JPH06502911A - 固相沈澱アッセイ装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ′　アーセイ壮　および　法 １、発里■肢止圀互 本発明は固相沈澱診断装置、および血液流体試料中の低密度リポタンパク質（Ｌ ＤＬ）から高密度リポタンパク質（ＨＤ　Ｌ）を分離する方法に関するものであ る。

２、象λ文献 アライ・エフら、米国特許第４．８２６，７６１号、１９８９年５月２日発行。

バコリク・ピー・ニスら、イン・メソソズ・イン・エンザイモロジイ、第１２９ 巻、アカデミツク・プレス（１９８６）、７８−１００頁。

フィゲラスら、米国特許第４，１４４，３０６号、１９７９年３月１３日発行。

ゴールドファーブ・エイら、米国特許第３．４６４，４１３号、１９６９年９月 ２日発行。

ヴオゲルら、米国特許第４，４７７．５７５号、１９８４年１０月１６日発行。

ザファロニ・エイ、米国特許第３，７９７，４９４号、１９７４年３月１９日発 行。

ジーゲンホーンら米国特許第４，５４４，６３０号、１９８５年１０月１日発行 。

３、発訓久１員 健康状態、例えば心臓病の危険を予言する分析のための血液その他の身体の流体 を幅広く試験する傾向にある。血液中に存在するコレステロールの分量は冠動脈 病の危険に関連するひとつのファクターである。

コレステロールはタンパク質結合形態で優位に血液中を循環する。コレステロー ルを運搬するタンパク質はりボタンバク質であ一層、それらの密度に基づき３つ のクラスにさらに分けられる。超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）は肝臓中で 合成され最後には低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に変わり、人体中の大部分の 血漿コレステロールを運搬する、トリグリセリドの豊富なりボタンバク質である 。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）はトリグリセリドの豊富なりボタンバク質の 異化作用において、また周辺組織からのコレステロールの除去および肝臓への移 送において含まれるリポタンパク質である。血清ＨＤＬ水準と心臓病の危険との 間の反比例関係が確立されている。特に、ＨＤＬと結合した血清コレステロール の割合が低いならば、心臓病の危険は増加する。

アテローム症の危険評価および管理における相対的な血清コレステロール水準の 重要性を考慮して、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ならびに全コレステロールおよびトリグリ セリドの血清水準に対する正常と高リスクの両方の個体の大母集団をスクリーニ ングするためにかなりの努力が費やされてきた。高リスクの個体の治療の有効性 は種々のりボタンバク質の区画においてコレステロールの血清水準を規則的に試 験することによってモニターされていた。

ＬＤＬおよびＨＤＬコレステロール試験のためのひとつの方法はポリアニオン性 化合物、例えばデキストランサルフェート、ヘパリン、およびホスホタングステ ートによって、ＭｇＺ−２Ｍｎ”、およびＣａ”″のような第■族のカチオンの 存在で、血清中の非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に沈澱させることに基づくも のである。

沈澱の特異性と度合は、ポリアニオン／金属剤の種類と濃度を含めて、種々のフ ァクターに依存している。一般に、血清コレステロール粒子の沈澱の順位は、ポ リアニオンの濃度の増加と共に■ＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬである。ＨＤＬ の少数のアポ８種は一層低い密度の粒子と共に沈澱できるが、ＨＤＬは通常、一 層低い密度の粒子を完全に沈澱するヘパリンまたはデキストランサルフェートの 濃度で溶解して残っている。

一層低い密度の粒子を選択的に沈澱することによって、ＨＤＬ血清コレステロー ル水準を決定することができる。ＨＤＬ値は、全血清コレステロールとトリグリ セリドの測定値と共に、次の関係式に従ってＬＤＬを計算するために使用するこ とができる：ＬＤＬコレステロール＝全コレステロール−トリグリセリド１５− ＨＤ！、コレステロール代表的な脂質アッセイ法では、少量の血液を取って遠心 分離して透明なプラズマまたは血清の流体試料をつくる。次に流体試料を、（ａ ）全血清コレステロール、（ｂ）トリグリセリド、および（ｃ）ＨＤＬコレステ ロールの測定のため、複数のアッセイチューブに等分する。ＨＤＬ試料を上記の ように沈澱させ、コレステロール検出前に濾過または遠心分離によって低密度の 粒子を除去する９次に試料を、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオ キシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびＨｔ　Ｏｚの存在ではっきりと着色され た生成物に酸化できる染料を含む酵素混合物と反応させる。チューブは分光光度 計によって読み取り、所望の全量のＨＤＬおよびＬＤＬコレステロール値を測定 することができる。

前記液相コレステロールアッセイを用いて達成できる精度と信転性にもかかわら ず、このアッセイは幅広いスクリーニングにおいて使用するには多くの制限があ る。第１に、この方法は静脈血試料を使用し、訓練された技術者が血液試料を取 り出し分別し、処理血液を各アッセイチューブに等分することが必要である。少 なくとも１本の試料チューブを（ＨＤＬ測定のために）沈澱剤を用いて取り扱い 、さらに沈澱物質を除去するように処理する必要がある。これらの方法のい（つ かは自動化できるが、このために設計された分析機械は高価であり、大病院以外 では広く入手することができない。

本発明は血清コレステロール水準を測定するための液体アッセイ方法に伴う上述 の問題点の多くを実質的に解決するアッセイ装置を提供する。１実施例では、本 装置は、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子も含む血液試料において、ＨＤＬ結合コレス テロールの濃度を測定するために設計される。本装置はマトリックスを通って流 体試料が移動するとき溶解するりボタンバク質と沈澱するりボタンバク質を分離 することができる篩分はマトリックスを含む。マトリックスと結合した貯蔵器を 、流体試料がマトリックス内に引き入れられ通過するとき、ＬＤＬおよびＶＬＤ Ｌを選択的に沈澱するため、沈澱剤を放出するように設計する。これは、篩分は マトリックスを通る一層速いＨＤＬの移動に基づいて、沈澱したりボタンバク質 からＨＤＬを分離する。非ＨＤＬリポタンパク質をこのようにして消耗した液体 試料をコレステロールについてアッセイする。

