KR20160029868A - 핵산의 왕복 증폭 반응 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일 구현예는 시료 내에 함유된 표적 색산 서열의 주형을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 시료를 표적 핵산 서열의 주형에 상보적인 프라이머를 함유하는 증폭 반응 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 반응 온도는 수회 온도 사이클 동안에 온도의 차이가 최대 약 20℃가 되는 상한 온도와 하한 온도 사이를 왕복한다. 표적 핵산 서열의 주형은 증폭된다.

Description

핵산의 왕복 증폭 반응{OSCILLATING AMPLIFICATION REACTION FOR NUCLEIC ACIDS}
관련 출원에 대한 상호 언급
[0001] 본 출원은 "핵산의 왕복 증폭 반응(Oscillating Amplification Reaction for Nucleic Acids)"이라는 제목으로 2011년 4월 20일에 출원된 미국 가특허출원 제61/477,437호의 출원에 대한 이익 및 우선권을 주장하며, 그 명세서 및 청구항은 언급에 의하여 본 명세서에 통합된다.
[0002] 본 출원은 "핵산 탐지 및 동정을 위한 통합된 장치(Integrated Device for Nucleic Acid Detection and Identification)"라는 제목으로 2011년 4월 20일에 출원된 미국 가특허출원 제61/477,357호의 출원에 대한 이익 및 우선권을 주장하며, 그 명세서 및 청구항은 언급에 의하여 본 명세서에 통합된다.
연방정부의 원조를 받은 연구 또는 개발에 대한 언급
[0003] 적용 없음
컴팩트 디스크 상으로 제출된 물질의 언급에 의한 통합
[0004] 적용 없음
저작권 자료
[0005] 적용 없음
서열 목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램에 대한 언급
[0006] 출원인은 ASCII에 순응하고 언급에 의하여 본 명세서에 통합되는, 2012년 4월 20일에 생성된 10K 킬로바이트의 041812_ST25.txt라는 제목 하에 제출된 텍스트를 서열 목록으로서 여기에 제출한다.
발명이 속하는 분야(기술분야):
[0007] 본 발명의 구현예들은, 주어진 그 어떠한 열적 중합 사이클 중에서도 좁은 범위, 좋기로는 20℃ 보다 크지 않은 범위 내에서 반응 온도를 왕복시키는 것에 의한, 표적 핵산 서열의 주형 의존성 증폭을 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
[0008] 이하 논의는 다수의 공보 및 참조문헌을 언급한다. 여기서 이와 같은 논의는 과학적 원리에 대한 보다 완전한 배경지식을 부여하기 위한 것이며, 그와 같은 공보가 특허성 결정 목적에 대하여 선행기술임을 인정하는 것으로 해석되지 아니한다.
[0009] 핵산 증폭은 연구, 유전적 시험, 농업 및 법의학에서 널리 사용되는분자 생물학에서 가장 필수불가결한 기술에 속한다. 가장 흔한 증폭 기법은 용액 중에서 특정 핵산 표적 서열의 유포가 기하급수적으로 증가하는 중합효소 연쇄반응(PCR)이다(미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호 참조). PCR 반응은 증폭하고자 하는 표적 서열의 업스트림(5') 또는 다운스트림(3')의 DNA 이중 나선의 반대 가닥에 혼성화하는 2개의 올리고뉴틀레오타이드를 채택한다. (일반적으로 열안정성인) DNA 중합효소는 표적 서열을 복사하고 2중사 DNA 산물을 발생시키기 위하여, 디옥시뉴클레오사이드-트리포스페이트(dNTPs)를 첨가하는 것에 의하여 5'->3' 방향으로 혼성화된 프라이머를 신장하는데에 사용된다. 반응 혼합물의 온도(전형적으로 섭씨 95℃)를 주기화하는 것에 의하여, DNA 두 가닥은 추후 낮은 온도(예컨대 55℃ 및 60℃)에서 프라이머의 결합 및 중합화를 위한 주형으로 기능할 수 있도록 고온에서 분리된다. 이러한 과정을 수회 반복한 후에, 단일 표적 서열이 수십억 개의 복사본으로 증폭될 수 있다.
*[0010] 비록 PCR이 장비가 잘 구비된 실험실에서 금본위의 증폭 방법이라 할지라도, 의미 있는 결과를 얻기 위해서는 활동적인 가열 및 냉각 가열 요소와 정확한 온도 조절자를 구비한, 비싸면서 복잡한 열적 순환 및 숙련된 기술자를 필요로 하면서 다소 복잡하다. 예를 들어, 대부분의 PCR 반응은 적어도 2개 온도(예컨대 95도 및 57도) 사이에서 신속하고도 정확한 순환을 요구하는데, 이는 전형적으로 비싸고 에너지적으로 비효율적인 펠티에 엔진(열적 전기 냉각 기전) 및 정확한 온도 조절 요소의 사용을 야기한다. 이와 같은 내재된 한계는, 뒷받침하는 실험적 인프라구조가 부재한 곳에서 유용하고 비용 효율적인 현장 진단 핵산 진단의 개발과 PCR을 양립 불가능하게 한다. PCR의 강한 재원 요구성 몇 가지를 제거하기 위한 노력으로서, 다양한 '등온' 증폭기술이 과거 수십년 동안 개발되어 왔다. 그와 같은 반응에서, 핵산은 단일 온도에서 증폭되어 비싼 열 순환계를 필요로 하지 않으며, 낮은 비용 진단 장치에서의 사용을 보다 용이하게 한다. 이러한 예로는 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 헬리카제 매개 증폭, 가닥 대체 증폭, 루프-매개 등온 증폭(LAMP) 등이 있다. 그러나, 이러한 등온 증폭 기법은 (느린 인 비트로 동적 효소 절차로 인하여) 종종 60-90분의 증폭 시간 및 극히 엄격한 증폭 반응에 순응하기 위하여 단일 온도 점에서의 정확한 온도 조절을 요구하는데, 이는 사용 현장 진단 응용에 요구되는 강건함 및 속도의 결여를 다시 야기한다.
[0011] 주형-의존성 핵산 증폭은 핵산 기반 분자 진단의 초석이다. 강건하고, 저 비용의 신속한 현장 진단 핵산 진단법은 건강 관리, 농업분야에서, 그리고 생물학적 테러 및 전쟁의 맥락에서 긴급하게 요구된다. 그러나, 기존의 PCR 또는 등온 증폭과 관련된 분석 화학적 전략은, 핵산계 분자가 떠오르는 질병 예방 및 통제에 있어 가장 큰 영향을 만들 수 있는 곳인 재원 한정된 장소에 대하여 그와 같은 증폭 접근을 비싸고 비실용적으로 만드는 현저한 공학적 및 강건함 한계를 부여한다. 전용의 실험실 인프라구조가 없는 장소에 대하여, 적당하고 강건한 진단을 가져다 줄 핵산 증폭에 있어서 상당한 개량이 아직 이루어져야만 한다.
[0012] 전통적인 PCR은 보통 40℃ 만큼이나 많은 온도를 변경시키는, 고도로 특이적이고 신속한 열적 순환에 의존한다. 그와 같은 증폭 방법은 용액 온도를 정확하게 유지하는 것에 더하여, PCR 반응 혼합물의 신속한 가열 및 (특히) 냉각을 위하여 비싼 기구를 필요로 한다. 등온 핵산 증폭 절차는 복잡한 열적 순환 기구에 대한 요구를 제거하는 반면에, 일반적으로 느리고(적어도 60분의 반응시간), 신뢰할만하지 않으며, 정확한 온도 측정을 요구한다.
[0013] PCR 열 순환과정에서, PCR 사이클러는 시료 내 온도를 유지하고, 전형적으로 초당 적어도 2℃의 가열(및/또는 냉각) 속도를 유지하기 위하여 좋은 온도 조절을 가져야만 한다. 온도 조절은 전형적으로 피드백 루프 시스템에 의하여 달성되는데 비해, 온도의 균일성은 구리와 같이 고열전도성이지만 벌키한 물질에 의하여 달성된다. 높은 가열 속도는 최대 허용 손실 및 열용량에 의하여 제한되는 PID(proportional integrated derivative) 조절 방법의 수행에 의하여 얻어진다. 고도의 냉각 속도는 달성하기가 다소 어려우며, 벌키 시스템은 열전기적 요소(P.Wilding, M. A. Shoffner and L. J. Kricka, Clin. Chem., 1994, 40, 1815-1817.)(종종 펠티에 요소로 불리움) 또는 물과 같은 다른 수단(J. B. Findlay, S. M. Atwood, L. Bergmeyer, J. Chemelli, K. Christy, T. Cummins, W. Donish, T. Ekeze, J. Falvo, D. Patterson, J. Puskas, J. Quenin, J. Shah, D. Sharkey, J. W. H. Sutherland, R. Sutton, H. Warren and J. Wellman, Clin. Chem., 1993, 39, 9, 1927-1933)에 의한 강제 냉각을 요구한다. 이러한 PCR 기계들은 복잡하고 파워가 많이 드는 장치이다. 시스템이 벌키하기 때문에, 그들의 열적 시간 상수는 초가 아닌 분 단위인데, 이는 긴 전이 시간 및 원하지 않는 PCR 부산물을 야기한다. 높은 파워 소비는 배터리 운전 및 운반가능한 PCR 시스템을 만들 수 없게 한다.
[0014] 최근, 실리콘 기술에 기반한 마이크로 머시닝 및 생물학적 마이크로-전기기계적 시스템(bioMEMS)의 발전과 함께, 전세계의 많은 그룹들이 마이크로 PCR(μPCR)의 개발에 착수하였는데, 이는 랩온어칩 또는 마이크로 토탈 분석 시스템(μTAS)의 중심부이다. 연구자들은 2가지 기초적 접근을 따른다: 순환 온도를 가진 정지 시스템 다른 온도에서 3가지 구역을 가진 플로우 시스템. 두 시스템은 모두 각자의 장점 및 단점을 갖는다. 정지 시스템은 PCR 용액의 온도를 변화시키기 위하여 챔버의 온도를 순환시킨다. 그들은 PCR 시료를 음직이게 할 펌핑 시스템이나 또는 다른 수단을 필요로 하지 않는다. 플로우-쓰루 시스템은 전형적으로 3개의 일정한 온도를 지닌 구역을 갖는다. 다른 온도의 구역 사이를 이동하는 것에 의하여 오직 시료만이 온도를 변화시킨다. 이와 같은 PCR 시스템 타입은 첫 번째 것보다 더 빠르지만, 시료를 이동시키기 위한 기전의 수행이 요구된다. 두 경우 모두에서, 히터가 PCR 시스템과 통합되며, 따라서 오직 한 번의 시험 수행 후에 교차 오염을 피하기 위하여, 장치를 비우는 것은 경제적이지 않다. 이러한 두 개의 포맷에 의하여 기술된 주요 장점은 전통적인 장치와 비교하여 더 적은 양의 시료 부피를 사용하는 것에 의한 감소된 사이클 시간이다. 그러나, 이들 PCR 칩은 실리콘과 같은 기질 물질을 사용하는데, 이는 매우 높은 단위 가격을 야기하는 비싸고 복잡한 제작 절차의 채택을 필요로 한다. 게다가, 증가된 표면 대 부피비를 얻기에는 극도로 소량인 반응 부피(<μL) 및 μPCR 칩에 사용되는 물질 타입의 결과로, 생물학적 시료의 비특이적 흡수, 억제, 시료 증발 및 거품의 형성을 포함하는 통상적인 PCR에는 매우 흔하지 않은 몇몇 효과가 현저하게 된다. 또한 다른 현재의 노력은, 정지 챔버와 연속적인 플로우 PCR을 통합하는 온도 사이클링 반응 마이크로칩을 개발하여, 정지 챔버 PCR 칩 내의 사이클 수 및 온도 영역 수 변화에 유동성을 부여하면서, 플로우 쓰루 마이크로채널 PCR 칩의 효과적인 온도 순환을 수행하는 것과 관련된다. 그러나, 하이브리드 PCR 장치의 효율은 여전히 확인 중에 있고, μPCR 접근과 관련된 시료 억제, 흡수 및 거품 형성에 관한 이슈들은, 모든 선행의 시료 준비/핵산 분리 과정 및 증폭 시약과 예컨대 극도로 높은 중합효소 농도, PCR 프라이머 농도 등과 같은 반응 조건에 대하여 현저한 엄격성을 부여한 채 남아있다.
[0015] 본 발명의 일 구현예는 시료 내에 함유되어 있는 표적 핵산 서열의 주형을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다. 본 방법은 시료를 표적 핵산 서열의 주형에 상보적인 프라이머를 함유하는 증폭 반응 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 반응 온도는 수회 온도 사이클 중에 온도 차이가 최대 약 20℃인 상한 온도와 하한 온도 사이에서 왕복된다. 표적 핵산 서열의 주형은 증폭된다.
[0016] 본 발명의 일 구현예는 수회 온도 사이클 중에 온도 차이가 최대 약 15℃인 것을 제공한다. 다른 구현예는 수회 온도 사이클 중에 온도 차이가 최대 약 10℃인 것인 제공한다. 또 다른 구현예는 수회 온도 사이클 중에 온도 차이가 최대 약 5℃인 것인 제공한다. 온도는 본 발명의 일 구현예에 따라 주어진 온도 및/또는 범위에 대하여 (+/-2℃)로 변동될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 상한 온도 또는 하한 온도에 도달한 후에, 온도 변동 이내에 정해진 시간 동안 온도가 유지되는 것을 제공한다. 또는 상한 온도 또는 하한 온도에 도달한 후에, 온도 범위 내에서 온도가 다른 온도로 변화하는 것을 제공한다. 일 구현예에서, 하한 온도는 최소 약 50℃이다. 다른 구현예에서, 상한 온도는 최대 약 85℃이다. 상한 및 하한 온도는 일 구현예에 따라 약 +/- 5℃로 변할 수 있다.
[0017] 본 발명의 일 구현예에 따라, 표적 핵산 서열의 주형은 단일 가닥 DNA 또는 RNA, 이중 가닥 DNA 또는 RNA, RNA, DNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 표적 핵산의 길이는 1000 bp 보다 짧을 수 있으며, 250 bp 보다 짧거나, 150 bp 보다 짧거나 또는 100 bp 보다 짧을 수 있다.
[0018] 1 이상의 구현예는 핵산 주형의 반대편 가닥에 결합하는 프라이머 쌍을 포함할 수도 있다. 프라이머 쌍은 융점이 65℃가 되도록 하는 길이 및 GC 함량을 가지는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 프라이머 쌍은 융점이 70℃가 되도록 하는 길이 및 GC 함량을 가지는 것이다. 예컨대, 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 독립적으로 35 내지 70 염기쌍 길이를 갖는다. 본 발명의 일 구현예에 따라서, 프라이머 쌍의 각각의 프라이머의 융점은 70 내지 80℃이다. 바람직한 일 구현예에서, 프라이머 쌍은 각각 40 내지 47 염기쌍 길이를 갖는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함한다.
[0019] 본 발명의 또 다른 구현예는 시료 내에 함유된 표적 핵산 서열의 주형을 증폭하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 35 내지 70 염기쌍 길이를 갖고 표적 핵산 서열의 주형과 상보적이며, 프라이머 쌍의 각각의 프라이머의 융점은 70 내지 80℃인 프라이머 또는 프라이머 쌍을 포함하는 증폭 반응 혼합물과 시료를 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 증폭 반응 혼합물은 DMSO, 1가 양이온, 2가 양이온, dNTPs 및 DNA 폴리머라제를 또한 함유한다. 반응 온도는 수회 온도 사이클 중에 온도 차이가 최대 약 20℃인 상한 온도와 하한 온도 사이에서 왕복되며, 표적 핵산 서열의 주형은 증폭된다. 바람직한 일 구현예에서, 2가 양이온은 마그네슘, 망간, 구리, 아연 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 1가 양이온은 나트륨, 칼륨, 리튬, 루비듐, 세슘, 암모늄 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 증폭 반응 혼합물은 핵산 불안정화제를 함유하는 것이다. 더 바람직한 구현예에서, 증폭 반응은 DNA 폴리머라제를 함유하는데, 이는 열에 안정한 DNA 폴리머라제일 수 있다. DNA 폴리머라제는 TAQ DNA 폴리머라제, VentR DNA 폴리머라제 및 DeepVentR DNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 명세서에 개시되거나 당업계에 알려진 다른 폴리머라제도 포함될 수 있다. DNA 폴리머라제는 가닥 대체 활성을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, DNA 폴리머라제는 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않는다. 다른 구현예에서, 주형을 증폭하는 방법은 역전사 효소 및 DNA 폴리머라제를 더 함유한다. 예를 들어, 역전사 효소는 열에 안정한 역전사 효소이다. 역전사 효소는 AMV-RT, 수퍼스크립트(Superscript) II 역전사 효소, 수퍼스크립트 III 역전사 효소 또는 MMLV-RT로부터 선택될 수 있으나, 당업계에 알려진 다른 역전사 효소도 사용할 수 있으므로, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예는 단일 가닥 결합 단백질을 개시된 바와 같은 반응 혼합물에 첨가하는 것을 더 포함한다. 예를 들어, 단일 가닥 결합 단백질은 열에 안정한 단일 가닥 결합 단백질이거나 또는 열에 안정하지 않은 단일 가닥 결합 단백질이다.
