM y 0,25 % de Triton X-100. 20 pl de tampon de elucion conteman:

35 12,1 pl de agua

2.0 pl de tampon de amplificacion 10x

2.0 pl de DMSO

0,4 pl de cloruro de potasio (2 M)

0,5 pl de cloruro de magnesio (100 mM)

40 0,5 pl de ditiotreitol (100 mM)

0,5 pl de dNTP (10 mM)

2.0 pl del conjunto de cebadores hyvl_For y hyvl_Rev (8 pM cada uno)

Antes de activar el dispositivo, se anadieron las siguientes enzimas a la muestra de acido nucleico eluida en la camara de muestras y se mezclaron brevemente usando una punta de pipeta de carga de gel.

45 1,0 pl de ADN polimerasa VentR (exo) (2 U/pl)

0,4 pl de Et SSB, protema de union a monocatenario extremadamente termoestable (500 pg/ml)

Se logro la ventilacion de la camara de amplificacion y la iniciacion del programa de amplificacion y deteccion apretando un interruptor tactil sobre la unidad reutilizable que sirve como boton de inicio. Despues de la ventilacion, la solucion entro en la camara de amplificacion, donde se calento la solucion a 85 °C durante 2 minutos, seguido de 50 40 ciclos de: 76 °C durante 10 segundos y 60 °C durante 25 segundos. Despues de completar la ciclacion termica,

se permitio fluir la reaccion en la camara de marcaje mediante ventilacion iniciada por microcontrolador. La camara de marcaje contema microesferas de deteccion de poliestireno tenidas de azul secadas por la cara interior de la camara de marcaje en presencia de sacarosa 500 mM. El oligonucleotido de deteccion conjugado con las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

microesferas tenidas era complementary de la hebra de codificacion del producto de amplificacion de acido nucleico. Se calento la camara de marcaje a 105 °C durante 2 minutos y se mantuvo entonces a 90 °C durante 30 segundos para inducir la ebullicion y mezcla completa de las perlas de poliestireno y desnaturalizar el producto de ADN bicatenario. Despues de calentar, se permitio enfriar durante 2 minutos la solucion de reaccion en la camara de marcaje. Se ventilo la camara de deteccion, causando que la solucion fluyese desde la camara de marcaje a la camara de deteccion y sobre el ensamblaje de tira de deteccion. Se inmovilizaron tres ftneas de captura sobre la membrana de flujo lateral, desde el fondo del dispositivo eran: un oligonucleotido de control negativo no complementario de ninguna diana ensayada, sonda de captura complementaria del producto de amplificacion y un oligonucleotido de control positivo complementario de la sonda de deteccion. Como puede observarse claramente en la FIG. 14, el dispositivo totalmente integrado daba como resultado un aislamiento, amplificacion y deteccion de acido nucleico exitosos del acido nucleico diana.

Ejemplo 3: Procedimiento de amplificacion y deteccion de un acido nucleico diana para el diagnostico de infeccion por Candidatus liberibacter en citricos

Se empleo una realizacion de la invencion en la que un componente desechable interacciona con un acoplamiento reutilizable para ensayar en extractos de tejido de hoja de cftrico brutos la presencia de Candidatus liberibacter asiaticus, el agente etiologico del enverdecimiento cftrico, sin una etapa precedente de aislamiento de acido nucleico.

Se construyo un dispositivo parcialmente desechable como se describe anteriormente. La unidad reutilizable comprendfa una PCB recubierta con cobre estandar de 42,5 g. Los componentes del circuito inclrnan un microcontrolador ATmega328, MOSFET de canal N de 0,5 A, resistores de SMD y componentes acondicionadores de energfa. Una cubierta de plastico formada por estereolitografta (SLA) cubna la placa y los interruptores tactiles. Se monto un conector de clavija hembra en la superficie superior para permitir una conexion vertical con el PCA desechable. El PCA desechable comprendfa una PCB similar junto con resistores de peftcula gruesa, el termistor 0402 y LED 0603. Se coloco un conector de clavija macho en el angulo correcto en un extremo de la placa para permitir la orientacion vertical cuando se insertaba en el enchufe hembra de la unidad reutilizable.