４．２浬Ｉ遅１！ 本発明のひとつの目的は、血清ＬＤＬ、ＨＤＬ、および全コレステロール値をア ッセイするための液体−アッセイ装置と関連する上記問題点を実質的に解消しあ るいは減らすアッセイ装置と方法を提供することである。

本発明の一般的な目的は可溶性アッセイ妨害化合物も含む流体試料中の可溶性分 析物を測定するための改良された固相アッセイ装置を提供することである。

１具体化では、本発明は特にＨＤＬと結合した血清コレステロールを測定する際 に使用するためのアッセイ装置を含む。沈澱剤は選択的にＶＬＤＬおよびＬＤＬ を沈澱し、その結果ＨＤＬ結合コレステロールはこれらの源から妨害されないで 測定することができる。

本発明のアッセイ装置は、試料が試料適用位置からマトリックスを通ってマトリ ックス内の試料収集位置まで流れるとき、流体試料中の沈澱物質から溶解物を分 離する篩分はマトリックスを含む。流体試料がマトリックスに流入しこれを通っ て流れるとき、装置内の試薬貯蔵器が沈澱剤をマトリックス内に徐々に放出する ように設計する。好適例では、篩分はマトリックスはグラスファイバのマトリッ クスから成り、沈澱剤はファイバ上に被覆される。

貯蔵器からの沈澱剤を除々に放出すると、アッセイされる分析物を沈澱すること なく、試料中の妨害化合物（単数または複数）を沈澱するために有効なマトリッ クス中の沈澱剤の濃度を与える。

また、流体試料中に存在する分析物濃度を測定するため、マトリックス上の試料 収集位置で収集された流体試料を移すことができるアッセイバットが装置内に含 まれる。

好適例では、沈澱剤はポリアニオン性化合物と第■族金属カチオンとの組合せを 含み、放出手段は、ＶＬＤＬｓおよびＨＤＬｓを選択的に沈澱する化合物の濃度 を与えるために十分な速度でポリアニオン性化合物を放出するために有効である 。試薬貯蔵器に使用するための好ましいポリアニオン性化合物は硫酸化多［１！ 、ヘパリン、およびリンタングステン酸を含み、第■族金属はＭｇＺ−１１ｎ！ ゛、およびＣａ”°から成る群から選ばれる。好ましい組合せは最終濃度が０． ５〜１．Ｏｎ＋ｇ／＋１のデキストランサルフェートおよび０．０４５〜０．１ ５ＭのＭｇＺ”を含む。これらの好ましい沈澱剤の配合は特にＨＤＬ結合コレス テロールのアッセイに有用である。

別の具体化では、装置は、このような沈澱剤の存在でマトリックスに可溶性分析 物が結合することを防ぐマトリックスに塗布したコーテイング物質を含む。ＨＤ Ｌｓがグラスファイバに結合することを阻止するのに有効な好ましいコーティン グは、親水性ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、 ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンイミン、ポ リビニルスルホン酸、ポリ　（３−ヒドロキシブチル酸）、ポリアクリル酸、ポ リ　（３−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ　（２ −アクリルアミドスルホン酸）、またはポリーＬ−グルタメートを含む。

表面シリル基を有するガラスファイバーの網状組織から成るマトリックスのため の別の好適なコーティングは、表面シリル基を含むコーティングがシリルエーテ ル、特にビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシシランのシリル モノまたはジエーテルから成るものである。

他の面では、本発明は血液流体試料中のＬＤＬｓおよびＶＬＤＬｓからＨＤＬｓ を分離する方法を含む。この方法では、流体血液試料はＬＤＬｓおよびＶＬＤＬ ｓを選択的に沈澱する若干の沈澱剤と混合する。次いで試料を、ＨＤＬがグラス ファイバに結合しないようにするコーティングを有するグラスファイバのマトリ ックスに通過させる。

好ましくは、本発明の方法に使用される沈澱剤はポリアニオン性化合物および第 ■族金属カチオンを含む０本発明の方法に特に有用なポリアニオン性化合物は硫 酸化多糖類、ヘパリン、およびリンタングステン酸を含む。第■族金属は好まし くはＭｇ２°、Ｍｎ”、またはＣａ　ｔ　ｅである。

本発明の方法の１具体化では、沈澱剤の存在でグラスファイバマトリックスに可 溶性ＨＤＬが結合しないようにするために使用されるコーティングは好ましくは ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ポリエチレングリコール、ポリ プロピレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリビニルスルホン酸、ポリ　（ ３−ヒドロキシブチル酸）、ポリアクリル酸、ポリ　（３−ヒドロキシ吉草酸） 、ポリ　（４−スチレンスルホン酸）、ボ’Ｊ（２−７’７リルアミドスルホン 酸）、またはポリーＬ−グルタメートから成る群から選ばれる親水性ポリマーで ある。

他の具体化では、マトリックスは表面シリル基を有するグラスファイバであり、 コーティングはシリルエーテルから成る。好ましいシリルエーテルはビス（ヒド ロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシシランのシリルモノまたはジエーテ ルを含む。