[0020] 본 발명의 또 다른 구현예는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 불안정화제를 함유하는 혼합물을 제공한다. 예를 들어, 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 포름아미드가 있는데, 글리세롤과 같은 다른 제제도 동일한 목적을 위하여 첨가될 수 있으므로, 이에 제한되는 것은 아니다.
[0021] 본 발명의 다른 구현예는 시료가 알코올 프리가 아니거나 및 또는 시료가 염 프리가 아닌 방법을 제공한다.
[0022] 본 발명의 또 다른 구현예는 시료 내에 함유된 표적 핵산 서열 주형을 증폭하는 방법을 제공하는데, 여기서 증폭 반응 혼합물은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 불안정화제; 1가 양이온; 2가 양이온; dNTPs; 및 활성을 뒷받침할 수 있는 pH로 완충된 DNA 폴리머라제를 포함한다.
[0023] 본 발명의 다른 구현예는 다음 중 1 이상을 함유하는 증폭 반응 혼합물을 제공한다: 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 불안정화제; 1가 양이온; 2가 양이온; dNTPs; 및 활성을 뒷받침할 수 있는 pH로 완충된 DNA 폴리머라제. DNA 폴리머라제는 열에 안정한 DNA 폴리머라제일 수 있다. DNA 폴리머라제는 TAQ DNA 폴리머라제, VentR DNA 폴리머라제 및 DeepVentR DNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다. DNA 폴리머라제는 가닥을 대체하는 활성을 가질 수 있다. DNA 폴리머라제는 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않는 것으로 선택될 수 있다. 혼합물은 다음의 1 이상을 또한 함유할 수 있다: 단일 가닥 결합 단백질, 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 포름아미드인 불안정화제; 마그네슘, 망간, 구리, 아연 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염일 수 있는 2가 양이온 및 나트륨, 칼륨, 리튬, 루비듐, 세슘, 암모늄 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염인 1가 양이온.
[0024] 본 발명의 목적, 이점 및 신규한 특성과 적용가능성의 추가 범위는, 수반하는 도면과 함께 고려되어 이하의 상세한 기술 내에 부분적으로 기술될 것이며, 이하 시험에 근거하여 당업계에서 숙련된 자에게 부분적으로 명백할 것이며, 또는 발명의 실행에 의하여 배워질 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 이점은 수반한 청구항 내에서 특히 지적된 방편 및 조합의 수단에 의하여 깨달아지고 얻어질 수 있다.
[0025] 본 명세서 내로 통합되고 그 부분을 형성하는 수반하는 도면은 본 발명의 일 구현예를 기술하고, 상세한 설명과 함께, 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다. 도면들은 오직 본 발명의 바람직한 구현예를 기술할 목적을 가질 뿐이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 도면은 다음과 같다:
[0026] 도 1은 전통적인 2단계 PCR 반응(흑색 선)과 비교하여 OPCRar(회색 선)의 수회 사이클 동안에 관찰된 열적 변동의 대표적 흔적을 나타내는 패널 A와, 본 발명의 일 구현예에 따른 뉴클레오타이드 증폭 방법을 기술하고 있는 패널 B를 가지고, 본 발명의 일 구현예에 따른 왕복 PCR 증폭 반응의 도식도를 나타내고 있다.
[0027] 도 2. 패널 A-E는 본 발명의 일 구현예에 따라 153 염기쌍(bp) 산물을 생성시키기 위하여 사용한 다른 폴리머라제를 보여주는 아크릴아미드 겔의 일련의 사진을 나타내고 있다.
[0028] 도 3. 패널 A-B는 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 증폭에 대한 에탄올의 영향을 보여주는 아크릴아미드 겔의 일련의 사진을 나타낸다.
[0029] 도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 효율적인 증폭을 뒷받침하는 어닐링의 온도와 프라이머 녹는점(용융 온도)의 차이를 나타내는 아크릴아미드 겔의 사진이다.
[0030] 도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 핫-스타트(hot-start) DNA 폴리머라제의 프라이머 다이머(dimer) 형성에 대한 영향을 보여주는 아크릴아미드 겔의 사진이다.
[0031] 도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 GC 및 AT 클램프의 프라이머-다이머 형성에 대한 영향을 나타내는 아크릴아미드 겔의 사진이다.
[0032] 도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 단일 가닥 결합 단백질의 산물 형성에 대한 영향을 나타내는 아크릴아미드 겔의 사진이다.
[0033] 도 8. 패널 A-B는 본 발명의 일 구현예에 따른 T4 유전자 단백질
32에 의한 프라이머-다이머 형성량의 감소를 기술하는 아크릴아미드 겔의 사진들을 나타낸다.
[0034] 도 9는 본 발명의 일 구현예에 따라 증폭된 이중사 DNA 내에 존재하는 특이적 표적 서열을 나타내는 아크릴아미드 겔 사진이다.
[0035] 도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 ssDNA 내에 존재하는 특이적 표적 서열의 증폭을 기술하는 아크릴아미드 겔 사진이다.
[0036] 도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 플라스미드 DNA 내 존재하는 특이적 표적 서열의 증폭을 나타내는 아크릴아미드 겔 사진이다.
[0037] 도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 단일 가닥 RNA의 증폭을 나타내는 아크릴아미드 겔 사진이다.
[0038] 도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 박테리아 게놈 DNA 내의 특이적 표적 서열의 증폭을 나타내는 아크릴아미드 겔 사진이다.
[0039] 도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 엽록체 DNA 내 존재하는 특이적 표적 서열의 증폭을 나타내는 아크릴아미드 겔 사진이다.
[0040] 도 15는 본 발명의 일 구현예에 따른 2개의 표적 서열의 증폭을 나타내는 아크릴아미드 겔 사진이다.
[0041] 도 16. 패널 A-B는 본 발명의 일 구현예에 따른, 낮은 녹는점에서 SSB의 존재 하 표적 서열의 증폭을 나타내는 아크릴아미드 겔 사진을 보여준다.
[0042] 도 17 패널 A-B는 전형적인 PCR 서모사이클러에 요구되는 것과 같은 정확한 온도 조절 및/또는 신속한 램핑 파라미터를 이용한 표적의 증폭을 보여주는 아크릴아미드 겔 사진을 나타낸 것이다.
[0043] 도 18은 램핑 또는 정확한 온도 조절이 없이 저 비용 히터 중에서 증폭된 표적 Rbcl의 증폭을 보여주는 아크릴아미드 겔 사진이다.
[0044] 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용되는 용어 '핵산'은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성 분자를 의미한다. 단일 가닥 핵산은 헤어핀, 루프 및 스템 요소와 같은 2차 구조를 가질 수 있다. 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산은 선형 또는 환형일 수 있다. 이중 가닥 핵산은 온전하거나 또는 틈새가 있는 것일 수 있다. 이중 가닥 분자는 뭉툭한 말단을 갖거나 또는 단일 가닥이 돌출된 말단을 가질 수 있다. 핵산 시료는 세포 또는 바이러스로부터 분리될 수 있으며, 세포 또는 바이러스 중에서 발생하는 크로모좀 DNA, 플라스미드 DNA를 포함하는 엑스트라-크로모좀, 재조합 DNA, DNA 단편, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 트랜스퍼 RNA, 이중 가닥 RNA 또는 다른 RNA들을 포함할 수 있다. 핵산은 농업, 식품, 환경, 발효 또는 침, 혈액, 코 또는 폐 대기음, 뇌척수액, 가래, 대변, 젖, 점막 조직 닦은 것, 점막 조직, 조직 시료 또는 세포와 같은 생물학적 액체와 같은 임의의 개수의 원천으로부터 분리될 수도 있다. 핵산은 인 비트로에서 분리되거나, 클로닝 또는 합성될 수도 있다. 상기 기술된 핵산의 범위 내에, 개별 뉴클레오타이드는 메틸화와 같은 변형 또는 화학적 변경의 대상이 될 수도 있다. 이러한 변형 또는 변경은 자연적으로 일어날 수도 있고 또는 인 비트로 합성에 의하여 발생할 수도 있다.
[0045] 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용되는 용어 '표적 핵산' 또는 '주형 핵산'은 선택적으로 증폭되어질 것으로 의도된 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 단편 또는 서열을 의미한다. 증폭되어질 핵산의 크기는 업스트림(5') 및 다운스트림(3') 경계에 의하여 정의되며, 500 bp 미만일 수 있고, 좋기로는 250 bp 미만, 더 좋기로는 150 bp 미만일 수 있고, 보다 더 좋기로는 100bp 미만일 수 있다. 표적 핵산은 긴 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 내에 포함되는 단편일 수 있으며, 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 전체일 수도 있다.
[0046] 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용되는 용어 '듀플렉스'는 전체 또는 부분이 이중 가닥인 DNA 또는 RNA 핵산 분자를 의미한다.
[0047] 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용되는 용어 '열적 사이클'은 핵산 증폭이 발생하기 위하여 요구되는 반복되는 온도 변동을 의미한다. 열적 사이클은 고온의 용융 또는 변성 단계 및 저온의 어닐링 또는 혼성화 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[0048] 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용되는 용어 '용융' 또는 '변성'은 고온에서 핵산 듀플렉스의 2개의 상보적인 가닥의 전부 또는 일부를 분리하는 것을 의미한다. 용융 또는 변성 온도는 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 길이 및 서열, DMSO 및 포름아미드와 같은 듀플렉스 비안정화 시약의 농도 및 용액의 이온 강도 또는 pH에 의하여 영향받을 수 있다.
[0049] 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용되는 용어 '어닐링' 또는 '혼성화'는 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 핵산 주형으로의 서열 특이적 결합을 의미한다. 서열은 주형 가닥들 중 하나 위의 그의 상보적 서열에만 결합할 수 있으며, 주형의 다른 영역에는 결합하지 않는다. 어닐링 또는 혼성화의 특이성은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열, 결합이 수행되는 온도, DMSO 및 포름아미드와 같은 듀플렉스 불안정화 시약의 농도 및 용액의 이온 강도 또는 pH에 의하여 영향 받을 수 있다.
[0050] 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용되는 용어 '프라이머'는 표적 핵산의 폴리머라제-의존적 복제를 가능하게 하는, 서열 특이적 방식으로 표적 서열 상의 단일 가닥 영역에 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
[0051] 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용되는 용어 'OPCRar'은 , 왕복 PCR 증폭 반응(Oscillating PCR Amplification Reaction)을 의미하는데, 이는 전형적인 증폭 기술에서보다 적은, 변성 온도와 어닐링 온도 사이의 온도 변동, 예컨대 20℃ 미만, 좋기로는 15℃ 미만, 더욱 좋기로는 10℃ 미만의 온도 변동 사용하여, 핵산을 증폭하는 인 비트로 기술이다.
[0052] 명세서 및 청구항 전체에 걸쳐 사용되는 용어 '액세서리 단백질'은 활성을 자극할 수 있는 능력이 있는 임의의 단백질을 일컫는 데, 예를 들어 열안정성 단일 가닥 결합 단백질(SSB), 예컨대 rec A 또는 RPA (복제 단백질 A)가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
[0053] 본 발명의 일 구현예에서, 열적 사이클링에 의하여 특이적 핵산 표적을 기하급수적으로 증폭시키는 방법이 제공되는데, 여기서 온도의 변동은 좋기로는 20℃ 미만, 더 좋기로는 15℃ 미만, 보다 더 좋기로는 10℃이다. 이는 증폭되어질 핵산의 단일 가닥 주형, 핵산 주형에 혼성화하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제공하는 단계, DNA 폴리머라제의 수단에 의하여 주형 가닥에 상보적인 이중 가닥 신장 산물을 생산하기 위하여 혼성화된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 단계 및 선별된 핵산 표적을 기하급수적으로 증폭하기 위하여 상기 단계들을 반복하는 단계를 포함한다.
[0054] 이제 도 1을 보면, 본 발명의 일 구현예에 따른 왕복 PCR 증폭 반응(OPCRar)의 도식도가 패널 A에 기술되어 있는데, 이는 통상적인 2-단계 PCR 반응(흑색 선)과 비교하여, OPCRar(회색 선)의 수회 사이클 동안에 관찰된 열적 변동의 대표적인 흔적을 보여주고 있다. OPCRar에서 온도 변동의 드라마틱한 감소에 주목하라. 도 1B는 본 발명의 일 구현예에 따라 이중 가닥 표적 핵산이 용융 단계에 들어가는데, 여기서 온도에 따라 듀플렉스의 부분 또는 완전한 변성이 야기될 수 있다. 듀플렉스의 풀림은 표적의 말단에서 시작되며, 단일 가닥 핵산은 단일 가닥 결합 단백질(원으로 표시)에 의하여 결합되고 안정화된다. 반응을 냉각시키고, 혼성화/중합화 단계로 들어가게 하는데, 여기서 프라이머는 표적 듀플렉스의 각 가닥의 5' 말단에 특이적 방식으로 혼성화한다. 프라이머의 혼성화 후에, DNA 폴리머라제(사각형)는 주형/프라이머 듀플렉스에 결합하여, DNA 주형 가닥을 복사하면서, dNTPs의 통합에 의하여 5'->3' 방향으로 프라이머를 신장시킨다. 만일 사용된 폴리머라제가 가닥 대체 활성을 갖는다면, 부분적으로 변성된 복합체 중의 반대 가닥을 대체할 수 있을 것이다. 새로운 듀플렉스 DNA가 생성되면, 열적 사이클이 수회 반복되어, 표적 핵산 서열의 기하급수적인 증폭을 야기한다.
[0055] 본 발명의 일 구현예서, 열적 사이클링은 △T가 좋기로는 20℃ 이하, 더 좋기로는 15℃ 이하, 보다 더 좋기로는 10℃ 미만인 두개의 온도 사이에서 왕복 또는 순환하는 온도와 관련된다. 두 개의 온도 중 더 높은 쪽은 이중 가닥 표적 DNA를 변성시키거나 또는 좋기로는 이중 가닥 DNA 표적의 오직 부분적인 변성만을 일으키기에 충분할 수 있다. 높은 또는 낮은 온도에 도달하면, 상기 온도는 정해진 시간 동안에 유지되거나 또는 좋기로는 다른 온도로 즉시 변한다.
[0056] 본 발명의 추가적인 구현예에서, 핵산 표적은 이중사 DNA와 같은 이중 가닥 핵산이거나 또는 단일 가닥 RNA 또는 DNA와 같은 단일 가닥 핵산일 수도 있다. 만일 표적 핵산이 이중 가닥이라면, 그것은 열 또는 효소에 의하여 전체적으로 또는 부분적으로 변성되어, DNA 폴리머라제 활성 및 증폭을 위하여 필수적인 단일 가닥 주형 또는 주형 영역을 형성하여야만 한다. 표적 핵산의 길이는 1000 bp 미만, 좋기로는 250 bp 미만, 더 좋기로는 150 bp 미만일 수 있다.