La capa flrndica comprendfa dos componentes de cara, un componente de pared y una membrana fina. Los componentes de cara estaban compuestos por poliester de 0,10 mm. Los componentes de pared estaban compuestos por acnlico de 0,5 mm que se laminaba con peftcula de transferencia de silicona de 0,05 mm de Advanced Adhesives, Inc. La membrana de ventilacion estaba compuesta por poliolefina de 0,01 mm con adhesivo acnlico resistente a disolventes de 0,10 mm de 3M, Inc. Se cortaron los componentes individuales a su forma usando un cortador laser VersaLaser 3.5 de Universal Laser Systems, Inc. Antes del ensamblaje, se dispusieron todos los componentes flrndicos plasticos cortados con laser, excepto el componente de membrana, en un bano sonicador que contema hidroxido de sodio 100 mM y dodecilsulfato de sodio al 0,1 %, y se sonicaron durante 30 minutos para retirar cualquier desecho, acidos nucleicos contaminantes o nucleasas. Se lavaron finalmente los componentes plasticos limpiados con agua libre de nucleasa. Se laminaron en primer lugar los componentes de pared y cara (orientados a PCA) aplicando una presion de 34,5 MPa. Se depositaron perlas de poliestireno conjugadas con el oligonucleotido de deteccion en sacarosa 500 mM en la camara de marcaje y se secaron a vacfo. Despues de secar, se coloco un trozo de cinta de doble cara en la camara de deteccion y se ensamblo el componente de membrana de deteccion usando una tira de membrana de nitrocelulosa, una almohadilla de tensioactivo Accuflow-P y papel secante para servir como almohadilla absorbente. En algunos casos, se anadio a la camara de muestras una perla liofilizada compuesta por enzimas de reaccion y excipientes. Finalmente, se sello la capa flrndica con el otro componente de cara y se lamino el componente de membrana de ventilacion para sellar los recintos de ventilacion. Se aplico ligeramente compuesto termico de silicona (Radio Shack, Inc.) a los resistores de amplificacion y marcaje, y se laminaron las capas flrndica y electronica usando un relleno adhesivo.

Despues de la terminacion del ensamblaje del dispositivo, se anadieron 40 pl de mezcla de reaccion a la camara de muestras. Dependiendo del experimento, las enzimas requeridas para la amplificacion estaban presentes en esta mezcla de reaccion en forma ftquida o presentes en una torta liofilizada incorporada a la camara de muestras de la capa flrndica. En ambos casos, el especimen ensayado comprendfa 4 pl de extracto de tejido cftrico bruto preparado triturando 5 punciones de biopsia de 1,5 mm de diametro en 500 pl de agua libre de nucleasa. Se usaron los cebadores hyvl_For y hyvl_Rev para amplificar una secuencia de acido nucleico de 139 pb que diagnostica la presencia de la bacteria patogenica vegetal Candidatus liberibacter asiaticus. Se efectuo una qrnmica de reaccion de amplificacion registrada. Se preelaboro el tampon de amplificacion (10X) y contema Tris-HCl 400 mM (pH 8,4), sulfato de amonio 10 mM, cloruro de potasio 100 mM y Triton X-100 al 0,25 %. Cada 40 pl de solucion de reaccion conteman:

18,8 pl de agua

4.0 pl de tampon de amplificacion 10x

4.0 pl de DMSO

0,8 pl de cloruro de potasio (2 M)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1.0 |jl de cloruro de magnesio (100 mM)

1.0 jl de ditiotreitol (100 mM)

1.0 jl de dNTP (10 mM)

4.0 jl del conjunto de cebadores hyvl_For y hyvl_Rev (8 jM cada uno)

1.0 jl de ARN polimerasa VentR (exo) (2 U/jl)*

0,4 jl de Et SSB, protema de union a monocatenario extremadamente termoestable (500 jg/ml)*

4.0 jl de extracto de tejido cftrico generado triturando brevemente 5 punciones de biopsia (1,5 mm de diametro, obtenidas de peciolo de hoja de cftrico o de la vena central proximal al peciolo de hoja de cftrico de arboles cftricos sanos o infectados por C. liberibacter) o tejido de peciolo de ~4 mm de longitud en 500 jl de agua libre de nucleasa