５、四凱虫皿皇呈望所 図ＩＡおよびＩＢは本発明に従って構成されたマルチ分析物アッセイ装置の側面 図、およびこの図に示された線で切断した断面図をそれぞれ示す図であり； 図２は図１に示したアッセイ装置の中央の小板領域の拡大破断図であり； 図３３．３ｂ、および３Ｃは装置内に用いられる３つのタイプの放出の遅い貯蔵 器の拡大図であり； 図４は沈澱剤の放出と血清試料（図の左側）中のＬＤＬ　（白い四角）およびＶ ＬＤＬ　（白い三角）の沈澱、および装置（図の中央）内の小板を通って移動し た後に形成する沈澱したＬＤＬおよびＶＬＤＬからのＨＤＬ（ＪｉＡ丸）粒子の 分離を示す図であり；図５Ａ〜５Ｃはシリル化剤（５Ｂ）または親水性ポリマー （５Ｃ）を用いてグラスファイバー表面（５Ａ）をコーティングするための方法 を示す図であり； 図６は種々の処理およびグラスファイバコーティングを用いたグラスファイバマ トリックス上でＨＤＬを分離した後に測定したＨＤＬコレステロール値を示す棒 グラフであり；図７はＨＤＬと結合した血清コレステロールの測定のために設計 したアッセイ装置中の小板の平面図であり；図８は本発明の方法と装置の使用に 従って２参照標準曲線を用いるＨＤＬコレステロール濃度の測定を示すプロット であり；図９３と９ｂは、それぞれ、そのうちのひとつがＨＤＬである複数の分 析物の測定のために設計されたアッセイ装置内の小板の平面図、およびこの小板 の破断面図であり；図１０は本発明の方法に従ってアッセイ装置からの全コレス テロール、ＨＤＬ、および血清トリグリセリドを測定した結果を示すプロットで あり；そして 図１１は本発明に従って測定したＨＤＬコレステロールと、標準液相アプローチ によって測定したものを比較するプロットを示す図であり、図中の直線は２つの 試験の間の理想的な一致を示している。

このセクションは１種またはそれ以上の妨害化合物も含む流体試料中の可溶性分 析物を測定するために設計された単一または複数の分析物を使用するために適し ているアッセイ装置について記述する。妨害化合物は関係する分析物を検出する ために用いられる試薬と反応し、このような試薬を阻害し、あるいは分析物特異 的反応において生じた信号レベルで非特異的に妨害する化合物である。この妨害 化合物はまた可溶性分析物分子または分子コンプレックスを沈澱しない条件下で 選択的に沈澱（または凝集）できるものでもある。選択的な沈澱は試料を沈澱剤 に所定の濃度範囲内でさらすことによって生成する。妨害化合物はこの濃度範囲 以下では不完全に沈澱することがあり；この範囲を趨えると分析物の沈澱が起こ ることがある。

本発明によって検出するためのひとつの例示的な分析物は高密度リポタンパク質 結合コレステロール（ＨＤＬコレステロール）である、上記のように、ＨＤ　Ｌ は血液中にコレステロールを運搬するりボタンバク質の種類のひとつである。Ｈ ＤＬ、および低密度リポタンパクｌｊ　（ＬＤＬ）と結合したコレステロールの レベルは心血管疾患と強い相互関係を与える。ＨＤＬア７セイにおいて妨害する 化合物は主としてキロミクロン、ＶＬＤＬおよびＬＤＬを含む非ＨＤＬｍ漬りボ タンバク質である。以下に述べるように、非ＨＤＬリポタンパク質は、第■族金 属カチオンと組合わせて、沈澱成分の選択された濃度範囲内で、種々のポリアニ オン性化合物によって選択的に沈澱することができる。

図１ａは本発明に従って構成された複数の分析物のアッセイ装置１４を示す。こ の装置は特に少量の血液試料を、代表的には１０〜５０μｌの血液を使用する複 数の分析物を測定するために設計される。一般的なアッセイの構成は、ここに参 考文献として加えられる共有する米国特許出＠［マルチ分析物アッセイ装置」、 第５０３゜３７１号、１９９０年４月２日に出願したものに記載されており、特 に複数の血液試料アッセイの測定のために適している。

装置１４は一触に、一定量の血液試料、代表的には約２５〜５０μｌの血液を収 容する大きさと寸法のウェル１６を画定する支持体１５を含む。プレート内に形 成されたキャピラリー導管１８はウェルの底に設けられ、支持体の上縁に形成さ れた切り欠き領域２０と連結する。この支持体は好ましくは、標準の成形または 加工方法によって形成されたウェル、導管および切り欠き領域と共に、薄いプラ ス千ツク板等である。

領域２０に収容される篩分はバッド２２は、図１ａに示したように底から上部ま で、試料がウェルがら離れた方向にマトリックスを通って移動するとき、大きい 粒状物質（血球を含む）を部分的に動かすように働く、バッド２２は、表面湿潤 によって水性流体を引き出し、血液試料がマトリックスを通って引き出されると き血球の移動を遅らせるように設計された繊維状マトリックス材料から形成され る。すなわち、バンドは、媒体を通過する異なる移動速度に基づいて可溶性血清 成分がら血球の大きさの粒子を分離するためのクロマトグラフィー媒体として働 く。

セルロース、セルロースアセテート、およびグラスファイバマトリックスを含む 繊維状マットフィルターに使用されるような種々の繊維状材料が、篩分はバッド 用材料に適している。所望により、ファイバは、化学的架橋、熱溶融等によって 架橋することができる。また多孔性支持体、例えば焼結ガラス、溶融ポリマービ ーズ等、隙間の湿潤性および寸法が表面のぬれによってマトリックス内に水性媒 体の移動を促すようなものが適している。ｌ実施例のフィルターはグラスファイ バフィルターであり、例えばワットマンによって供給され、約０．１６ｇ／ｃ＋ ｗ３の充填密度を有するＧＦ／Ｄまたは、ＰＤＯＯ８フィルターがある。小板は 側面寸法が約３Ｘ８ｎｕｗ、および厚さが約ｌｌに切断される。バンドは一定の 容量、代表的には約３〜２５μｍ、そして好ましくは約１５〜２５μｌの流体試 料を吸着するような大きさである。