[0057] 본 발명의 추가적인 구현예에서, 표적 핵산 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 표적 핵산의 특이적 이중 가닥의 반대편 가닥에 결합하는 프라이머 쌍인데, 여기서 하나의 프라이머는 표적의 5' 말단의 업스트림에 결합하고, 하나의 프라이머는 3' 말단의 다운스트림에 결합한다. 복합 조건 하에서, 1 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍이, 동일한 반응 혼합물 중의 다수의 핵산 표적을 동시에 증폭하기 위하여 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로 받아들여지는 PCR 완충 조건 하에서, 융점이 65℃ 초과, 좋기로는 70℃ 초과가 되도록하는 길이 및 GC 함량을 가질 수도 있다.
[0058] 또한, 본 발명의 추가적인 구현예에서, 사용되는 DNA 폴리머라제는 좋기로는 TAQ DNA 폴리머라제, 벤트알(VentR) DNA 폴리머라제, 깊은벤트알(DeepVentR) DNA 폴리머라제 및 유사한 열안정성 DNA 폴리머라제로부터 선택된다. 좋기로는 DNA 폴리머라제는 가닥 대체 활성을 보유하고, 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않는다(도 1B 참조). 또한, 만일 주형 핵산이 단일 가닥 RNA인 경우, 사용되는 역전사 효소는 AMV-RT, 수퍼스크립트(Superscript) II 역전사 효소(Invitrogen, Carlsbad, CA), 수퍼스크립트 III 역전사 효소(Invitrogen) 및 유사한 열안정성 효소로부터 선택될 것이다.
기타-가능한 열친화성(thermalphilic) 폴리머라제들
[0059] 열친화성 DNA 폴리머라제
[0060] 폴리머라제 및 (벤더)
[0061] 벤트알(VentR)®(네브)
[0062] 벤트알(VentR) (엑소-)®(네브)
[0063] 깊은 벤트(Deep Vent) (네브)
[0064] 깊은 벤트알(Deep VentR) (엑소-) (네브)
[0065] 태그(Tag) (네브)
[0066] 파이로스크립트(PyroScript) (루시젠)
[0067] 파이로파지(PyroPhage)® 3173, 야생형 (루시젠)
[0068] 롱앰프 태그(LongAmp Tag) (네브)
[0069] Bst 폴리머라제
[0070] 파이어 핫 스타트(Phire Hot Start) II (네브)
[0071] 퓨전 하이 피델티(Phusion High Fidelty) DNA 폴리머라제 (네브)
[0072] 퓨전(Phusion) (네브)
[0073] 퓨전 플래쉬(Phusion® Flash) (네브)
[0074] 9　Nm (네브)
[0075] 디엔에이자임 II 핫 스타트(DyNAzyme II Hot Start) (네브)
[0076] 디엔에이자임 이엑스티(DyNAzyme EXT) (네브)
[0077] 드림태그(DreamTag) (퍼멘타스)
[0078] 태그(Tag) (천연) (퍼멘타스)
[0079] 맥시마 핫 스타트 태그(Maxima® Hot Start Tag) (퍼멘타스)
[0080] Pfu (재조합), (퍼멘타스)
[0081] Bsm (큰 단편), (퍼멘타스)
[0082] 트루스타트 핫 스타트 태그(TrueStart® Hot Start Tag) (퍼멘타스)
[0083] Tfi (인비트로겐)
[0084] 앰피태그(AmpiTag®) (인비트로겐)
[0085] 앰피 골드(AmpliTag Gold®) (Invitrogen)
[0086] 플래티늄(Platinum®) Pfx
[0087] 본 발명의 추가의 구현예에서, 반응 혼합물은 좋기로는 열친화성 생물로부터 분리되고 클로닝된 T4 유전자 32 단백질 또는 열 안정성 SSB와 같은 단일 가닥 결합 단백질(SSB)을 포함한다.
[0088] 추가적으로, 효소 제조물은 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 포름아미드와 같은 단일 또는 이중 가닥 핵산 불안정화 제제를, 좋기로는 총 반응 부피의 8-15%의 농도로 함유한다. 대체적으로는, 글리세롤 데아자(glycerol deaza)-dGTP, 3다조퓨레인(3dazopurein), dITP와 같은 다른 제제를 단독으로 사용하거나, 앞서 열거한 제제들과 조합으로 사용할 수도 있다.
[0089] 본 발명의 구현예는 미세 유동층이 가열 요소 위에 위치하는, 저비용의 현장 핵산 진단에 사용하기에 이상적으로 적합하다. 온도 범위 사이클링 요구조건을 감소시키는 것에 의하여, 수동 냉각 메카니즘을 구비한 상대적으로 간단한 가열이, 반응 용액의 온도를 신속하게 순환시키기 위하여 사용될 수 있다. 열적 사이클링 동안의 낮아진 최대 온도는 증폭 반응 전체에 부정적인 영향을 줄 수 있는 유체 증발을 최소화한다. 더욱 중요하게는 통상적인 PCR 절차와 비교하여 증폭의 강건함이 크게 개선되는데, 이는 새로운 방법이 증폭 과정 동안에 온도 변동(부정확한 온도 조절)을 수용할 수 있게 하는 것이다. 본 발명의 특이적 반응 화학은, 전체 반응 부피에 걸쳐 균일한 온도에 대한 요구를 제거하면서, 넓은 범위의 용융(예컨대, 70-105℃, 특히 거품생성에 민감하지 않음) 및 혼성화 온도에 걸쳐 작동하는 것으로 나타났다. 마지막으로 본 발명의 구현예는, 전통적인 핵산 추출 화학과 관련되는 알코올 기반 세척(예컨대 알코올 또는 이소판올) 및 핵산 추출 단계 사이의 원심분리, 열-건조 또는 진공 단계를 제거하는 것에 의하여, 당면한 핵산 분리의 엄격함을 크게 줄이면서, 알코올 및 염(예컨대, ~10% 에탄올)의 존재하에서 잘 수행된다.
[0090] 본 발명의 구현예는 병원균 핵산이 표적 핵산인 생물학적 시료 중의 병원균의 탐지를 포함한다. 대안적으로는, 본 발명은 염록체 DNA 내의 차이를 탐지하기 위하여 사용될 수도 있는데, 여기서 염록체 DNA의 단편이 표적 핵산이 된다. 이 방법에서, 동일하거나 다른 원천으로부터 유래한 표적 핵산 내에서 단일 염기 다형성이 탐지될 수도 있다.
[0091] 본 발명의 증폭 기술의 구현예는 '왕복 PCR 증폭 반응'(OPCRar)으로서 언급된다. OPCRar은 반응 융점 온도를 낮추는 이중 가닥 불안정화 제제 및 주어진 열적 사이클 중에서 어닐링 온도를 높이기 위한 특별히 높은 녹는점(Tm)을 가지는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 조합하여 사용하는 것에 기반하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 방법에서 표적 핵산의 인 비트로 증폭은, 좋기로는 20℃, 더 좋기로는 15℃, 보다 더 좋기로는 10℃가 차이 나는 온도 사이를 빠르게 열적 순환시키는 것에 의하여 수행될 수 있다(도 1A). 표적 핵산의 업스트림(5') 및 다운스트림(3') 영역에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 주형에 혼성화하여, DNA 폴리머라제에 의한 신장을 허용하여 표적을 증폭한다. 만일 사용되는 DNA 폴리머라제가 엑소뉴클레아제 활성이 없는 가닥 대체 폴리머라제라면, 녹는점을 낮추기 위하여 듀플렉스 불안정화 제제와 함께 작동하면서 이중 가닥 표적 핵산의 완전한 열적 변성이 불필요하다. 온도 사이클링 절차는 반복되어, 특이적 핵산 표적 서열의 기하급수적인 증폭을 야기한다(도 1B). OPCRar에서, 이중 가닥 표적 핵산은 용융 단계에 들어가는데, 여기서 온도에 따라 듀플렉스의 부분적 또는 완전한 변성을 야기할 수 있다. 듀플렉스의 풀림은 표적의 말단에서 시작하며, 단일 가닥 결합 단백질(원)이 단일 가닥 핵산에 결합하고 이를 안정화시킨다. 반응을 냉각시키고, 혼성화/중합화 단계에 들어가게 하는데, 여기서 프라이머는 표적 듀플렉스의 각각의 가닥의 5' 말단에 특이적 방식으로 혼성화한다. 프라이머 혼성화 후에, DNA 폴리머라제(사각형)은 주형/프라이머 듀플렉스에 결합하고, DNA의 주형 가닥을 복사하면서 dNTPs를 통합하는 것에 의하여 5'->3' 방향으로 프라이머를 신장시킨다. 만일 사용되늰 폴리머라제가 가닥 대체 활성을 갖는다면, 부분적으로 변성된 복합체 중의 반대 가닥을 대체하는 것이 가능할 것이다. 새로운 듀플렉스 DNA의 생성에 따라, 열적 순환이 여러 번 반복되면, 표적 핵산 서열의 기하급수적인 증폭이 야기된다.
[0092] OPCRar 방법은 반응 용융 온도(녹는점)를 낮추는 핵산 불안정화 제제와, 열적 사이클링 동안에 어닐링 온도를 높이기 위한 특이하게 높은 녹는점을 가지는 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 조합하여 사용하는 것에 기반하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 주어진 표적 핵산에 대하여, 하나의 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 좋기로는 표적 서열을 포함하는 센스 가닥의 5'-말단에 혼성화하고, 하나의 프라이머는 좋기로는 역-상보적인 표적 서열을 포함하는 안티센스 가닥의 5'-말단에 혼성화한다. OPCRar은 좋기로는 효율적인 표적 핵산의 증폭을 위하여 요구되는 용융 또는 변성 온도를 더 낮추기 위하여, 엑소뉴클레아제 활성이 없는 가닥 대체 DNA 폴리머라제를 사용하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. OPCRar는 액세서리 단백질의 존재 또는 부존재 하에서 표적 핵산을 증폭할 수 있다. 그 어떠한 특이적인 OPCRar 시스템도, 혼합물 내에 첨가, 삭제 또는 치환에 의하여 최적화될 수 있다.
[0093] 이러한 증폭 기술은 저비용, 신속함, 현장 핵산 진단의 측면에서, 당업계에 보고된 다른 증폭 기법보다 개량된 특성을 갖는다. 앞서 기술한 핵산 증폭 기법들과는 달리, 강건한 효소적 절차에 의하여 가능하게 된 OPCRar 시스템은 강건하고, 신속하고, 저 비용 가열 장치의 온도 변동에 관용적이므로, 저 비용 및 현장진단 응용에 이상적으로 적합하다. 열적 사이클링 동안에 직면하는 온도 차이를 최소화함에 의하여, OPCRar는 등온의 증폭 기법들의 낮아진 장치 요구와 함께 PCR의 속도와 신뢰성을 조합한다.
[0094] OPCRar 시스템의 단순화된 열 순환 필요조건은 수동-냉각 기구에 이상적으로 적합한데, 여기서 열은 챔버의 한쪽 면에 적용될 수 있고, 냉각은 반대 면에서 열의 대기중 발산에 의하여 일어난다. 이와 같은 수동-냉각은 임의의 핵산 진단 장치의 비용 및 복잡성을 드라마틱하게 낮춘다. 수동-냉각은 진단 장치에 있어 사용이 종전에 보고된 바 있지만, 이들 장치는 반응 속도를 제한하면서 표적 핵산을 증폭시키기 위하여 전통적인 PCR 사이클링 분석 화학을 채택하였다(Luo et. al. Nuc Acids Res. 2005; Wilding et. al., Nuc. Acids. Res. 1996; Burke et. al., Science 1998;). OPCRar의 다른 장점은 효과적인 핵산 증폭이 넓은 범위의 용융 및 어닐링 온도에 걸쳐서 일어날 수 있으며, 그 결과 덜 엄격한 온도 조절 메카니즘을 요구한다는 데 있다. 초소형화된 핵산 진단 구조의 구축에서, 전체 반응 부피에 걸친 균일한 온도의 유지는, 반응 챔버의 가열된 면과 가열되지 않은 면 사이에서 발생하는 특히 높은 온도 구배와 함께 도전적인 것이 될 수 있다. 그와 같은 온도 변동은 통상적인 PCR 또는 등온의 반응 화학을 사용하면서 비효율적인 증폭을 야기할 수 있다. OPCRar은 강건한 폴리머라제, 불안정화 시약 및 다른 폴리머라제 액세서리 인자의 조합을 사용하는 것에 의하여, 정확한 온도 조절 및 유지와 관련된 문제를 최소화하기 위하여 디자인된 것이다: 반응 챔버의 가장 시원한 영역이 주어진 핵산 표적에 대한 최소 가능 용융 온도와 최대 가능 어닐링 온도를 보는 한, 비록 반응 부피의 다른 영역이 >10℃로 변한다고 하더라도, 반응이 효과적으로 진행할 것이다. 게다가, 최소의 힘/에너지 소비와 함께 증폭 화학의 강건한 OPCRar 성질은, 당면한 시료 제조/핵산 분리 과정의 엄격함(염 및 알코올 캐리 오버 및 억제 물질과 같은 오염물질의 그 어떠한 흔적도 없이 고도로 순수하면서 동시에 고도로 농축된 핵산인 유입 주형의 sub μL를 취득하는 관점에서) 및 PCR 효소 및 생제제들의 초고농도 및 초순도에 대한 요구조건을 크게 경감시키면서, 다량의 부피(예컨대, 전형적인 μPCR 칩 내의 sub μL 대신에 20 μL)에 대하여 신속하고도 효과적인 증폭을 가능하게 한다.
용매 시약
[0095] DMSO 및 포름아미드와 같은 용매는 첨가되는 매 1% 부피마다 듀플렉스 핵산의 녹는점을 ~0.5-0.7 ℃ 낮추는 것으로 알려져 있다. 높은 GC 함량을 가지고 그 결과 높은 Tm을 가지는 표적 핵산의 증폭 효율을 개선하여, 녹이기가 어려운 이중 가닥 주형의 완전한 변성을 촉진하기 위하여, 이들 시약이 자주 사용된다. 보통 PCR 열적 사이클링 온도는, 듀플렉스 불안정화 시약을 PCR 반응물에 넣는 것에 의하여 일정하게 유지된다. 반면에, OPCRar는 좋기로는 열적 사이클의 녹는점을 드라마틱하게 낮추기 위하여 특별히 고농도의 DMSO를 첨가하는 것을 활용한다. 전통적인 PCR에 있어서, DMSO는 용융 단계의 고온(일반적으로 90℃ 초과)과 함께 이들 시약의 고 농도와 관련된 폴리머라제 활성의 상실로 인하여, 10% v/v 초과로는 거의 사용되지 않는다. 반면에, OPCRar 시스템 및 방법은 좋기로는 10 내지 15%의 DMSO 농도를 사용한다. 예상밖으로, 이러한 DMSO의 양은 폴리머라제 활성의 현저한 손실을 야기하지 않는다.
[0096] 이제 도 2를 보면, 본 발명의 일 구현예에 따른 증폭은 조건에 의존하여 다양한 DNA 폴리머라제와 양립가능하다. 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는 코 대기음으로부터 분리한 리보핵산(0.3 ng/μL)을 VentR 폴리머라제를 사용하는 멀티플 역전사-OPCRar 조건하에서 핵산 주형으로 사용하였다. OPCRar 프라이머 FP3 및 RP4을 사용하여 153 bp 산물을 생성시켰는데, 이는 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하여 시각화하였다. 모든 반응은 수퍼스크립트 III 역전사 효소를 포함하였는데, 여기서 열 사이클링에 앞서, 초기 cDNA 발생 단계를 55 ℃에서 5분간 수행하였다. 겔 레인을 DMSO의 농도 및 사용한 용융 및 혼성화 단계 온도로 표지하였다: 반응을 40 사이클 수행하였다.