*incluido en la solucion o, en el caso de usar enzima liofilizada, sustituido por agua

Se logro la ventilacion de la camara de amplificacion y la iniciacion del programa de amplificacion y deteccion apretando un interruptor tactil sobre la unidad reutilizable que sirve como boton de inicio. Despues de la ventilacion, la solucion de reaccion entro en la camara de amplificacion, donde se calento la solucion a 85 °C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 76 °C durante 10 segundos y 60 °C durante 25 segundos. Despues de completar la ciclacion termica, se permitio fluir la reaccion en la camara de marcaje mediante ventilacion iniciada por microcontrolador. La camara de marcaje contema microesferas de deteccion de poliestireno tenidas de azul secadas por la cara interior de la camara de marcaje en presencia de sacarosa 500 mM. El oligonucleotido de deteccion conjugado con las microesferas tenidas era complementario de la hebra codificante del producto de amplificacion de acido nucleico. Se calento la camara de marcaje a 105 °C durante 2 minutos y se mantuvo entonces a 90 °C durante 30 segundos, para inducir la ebullicion y mezcla completa de las perlas de poliestireno y desnaturalizar el producto de ADN bicatenario. Despues de calentar, se permitio enfriar durante 2 minutos la solucion de reaccion en la camara de marcaje. Se ventilo la camara de deteccion, causando que la solucion fluyese desde la camara de marcaje a la camara de deteccion y sobre el ensamblaje de tira de deteccion. Se inmovilizaron tres lmeas de captura sobre la membrana de flujo lateral; desde el fondo del dispositivo eran: un oligonucleotido de control no complementario de ninguna diana ensayada; sonda de captura complementaria del producto de amplificacion y oligonucleotido de control positivo complementario de la sonda de deteccion. La invencion amplificaba y detectaba exitosamente el acido nucleico diana sin hibridacion cruzada detectable con las lmeas de control negativo de la tira de deteccion.

Ejemplo 4: Procedimiento de amplificacion y deteccion de acido nucleico diana para la deteccion de Candidatus liberibacter en el psilido asiatico Diaphorina citri Kuwavama

Se fabrico una realizacion de la invencion en la que un componente desechable interacciona con una conexion reutilizable como se describe en el Ejemplo 3, y se empleo para ensayar en extractos de insecto entero brutos preparados a partir de Diaphorina citri Kuwavama la presencia de Candidatus liberibacter asiaticus, el agente etiologico del enverdecimiento cftrico, sin una etapa precedente de aislamiento de acido nucleico.

En algunos casos, se anadio a la camara de muestras una perla liofilizada compuesta por enzimas de reaccion y excipientes. Despues de la terminacion del ensamblaje del dispositivo, se anadieron 40 jl de mezcla de reaccion a la camara de muestras. Dependiendo del experimento, las enzimas requeridas para amplificacion estaban presentes en esta mezcla de reaccion en forma ftquida o presentes en una torta liofilizada incorporada a una camara de muestras de la capa flmdica. En ambos casos, la muestra comprendfa 4 jl de una solucion preparada triturando 5 Diaphorina citri Kuwayama vivos enteros en 500 jl de agua libre de nucleasa. Se usaron los cebadores hyvl_For y hyvl_Rev para amplificar una secuencia de acido nucleico de 139 pb que diagnostica la presencia de la bacteria patogenica vegetal Candidatus liberibacter asiaticus. Se efectuo la qrnmica de reaccion de amplificacion registrada. Se preelaboro el tampon de amplificacion (10X) y contema Tris-HCl 400 mM (pH 8,4), sulfato de amonio 10 mM, cloruro de potasio 100 mM y Triton X-100 al 0,25 %. Cada 40 jl de solucion de reaccion conteman:

18,8 jl de agua

4.0 jl de tampon de amplificacion 10x

4.0 jl de DMSO

0,8 jl de cloruro de potasio (2 M)

1.0 jl de cloruro de magnesio (100 mM)