篩分はバッド２２はさらに赤血球捕獲試薬、例えばレクチン、赤血球表面膜タン パク質に対して特異的な抗体、トロンビン、またはイオン交換剤を含む。また、 バンド２２の上部表面は流体試料中に存在する血球その他の粒状物質を濾過する ように設計されたミクロ細孔膜によって被覆することができる。血液中の大きい りボタンバク質本体、例えば、ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬと結合すること ができる全コレステロールまたは他の脂質成分をアッセイするために装置を使用 する場合、この種の膜の孔寸法は血球を濾過するが、これらの分子を通過させる ように選択される。ひとつの好ましい膜はヌクレオボアＣすリポルニア州リバー モア）から入手でき、１ミクロンの孔寸法をもつポリカーボネート膜である。

特に図２を参照すると、この図はアッセイ装置の中央部の拡大図であり、篩分は バンド２２は、）頓番にプレートの上縁の内側部分に取付けられこれに沿って延 びている細長い小板またはマトリックス２６によって被覆されている。マトリッ クス２６は流体試料を、マトリックス小板の中央試料適用領域２８から、マトリ ックスの端部付近の向い合った試料収集領域３０．３２まで分配するために役立 つ（図１）。マトリックスは好ましくは、バッド２２に用いたような繊維状物質 から形成され、毛細管流によって小板を通って流体を引き出すことができる。

マトリックスは、小板の試料収集領域まで小板の試料通用領域に供給される少量 、例えば、１０〜２５μｍの流体を吸着し分配するような充填密度および厚さで ある。マトリックスは充填密度が約０、１６ｇ／ｃｍ３と４．０ｇ／ｃｍ３の間 であることが好ましい。ｌ実施例のマトリックス材料は、約０．２ｇｌｌ１／ｃ ＋ｓ’の充填密度、約３１１１ａの幅、約３Ｃ１１の長さ、および約０．１２ｍ ｍの厚さを有するワットマンがら入手できるＢＳＢ−２０グラスフアイバフイル ターである０分離マトリックス中のグラスファイバは、以下に述べるように、沈 澱剤の存在でグラスファイバにＨＤＬが結合することを妨げるために有効なコー ティングを含むように調製される。

図２を引続き参照すると、装置内の試薬貯蔵器３４は、流体試料をマトリックス の試料通用領域に引き入れるとき、流体試料中のＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子のよ うな妨害化合物を選択的に沈澱するために使用される沈澱剤を含む、貯蔵器３４ は、マトリックス２６の中央試料適用領域２８と篩分はバ・ノド２２との間に挿 入される繊維状ウェブ（図３ａ、３ｂ、および３ｃに示した）を含む。図に見ら れるように、ウェブは領域２０の縁部をいくらが越えて伸びており、バッド２２ からマトリックス２６に引き入れる流体試料もまた貯蔵器を通して引き出される ようにする。ウェブはバッド２２またはマトリックス２６に用いられるような繊 維状フィルター材料から形成することができる。ｌ実施例の材料は充填密度が約 ０−２ｇ＋ａ／ｃ＋ｍ”。

厚さが約０．１２＋＋＋ａ、および長さおよび幅寸法がそれぞれ約４ｍｍおよび ３ＩＩＩのグラスファイバフィルターである。以下に詳しく述べるように、図３ ａ、３ｂ、および３ｃは、そのウェブ構成を示す試薬貯蔵器の拡大部分の実施例 を示す。貯蔵器はここではマトリックス２６から分離して示されているが、マト リックスの中央部分に沈澱剤を組み込むことによって、貯蔵器をマトリックスと 一体形成することができることが認められるだろう。

試薬貯蔵器３４はマトリックスに入る流体試料中の薬剤の濃度を維持する速度で 沈澱剤を放出するように設計され、さらに特に、少なくとも最初の１０％そして 好ましくは２０〜４０％の全流体試料をマトリックス上の試料適用位！および試 料収集位置の間のマトリックスに引き入れ、その濃度範囲は流体試料中の非ＨＤ Ｌ化合物で（ｂ）可溶性の形で流体試料に貯蔵器から放出される、任意の化学的 な１または複数の成分である。薬剤は塩析沈澱効果を生じる塩、選択的なｐＨ依 存沈澱効果を生じる酸または塩基、またはさらに代表的には、妨害化合物１散ま たは複数）と分子内凝集物を形成する１または複数の化合物であることができる 。好ましい沈澱剤は、非ＨＤＬ血清すポタンパク質の選択的沈澱に使用するため 、スルホン化多糖、例えば中性ｐｌ＋を維持するように緩衝剤で処理された酢酸 マグネシウムまたは塩化マグネシウムと組合わせたデキストランサルフェート（ 代表的な分子量はｓｏ、　ｏｏｏダルトンである）である。

上述のように、リポタンパク質は選択されたポリアニオン性化合物および二価の カチオンの組合せを含む種々の沈澱剤によって選択的に沈澱することができる。

リポタンパク質沈澱においてこれらの薬剤を使用することは概説されている（バ コリク・ビー・ニスら、イン・メソソズ・イン・エンザイモロジイ、アカデミ・ ７り・プレス（１９８６）、７８〜１００頁）。最も広く使用されている薬剤は （ａ）ヘパリン−Ｍｎ”°またはヘパリン−Ｃａ”、（ｂ）デキストランサルフ ェート−Ｍｇ１、（Ｃ）ホスホタングステート−ＭｇＺ−１および（ｄ）ポリエ チレングリコールである。

ヘパリンおよび二価金属を含むヘパリン剤は１ｍｇ／＋ｉｌのヘパリン濃度で有 効であり、１＋ｓｇ／ｍｌまでの濃度ではＨＤＬを沈澱しない、　Ｍｎ”、代表 的にはＭｎＣ１ｚ塩の形で、非ＨＤＬ　（アポＢ含有）リポタンパク質の完全な 沈澱に対して少な（とも約０．０４Ｍ、そして好ましくは約、００６と、　０９ ２　Ｍの間のＭｎ”°でなければならない。同様のγ農度のＣａ”をＨｇＸ−と 置換することができる。