[0097] 통상적인 PCR 효소, 예컨대 Taq DNA 폴리머라제 반응 혼합물은 에탄올과 같은 알코올의 그 어떠한 흔적량에도 극도로 민감한 반면에, 본 발명의 일 구현예에서, 새로운 반응 혼합물은 에탄올에 의한 억제에 매우 저항성이 있다. 이제 도 3을 보면, 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 증폭에 대한 에탄올의 효과가 나타나있다. 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(Candidatus . Liberibacter asiaticus) 감염된 잎 조직으로부터 분리한 총 핵산(3.4 ng/μL)을 시작 주형으로 사용하였다. 15% DMSO 존재 하 VentR (엑소-) DNA 폴리머라제, Et SSB와 프라이머 hyvl_For 및 hyvl_Rev를 사용하는 OPCRar 조건(도 3A) 또는 Taq 폴리머라제 및 프라이머 HLBas-P2 및 HLBr-P1를 사용하는 통상의 PCR 조건(도 3B) 하에서 반응을 수행하였다. OPCRar 용액을 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 76℃에서 10초 및 60℃에서 10초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하여, 139 bp 산물을 생성시켰다. 통상적인 PCR 반응은 95℃까지의 온도로 2분간 가열하고, 그 다음 95℃에서 10초 및 58℃ 에서 40초 사이를 변화하는 40회 사이클을 수행하여 130 bp 산물을 생성시켰다. 증폭된 산물을 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에서 시각화하였다. 증폭 반응 혼합물 내에 포함된 에탄올 농도를 보여준다. OPCRar 제제(도 3A)는 통상적인 PCR(도 3B)와 비교하여 에탄올에 의한 불활성화에 대하여 드라마틱하게 더 저항성이라는 것이 명백하다.
[0098] 전형적인 OPCRar 조건 하의 VentR(엑소-) DNA 폴리머라제 및 Et SSB의 사용은 에탄올 10%까지 활성의 그 어떠한 상실도 야기하지 아니하였다. 이는 OPCRar의 저비용 현장진단 장치에의 응용과 관련하여 매우 현저하게 놀라운 발견이다. PCR 및 등온 증폭의 통상적인 지혜는 전형적으로 사용자들에게 알코올 및 염이 없는 고도로 정제된 핵산 투입을 제공할 것을 충고하기 때문이다. 그 결과 모든 연구자 대부분은, 그들이 PCR 증폭 과정을 통하여 시료를 걸기 이전에, 알코올 기반 세척 및 핵산-친화성 마이크로 비드, 글래스 프릿, 매트릭스 또는 필터 등으로부터 표적 핵산을 추출하는 단계 사이에, 몇몇 종류의 진공 건조, 공기 건조, 스핀 다운 또는 가열 단계를 채택하고 있다. 통합된 현장 진단 장치의 예로서, 핵산의 증폭 및 탐지에 더하여, 장치는 또한 표적 핵산을 신속하게 분리하여야 한다. 일반적으로 이는 핵산을 유리 섬유 매트릭스에 결합시키고 현저한 농도의 염 및 알코올의 존재하에서 세척하고, 그 다음 최소의 염을 포함하고 알코올이 없는 완충액 중에 추출하는 것에 의하여 수행된다. 추출 이전에, 결합 매트릭스 상에 보유된 세척 완충액은 추출 부피로의 캐리 오버를 방지하기 위하여 제거된다; 상업적인 핵산 분리 키트에서 이는 전형적으로 원심분리에 의하여 수행된다. OPCRar의 특이적 효소 혼합물은 핵산 분리 동안에 에탄올을 주의 깊게 제거해야 하는 필요성을 제거하여, 본 발명의 구현예가 진공, 원심분리, 공기 건조 또는 가열 건조 요소를 필요로 하지 않는 저비용의 통합된 진단에 대하여 맞춤형이 될 수 있게 한다.
프라이머
[0099] 본 명세서에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 방법에 의하여 제조되고 정제될 수 있다(참고, 예컨대 미국 특허 제6,214,587호). 본 구현예에서, 프라이머 쌍을 대표하는 2개의 서열-특이적 프라이머를 사용하여 표적 핵산 서열을 기하급수적으로 증폭한다. 첫 번째 프라이머는 표적 핵산의 업스트림 5' 영역에 혼성화하고, 두 번째 프라이머는 표적 서열의 다운스트림 3' 영역에 혼성화한다. 프라이머는 표적 듀플렉스 내에 존재하는 하나의 가닥의 5'에 혼성화하고, 표적 핵산 서열을 주형으로서 사용하여 5'에서 3'의 방향으로 폴리머라제에 의하여 프라이머가 신장된다(도 1B). 혼성화의 조건은 문헌("Molecular Cloning and Laboratory Manual" 2판, Sambrook, Rich and Maniatis, pub. Cold Spring Harbor (2003))에 기술되어 있는 바에 따라 표준화한다. 주어진 표적 서열의 특이적 증폭을 얻기 위하여, 상동의 프라이머가 선호되는데, 여기서 프라이머 내 모든 뉴클레오타이드는 표적 서열에 상보적이다. 그러나, 프라이머는 주형 핵산에 대하여 비상동성인 염기를 포함하거나, 또는 표적 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적이지 않은 5' 서열을 포함할 수도 있다. 동일한 반응 혼합물 중의 복수의 핵산 표적을 동시에 증폭하기 위하여, 단일 OPCRar 실험에 있어 프라이머의 복수의 쌍을 사용할 수도 있다. 소위 멀티플렉싱은 단일 염기 다형성 분석, 병원균 탐지에 대하여, 그리고 내부 조절의 개별 반응속으로의 통합을 위하여 흔하게 사용되는 기술이다. 또한, 멀티플렉싱의 높은 레벨은, 다른 내부 병원균 서열을 가진 표적 서열 모두의 일반적인 증폭을 가능하게 하는, 각각의 표적 특이적 3' 영역에 도입된 5' 일반적 tag 서열의 사용을 통하여 달성될 수도 있다.
[00100] 올리고뉴클레오타이드 프라이머 디자인은, 녹는점 및 인트라- 및 인터-프라이머 서열 배열과 같은 수개의 파라미터와 관련된다. 녹는점은 프라이머 길이 및 GC 함량과 같은 인자에 의하여 통제된다. 인터-프라이머 서열 상보성은 헤어핀 구조를 야기할 수 있는데, 이는 효율적인 증폭을 방해할 수 있는 반면에, 인트라-프라이머 상동성은 프라이머-다이머 더빙된 원치 않은 증폭 산물을 생산할 수 있다. 프라이머를 설계할 때, 증폭될 핵산 분자에 특이적이고, 증폭 반응 중에 존재하는 다른 프라이머 또는 자기 자신과 최소한으로 상호작용을 할, 표적 내의 서열을 선별하는 것이 중요하다.
[00101] 대부분의 핵산 증폭 전략에서, 프라이머의 녹는점은 혼성화 및 증폭이 발생할 온도보다 약 10 내지 30℃ 높은 것이 바람직하다. PCR 반응에서 어닐링/중합화 단계의 온도가 55-60℃인 것과 함께, 프라이머는 전형적으로 18-30 염기쌍 길이이다. 서열 특이성의 손실 없이 용이한 프라이머 결합을 허여하기 위하여, 이러한 특이적인 올리고뉴클레오타이드의 길이는 최소화된다. 그러나 OPCRar 시스템에서 프라이머는, 어닐링 단계의 온도를 상승시키기 위하여 평소와 달리 35-55 염기쌍 길이를 가지고 좋기로는 70-80℃의 녹는점을 가지도록 디자인된다. 전형적인 OPCRar 반응에 사용되는 듀플렉스 불안정화 제제, DMSO의 레벨(~10-15%)을 고려할 때, OPCRar의 계산된 Tm은 열적 사이클 동안에 사용되는 어닐링 온도보다 오직 <10 ℃ 이상인 것이 바람직하다. OPCRar 프라이머의 극도의 길이를 이용한 실험에서, 프라이머 Tm 및 어닐링/신장 온도에서의 최소한의 차이(DMSO의 농도를 보상하는)에도 불구하고, 효율적인 증폭이 발생하였다.
[00102] 이제 도 4를 보면, OPCRar 프라이머는 어닐링 단계 온도와 프라이머 Tm 사이에 최소한의 차이를 요구하여, 본 발명의 일 구현예에 따른 효율적인 증폭을 뒷받침한다. 프라이머 hyvl_For 및 hyvl_Rev를 사용하여 hyvl 유전자 서열을 포함하는 플라스미드(12 ng/μM)를 증폭하여 139 bp 산물을 생성시켰는데, 이는 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하여 시각화하였다. 모든 반응은 초기의 85℃에서 2분간 용융 단계를 거친 다음, 지시된 용융 및 혼성화 각각의 온도에서 10초씩 40회 사이클을 수행하였다.
프라이머 hyvl_For 및 hyvl_Rev에 대하여 계산된 Tm은 각각 72.2℃ 및 70.9℃이었다. 1% 부피당 0.7℃의 감소를 가정할 때 Tm을 7℃ 낮추는, 10% DMSO 중에서 반응을 수행하였다. 프라이머 Tm과 혼성화 온도 사이의 무시할 만한 차이를 가지고서도, 증폭반응은 마치 온도 차이가 훨씬 적은 것만큼 효율적으로 진행되는 것으로 관찰되었다.
[00103] 이제 도 5를 보면, OPCRar를 사용한 프라이머 다이머 형성에 대한 핫-스타트 DNA 폴리머라제의 효과를 나타낸다. 핵산 주형을 함유하지 않은 대조군 반응은, 프라이머 쌍 FP3 및 RP4 (각각 8 μM)와 15 % DMSO의 존재 하에서, 수퍼스크립트 III RT, 및 Taq 또는 플래티늄 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 수행되었다. 사이클링 파라미터는 55℃에서 5분, 85℃에서 2분, 및 80℃에서 15초와 65℃에서 15초의 40회 사이클이었다. 12% 아크릴아미드 겔 상의 전기 영동 이후에, 에티디움 브로마이드를 사용하여 OPCRar 산물을 시각화하였다. 플래티늄 Taq은 상업적으로 이용가능한 핫-스타트 효소(Invitrogen, Carlsbad, CA)인데, 통상의 PCR 조건 하에서 반응 용액을 94℃까지 가열하는 것에 의하여 분리되는 항체와 컨주게이션되어 있다. 주형 핵산의 존재 하에서, 이 프라이머 쌍은 153 bp 산물을 생산할 것이다. OPCRar 동안에 <110 bp 프라이머 다이머의 형성을 감소시키는 것에 있어, 이 핫-스타트 제조물이 통상의 Taq 보다 더 좋은 것은 아니라는 것이 명백할 것이다. OPCRar 반응에서 사용되는 긴 프라이머가 갖는 하나의 문제점은, 프라이머 다이머(dimer)로 알려진 원치 않은 비특이적인 증폭 산물을 생산하기 더 쉬운 경향이 있다는 점이다. 프라이머 다이머는 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단이, 증폭 반응 시점의 초기 온도 증가 동안에 서로 간에 일시적으로 결합할 때 형성된다. 이러한 중요한 기간 동안에, DNA 폴리머라제는, 특히 만일 시작 주형 핵산의 농도가 매우 낮은 경우에, 열 사이클 동안 특이적 표적 증폭과 경쟁하는 생산물을 야기하면서 이러한 일시적 복합체를 신장할 수 있다. PCR 동안에 프라이머 다이머 형성을 감소시키기 위하여 흔히 채택되는 기술은 소위 '핫-스타트' DNA 폴리머라제를 사용하는 것이다. 상업적으로 이용가능한 이들 효소는 항체와 같은 억제 분자에 비 공유결합성으로 결합되어 있다. 반응 온도가 90℃를 넘는 때에, 억제 분자는 분리되어 폴리머라제가 정상적으로 기능할 수 있도록 놓아준다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명자들의 수중에서 핫-스타트 효소인 플래티늄 Taq DNA 폴리머라제(Invitrogen, Carlsbad, CA)는 프라이머 다이머 증폭의 양을 눈에 띄게 감소시키지 못하였는데, 이는 흔하게 사용되는 기법이 OPCRar에는 충분하지 않다는 사실을 나타내며, 이는 통상적인 PCR 절차에서는 전형적으로 발생하지 않는 동형 및 이형 다이머의 일시적인 동적 충돌로부터 기인하는 다이머 형성을 가능하게 할 정도로 OPCRar 과정이 전통적인 PCR 보다 훨씬 더 효과적인 증폭 과정이라는 것을 나타낸다.
[00104] 이제 도 6을 보면, 본 발명의 일 구현예에 따라, OPCRar 동안에 GC 및 AT 클램프의 프라이머 다이머의 형성에 대한 효과를 보여주는 겔이 제시되어 있다. 시작 주형의 부존재 하에서, C. 리베리박터 아시아티쿠스의 신장 인자를 증폭하기 위하여 디자인된 프라이머(3.5 ng/μL)를 사용하여 프라이머 다이머 형성의 경향을 결정하였다. 주형의 존재 하에서, 다양한 프라이머 세트에 대한 생산물의 크기는 140-155 bp 사이 범위일 것이다. 프라이머 서열은 회색의 AT 또는 GC 클램프와 함께 오른쪽에서 볼 수 있다. '모드(mod)' 프라이머 세트에 대하여, 각각의 프라이머는 주형(밑줄)에 대하여 비상동성인 염기를 포함하는데, 이는 제2의 프라이머와의 상동성을 높인다. 모든 반응은 15% DMSO의 존재 하에서, VentR(엑소-) DNA 폴리머라제, Et SSB를 사용하여 수행하였다. 용액을 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음에 80℃에서 15초 및 65℃에서 15초 사이를 왕복하는 30회 또는 40회의 사이클을 수행하였다. 증폭된 산물은 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에 시각화하였다. 명확하게 관찰된 바와 같이, GC 클램프 세트는 현저한 프라이머 다이머 형성을 야기한 반면에, AT 클램프 프라이머는 프라이머 다이머 형성을 야기하지 않았다.
[00105] 잠재적인 프라이머 다이머 형성을 최소화하기 위하여, OPCRar 프라이머는통상적인 PCR 프라이머를 발생시키기 위하여 사용하는 것과 다른 수개의 전략을 채택하여 디자인 될 수 있다. 첫째로, PCR 프라이머는 일반적으로 'GC 클램프'라고 불리우는 GC가 풍부한 3' 말단을 갖는데, 이는 표적 서열에의 현저하게 특이적인 결합을 야기한다. 그러나 OPCRar 프라이머에서는, 프라이머의 3' 영역의 높은 GC 함량이 더 큰 프라이머 다이머 형성을 야기하는 것으로 관찰되었고, 따라서 OPCRar 프라이머는 이러한 원하지 않는 증폭 산물을 야기하는 3'-3' 프라이머 상호작용의 친화도를 에너지적으로 줄이기 위하여 AT가 풍부한 3' 영역을 포함하도록 만들어진다(도 6). OPCRar 프라이머 디자인을 위한 두 번째 전략은 적어도 5개의 연속적인 뉴클레오타이드의 상보적인 5' 또는 내부 서열을 포함하는 프라이머를 디자인하는 것이다. 이러한 방법으로 디자인된 올리고뉴클레오타이드는, 반응 온도 중 초기의 증가 동안에 임의의 프라이머 혼성화를, 폴리머라제 신장에 대하여 경쟁적이지 않은 듀플렉스 구조 쪽으로 조정할 것이다. 만일 적절한 상보적 서열이 표적 핵산 서열 중에서 발견될 수 없다면, 비-상동성 또는 변이된 염기가 OPCRar 프라이머 내에 그들을 발생시키기 위하여 사용될 수 있다. OPCRar 프라이머의 예외적인 길이는, 증폭 반응의 초기 사이클 동안에 프라이머와 표적 간의 최소한의 잘못 짝지음을 극복한다. 프라이머 세트는 다음과 같다:
EU _ AT
정방향
GTTCTTGTAG CGTTGCAGTC TTCTGCGGAA GATAAGGAAT TGCTTT (SEQ ID NO 21)
역방향
GGGCACGTTT ATTAGCAACA ATAGAAGGAT CAAGCATCTG CACAGAAAT (SEQ ID NO 22)
EU _ GC
정방향
CTTGTAGCGT TGCAGTCTTC TGCGGAAGAT AAGGAATTGC TTTCTGCG (SEQ ID NO 23)
역방향
CACGTTTATT AGCAACAATA GAAGGATCAA GCATCTGCAC AGAAATCACCG (SEQ ID NO 24)
EU - Atmod
정방향
GGTGTTCTTG TATCGTTGCA GTCTTCTGCG GAAGATAAGG AATTGCTTT (SEQ ID NO 25)
역방향
GTAATGGGCA CGTTTATTAG CAACGATAGA AGGATCAAGC AACTGCACAG AAAT (SEQ ID NO 26)
EU _ GCmod
정방향
CTTGTATCGT TGCAGTCTTC TGCGGAAGAT AAGGAATTGC TTTCTGCG (SEQ ID NO 27)
역방향
GGCACGTTTA TTAGCAACGA TAGAAGGATC AAGCATCTGC ACAGAAATCA CCG (SEQ ID NO 28)
[00106] OPCRar 프라이머는 아데닌 "A", 티민 "T", 구아닌 "G", 또는 시토신 "C"의 디옥시 리보뉴클레오타이드 염기 및/또는 A, C, 우라실 "U", G의 리보뉴클레오타이드 염기인 1 이상 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 게다가, OPCRar 프라이머는 1 이상의 변형된 디옥시 리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기를 포함할 수 있는데, 여기서 변형은 표적 핵산으로의 프라이머 혼상화, 폴리머라제에 의한 프라임 신장 또는 듀플렉스 핵산의 변성을 방해하지 않는다. OPCRar 프라이머는 메틸포스포네이트 또는 포스포로티오에이트와 같은 화학적 그룹으로, 비뉴클레오타이드 링커로, 바이오틴으로, 또는 카르복시플루오레신의 아민-반응성 플루오레신 에스테르아 같은 형광 표지로 변형될 수 있다. 이와 같은 변형은 프라이머 성능을 증진시키거나 또는 증폭 산물의 탐지 및 특성화를 촉진할 수 있다.