1.0 jl de ditiotreitol (100 mM)

1.0 jl de dNTP (10 mM)

4.0 pl del conjunto de cebadores hyvl_For y hyvl_Rev (8 pM cada uno)

1.0 pl de ADN polimerasa VentR (exo) (2 U/pl)*

0,4 pl de Et SSB, protema de union a monocatenario extremadamente termoestable (500 pg/ml)*

4.0 pl de extracto de Diaphorina citri Kuwayama enteros generado triturando brevemente 5 insectos enteros en 500 5 pl de agua libre de nucleasa

Se logro la ventilacion de la camara de amplificacion y la iniciacion del programa de amplificacion y deteccion apretando un interruptor tactil sobre la unidad reutilizable que sirve como boton de inicio. Despues de la ventilacion, la solucion de reaccion entro en la camara de amplificacion, donde se calento la solucion a 85 °C durante 2 minutos, 10 seguido de 40 ciclos de 76 °C durante 10 segundos y 60 °C durante 25 segundos. Despues de completar la ciclacion termica, se permitio fluir la reaccion en la camara de marcaje mediante ventilacion iniciada por microcontrolador. La camara de marcaje contema microesferas de deteccion de poliestireno tenidas de azul secadas por la cara interior de la camara de marcaje en presencia de sacarosa 500 mM. El oligonucleotido de deteccion conjugado con las microesferas tenidas era complementario de la hebra codificante del producto de amplificacion de acido nucleico. Se 15 calento la camara de marcaje a 105 °C durante 2 minutos y se mantuvo entonces a 90 °C durante 30 segundos, para inducir la ebullicion y mezcla completa de las perlas de poliestireno y desnaturalizar el producto de ADN bicatenario. Despues de calentar, se permitio enfriar durante 2 minutos la solucion de reaccion en la camara de marcaje. Se ventilo la camara de deteccion, causando que la solucion fluyese desde la camara de marcaje a la camara de deteccion y sobre el ensamblaje de tira de deteccion. Se inmovilizaron tres lmeas de captura sobre la membrana de 20 flujo lateral; desde el fondo del dispositivo eran: un oligonucleotido de control negativo no complementario de ninguna diana ensayada; sonda de captura complementaria del producto de amplificacion y oligonucleotido de control positivo complementario de la sonda de deteccion. La invencion amplificaba y detectaba exitosamente el acido nucleico diana sin hibridacion cruzada detectable con las lmeas de control negativo de la tira de deteccion.

Ejemplo 5: Procedimiento de amplificacion y deteccion de un acido nucleico diana para la deteccion de 25 Candidatus liberibacter en vinca rosa (Catharanthus roseus)

Se fabrico una realizacion de la invencion en la que un componente desechable interacciona con un acoplamiento reutilizable como se describe en el Ejemplo 3 y se empleo para ensayar en extractos de tejido de vinca rosa (Catharanthus roseus) brutos la presencia de Candidatus liberibacter asiaticus, el agente etiologico del enverdecimiento cftrico, sin una etapa precedente de aislamiento de acido nucleico.

30 En algunos casos, se anadio a la camara de muestras una perla liofilizada compuesta por enzimas de reaccion y excipientes. Despues de la terminacion del ensamblaje del dispositivo, se anadieron 40 pl de mezcla de reaccion a la camara de muestras. Dependiendo del experimento, las enzimas requeridas para amplificacion estaban presentes en esta mezcla de reaccion en forma lfquida o presentes en una torta liofilizada incorporada a una camara de muestras de la capa flmdica. En ambos casos, la muestra comprendfa 4 pl de una solucion preparada triturando 5 35 punciones de biopsia de 1,5 mm de diametro cada uno en 500 pl de agua libre de nucleasa. Se obtuvieron las punciones de biopsia de vinca rosa (Catharanthus roseus) infectada por Candidatus liberibacter asiaticus o no infectada. Se usaron los cebadores hyvl_For y hyvl_Rev para amplificar una secuencia de acido nucleico de 139 pb que diagnostica la presencia de la bacteria patogenica vegetal Candidatus liberibacter asiaticus. Se efectuo la qrnmica de reaccion de amplificacion registrada. Se preelaboro el tampon de amplificacion (10X) y contema Tris-HCl 40 400 mM (pH 8,4), sulfato de amonio 10 mM, cloruro de potasio 100 mM y Triton X-100 al 0,25 %. Cada 40 pl de

solucion de reaccion conteman:

18,8 pl de agua

4.0 pl de tampon de amplificacion 10x

4.0 pl de DMSO

45 0,8 pl de cloruro de potasio (2 M)

1.0 pl de cloruro de magnesio (100 mM)

1.0 pl de ditiotreitol (100 mM)

1.0 pl de dNTP (10 mM)

4.0 pl del conjunto de cebadores hyvl_For y hyvl_Rev (8 pM cada uno)

50 1,0 pl de ADN polimerasa VentR (exo) (2 U/pl)*

4.0 pl de extracto de tejido de vinca rosa generado triturando brevemente 5 punciones de biopsia de 1,5 mm de diametro (tomadas del peciolo de una hoja de vinca rosa) en 500 pl de agua libre de nucleasa

Se logro la ventilacion de la camara de amplificacion y la iniciacion del programa de amplificacion y deteccion 5 apretando un interruptor tactil sobre la unidad reutilizable que sirve como boton de inicio. Despues de la ventilacion,

la solucion de reaccion entro en la camara de amplificacion, donde se calento la solucion a 85 °C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 76 °C durante 10 segundos y 60 °C durante 25 segundos. Despues de completar la ciclacion termica, se permitio fluir la reaccion en la camara de marcaje mediante ventilacion iniciada por microcontrolador. La camara de marcaje contema microesferas de deteccion de poliestireno tenidas de azul secadas por la cara interior 10 de la camara de marcaje en presencia de sacarosa 500 mM. El oligonucleotido de deteccion conjugado con las microesferas tenidas era complementario de la hebra codificante del producto de amplificacion de acido nucleico. Se calento la camara de marcaje a 105 °C durante 2 minutos y se mantuvo entonces a 90 °C durante 30 segundos, para inducir la ebullicion y mezcla completa de las perlas de poliestireno y desnaturalizar el producto de ADN bicatenario. Despues de calentar, se permitio enfriar durante 2 minutos la solucion de reaccion en la camara de marcaje. Se 15 ventilo la camara de deteccion, causando que la solucion fluyese desde la camara de marcaje a la camara de

deteccion y sobre el ensamblaje de tira de deteccion. Se inmovilizaron tres lmeas de captura sobre la membrana de flujo lateral; desde el fondo del dispositivo eran: un oligonucleotido de control negativo no complementario de ninguna diana ensayada; sonda de captura complementaria del producto de amplificacion y oligonucleotido de control positivo complementario de la sonda de deteccion. La invencion amplificaba y detectaba exitosamente el 20 acido nucleico diana sin hibridacion cruzada detectable con las lmeas de control negativo de la tira de deteccion.

Ejemplo 6: Procedimiento de amplificacion y deteccion de un acido nucleico diana para la deteccion de Candidatus liberibacter asiaticus en cuscuta (Cuscuta pentagona)

Se fabrico una realizacion de la invencion en la que un componente desechable interacciona con un acoplamiento reutilizable como se describe en el Ejemplo 3 y se empleo para ensayar en extractos de tejido de vinca rosa 25 (Catharanthus roseus) brutos la presencia de Candidatus liberibacter asiaticus, el agente etiologico del

enverdecimiento cftrico, sin una etapa precedente de aislamiento de acido nucleico.