デキストランサルフェートとＭｇｔｏを含むデキストランサルフェート剤は好ま しくは約５０ｋｄ　（キロダルトン）の分子量のデキストランサルフェートを用 いる。高分子量、例えば５００ｋｄでは、かなりの分量のＨＤＬが沈澱する。低 分子量、例えば１５ｋｄでは、アポＢリポタンパク質が不完全に２ｔ１．ｔｉす る。非ＨＤＬ粒子の選択的沈澱のため最適なデキストランサルフェート濃度は約 ０．９１ｍｇ／ｍｌであり、１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度ではＨＤＬを沈澱しない 。ＭｇＺ゛の濃度は、代表的にはＭｇＣ１，の形で約０．０４５Ｍと０．１５Ｍ の間である。

ホスホタングステート剤は水溶性ホスホタングステートおよびＭ　ｇ　ｔ　＋を 、代表的にはＭｇＣ１，の形で含む。非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に沈澱す るために有効な薬剤の濃度は２〜８ｍｇ／ｍｌのホスホタングステートおよび約 ０．０２５と０．０７５Ｍの間の−ｇ塩である。

沈澱剤は代表的には、選択された分量の沈澱剤を用いて貯蔵器ウェブを浸出させ る所望の濃度までＨＥＰＥＳ緩衝液のような水性緩衝液に配合される。貯蔵器内 の薬剤の全量は、所望の沈澱剤濃度にて、沈澱剤を含むだろうアッセイ装置内の 推定溶媒初期容量、およびその濃度を生じるために必要な沈澱剤の全量から計算 される。ウェブに適用される配合は、以下に図３８を参照して記載されるバイン ダー、または放出の遅いコーティングを用いて被覆される沈澱剤単独を含むこと ができる。デキストランサルフェ−）−ＭｇＣ１，沈澱剤を含む貯蔵器の詳細は 実施例１で示す。

バインダー材料、および配合中の沈澱剤に対するバインダーの割合は、流体試料 をマトリックス中に引き出すとき、さらに特に、最初の１０〜４０％またはそれ 以上の全流体試料をマトリックス中に引き出すとき、その間に徐々に粒子が溶解 するように選択される。

好ましいポリマーバインダーは線状ポリオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポ リエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミ ド、ポリメタクリル酸、ポリビニル酢酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルオ キサゾリドン、および種々の水溶性ヒドロキシルポリマー、例えば天然ゴム、ゼ ラチン、および水溶性セルロース化合物、例えばメチルセルロースおよびヒドロ キシメチルセルロース、およびコポリマーおよびこれらポリマーの混合物である 。これらのポリマーは一般に種々の分子量の大きさで市販品として入手できる。

バインダーの配合はバインダーと沈澱剤を、代表的には約−１：１０ないし１： １の沈澱剤：バインダーの重量比で調製することができる。乾燥したバインダー の配合は代表的には、バインダーの性質と貯蔵器の所望の溶解速度に従って、約 １：１０ないし１：１の薬剤対バインダーの割合で含む。しかし特に、バインダ ーそれ自体は沈澱剤または１の薬剤成分であっても良く、例えばデキストランサ ルフェートとＭｇＺ゛から成る沈澱剤中のデキストランサルフェートポリマーが ある。

図３ａ、３ｂ、および３Ｃは、特に好適例のウェブ様構成を示す貯蔵器３４の具 体化の拡大図である。図３３に示した実施例では、沈澱剤はバインダー中に配合 され、ウェブの繊維上で乾燥される。

即ち、３８で示したウェブの繊維はバインダー／沈澱側混合物の乾燥した不規則 な沈積物３６に覆われる。バインダー材料、および配合中のバインダ一対沈澱剤 の割合は、流体試料をマトリックス中に引き出すとき、さらに特に、全流体試料 の最初の１０〜４０％またはそれ以上をマトリックス中に引き出すとき、その間 に徐々に粒子を溶解するように選択される。貯蔵器を調製するため、既知の分量 の沈澱剤を含むバインダー配合の懸濁液を用いてウェブは浸出される。次にウェ ブを、例えば真空下に、あるいは加熱によって乾燥し、図３ａに示したようなウ ェブコーティングを得る。実施例１はデキストランサルフェートおよびＩ’１ｇ Ｃｌ□を含有するこのタイプの貯蔵器の調製を記載する。

図３ｂに示した第２の実施例では、沈澱剤をウェブ中に浸出させ、脱水し、ウェ ブの繊維上に沈積物４５を形成する。次にこの沈積物を水溶性物質、代表的には 上述のような水溶性ポリマーを用いて被覆し、流体試料と接触して沈積物の溶解 を遅らせるように働く沈積物上に徐々に放出するコーティング４６（図中の点線 ）を形成する。コーティングは噴霧、浸漬、またはウェブと沈積物に塗布された 非水性溶媒からの脱水によって行うことができる。コーティングは好ましくはウ ェブ全体に異なる厚さのコーティングを塗布するように行われ、貯蔵器を通って 試料物質が流れるとき連続して薬剤を放出させる。

図３ｃは貯蔵器内の貯蔵器粒子４８のミクロスフェアまたはマイクロカプセルの タイプを示す。ミクロスフェアは微細孔ポリマー外殻４９および、沈澱剤を含む 封入された内側領域５１から成る。封入剤を有するミクロスフェアは米国特許第 ３，７９７，４９４および３，４６４．４１３号に記載されたような既知の方法 によってｔｌｉ製され、ウェブ内に包埋される。ミクロスフェアの孔は関係する 分析物化合物を排除するような大きさであり、分析物がミクロスフェア内の高濃 度の沈澱剤にさらされないようにする。