폴리머라제
[00107] OPCRar 중에, 프라이머가 단일 가닥 주형 핵산 영역에 혼성화 한 후에, 중합 과정이 일어난다. 만일 표적 핵산이 DNA인 경우, 이중 가닥 산물을 형성하기 위하여 4가지 dNTP 뉴클레오타이드 염기의 존재 하에서 핵산 주형을 따라 혼성화 된 프라이머를 신장시키기 위하여 표적 상에 작용하는 DNA 폴리머라제가 선택되는데, 여기서 새롭게 합성된 가닥은 주형의 뉴클레오타이드 서열과 상보적이다(도 1). 만일 초기 타겟이 RNA인 경우에, 역전사 효소가 우선 사용되어 RNA 주형을 cDNA 분자로 복사하고, 이는 OPCRar 중에 DNA 폴리머라제에 의하여 더 증폭된다.
[00108] 다양한 DNA 폴리머라제가 특히 비안정화 제제 및 알코올의 존재하에서 열안정성 및 진행성에 근거하여 OPCRar를 위하여 선택될 수 있다(도 2). 비록 요구되지 않더라도, 가닥 대체 활성을 나타니고, 엑소뉴클레아제 활성을 결여한 폴리머라제가 OPCRar 반응을 현저하게 개선하는 것으로 발견된다(도 2). 적절한 DNA 폴리머라제의 예로는 Taq 폴리머라제, KlenTaq DNA 폴리머라제(AB Peptides, (St Louis, MO)), Bst DNA 폴리머라제 큰 단편(New England Biolabs, Beverly, MA), VentR 또는 VentR (엑소-)(New England BioLabs), DeepVentR 또는 DeepVentR (엑소-)(New England BioLabs) 및 유사한 효소들을 포함한다. 적절한 열안정성 역전사 효소로는 수퍼스크립트 II(Invitrogen, Carlsbad, CA), 수퍼스크립트 III(Invitrogen) 및 유사한 효소들이 포함된다. 출간된 통상적인 PCR 증폭 폴리머라제 혼합물은, OPCRar 증폭의 특유의 강건한 요구조건으로 인하여 OPCRar를 수행하는데 실패한다는 것을 주목하여야 한다. 모든 선택된 폴리머라제 및 생시약 요소들은 사용에 앞서 주의 깊게 평가되고 실험적으로 시험되어야 한다.
단일 가닥 결합 단백질
[00109] OPCRar 시스템은 좋기로는 용융 및 어닐링 열적 사이클 단계 사이에 온도차이를 최소화하는데, 여기서 이 온도 차이는 만일 핵산 듀플렉스의 완전한 변성이 필수적이지 않다면 가장 낮게 된다. 가닥-대체 DNA폴라머라제가 이와 관련하여 도움이 되는 반면에, 액세서리 단백질들은 효율적인 증폭을 위하여 열적 요구사항을 더욱 낮추기 위해 사용될 수 있다. 단일 가닥 결합 단백질(SSBs)은 이중 가닥 듀플렉스 형성의 어닐링을 방지하기 위하여 단일 가닥 핵산을 안정화하는 것으로 알려져 있으며, 핵산 증폭 반응의 효율을 증가시키는 것으로 보여져 왔다. 열 안정성 SSB를 본 발명에 따른 OPCRar 방법에 첨가하는 것은 증가된 활성을 야기하는 것으로 발견되었다(도 7). 비록 SSB의 선택이 특정 단백질에 한정되지 아니하고, 열친화성 생물로부터 분리하고 클로닝한 SSB 또는 비열안정성 전구체 SSB로부터 조작한 SSB를 포함할 수 있음에도 불구하고, 예로서, Et SSB(BioHelix Corporation, Beverly, MA)가 있다.
[00110] 이제 도 7을 보면, 본 발명의 일 구현예에 따른 OPCRar 산물 형성에 대한 단일 가닥 결합 단백질의 효과를 보여주는 겔이 제시되어 있다. 일반적인 인플루엔자 A 단일 가닥 DNA 주형(1E6 카피/μL, Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA)을 OPCRar 프라이머 FP3 및 RP3을 사용하여 증폭하여, 133 bp 산물을 생성시키고, 이를 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하여 시각화하였다. 본 발명의 하나의 구현예에 따른 OPCRar을 열안정성 SSB의 존재 또는 부존재 하에서 다음의 조건에서 수행하였다: i) 15% DMSO; ii) 15% DMSO, 5% 글리세롤; iii) 15% DMSO, 0.25 M 베타인. 모든 반응에 대하여 사용한 사이클링 파라미터는 75℃에서 15초 및 65℃에서 15초이었고, 45회 반복하였다.
[00111] OPCRar 용액의 초기 가열 중 프라이머 다이머 형성을 감소시키기 위하여, OPCRar를 돕는 열안정성 SSBs에 더하여, T4 박테리오파지 SSB (New England BioLabs)와 같은 비-열안정성 SSBs를 사용할 수도 있다(도 8). T4 유전자 32 단백질의 몰 과다의 존재 하에서 OPCRar 프라이머를 예비 배양하고, 그 다음 그들을 반응 혼합물에 첨가하는 것에 의하여, OPCRar 동안에 원치 않는 프라이머 다이머의 증폭이 최소화되는 것으로 관찰되었다. 이들 SSBs는 3'-3' 짝지음 및 그에 따른 프라이머 다이머의 형성의 잠재성을 감소시키면서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 결합하는 것으로 가정된다. 용액을 65℃ 넘게 가열하면, T4 SSB는 변성되어 열 사이클 동안 정상적인 반응성을 위하여 프라이머를 방출한다. 도 8을 이제 보면, 겔은 프라이머와 T4 유전자 32 단백질과의 예비 배양을 사용한 본 발명의 일 구현예 동안에 형성된 프라이머-다이머의 양의 감소를 보여준다. 반응 혼합물의 첨가 전에, OPCRar 프라이머는 1X 서모폴(ThermoPol) 완충액 (New England BioLabs, Beverly,MA)의 존재 하 25℃에서 5분간, T4 유전자 32 단백질 (T4 SSB)의 활성 단위의 지시된 화학양론적 과다와 함께 배양되었다. 합성의 일반적인 플루 A DNA 주형(1E6 카피/μL, Biosearch Technologies, Inc.)은 프라이머 FP3 및 RP3를 사용하여 증폭하여, 133 bp 서열 산물을 생성시켰다. 반응을 85℃에서 2분간 수행하고, 그 다음 75℃에서 15초 및 65℃에서 15초의 50회 사이클을 수행하였다. 반응 산물을 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하여 시각화하였다. 도 7에 기술된 실험을 다른 날, 다른 연구자에 의하여 반복하여, 데이터의 재생산성을 산정하고 이를 도 8에 나타내었다. 프라이머를 T4 SSB와 예비 배양하는 것은, 예비 배양을 하지 않은 경우(제일 오른쪽 레인)와 비교하여, 증폭된 산물의 양을 늘릴 뿐만 아니라, 프라이머 다이머 밴드(~100 bp)의 강도를 감소시키는 것이 명백하게 관찰되었다.
[00112] OPCRar 기법은 "핵산 탐지 및 동정을 위한 통합된 장치(Integrated Device for Nucleic Acid Detection and Identification)"라는 제목으로 본건과 동일한 날에 출원된 일반적으로 소유된 가특허출원에 기술된 바와 같은 장치에 사용되기에 특히 매우 적합하다. 그 장치의 특정 구현예의 모습은 용액이 동일한 챔버 내에 유지되는 동안에 용액 온도가 신속하게 사이클링되는 것을 가능하게 하며, 좋기로는 능동적인 냉각은 없다. 예를 들어, 온도는 20초 이하 이내에, 더 좋기로는 15초 이하, 또는 더 좋기로는 8초 이하, 또는 더 좋기로는 4초 이하 이내에, OPCRar를 수행하기에 충분하게 증가되거나 또는 감소될 수 있다. 따라서, OPCRar 온도 사이클은 심지어 8초보다도 더 빠른, 소량의 시간 이내에 수행될 수 있다.
실시예 1: OPCRar 에 의한 DNA 표적 듀플렉스의 증폭 방법
[00113] OPCRar이 이중사 DNA 분석체 중에 존재하는 특이적인 표적 서열을 증폭할 수 있는 능력이 있음을 기술하기 위하여, 본 발명자들은 2개의 OPCRar 프라이머, 프라이머 HLB (Huang Long Bing) ForSh 및 프라이머 HLBRevSh를 사용하여, C. 리베리박터 아시아티쿠스(Liberibacter asiaticus) 신장 인자 유전자의 PCR-증폭되는 단편으로부터 OPCRar 시스템에 의하여 140 bp 서열을 발생시켰다. OPCRar 완충액(10X)을 미리 만들어놓고, 400 mM Tris-HCl(pH 8.4), 10 mM 암모늄 설페이트, 100 mM 염화칼륨 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함시켰다. 다음을 혼합하여 OPCRar 용액 20 μL를 마련하였다:
8.4 μL 물
2.0 μL 10x OPCRar 완충액
3.0 μL DMSO
0.4 μL 염화칼륨(2 M)
0.5 μL 염화마그네슘(100 mM)
0.5 μL 디티오트레이톨(100 mM)
0.5 μL dNTPs (10 mM)
2.0 μL 프라이머 세트 HLBForSh 및 HLBRevSh (각각 4 μM)
0.5 μL VentR (엑소-) DNA 폴리머라제 (2 U/μL)
0.2 μL Et SSB, 극도의 열안정성 단일 가닥 결합 단백질 (500 ㎍/mL)
2.0 μL PCR 산물 희석액(시작 농도 0.6 내지 0.0006 ng/μL)
[00114] 반응은 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 80℃에서 3초 및 65℃에서 5초 사이를 반복하면서 40회 사이클을 수행하였다. 반응이 완결된 후에 OPCRar 산물 5 μL를 6X 시료 로딩 완충액(New England BioLabs) 2 μL 및 포름아마이드 1 μL와 혼합하고, 12% 아크릴아미드 겔에 걸고, 에티디움 브로마이드로 시각화하였다. 보여진 모든 희석액으로부터 140 bp 산물이 명확하게 관찰되었으며, 이는 OPCRar 표적 서열의 예상된 길이와 일치하였다(도 9).
[00115] 이제 도 9를 보면, 본 발명의 일 구현예에 따른 이중사 DNA 중에 존재하는 특이적 표적 서열의 증폭이 겔에 나타나있다. C. 리베리박터 아시아티쿠스(Liberibacter asiaticus) 신장 인자 유전자(0.6 내지 0.0006 ng/μL)의 PCR-증폭된 단편의 일련의 희석을 시작 주형으로서 사용하였다. 140 bp 서열을 발생시키기 위하여, 15% DMSO의 존재 하에 VentR(엑소-) DNA 폴리머라제, Et SSB 및 프라이머 HLBForSh 및 HLBRevSh를 사용하여 반응을 수행하였다. 반응은 주형을 변성시키기 위하여 85℃에서 2분간 가열하고, 그 다음 80℃에서 5초 및 65℃에서 5초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에서 OPCRar 산물을 시각화하였다. 표적 서열의 예상 길이와 매칭되는 140 bp 산물은 보여진 모든 희석액에서 명확하게 관찰되었다.
실시예 2: OPCRar 에 의한 단일 가닥 DNA 표적의 증폭 방법
[00116] OPCRar이 단일 가닥 DNA 주형으로부터 특정 표적 서열을 증폭할 수 있음을 기술하기 위하여, 본 발명자들은 OPCRar 프라이머 FP3 및 RP4를 사용하여, 상업적으로 이용가능한 유니버설 인플루엔자 A 주형(Biosearch Technologies,Inc.)으로부터 OPCRar 시스템에 의하여 153 bp 서열을 발생시켰다. 10xOPCRar 완충액은 400 mM 트리스-HCl (pH 8.4), 10 mM 암모늄 설페이트, 100 mM 염화칼륨 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함한다. 다음을 혼합하는 것에 의하여 OPCRar 용액 20 μL를 준비하였다:
8.4 μL 물
2.0 μL 10x OPCRar 완충액
3.0 μL DMSO
0.4 μL 염화칼륨(2 M)
0.5 μL 염화마그네슘(100 mM)
0.5 μL 디티오트레이톨(100 mM)
0.5 μL dNTPs(10 mM)
2.0 μL 프라이머 세트 FP3 및 RP4 (각각 8 μM)
0.5 μL VentR (엑소-) DNA 폴리머라제(2 U/μL)
0.2 μL Et SSB, 극도의 열안정성 단일 가닥 결합 단백질(500 ㎍/mL)
2.0 μL 단일 가닥 DNA 주형(1E9 내지 1E2 카피/μL).
[00117] 민감성 비교로서, 상기 OPCRar들에 사용된 것과 동일한 주형 농도를 사용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 10x 서모폴(ThermoPol; New England BioLabs)은 200 mM 트리스-HCl(pH 8.8), 100 mM 암모늄 설페이트, 100 mM 염화칼륨, 20 mM 마그네슘 설페이트 및 1% 트리톤 X-100를 포함한다. 다음을 조합하는 것에 의하여 RT-PCR 용액 15 μL를 준비하였다:
9.7 μL 물
1.5 μL 10x 서모폴(ThermoPol) 완충액
0.4 μL dNTPs(10 mM)
1.5 μL 프라이머 세트 UniAfCDC/UniArCDC(각각 4 μM), TaqMan 프로브 UniApCDC (1 μM)을 포함함.
0.4 μL Taq 폴리머라제(5 U/μL)
1.5 μL 단일 가닥 DNA 주형(1E9 내지 1E2 카피/μL)
[00118] 15% DMSO의 존재 하 OPCRar에 의하여, 그리고 TaqMan 프로브를 사용한 실시간 PCR에 의하여,1E9 내지 1E2 카피/μL 사이의 유니버설 인플루엔자 A 단일 가닥 DNA 주형의 일련의 희석액을 증폭하였다. OPCRar 반응은 우선 85℃로 2분 동안 가열하고, 그 다음 80℃ 15초 및 65℃ 15초간 40회 반복되는 사이클을 수행하였다. RT-PCR 반응은 95℃로 2분 동안 가열하고, 그 다음 95℃ 10초 및 58℃ 40초 사이의 45회 사이클을 수행하였다. 반응이 완결된 후에, OPCRar 산물 5 μL를 6X 시료 로딩 완충액 (New England BioLabs) 2 μL 및 포름아미드 1 μL와 혼합하고, 12% 아크릴아미드 겔에 걸고 에티디움 브로마이드로 시각화하였다. 모든 시료에 대하여 153 bp 산물이 명확하게 관찰되었으며(도 10), OPCRar 표적 서열의 예상 길이와 일치하였다.