En algunos casos, se anadio a la camara de muestras una perla liofilizada compuesta por enzimas de reaccion y excipientes. Despues de la terminacion del ensamblaje del dispositivo, se anadieron 40 pl de mezcla de reaccion a la camara de muestras. Dependiendo del experimento, las enzimas requeridas para amplificacion estaban presentes 30 en esta mezcla de reaccion en forma lfquida o presentes en una torta liofilizada incorporada a una camara de muestras de la capa flmdica. En ambos casos, la muestra comprendfa 4 pl de una solucion preparada triturando una cepa de cuscuta (Cuscuta pentagona) de 1 cm de longitud en 500 pl de agua libre de nucleasa. Se obtuvieron las punciones de biopsia de vinca rosa (Catharanthus roseus) infectada por Candidatus liberibacter asiaticus o no infectada. Se usaron los cebadores hyvl_For y hyvl_Rev para amplificar una secuencia de acido nucleico de 139 pb 35 que diagnostica la presencia de la bacteria patogenica vegetal Candidatus liberibacter asiaticus. Se efectuo la qrnmica de reaccion de amplificacion registrada. Se preelaboro el tampon de amplificacion (10X) y contema Tris-HCl 400 mM (pH 8,4), sulfato de amonio 10 mM, cloruro de potasio 100 mM y Triton X-100 al 0,25 %. Cada 40 pl de solucion de reaccion conteman:

18,8 pl de agua

40 4,0 pl de tampon de amplificacion 10x

4.0 pl de DMSO

0,8 pl de cloruro de potasio (2 M)

1.0 pl de cloruro de magnesio (100 mM)

1.0 pl de ditiotreitol (100 mM)

45 1,0 pl de dNTP (10 mM)

4.0 pl de conjunto de cebadores hyvl_For y hyvl_Rev (8 pM cada uno)

1.0 pl de ADN polimerasa VentR (exo) (2 U/pl)*

4.0 pl de extracto de Cuscuta pentagona generado triturando brevemente una cepa de 1 cm de longitud en 500 pl de 50 agua libre de nucleasa

Aunque la invencion se ha descrito con detalle con referencia particular a las realizaciones descritas, otras realizaciones pueden conseguir los mismos resultados. Las variaciones y modificaciones de la presente invencion

5

10

15

20

25

30

35

seran obvias para los especialistas en la materia y se pretende que cubra todas dichas modificaciones y equivalentes. Todas las divulgaciones de todas las patentes y publicaciones citadas anteriormente se incorporan por la presente como referencia.

Listado de secuencias

<110>: Mesa Tech International, Inc.

<120>: DISPOSITIVO INTEGRADO PARA

<130>: 33106-PCT1

<140>: 61/477.357

<141>

<150>: 61/477.437

<151>

<160>: 4

<170>: PatentIn version 3.5

<210>: 1

<211>: 45

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: cebador de codificacion' o LL 1 >

<400>: 1

ggccgtttta acacaaaaga tgaatatcat agatggggta gtcaa 45

<210>: 2

<211>: 51

<212>: ADN

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: cebador inverso "hyvl_Rev'

<400>: 2

cggcoatttt agataaatca atttgttcta gtttagatac atcaatttgt t 51

<210> 3 <211> 32 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> captura

<221>: misc_feature

<222>: (21)..(31)

<223>: n es a, c, g o t

5 <400>: 3

tcgtttgagt agctagatcc nnnnnnnnnn nt 32

<210>: 4

<211>: 38

<212>: ADN

10 <213> <220>: Secuencia artificial

<223>: deteccion

<400>: 4

aattgatgga tgacgtgata gtttacgacc aacatctt 38

15

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Una plataforma desechable para detectar un acido nucleico diana, comprendiendo la plataforma desechable:

una camara de muestras para recibir una muestra que comprende el acido nucleico diana;

una camara de amplificacion conectada a traves de un primer canal con dicha camara de muestras y conectada a traves de un segundo canal con un primer recinto de ventilacion;

una camara de marcaje conectada a traves de un tercer canal con dicha camara de amplificacion y conectada a traves de un cuarto canal con un segundo recinto de ventilacion;

un subsistema de deteccion conectado con dicha camara de marcaje a traves de un quinto canal y conectado a traves de un sexto canal con un tercer recinto de ventilacion;

una pluralidad de elementos de calentamiento resistivos y uno o mas dispositivos medidores de la temperatura;

caracterizada porque dichos recintos de ventilacion se sellan cada uno a baja presion por un material termolabil localizada en la cercama de uno de dichos elementos de calentamiento resistivos y