図４は血清試料中のＨＤＬを測定するためのアッセイの間に、マトリックス２６ 内の試料適用と試料収集領域との間に起こる選択的な沈澱と分離の操作を示して いる。試料中の異なるリポタンパク質は黒丸（ＨＤＬ）、白い四角（ＶＬＤＬ） 　、白い三角（ＬＤＬ）、およびユニットの集団（集塊）によって示される。流 体試料は、図に示すように、矢印で示したように、マトリックスを通って左から 右へ流れる。

図４の左側部分はマトリックスの試料適用領域２８を示し２、表層部を切り取り 内部を見せている部分はマトリックス内の試薬貯蔵器３４の繊維３８およびこの 繊維に含まれる沈澱剤の領域３６を示している。この領域の流体試料は、図に示 したように、元のりボタンバク質濃度での元のりボタンバク質成分の全部を含む 。

図の中央部は、試薬貯蔵器から下流で、試′！４通用領域２８と試料収集部位３ ２との間に、マトリックス２６の一部４４を示す。流体試料を貯蔵器中でウェブ を通って引き出すとき、沈澱剤を試料中に放出しながら、ウェブ上の沈積物が徐 々に溶解する。溶媒前部のコレステロール含有粒子を図中の右へ試料収集領域に 対して引き出すとき、集塊および非集塊の粒子をクロマトグラフィーで分離する 。中央の表層部を切り取り内部を見せている部分に示されるように、ＬＤＬおよ びＶＬＤＬリポタンパク質は主として沈澱、または集塊した形である。

図の右側部分は試料収集部位３２でマトリックスの一部を示している。ここでは 最初に試料収集領域に到達する流体試料の成分は非ＨＤ　Ｌ粒子を殆ど含まない が、初めから適用された血液試料中に存在する濃度でＨＤ　Ｌ粒子を含む。

本発明のひとつの特徴によれば、選択的に沈澱する非ＨＤＬ血液すポタンパク質 に使用される薬剤を用いて血液を処理すると、市販品どして入手できるガラスフ ィルターに供給されるタイプのグラスファイバに対して試料中に存在するＨ　Ｄ 　Ｌの一部を結合することになることが見出された。グラスファイバへのこの結 合から得られる測定されたＨＤＬコレステロールの減少は、以下の図６のデータ ーから認められるだろう。このような結合は分離マトリックス２Ｇの繊維にコー ティングを追加して有効に排除することができる。

ふたつの好ましいタイプのコーティングとその調製法は図５Ａ〜５Ｃに示される 。

図５Ａは基５２のようなシリルヒドロキシル（Ｓｉ−ＯＨ）表面基を有するグラ スファイバ５０の断片表面部分を示す。このシリルヒドロキシル基は市販のガラ スフィルター等のグラスファイバ面が代表的である。ここには示していないが、 ファイバはまた、配合前にグラスファイバの充填性を改良するため、ガラスと共 に配合されるポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のようなポリマーを少量パーセン ト（約２重量％以下）含むように配合することができる。

図５Ｂに示したコーティング方法では、ガラスフィルターは表面シリルヒドロキ シル基を一般弐Ｒ−５ｉ　（ＯＸ）、　（式中のＲは親水性基であり、Ｘは低級 アルキル、好ましくはメチルまたはエチルラジカルであり、ｎは２または３であ る）を有する親木性シリル化剤と化学的に反応させて被覆される。例示的なシリ ル化剤はビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシシランのシリル モノおよびジエーテルを含む。

反応はシリル化ガラスについて既知の方法に従って行われる。

代表的な方法では、ビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシシラ ンのようなシリル化試薬の２％水性“ワーキング溶液は、例えばフルス・アメリ カ（ペトラーチ・システムズ、ブリストル、ＰＡ）から市販品として入手される ６２％ストック溶液から調製される。マトリックスを形成するガラスフィルター は新しく調製されたワーキング溶液に少なくとも１ｏ分間浸し、９５％エタノー ルですすぎ、オープンで５０℃で５分間乾燥する。

図５Ｂに示すように、シリル化試薬は２つの５ｉ−ＯＨ表面基のいずれかひとつ と反応し、５４で示したシリルモノまたはジエーテルコーティングを形成する。

このコーティングは未処理のガラスの表面５ｉ−０）１基をマスクして、これら の基を上記タイプの親水性Ｒ基と置き換える。

図５０に示した第２の一般的な実施例では、ガラスフィルターは５６で示したよ うな親水性ポリマーを用いて被覆される。ポリマーコーティングを適用するため の好ましい方法では、マトリックスを形成するガラスフィルターはポリビニルア ルコール（ＰＶＡ）の溶液に浸し、次に数分間高温（約９０℃）で乾燥する。最 終のポリマーの混入量は、ガラスフィルターがら有機化合物を火炎１発する前後 の買置を比較して見積もるとき、約５％の乾燥重量である。図５０はポリマー繊 維から形成されて得られたポリマーコーティング５８を示す。化学的改良方法を 用いると、コーティングは表面５ｉ−ＯＨ基をマスクしてそれらをポリマーサブ ユニットの親水性基と置き換えるために有効である。

本発明に使用するために好ましいポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリビニ ルピロリジン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチ レンイミン、ポリビニルスルホン酸、ポリ　（３−ヒドロキシ酪酸）、ポリアク リル酸、ポリ　（３−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ　（４−スチレンスルホン酸） 、ポリ（２−アクリルアミドスルホン酸）、またはポリーＬ−グルタメートを含 む。好ましいポリマーの分子量は約１０〜２００キロダルトンの間である。正確 な好ましいポリマー含量はグラスファイバマトリックスのタイプ、そして特に、 そのファイバー密度に依存する。以下に示されるように、ワットマンＢＳＢ−２ ０膜を用いると、好ましいポリマー含量は、上記のように測定して、標準として ポリビニルアルコールに関して、約４％よりも大きいポリマーである。