[00119] 이제 도 10을 보면, 본 발명의 일 구현예에 따라 증폭된 단일 가닥 DNA 주형 내 존재하는 표적 서열을 보여주는 겔이 존재한다. 유니버설 인플루엔자 A 단일 가닥 DNA 주형(1E9 내지 1E2 카피/μL, Biosearch Technologies, Inc.)의 일련의 희석을, 15% DMSO 존재 하에서 프라이머 FP3 및 RP4를 사용하는 OPCRar에 의하여 증폭시키어, 153 bp 산물을 발생시키었는데, 이는 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에 전기영동에 의하여 시각화되었다(왼쪽 패널), 비교로서, 프라이머 세트 UniAfCDC/UniArCDC 및 TaqMan 프로브 UniApCDC를 사용하는 실시간 PCR을 위한 시작 주형으로서 동일한 희석을 사용하였다(오른쪽 패널). OPCRar 반응은 우선 85 ℃로 2분간 가열하고, 그 다음 80℃에서 15초 및 65℃에서 15초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. RT-PCR 반응은 95℃로 2분간 가열한 다음, 95℃에서 10초 및 58℃에서 40초를 왕복하는 45회 사이클을 수행하였다. OPCRar는 적절히 최적화한 경우 통상적인 PCR 반응과 유사한 민감성을 가지는 것이 명백하다.
실시예 3: OPCRar 에 의하여 플라스미드 DNA 상에 존재하는 특이적 서열을 증폭하는 방법
[00120] OPCRar이 이중사 플라스미드 DNA 내에 존재하는 특이적 표적 서열을 증폭할 수 있다는 것을 기술하기 위하여, 본 발명자들은 2개의 OPCRar 프라이머인, 프라이머 hyvl_For 및 프라이머 hyvl_Rev를 사용하여 OPCRar 시스템에 의하여 C. 리베리박터 아시아티쿠스(Liberibacter asiaticus) hyvl 유전자를 포함하는 플라스미드로부터 139 bp 서열을 발생시켰다. OPCRar 완충액(10X)을 미리 만들고 400 mM 트리스-HCl(pH 8.4), 10 mM 암모늄 설페이트, 100 mM 염화칼륨 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하게 하였다. 다음을 혼합하는 것에 의하여, OPCRar 용액 20 μL를 준비하였다:
9.4 μL 물
2.0 μL 10x OPCRar 완충액
2.0 μL DMSO
0.4 μL 염화칼륨(2 M)
0.5 μL 염화마그네슘(100 mM)
0.5 μL 디티오트레이톨(100 mM)
0.5 μL dNTPs(10 mM)
2.0 μL 프라이머 세트 hyvl_For 및 hyvl_Rev (각각 8 μM)
0.5 μL VentR(엑소-) DNA 폴리머라제(2 U/μL)
0.2 μL Et SSB, 극도의 열안정성 단일 가닥 결합 단백질(500 ㎍/mL)
2.0 μL C. 리베리박터 감염된 건강한 조직으로부터 추출한 건강한 DNA(17.2 ng/μL)
[00121] DMSO를 사용한 적정을 13-8% v/v로부터 수행하였다. 반응은 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 80℃에서 10초 및 65℃에서 10초간을 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. 반응이 완결된 후에 OPCRar 산물 5 μL를 6X 시료 로딩 완충액(New England BioLabs) 2 μL 및 포름아미드 1 μL와 혼합하고, 12% 아크릴아미드 겔에 걸고, 에티닐 브로마이드로 시각화하였다. 모든 시료에 대하여 139 bp 산물이 명확하게 관찰되었으며(도 11), 이는 OPCRar 표적 서열의 예상된 길이와 일치하였다.
[00122] 도 11을 이제 참조해보면, 본 발명의 하나의 구현예에 따라 증폭된 플라스미드 DNA 중에 존재하는 특이적 표적 서열의 겔이 존재한다. C. 리베리박터 아시아티쿠스(Liberibacter asiaticus) hyvl 유전자(17.2 ng/μL)를 포함하는 플라스미드를 시작 주형으로 사용하고, DMSO의 농도는 13-8% v/v에서부터 적정하였다. 모든 반응은 VentR(엑소-) DNA 폴리머라제, Et SSB 및 프라이머 hyvl_For 및 hyvl_Rev를 사용하여 수행하였다. 반응은 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 80℃에서 10초 및 65℃에서 10초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에서 OPCRar 산물을 시각화하였다. 표적 서열의 예상된 길이와 일치하는 139 bp 산물이 시험된 모든 DMSO 농도에서 명확하게 관찰되었다.
실시예 4: 코의 대기음 중에 존재하는 인간 병원성 바이러스의 OPCRar 에 의 한 RNA 표적 서열의 증폭 방법
[00123] OPCRar가 단일 가닥 RNA 주형에 존재하는 특이적 표적 서열의 증폭을 할 수 있다는 것을 기술하기 위하여, 본 발명자들은 OPCRar 프라이머 쌍인 FP3 및 RP4를 사용하여, 인플루엔자 A 바이러스로 감염되거나 또는 감염되지 않은 임상적인 코의 대기음으로부터 분리된 리보핵산으로부터 153 bp 서열을 발생시켰다. OPCRar 완충액(10X)을 미리 제조하고, 400 mM 트리스-HCl (pH 8.4), 10 mM 암모늄 설페이트, 100 mM 염화칼륨 및 0.25% 트리톤 X-100를 포함하게 하였다. 다음을 조합하는 것에 의하여 OPCRar 용액 20 μL를 제조하였다:
9.3 μL 물
2.0 μL 10x OPCRar 완충액
3.0 μL DMSO
0.4 μL 염화칼륨(2 M)
0.5 μL 염화마그네슘(100 mM)
0.5 μL 디티오트레이톨(100 mM)
0.5 μL dNTPs(10 mM)
2.0 μL 프라이머 세트 FP3 및 RP4(각각 8 μM)
0.5 μL VentR (엑소-) DNA 폴리머라제(2 U/μL)
0.2 μL Et SSB, 극도로 열안정성인 단일 가닥 결합 단백질(500 ㎍/mL)
0.1 μL 수퍼스크립트 III 역전사 효소(200 U/μL)
2.0 μL 12% 임상적 코 대기음으로부터 분리된 핵산(0.3 ng/μL)
[00124] 반응은 cDNA 생성을 위하여 55℃에서 5분간 배양하고, 85℃로 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 80℃에서 10초 및 65℃에서 10초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. 반응이 완결된 후에, OPCRar 산물 5 μL를 6X 시료 로딩 완충액(New England BioLabs) 2 μL 및 포름아미드 1 μL와 혼합하고, 12% 아크릴아미드 겔에 걸고, 에티디움 브로마이드로 시각화하였다. 양성 임상 시료에서는 153 bp 산물이 명확하게 관찰되었으나, 음성 임상 시료에서는 발견되지 않았으며(도 12), 이는 OPCRar 표적 서열의 예상된 길이와 일치하였다.
[00125] 이제 도 12를 참조해보면, 본 발명의 하나의 구현예에 따라 증폭된 단일 가닥 RNA 중에 존재하는 특이적 표적 서열을 기술하는 겔이 나타나있다. 인플루엔자 A 바이러스로 감염되거나 또는 감염되지 않은 코의 대기음으로부터 분리된 리보핵산(0.3 ng/μL)을 주형으로서 사용하였다. 모든 반응은 15% DMSO 존재 하에서, 수퍼스크립트 III 역전사 효소, VentR(exo-) DNA 폴리머라제, Et SSB 및 프라이머 FP3 및 RP4를 사용하여 수행되었다. 반응은 cDNA 생산을 위하여 55℃에서 5분간 배양하고, 85℃로 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 80℃에서 10초 및 65℃에서 10초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. OPCRar 산물은 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에서 시각화하였다. 양성 임상 시료에서는 표적 서열의 예상된 길이와 일치하는 153 bp 산물이 명백하게 관찰되었지만, 음성 시료에서는 관칠되지 않았다.
실시예 5: OPCRar 에 의한 병원성 식물 박테리아로부터 유래한 표적 서열의 증폭 방법
[00126] OPCRar이 병원성 박테리아 게놈 중에 존재하는 특이적 표적 서열을 증폭할 수 있다는 것을 기술하기 위하여, 본 발명자들은 OPCRar 프라이머 쌍, EU523377-F-57 및 EU523377-R-56를 사용하여, 감염된 식물 조직으로부터 분리한 총 핵산으로부터, 리베리박터 아시아티쿠스(Liberibacter asiaticus) 신장 인자 유전자의 213 bp 단편을 발생시켰다. OPCRar 완충액(10X)을 미리 준비하고 400 mM 트리스-HCl(pH 8.4), 10 mM 암모늄 설페이트, 100 mM 염화칼륨 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하게 하였다. 다음을 조합하는 것에 의하여 OPCRar 용액 20 μL를 준비하였다:
8.4 μL 물
2.0 μL 10x OPCRar 완충액
3.0 μL DMSO
0.4 μL 염화칼륨(2 M)
0.5 μL 염화마그네슘(100 mM)
0.5 μL 디티오트레이톨(100 mM)
0.5 μL dNTPs(10 mM)
2.0 μL 프라이머 세트 EU523377-F-57 및 EU523377-R-56(각각 4 μM), 프라이머 EU523377-F-57는 바이오티닐화(5')되거나 또는 비-바이오티닐화된 것임
0.5 μL VentR (엑소-) DNA 폴리머라제(2 U/μL)
0.2 μL Et SSB, 극도로 열안정성인 단일 가닥 결합 단백질(500 ㎍/mL)
2.0 μL 리베리박터 아시아티쿠스(Liberibacter asiaticus) 감염된 식물 조직으로부터 분리한 총 핵산(1.1 ng/μL)
[00127] 프라이머 변형이 OPCRar와 양립가능하다는 것을 기술하기 위하여, 몇몇 반응에서 정방향 프라이머 EU523377-F-57의 5' 말단을 바이오티닐화하였다. OPCRar 용액을 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시킨 다음에 80℃에서 15초 및 65℃에서 15초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. 반응이 완결된 후에, OPCRar 산물의 5 μL를 6X 시료 로딩 완충액 (New England BioLabs) 2 μL 및 포름아미드 1 μL와 혼합하고, 12% 아크릴아미드 겔 상에 걸고, 에티디움 브로마이드로 시각화하였다. 213 bp 산물이 모든 시료에서 명확하게 관찰되었고, OPCRar 표적 서열의 예상되는 길이와 일치하였다(도 13).
*[00128] 이제 도 13을 참고하면, 본 발명의 하나의 구현예에 따라 증폭된 박테리아 게놈 DNA 중에 존재하는 특이적 표적 서열의 겔이 나타나있다. C. 리베리박터 아시아티쿠스(Liberibacter asiaticus)-감염된 잎 조직으로부터 분리된 총 핵산(1.1 ng/μL)를 시작 주형으로 사용하였다. 모든 반응은 15% DMSO 존재 하에서, VentR(exo-) DNA 폴리머라제, Et SSB, 및 프라이머 EU523377-F-57 및 EU523377-R-56을 사용하여 수행하였다. 프라이머 EU523377-F-57는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 바이오티닐화하거나 또는 비변형된 것이었다. OPCRar 용액을 85℃에서 2분 동안 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음에 80℃에서 15초 및 65℃에서 15초 사이를 왕복하는 40 사이클을 수행하였다. 증폭된 산물을 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에 시각화하였다. 모든 양성 시료에 대하여, OPCRar 표적 서열의 예상되는 길이와 일치하면서 213 bp 산물이 명확하게 관찰되었으며, 음성 시료에서는 관찰되지 아니하였다.
실시예 6: 세포기관 DNA 상의 특이적 서열의 증폭 방법
[00129] OPCRar이 세포기관 DNA 내 존재하는 특이적 표적 서열을 증폭할 수 있는 능력이 있음을 기술하기 위하여, 엽록체 DNA의 경우, 본 발명자들은 OPCRar 프라이머 쌍, rbcL_For 및 rbcL_Rev를 사용하여, C. 리베리박터 아시아티쿠스(Liberibacter asiaticus)로 감염시키거나 또는 감염시키지 않은 식물 조직으로부터 분리한 총 핵산으로부터 식물 rbcL 유전자의 137 bp 단편을 발생시켰다. OPCRar 완충액(10X)을 미리 만들고, 400 mM 트리스-HCl(pH 8.4), 10 mM 암모늄 설페이트, 100 mM 염화칼륨 및 0.25% 트리톤 X-100을 포함하게 하였다. 다음을 조합하는 것에 의하여 OPCRar 용액 20 μL를 준비하였다:
8.4 μL 물
2.0 μL 10x OPCRar 완충액
3.0 μL DMSO
0.4 μL 염화칼륨(2 M)
0.5 μL 염화마그네슘 (100 mM)
0.5 μL 디티오트레이톨 (100 mM)
0.5 μL dNTPs (10 mM)
2.0 μL 프라이머 세트 rbcL_For 및 rbcL_Rev (각각 2 또는 4 μM)
0.5 μL VentR (엑소-) DNA 폴리머라제 (2 U/μL)
0.2 μL Et SSB, 극도의 열안정성 단일 가닥 결합 단백질 (500 ㎍/mL)
2.0 μL 잎 조직으로부터 분리한 총 핵산 (3.3 ng/μL)
[00130] rbcL 유전자 단편을 효과적으로 증폭시키기 위하여 필요한 프라이머 농도의 임계치를 결정하기 위하여, 2개의 다른 농도의 프라이머 쌍 rbcL_For 및 rbcL_Rev을 사용하였다. 반응은 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 76℃에서 10초 및 60℃에서 10초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. 반응이 완결된 후에, OPCRar 산물 5 μL을 6X 시료 로딩 완충액(New England BioLabs) 2 μL 및 포름아미드 1 μL와 혼합하고, 12% 아크릴아미드 겔에 걸고, 에티디움 브로마이드로 시각화하였다. 감염된 시료 및 비감염된 시료 모두에서 137 bp 산물이 명확하게 관찰되었고, 이는 OPCRar 표적 서열의 예상된 길이와 일치하였다(도 14).
[00131] 이제 도 14를 보면, 본 발명의 일 구현예에 따른 엽록체 DNA 내에 존재하는 특이적 표적 서열의 증폭이 겔 내에 존재한다. C.리베리박터 아시아티쿠스-감염된(i) 또는 비감염된(ii) 잎 조직으로부터 분리한 총 핵산(3.3 ng/μL) 를 시작 주형으로 사용하였다. 모든 반응은 10% DMSO 존재 하에서 VentR(엑소-) DNA 폴리머라제, Et SSB 및 프라이머 rbcL_For 및 rbcL_Rev를 사용하여 수행하였다. OPCRar 용액을 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 76℃에서 10초 및 60℃에서 10초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. 증폭된 산물을 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에 시각화하였다.K 모든 양성 시료에 대하여 137 bp 산물이 명확하게 관찰되었으며, 이는 OPCRar 표적 서열의 예상된 길이와 일치하였다.