opcionalmente en la que dicha camara de marcaje es calentable usando uno de dichos elementos de calentamiento resistivos.
2. La plataforma desechable de la reivindicacion 1, que comprende ademas una etapa de preparacion de muestra que comprende una salida en conexion directa de fluido con una entrada de dicha camara de muestras.
3. La plataforma desechable de la reivindicacion 1, en la que las dimensiones de una superficie sustancialmente plana de dicha camara de amplificacion son aproximadamente las mismas que las dimensiones de la superficie sustancialmente plana de un elemento de calentamiento resistivo en contacto termico con dicha camara de amplificacion.
4. La plataforma desechable de la reivindicacion 1, en la que dicha camara de amplificacion no se enfna mediante un dispositivo de enfriamiento activo.
5. La plataforma desechable de la reivindicacion 1, en la que dicha camara de amplificacion contiene una solucion de amplificacion, dicha camara de muestras comprende una mezcla lfquida de reactivos de amplificacion o una mezcla liofilizada de reactivos de amplificacion, y/o dicha camara de marcaje comprende partfculas de deteccion.
6. La plataforma desechable de la reivindicacion 1, en la que dicho subsistema de deteccion comprende una tira de flujo lateral que no comprende partfculas de deteccion.
7. La plataforma desechable de la reivindicacion 1, en la que dichas camaras, dichos canales y dichos recintos de ventilacion estan localizados sobre una capa de ensamblaje de fluido y dichos elementos electronicos estan localizados sobre una capa separada que comprende una placa de circuito impreso, estando dicha capa separada unida a dicha capa de ensamblaje de fluido.
8. La plataforma desechable de la reivindicacion 1, en la que dicho subsistema de deteccion esta localizado sobre dicha capa de ensamblaje de fluido o sobre una segunda capa de ensamblaje de fluido.
9. La plataforma desechable de la reivindicacion 1, en la que un volumen de al menos una de dichas camaras esta entre aproximadamente 1 microlitro y aproximadamente 50 microlitros.
10. La plataforma desechable de la reivindicacion 1, que comprende ademas un conector para acoplar dicha plataforma desechable con una unidad basica que no es un instrumento externo y que mantiene la plataforma desechable en una orientacion vertical o inclinada.
11. Un procedimiento para detectar un acido nucleico diana, consistente el procedimiento en:

colocar una muestra que comprende el acido nucleico diana en una camara de muestras de una plataforma desechable segun la reivindicacion 1;

orientar la plataforma desechable verticalmente o inclinada;

hacer reaccionar la muestra con una mezcla lfquida o previamente liofilizada de reactivos de amplificacion; caracterizado por las etapas de:

abrir un primer recinto de ventilacion conectado con una camara de amplificacion a baja presion, posibilitando asf

que la muestra reaccionada fluya al interior de la camara de amplificacion; amplificar el acido nucleico diana en la camara de amplificacion;

abrir un segundo recinto de ventilacion conectado con una camara de marcaje a baja presion, posibilitando asf que el acido nucleico diana amplificado fluya al interior de la camara de marcaje;

5 marcar el acido nucleico diana amplificado usando partfculas de deteccion en la camara de marcaje;

abrir un tercer recinto de ventilacion conectado con un subsistema de deteccion a baja presion, posibilitando asf que el acido nucleico diana marcado fluya al interior del subsistema de deteccion y

detectar el acido nucleico diana amplificado;

opcionalmente en el que la plataforma desechable es controlable mediante el uso de una estacion de acoplamiento 10 que no es un instrumento externo.
12. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que la etapa de amplificacion comprende amplificar el acido nucleico diana usando un elemento de calentamiento resistivo localizado dentro de la plataforma desechable en una cercama de la camara de amplificacion.
13. El procedimiento de la reivindicacion 11, que comprende ademas enfriar pasivamente la camara de

15 amplificacion.
14. El procedimiento de la reivindicacion 11, que comprende ademas calentar la camara de marcaje durante la etapa de marcaje usando un elemento de calentamiento resistivo localizado dentro de la plataforma desechable en una cercama de la camara de marcaje.
15. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que el subsistema de deteccion no comprende partfculas de

20 deteccion.