ＨＤＬをガラスフィルター繊維に結合する際の種々のガラス組成と表面コーティ ングの効果は研究によって知ることができ、その結果は図６に示される。この研 究では、以下に述べるように処理された６本のガラスフィルターの各々は、篩分 はマトリックスとして使用した。各場合において、ＶＬＤＬとＬＤＬを除去する ようにデキストランサルフェート沈澱試薬を用いて予備処理した血清試料を、フ ィルターに通し、次に通常のコレステロールアッセイによってＨＤＬ結合コレス テロール含量を分析した。コントロールとして、同じ試料を、フィルターに通さ ないで、溶液相法によって直接分析した。濾過物質に対するＨＤＬコレステロー ル濃度を次に未濾過物質のパーセントとして表した。

図６のグラフの上部の捧（ａ）に示すように、マトリックスのガラスにＨＤＬを 結合するため、未処理のグラスファイバ（ワットマンＢ５８−２０）を通過する 血清試料はＨＤＬコレステロール含量ノ約１５％のロスとなった。製造者の仕様 書によれば、このフィルター上のグラスファイバーは、ファイバの艷消性譬を改 良するため、配合中にガラスフィルターに混入する約１％ＰＶＡを用いて配合さ れる。

同じフィルター材料は、ビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシ シランを用いてシリル化した後、コントロール試料（ｂ）のそれと同量のＨＤＬ コレステロール含量によって証明されるように、殆どＨＤＬを結合しないことが 示された。同じフィルター材料はＰＶＡの溶液を用いて被覆したとき、４重量％ 以下のポリマー（ｃ）で、未処理ファイバよりも低い結合を示すが、なおＨＤＬ の結合を示した。４〜５重量％のＰＶＡコーティング（ｄ）を有するフィルター は評価できるＨＤＬ結合を示さなかった。

これらの結果から、この研究（ワットマンＢＡＢ−２０）に用いられた繊維組成 に対して、ＨＤＬのフィルター材料への結合を妨げるために４〜５％のＰＶＡコ ーティングが十分であったと結論することができる。必要なＰＶＡコーティング の正確な分量は使用したフィルター材料の組成そして特にグラスファイバー密度 に依存することが、追加の研究から示唆された。

また図６には６重量％のＰＶＡを含むように製造業者によって作られたガラスフ ィルターに試料を濾過した結果を示している。

これらのフィルターは、上記方法論に従って、ＰＶＡを用いて表面が特に被覆さ れていなかった。このフィルターを通過する試料は濾液のＨＤＬ−コレステロー ル含量を僅かに減らした（ｅ）、このフィルターに結合するＨ　Ｄ　Ｌの減少は 、追加したＰＶＡが一部グラスファイバ表面で通常５ｔ−ＯＨ基を被覆しマスク するように働いていることを示唆している。上記シリル化方法を用いて、６％Ｐ ＶＡ増加繊維材料をさらにシリル化したとき、ＨＤＬをフィルターに結合するこ とによる試料のＨＤＬコレステロール含量の測定できるロスは観察されなかった （ｒ）。

この研究は、親水性シリル化基による化学コーティングおよび親水性ポリマー（ 十分なポリマー濃度で）によるポリマーコーティングの両方が、沈澱剤の存在で ＨＤＬがグラスファイバに結合することを妨げるために有効であることを示して いる。

図１の記述をまとめると、装置１４は細長い支持体６２、および図示した位置で 、この支持体の下部表面に備えられた湿潤性吸着反応テストパッド６４．６６． ６８および７０から成るテストプレート６０を含む。支持体は透明であり、また はテストパッドを支持体を介して見ることができる透明ウィンドウを有する。テ ストプレート中のパッドは透明または半透明粘着性材料によって、または音波溶 接または他の適当な結合方法によって支持体に取り付けられる。

特定のアッセイにおいて使用される各パッドは、既知の方法で、視覚または検出 器のいずれかによって、光学的に検出できるパッドにおける分析物に依存する変 化を生じさせるために有効な分析物依存試薬を含む。バンドの全部または任意の 一体のサブセントを特定のアッセイにおいて用いることができる。コレステロー ルおよびトリグリセリドアッセイのための試薬の性質は、以下に、セクシヨンＢ およびＣで述べる。

理想的には、反応テストパッドは、流体が完全に浸透した後に、約１００〜１５ ０μの厚さと約３ｍｍの側部寸法を有する多孔性の溶融ポリマーまたは微細孔の ポリマー膜である。各パッドの吸収容量は好ましくは約０．５〜２μｍの間であ る。反応パッドの好ましい組成材料はポリスルホンである。

マトリックス２６の端部付近の部位３２のような試料収集部位に血清が達すると 、テストプレート６ｏを、パッド６４．６６．６８．７ｏがマトリックスと接触 するまで動がす。この位置では、マトリックス中の流体試料は、パッド表面に正 常な方向で生じる流体の動きと共にキャピラリー流によって近接するパッドに引 き入れられる。

プレートはこの位置で所望の程度に湿潤したパッドが得られるまで保持される。

パッド中の分析物依存試薬は、既知の方法で、視覚または検出器によって、光学 的に検出できるパッド中の分析物依存の変化を生じさせる。パッドの信号水準を 読み取るため、および読み取りによって収集された分析物の値を計算するための ひとつの好ましい装置は、“制御された容量アッセイ方法および装置”について １９８９年３月８日に出願された共有の米国特許出願第３２０，４７４号に記載 されており、ここに参考文献として加える。