실시예 7: OPCRar 에 의한 표적 서열 및 양성 대조군의 복합 증폭 방법
[00132] OPCRar이 다수의 특정 표적 서열을 증폭할 수 있음을 기술하기 위하여, 본 발명자들은 OPCRar 프라이머 쌍인 hyvl_For/hyvl_Rev 및 rbcL_For/rbcL_Rev를 사용하여, C. 리베리박터 아시아티쿠스로 감염시킨 식물 조직으로부터 추출한 핵산을 증폭하였다. 이러한 프라이머 세트는 각각 139 및 137 bp 산물을 발생시킨다. OPCRar 완충액 (10X)을 미리 만들고, 400 mM 트리스-HCl(pH 8.4), 10 mM 암모늄 설페이트, 100 mM 염화칼륨 및 0.25% 트리톤 X-100를 포함하게 하였다. 다음을 조합하는 것에 의하여 20 μL OPCRar 용액을 준비하였다:
6.4 μL 물
2.0 μL 10x OPCRar 완충액
3.0 μL DMSO
0.4 μL 염화칼륨(2 M)
0.5 μL 염화마그네슘(100 mM)
0.5 μL 디티오트레이톨(100 mM)
0.5 μL dNTPs(10 mM)
2.0 μL 프라이머 세트 rbcL_For 및 rbcL_Rev(각각 2 또는 3 μM)
2.0 μL 프라이머 세트 hyvl_For 및 hyvl_Rev(각각 8 μM)
0.5 μL VentR (엑소-) DNA 폴리머라제(2 U/μL)
0.2 μL Et SSB, 극도의 열안정성 단일 가닥 결합 단백질(500 ㎍/mL)
2.0 μL 잎 조직으로부터 분리한 총 핵산(3.3 ng/ μL)
[00133] hyvl 유전자 단편에 대하여 특이적인 800 nM 프라이머의 존재 하에서, rbcL gene유전자 단편을 효율적으로 증폭하기 위하여 필요한 프라이머 농도의 임계치를 결정하기 위하여, 2개의 다른 농도의 프라이머 쌍 rbcL_For 및 rbcL_Rev을 사용하였다. 반응은 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 76℃에서 10초 및 60℃에서 10초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. 반응이 완결된 후에, OPCRar 산물 5 μL를 6X 시료 로딩 완충액(New England BioLabs) 2 μL 및 포름아미드 1 μL와 혼합하고, 12% 아크릴아미드 겔에 걸고, 에티디움 브로마이드로 시각화하였다. OPCRar 표적 서열의 예상되는 길이와 일치하면서, 139 bp 및 137 bp 산물 모두가 명확하게 관찰되었다. 명확성을 위하여, 두 프라이머 쌍 단독(실시예 3 및 6)을 사용하여 발생시킨 OPCRar 산물을 복합 반응과 나란히 걸었다(도 15).
[00134] 이제 도 15를 참조하여 보면, 본 발명의 일 구현예에 따른 2개의 표적 서열의 복합 증폭 산물을 나타내는 겔이 존재한다. C. 리베리박터 아시아티쿠스-감염된 잎 조직으로부터 분리한 총 핵산(3.3 ng/μL)을 시작 주형으로 사용하였다. 모든 반응은 10% DMSO의 존재 하에서, VentR(엑소-) DNA 폴리머라제, Et SSB 및 프라이머 세트 hyvl_For/hyvl_Rev 및 rbcL_For/rbcL_Rev를 지시된 농도로 사용하여 수행하였다. 복합 OPCRar 용액을 85℃에서 2분간 가열하여 주형을 변성시키고, 그 다음 76℃에서 10초 및 60℃에서 10초 사이를 왕복하는 40회 사이클을 수행하였다. 복합 산물을 에티디움 브로마이드로 염색한 12% 아크릴아미드 겔 상에 시각화하였다. 각 프라이머 세트 단독(도 11 및 15 참조)로부터 발생시킨 OPCRar 산물과 비교하였을 때, 139 및 137 bp 산물 모두가 명확하게 관찰되었다.
[00135] 이제 도 16을 참조하여 보면, 본 발명의 일 구현예에 따라 Et SSB의 존재 하 반응으로부터 유래한 증폭 산물이 나타나있다. SSB는 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하여 낮은 녹는점에서 증폭 효율을 향상시킨다. 본 발명자들은 특정의 녹는점에서 OPCRar의 수행을 돕는다는 것을 보이기 위하여, 극도의 열안정성 단일 가닥 결합 단백질인 "ET SSB"의 사용을 연구하였다. OPCRar 반응은 HLB 질병 유전자를 포함하는 정제된 잎 시료 DNA를 사용하여 HLB 병원균에 대하여 수행하였다. 주형은 C. 리베리박터 감염된 나무의 시트러스 잎으로부터 정제한 DNA이었다. 프라이머는 hyvl_For/ 및 hyvl_Rev이었다. 서모사이클러 조건은 다음과 같았다: 85℃에서 2분간 초기 용융, 그 다음 76℃ 또는 74℃에서 10초간 변성 및 60℃에서 10초간 어닐링의 40회 사이클. Et SSB 존재 하에서 지시된 결과는, 모든 분석된 온도 요법에서 C. 리베리박터 표적의 증폭을 야기하였다. ET SSB 단백질의 존재 및 ET SSB의 부존재 하에서, 비교 OPCRar 실험을 2회 수행하였다. 정확한 온도 조절을 구비한 표준 PCR 서모사이클러를 사용하여 SSB를 사용한 경우 및 사용하지 않은 경우 증폭 수행의 평가를 수행하였다. 결과는, 본 발명자들이 ET SSB의 존재 하에서 74℃에서 증폭된 HLB를 수확하였지만, ET SSB 없이는 관찰되지 않았음을 나타내었다.
[00136] 이제 도 17을 참고하여 보면, 본 발명의 일 구현예에 따라 hyvl_For 및 hyvl_Rev 프라이머와 감염된 나무의 잎으로부터 분리된 정제된 C. 리베리박터 DNA를 사용하여 수행된 OPCRar 반응의 겔 전기영동을 보여주고 있는데, 여기서 반응은 전형적인 PCR 서모사이클러 도 17A와 관련된 램핑 파라미터를 포함하지 않거나 또는 사이클링 온도 도 17B에 대한 램핑 시간을 포함하는 것이다. 여기서 사용되는 램핑이란 가열을 의미하는데, 예컨대 각각의 열적 사이클링에서, 어닐링 온도로부터 변성 온도로 증폭 반응 온도를 높이는 가열 과정을 램핑 업이라 부르거나 또는 변성 온도로부터 어닐링 온도로 냉각시키는 것을 램프 다운이라고 부른다. 모든 전통적인 PCR 사이클러 및 방법은 통제된 가열 디자인을 갖는데, 여기서 램핑 업은 약 > 3 도/초이고, 램핑 다운 속도는 약 >1 도/초이다. 램핑 시간은 전형적인 사이클링 프로파일 내에 포함되지 않는다. 변성, 어닐링 및 신장 단계 동안에 원하는 온도에 도달할 때까지 기구는 시간 카운팅을 시작하지 않는다. 예를 들어, 변성 시간이 90에서 10초라면, 기구는 90도에 도달할 때까지는 10초를 세는 것을 시작하지 않을 것이다. 이와 대조적으로, 본 발명의 시스템 및 방법은 예를 들어 80도에서 10초란 가열 과정이 시작되는 때(원하는 변성 온도에 도달할 때까지 기다리는 것이 아니라) , 시간 카운팅이 시작됨을 의미하도록 디자인된 저비용 히터 장치를 제공한다. 도 17 A: 본 발명자들은 저 비용, 열적 히터 엔진(능동적인 냉각 및 정확한 온도 통제 없음, > + 2 도 변동, (예컨대, 61/477,357에 개시된 시스템 및 장치 참조) 중에서 HLB 질병 (감귤 그린병 병원균, Huang Long Bing) 표적의 OPCRar 증폭을 시험하였다.
메사 테크 인터네셔널 인크(Mesa Tech International, Inc.)에 의하여 개발된 장치(MTI 장치) 또는 전통적인 PCR 서모사이클러(PCR 서모사이클러) 중에서, 마이크로프로세서 하의 마이크로 히터 반응 챔버 중에서 OPCRar 20 μL 반응을 수행하여, 온도를 변화시키라는 명령이 마이크로프로세서에 의하여 수행되는 즉시 시작하여 계산될 때 프로그램의 각 온도 부분에 대하여 10초의 유지시간이 계산되도록 하였다(즉, 램핑 시간 없음 도 17A). 이는 반응 웰에 위치한 온도 센서에 의하여, 표적 온도가 감지된 직후에, 프로그램의 각각의 온도 부분에 대하여 계산되는 10초의 유지시간과 반대되는 것이다(즉 램핑 시간 도 17B). PCR 서모사이클러 조건은 다음과 같았다: 85℃에서 2분간 초기 용융, 그 다음 80℃에서 10초 및 60℃에서 10초의 40회 사이클. MTI 장치의 조건은 다음과 같았다: 85℃에서 2분간 초기 용융, 82℃에서 10초 및 59℃에서 20초의 40회 사이클.
[00137] 도 17A: 제1레인, 별도의 램핑 없이 OPCRar 증폭(20 μL 반응). 왼쪽에서 부터: 50 bp 표준 DNA 사이즈 가닥; 제2 및 제3레인: 램프 스텝 및 정확한 온도 조절이 구비된 표준 PCR 서모사이클러 중에서의 OPCRar 증폭 반응(2배, 제2 및 제3레인). 초기 용융: 85℃에서 2분, 80℃에서 10초간 변성 및 60℃에서 10초간 어닐링 사이의 반복 40회 사이클. 제4 및 제5레인: 능동의 냉각 및/또는 별도의 램핑 조절이 없는 저비용 열 엔진 중에서 수행된 OPCRar 증폭. 열적 엔진은, 변성 또는 어닐링 온도에 대하여 그 어떠한 램핑 단계를 가지지 않는 것과 비교하여, 주변 필드 온도(~ 25 도)로부터 80℃ 변성으로 램프 또는 60℃ 어닐링 온도로 램프 다운한다. HLB OPCRar은 20 μL 반응 중에서, HLB 질병 표적 서열을 포함하는 정제된 식물 DNAFMF 사용하여 수행되었다. 본 발명자들은 MTI 장치 시험에 대한 양성 대조군을 위하여, PCR 서모사이클러를 사용하였다. PCR 서모사이클러 조건은 다음과 같았다: 램핑 없음을 위한 MTI 장치 서모사이클러 조건은 다음과 같았다: 85℃에서 2분간 초기 용융, 82℃에서 10초간 변성 및 59℃에서 20초간 어닐링 사이를 사이클링. 사이클링을 40회 반복하였다. 램핑 업 단계를 위한 MTI 장치 서모사이클러는 < 10 초의 램프 업 단계 및 < 20초의 램프 다운 단계가 있는 것을 제외하고는 동일한 조건이었다. HLB OPCRar에 의하여 제시된 데이터는 램프 업 및 램프 다운 단계가 없음에도, HLB 앰플리콘을 여전히 증폭할 수 있었다. 17A 및 17B의 비교는 램프 시간이 제공된 때, 증폭 수율에서의 현저한 향상을 나타내었다.
[00138] 이제 도 18을 보면, MIT의 열적 레지스터계 저비용 증폭 장치 중에서, 상기 기술한 바와 같은 2개 프라이머 세트:1) C. 리베리박터 DNA 표적에 특이적인 프라이머 hyvl_For 및 hyvl_Rev와 2) 시트러스 하우스 키핑 유전자 rbcL. 증폭 산물에 특이적인 프라이머 rbcl_(리불로스-1,5-바이포스페이트 카르복실라제 옥시게나제) For 및 rbcl_Rev를 포함하는 본 발명의 일 구현예에 따른 복합 OPCRar 반응들이 겔에 나타나있다. 램핑(예컨대, PCR 장치 중에서 5 도/초)이 없으며, 정확한 온도 조절이 없는 저 비용 히터 중에서 기술되고 수행된 PCR 증폭으로부터의 반응 산물을 겔에 걸었다. 본 발명자들은 PCR 서모사이클러 및 MTI 장치(램핑 프로그램이 있거나 또는 램핑 프로그램이 없음) 중에서, HLB 프라이머를 가지고 RbCL 내부적 양성 대조군을 시험하였다. 본 발명자들은 정제된 HLB 시료를 가지고 40 uL 반응을 수행하였다. PCR 서무사이클러 조건은 다음과 같았다: 초기 용융: 85℃에서 2분, 80℃에서 10초간 변성 및 60℃에서 10초간 어닐링 사이의 사이클링. MTI 장치 증폭 조건은 다음과 같았다: 초기 용융: 90℃에서 2분, 82℃에서 10초간 변성 및 59℃에서 20초간 어닐링 사이의 사이클링. 본 발명자들은 램핑이 없이도, HLB 및 RbCL 프라이머 서열 둘 모두를 증폭하는 것이 여전히 가능하다는 것을 발견하였다. HLB 산물은 ~ 147 bp 근처이고, RbCL 산물은 ~140 bp 근처이다. MTI 장치는 두 조건 모두에 대하여 PCR 서모사이클러 산물에 필적할 만하였다. 이 반응의 정방향 프라이머는 ccagccttga tcgttacaaa gggcgatgct acaacatt (SEQ ID NO 9) (Tm은 약 73.9C (10% DMSO, 76/60C)이고, 역방향 프라이머는 iscatgttagta acagaacctt cttcaaaaag gtctaacggg taa (SEQ ID NO 10) (Tm은 약 71.2C (10% DMSO, 76/60 C)이다. OPCRar 반응은 지시된 바와 같이 (도 16 및 17에 기술된 바와 같이) 온도 유지 시간 중에서 램프 시간을 포함하거나 또는 포함함이 없이 수행되었다. C. 리베리박터로부터 유래한 정제된 시트러스 잎 DNA를 사용하여 40 μL 반응을 수행하였다. PCR 서모사이클러 조절 조건은 다음과 같았다: 초기 용융: 85℃에서 2분간, 80℃에서 10초 및 60℃에서 10초의 40 사이클. MTI 장치 증폭 조건은 다음과 같았다: 초기 용융: 90℃에서 2분, 82℃에서 10초 및 59℃에서 20초의 40 사이클. 결과는, 유지 시간 계산 내에 램프 시간을 포함하지 않고서, MTI 장치는 C. 리베리박터 및 rbcL 서열 둘 모두를 증폭할 수 있는 것으로 나타났다. C. 리베리박터 산물은 대략 147 bp (HLB)이고, rbcL (RbCL) 산물은 대략 140 bp이다.
[00139] 모든 프라이머의 녹는점(Tm)는 프라이머 3 Tm 계산 소프트웨어를 사용하는 IDT 올리고분석기 3.1 (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA)를 사용하여 계산하였는데, 여기서 염, dNTP, Mg, 프라이머 농도 파라미터는 다음의 파라미터들을 사용하여 고려된다:
올리고뉴클레오타이드 농도: 0.25 μM; Na+ 농도: 50mM; Mg++ 농도 = 2.5 mM; dNTPs 농도 = 0.25 μM. 기호 "a"는 아데닌을 의미하고, 기호 "g"는 구아닌을, "c"는 시토신, "t"는 티민, "u"는 우라실, "r"은 퓨린, "y"는 피리미딘, "m"은 아미노, "k"는 케토 , "n"은 a 또는 g 또는 c 또는 t/u, 알려지지 않음 또는 기타 중 어느 하나를 의미함.
[00140] (SEQ ID NO 1)
접근 번호: CY087034
형태: 바이러스 RNA
길이: 1010
유기체: 인플루엔자 A 바이러스 (H1N1)
기타 정보: 기질 단백질 2 (M2) 및 기질 단백질 1 (M1) 유전자
[00141] (SEQ ID NO 2)
형태: 정방향 프라이머
명칭: FP3
길이: 46
Tm: 평균 75 ℃
[00142] (SEQ ID NO 3)
형태: 역방향 프라이머
명칭: RP3
길이: 40
Tm: 평균 77.8 ℃
[00143] (SEQ ID NO 4)
형태: 역방향 프라이머
명칭: RP4
길이: 46
Tm: 평균 74.7 ℃
[00144] (SEQ ID NO 5)
형태: 정방향 프라이머
명칭: UniAfCDC
길이: 22
Tm: 평균 65.0 ℃
[00145] (SEQ ID NO 6)
형태: 역방향 프라이머
명칭: UniArCDC
길이: 24
Tm: 평균 66.6 ℃
[00146] (SEQ ID NO 7) FAM-tgcagtcctc gctcactggg cacg-BHQ
형태: TaqMan 프로브
명칭: UniApCDC
길이: 24
Tm: 73.4 ℃
[00147] (SEQ ID NO 8)
접근 번호: AB505957
형태: 엽록체 DNA
길이: 1326
유기체: 감귤(Citrus sinensis)
기타 정보: rbcL, 리불로스-1,5-바이포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 라아지 서브유닛
[00148] (SEQ ID NO 9)
형태: 정방향 프라이머
명칭: rbcL_For
길이: 38
Tm: 73.9 ℃
[00149] (SEQ ID NO 10)
형태: 역방향 프라이머
명칭: rbcL_Rev
길이: 43
Tm: 71.2 ℃
[00150] (SEQ ID NO 11)
접근 번호: EU523377 부터
형태: 박테리아 DNA
길이: 890
유기체: 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(Candidatus Liberibacter asiaticus)
다른 정보: 신장 인자 Ts
[00151] (SEQ ID NO 12)
형태: 정방향 프라이머
명칭: NBEU523377-F-57
길이: 57
Tm: 75.8 ℃
[00152] (SEQ ID NO 13) [바이오틴-5]tcttcgtatc ttcatgcttc tccttctgag ggtttaggat cgattggtgt tcttgta
형태: 바이오티닐화 정방향 프라이머
명칭: EU523377-F-57
길이: 57
Tm: 75.8 ℃
[00153] (SEQ ID NO 14)
형태: 정방향 프라이머
명칭: HLBForSh
길이: 47
Tm: 75.6 ℃
[00154] (SEQ ID NO 15)
형태: 역방향 프라이머
명칭: EU523377-R-56
길이: 56
Tm: 75.8 ℃
[00155] (SEQ ID NO 16)
형태: 역방향 프라이머
명칭: HLBRevSh
길이: 49
Tm: 75.5 ℃
[00156] (SEQ ID NO 17)
TARGET: 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 16S 리보솜 RNA
형태: 정방향 프라이머(밑줄침), 5' 탐지 서열 포함
명칭: HLBas-P2
길이: 39
Tm: 62.7 ℃
[00157] (SEQ ID NO 18)
TARGET: 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 16S 리보솜 RNA
형태: 역방향 프라이머(밑줄침), 5' T7 프로모터 포함
명칭: HLBr-P1
길이: 56
Tm: 64.5 ℃
[00158] (SEQ ID NO 19)
형태: 정방향 프라이머
명칭: hyvl_For
길이: 45
Tm: 72.2 ℃
[00159] (SEQ ID NO 20)
형태: 역방향 프라이머
명칭: hyvl_Rev
길이: 51
Tm: 70.9 ℃
[00160] 발명이 기술된 구현예에 대한 특정 언급과 함께 상세히 기술되었다고 하여도, 다른 구현예도 동일한 결과를 얻을 수 있다. 본 발명의 변경 및 변형은 본 기술 분야에서 숙련된 자들에게 자명할 것이며, 그와 같은 모든 변형 및 균등물을 커버하는 것으로 의도된 것이다. 위에서 인용된 모든 특허 및 공개의 전체 개시사항은 언급에 의하여 본 명세서에 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mesa Tech International, Inc. <120> Oscillating Amplification Reaction for Nucleic Acids <130> 33106-PCT2 <140> 61/477,357 <141> 2011-04-20 <150> 61/477,437 <151> 2011-04-20 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1010 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <222> (993)..(993) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1002)..(1002) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 taaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct ttctatcatc ccgtcaggcc 60 ccctcaaagc cgagatcgcg cagagactgg aaagtgtctt tgcaggaaag aacacagatc 120 ttgaggctct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatctt gtcacctctg actaagggaa 180 ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg aggactgcag cgtagacgct 240 ttgtccaaaa tgccctaaat gggaatgggg acccgaacaa catggataga gcagttaaac 300 tatacaagaa gctcaaagga gaaataacgt tccatggggc caaggaggtg tcactaagct 360 ttcaactggt gcacttgcca gttgcatggg cctcatatac aacaggatgg gaacagtgac 420 cacagaagct gcttttggtc tagtgtgtgc cacttgtgaa cagattgctg attcacagca 480 tcggtctcac agacaaatgg ctactaccac caatccacta atcaggcatg aaaacagaat 540 ggtgctggct agcactacgg caaaggctat ggaacagatg gctggatcga gtgaacaggc 600 agcagaggcc atggaggttg ctaatcagac taggcagatg gtacatgcaa tgagaactat 660 tgggactcat cctagctcca gtgctggtct gaaagatgac cttcttgaaa atttgcaggc 720 ctaccagaag cgaatgggag tgcagatgca gcgattcaag tgatcctctc gtcattgcag 780 caaatatcat tgggatcttg cacctgatat tgtggattac tgatcgtctt tttttcaaat 840 gtatttatcg tcgctttaaa tacggtttga aaagagggcc ttctacggaa ggagtgcctg 900 agtccatgag ggaagaatat caacaggaac agcagagtgc tgtggatgtt gacgatggtc 960 attttgtcaa catagagcta gagtaataga cgntttgtcc anaatgccct 1010 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer designed for SEQ ID NO 1 <400> 2 ywctcatgga rtggctaaag acaagaccra tcctgtcacc tctgac 46 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer designed for SEQ ID NO 1 <400> 3 agggcattyt ggacaaakcg tctacgytgc agtccycgyt 40 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for SEQ ID NO 1 <400> 4 tttggrtctc cattyccatt tagggcatty tggacaaakc gtctat 46 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer UniAfCDC for SEQ ID NO 1 <400> 5 gaccratcct gtcacctctg ac 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer UniArCDC designed for SEQ ID NO 1 <400> 6 agggcattyt ggacaaakcg tcta 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAQman probe UniApCDC <400> 7 tgcagtcctc gctcactggg cacg 24 <210> 8 <211> 1326 <212> DNA <213> Citrus sinensis <400> 8 tgttggattc aaggccggtg ttaaagatta taaattgact tattatactc ctgactatgt 60 aaccaaagat actgatatct tggcagcatt ccgagtaact cctcagcccg gagttccacc 120 cgaggaagcg ggggctgcgg tagctgcgga atcttctact ggtacctgga cagctgtgtg 180 gaccgatggg cttaccagcc ttgatcgtta caaagggcga tgctacaaca ttgagcccgt 240 tgctggagaa gagaatcaat atatatgtta tgtagcttac ccgttagacc tttttgaaga 300 aggttctgtt actaacatgt ttacttccat tgtgggtaat gtatttggtt tcaaagcact 360 gcgcgctcta cgtctagagg atctacgaat ccctcctgcg tatactaaaa ctttccaagg 420 cccgcctcac ggcatccaag ttgagagaga taaattgaac aagtatggcc gtcccctgtt 480 gggatgtact attaaaccta aactggggtt atccgcgaag aattatggta gggcggttta 540 tgaatgtcta cgtggtggac ttgactttac caaagatgat gagaacgtga actcccaacc 600 atttatgcgt tggagggacc gtttcttatt ttgtgcggaa gctctttata aagcgcaagc 660 tgaaacaggt gaaatcaaag gtcattactt gaatgctact gcagggacat gcgaagaaat 720 gctaaaaagg gctgtctttg ccagagagtt gggagttcct atcgtaatgc atgactactt 780 aacaggggga ttcaccgcaa atactacctt ggctcattat tgccgagata atggtctact 840 tcttcacatc caccgtgcaa tgcatgcagt tattgataga cagaagaatc atggtatgca 900 ctttcgtgta ctagctaaag ctttgcgtct gtctggtgga gatcatattc acgccggtac 960 agtagtaggt aaacttgagg gggaaagaga cataaccttg ggatttgttg atttactacg 1020 tgatgatttt gttgaaaaag atcgaagccg cggtatttat ttcactcaag attgggtctc 1080 tataccaggt gttatacctg tggcttccgg gggtattcac gtttggcata tgcctgcgtt 1140 gacagagatc tttggagatg attccgtatt acaatttggt ggaggaactt taggacaccc 1200 ttggggaaat gcacccggcg ctgtagctaa tcgagtagct ctagaagcat gtgtacaagc 1260 tcgtaatgaa ggacgcgatc ttgctcgtga aggtaatgaa attatccggg aggctagcaa 1320 atggag 1326 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer rbcL_For <400> 9 ccagccttga tcgttacaaa gggcgatgct acaacatt 38 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer rbcL_Rev <400> 10 catgttagta acagaacctt cttcaaaaag gtctaacggg taa 43 <210> 11 <211> 890 <212> DNA <213> Candidatus Liberibacter asiaticus <400> 11 atgagtaagg tatctgctgt tgcggtaaag gagttacgtg ggaaaactgg tgcaggtatc 60 ttggactgca agaatgccct tttggaggct aagggtgata gtgaattagc gattgatatt 120 ttgcgcacta aaggagctat ggcagctagt aagagagagg gtagaaaggt ttcagagggg 180 cttataggaa ttgctcgtga tggatataag aaggcatcga ttgtagaagt caatgttgag 240 accgatagtt tggcaaaaaa cactgatttt cagagtcttg tttctaatat tgcgggtatt 300 gctctttcca ccgatggttc tttggacaat gttcttgcga tgccatttga ccatagtggg 360 attactgtgg gggatggaat taagcagcag attgctatca ccggtgaatg tattaagctg 420 aggcgttccg ctcttctgtg tgtttcggaa ggggtcatct cttcgtatct tcatgcttct 480 ccttctgagg gtttaggatc gattggtgtt cttgtagcgt tgcagtcttc tgcggaagat 540 aaggaattgc tttctgcgat tggagagaag attgcagtgc atgtaatgct ggcttctcct 600 tcggtgattt ctgtgcagat gcttgatcct tctattgttg ctaataaacg tgcccattac 660 atgacagaag cacttgattc tgggaaatca ggtaatattg ttgaaaagat cgtaaatgga 720 aagatgcaaa gcttttgtaa ggaatgtgtt cttttgcatc aggggtttgt tgttgatcct 780 tccaaaactg tatcagattt tttgaaagaa tctgaaaaat caatcggtgc ttctattgaa 840 gttgttggtg tatctcattt tgttgtgggt aaagaaaatg atgatggtta 890 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer NBEU523377-F-57 <400> 12 tcttcgtatc ttcatgcttc tccttctgag ggtttaggat cgattggtgt tcttgta 57 <210> 13 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotinylated forward primer EU523377-F-57 <400> 13 tcttcgtatc ttcatgcttc tccttctgag ggtttaggat cgattggtgt tcttgta 57 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer HLBForSh <400> 14 cgattggtgt tcttgtagcg ttgcagtctt ctgcggaaga taaggaa 47 <210> 15 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer EU523377-R-56 <400> 15 tgcttctgtc atgtaatggg cacgtttatt agcaacaata gaaggatcaa gcatct 56 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer HLBRevSh <400> 16 aacaatagaa ggatcaagca tctgcacaga aatcaccgaa ggagaagcc 49 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer (underlined), contains 5' detection sequence HLBas-P2 <400> 17 gatgcaaggt cgcatatgag gagcgcgtat gcaatacga 39 <210> 18 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer (underlined), contains 5' T7 promoter HLBr-P1 <400> 18 aattctaata cgactcacta tagggagaag ggcgttatcc cgtagaaaaa ggtaga 56 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer hyvl_For <400> 19 ggccgtttta acacaaaaga tgaatatcat agatggggta gtcaa 45 <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer hyvl_Rev <400> 20 cggccatttt agataaatca atttgttcta gtttagatac atcaatttgt t 51 <210> 21 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 21 gttcttgtag cgttgcagtc ttctgcggaa gataaggaat tgcttt 46 <210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 22 gggcacgttt attagcaaca atagaaggat caagcatctg cacagaaat 49 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 23 cttgtagcgt tgcagtcttc tgcggaagat aaggaattgc tttctgcg 48 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 24 cacgtttatt agcaacaata gaaggatcaa gcatctgcac agaaatcacc g 51 <210> 25 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 25 ggtgttcttg tatcgttgca gtcttctgcg gaagataagg aattgcttt 49 <210> 26 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 26 gtaatgggca cgtttattag caacgataga aggatcaagc aactgcacag aaat 54 <210> 27 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 27 cttgtatcgt tgcagtcttc tgcggaagat aaggaattgc tttctgcg 48 <210> 28 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 28 ggcacgttta ttagcaacga tagaaggatc aagcatctgc acagaaatca ccg 53

Claims (33)

  1. 시료 중에 함유된 표적 핵산 서열의 주형을 선택적으로 증폭하는 방법으로서,
    표적 핵산 서열의 주형에 상보적인 프라이머 및
    DMSO, 포름아마이드 또는 베타인을 포함하는 핵산 불안정화제 8-15 부피% 농도를 함유하는 증폭 반응 혼합물과 시료를 접촉시키는 단계;
    반응 온도를 수회 온도 사이클 동안에 온도 차이가 최대 20℃인 상한 변성 온도와 하한 어닐링 온도 사이에서 왕복시키는 단계; 및
    표적 핵산 서열의 주형을 증폭시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 수회 온도 사이클 동안에 온도 차이가 최대 15℃인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 수회 온도 사이클 동안에 온도 차이가 최대 10℃인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 수회 온도 사이클 동안에 온도 차이가 최대 5℃인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상한 온도 또는 하한 온도에 도달한 후에, 온도 변동 이내에 정해진 시간 동안 온도가 유지되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상한 온도 또는 하한 온도에 도달한 후에, 온도 범위 내에서 온도가 다른 온도로 변화하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 하한 온도는 최소 50℃인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상한 온도는 최대 85℃인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 표적 핵산 서열의 주형은 단일 가닥 DNA 또는 RNA인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 표적 핵산 서열의 주형은 이중 가닥 DNA 또는 RNA인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 표적 핵산 서열의 주형은 RNA인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 표적 핵산 서열의 주형은 DNA인 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 표적 핵산의 길이는 1000 bp 보다 짧은 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 표적 핵산의 길이는 250 bp 보다 짧은 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 표적 핵산의 길이는 150 bp 보다 짧은 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 표적 핵산의 길이는 100 bp 보다 짧은 것인 방법.
  17. 시료 내에 함유된 표적 핵산 서열의 주형을 증폭하는 방법으로서,
    35 내지 70 염기쌍 길이를 포함하고 표적 핵산 서열의 주형과 상보적인 프라이머 또는 프라이머 쌍(여기서, 프라이머 쌍의 각각의 프라이머의 융점은 70 내지 80℃임),
    8-15 부피% 농도의 DMSO,
    1가 양이온,
    2가 양이온,
    dNTP, 및
    DNA 폴리머라제
    를 함유하는 증폭 반응 혼합물과 시료를 접촉시키는 단계;
    반응 온도를 수회 온도 사이클 동안에 온도 차이가 최대 20℃인 상한 변성 온도와 하한 어닐링 온도 사이에서 왕복시키는 단계; 및
    표적 핵산 서열의 주형을 증폭시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 2가 양이온은 마그네슘, 망간, 구리, 아연 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염인 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 1가 양이온은 나트륨, 칼륨, 리튬, 루비듐, 세슘, 암모늄 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염인 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 증폭 반응은 DNA 폴리머라제를 함유하는 것인 방법.
  21. 제17항 또는 제20항에 있어서, DNA 폴리머라제는 열에 안정한 DNA 폴리머라제인 것인 방법.
  22. 제17항 또는 제20항에 있어서, DNA 폴리머라제는 TAQ DNA 폴리머라제, VentR DNA 폴리머라제 및 DeepVentR DNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 제17항 또는 제20항에 있어서, DNA 폴리머라제는 가닥을 대체하는 활성을 가지는 것인 방법.
  24. 제17항 또는 제20항에 있어서, DNA 폴리머라제는 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않는 것인 방법.
  25. 제11항에 있어서, 증폭 반응 혼합물은 역전사 효소 및 DNA 폴리머라제를 함유하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 역전사 효소는 열에 안정한 역전사 효소인 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 역전사 효소는 AMV-RT, 수퍼스크립트(Superscript) II 역전사 효소, 수퍼스크립트 III 역전사 효소 또는 MMLV-RT로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제1항 또는 제17항에 있어서, 증폭 반응 혼합물은 단일 가닥 결합 단백질(SSB protein)을 함유하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단일 가닥 결합 단백질은 열에 안정한 단일 가닥 결합 단백질인 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 단일 가닥 결합 단백질은 열에 안정하지 않은 단일 가닥 결합 단백질인 것인 방법.
  31. 제1항 또는 제17항에 있어서, 시료는 알코올 프리(alcohol free)가 아닌 것인 방법.
  32. 제1항 또는 제17항에 있어서, 시료는 염 프리(salt free)가 아닌 것인 방법.
  33. 제1항에 있어서, 증폭 반응 혼합물은 다음을 포함하는 증폭 반응 혼합물 완충액을 함유하는 것인 방법:
    단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 불안정화제;
    1가 양이온;
    2가 양이온;
    dNTP; 및
    DNA 폴리머라제.
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