テストプレート６０を、弾性ブロック７１．７２のような一対の弾性部材によっ て支持体１５に取り付ける。ブロックは非移送位置に対してバンドをバイアスに するように働き、この位１でバンドは、代表的には約０．５ないし１　、　ＯＬ １＃の間の間隔でディスペンサーの試料移送表面から離れる。

Ｂ、ＨＤＬアッセイ 少量の血液試料でＨＤＬを測定するためのアッセイにおいて装置を操作するため 、試料をウェルｌＧに置き（図１３）、試料をキャピラリーによってパッド２２ に引き入れパッドに通して、血球を含まない血清試料を生成し次に貯蔵器３４を 介してマトリックス２６に引き入れる。流体試料をウェブを介して貯蔵器に引き 入れると、沈澱剤を流体試料に放出しながら、貯蔵器ウェブ上の沈澱剤／バイン ダー沈積物は徐々に溶解する。上記のように、貯蔵器を通る全溶媒流の選択され た部分−一代表的には少なくとも最初の１０〜４０％の全溶媒流、そして好まし くは少なくとも最初の２０％の全溶媒流に対して、全量の沈澱剤を放出するよう に設計する。沈澱剤の放出速度は、相当量のＨＤＬを沈澱することなく試料中に 存在するＬＤＬおよびＶＬＤＬを選択的に沈澱するために必要な範囲内にある流 体試料中の試薬の濃度を維持するような速度である。

溶媒前部の下流領域中のコレステロール含有粒子は、マトリックス中にそして試 料収集領域に向って図の右側に引き入れられるので、上記のように図４に示した ように、凝集粒子および非凝集粒子はクロマトグラフィーで分離される。最初に 試料収集領域に達する流体試料は非ＨＤＬ粒子を殆ど含まないが、マトリックス に導入される血球を含まない（血清）流体試料血清と同じＨＤＬ濃度を有する。

図７は、支持体６２を介して見るときの装置１４内のマトリックス２６の上面の 平面図であり、また６４．６６．６８、および７ｏで示される４個の反応パッド がテストプレート６２上に収容されていることを示す図である。図中の点線７２ は下にある領域２２の縁部を示し、装置内の貯蔵器３４の縁部に近接しており、 マトリックス２６の下の表層部を切り取って内部を見せている。貯蔵器は、デキ ストランサルフェートおよびＭｇＺｏを徐々に放出するために設計されており、 上述のように、ウェブ繊維３８上の乾燥沈澱物３６として示される。

図から、マトリックスの両側に対して引き出される流体試料は沈澱剤にさらされ るので、マトリックスの両側の非ＨＤＬ粒子は、流体試料が反応パッドの下にあ る試料収集領域に達するときＨＤＬ分析物から分離される。

図７の実施例における反応パッドのうち２個は、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ ＩおよびＨＤＬａ）の二重アッセイのために設計され、図では６６および６日で 示した。２個の参照標準パッドは（６４および７０で示したＢ、およびＢ、）、 コレステロール値を測定するため自己収集標準曲線を与え、これについては“自 己収集されたアッセイおよび方法“として１９８９年８月２３日に出願された米 国特許出願第３９６．３２６号に記載されており、ここに参考文献として加える 。ＨＤＬテストおよび参照標準テストのバンドの多くの配置が可能であることは 高く評価される。すなわち、参照標準パッドは、各場合において交替の場所でＨ ＤＬテストパッドと共に、二者択一的に６６および６８．６４および６６．６８ および７ｏに位置する。また、装置はコレステロール依存試薬を含む唯一の反応 テストパッドをもつようにすることができる。さらに、装置は参照標準パッドな しに作ることができ、標準化した反射率値を使用し、テストした流体試料中に存 在するＨＤＬコレステロールの濃度を測定することができる。

血清がマトリックス２６の端部付近の試料収集部位（３０，３２）に達すると、 テストプレートをその試料移送位置に向がって勅がし、そこでテストバンドはマ トリックスと接触す之。この位置で、ディスペンサー中の流体試料を、パッド表 面に対して正常な方向に生しる流体の動きと共にキャピラリー流によってパッド に引き入れる。プレートはパッドが所望の湿潤度に達するまでこの位置に保持さ れる。

テストバンド中のコレステロール依存試薬は、既知の方法で、視覚的にまたは検 出器によって、光学的に検出できるパッド内の変化を生じさせる。パッドの信号 水準を読み取るため、および読み取った値に基づいて補正された分析値を計算す るためのひとつノ好ましい装置は、“制御された容量アッセイ方法および装ｆ“ について１９８９年３月８日に出願された上記の共存の米国特許第３２０　、４ ７４号に記載されており、ここに参考文献として加えた。

ＨＤＬアッセイを行うように配置するとき、上記装置はテスト（ＨＤＬ）および 参照標準パッド（Ｂ＋、Ｂｉ）の両者を含む。テストパッドはＨｚ（ｈを着色信 号反応生成物に変えるため共通の経路試薬成分を含む。共通の経路成分はパーオ キシダーゼ、およびＨ２０□の存在で、パーオキシダーゼによってはっきりと着 色された信号反応生成物に変える単一またはカップルになった染料システムを含 む、　ｎ、ｏｆの酵素生成に対して、種々の基質特異的オキシダーゼを用いる酵 素着色反応、およびその後の着色された反応生成物を形成するための染料の酸化 は良く知られている。またＨＤＬテストパッドは共通の経路成分に加えて、ＨＤ Ｌから遊離コレステロールを放出するためのコレステロールエステラーゼ、およ び試料中の遊離コレステロールと反応してＨ２Ｏ２を生成するためのコレステロ ールオキシダーゼを含む。

参照標準パッドは、共通経路成分に加えて、種々の既知量の非コレステロール参 照化合物、好ましくはＤ−アミノ酸、およびパッドが流体試料で濡れたときにＨ ，Ｏ□を発生するため、オキシダーゼ、例えばＤ−アミノ酸オキシダーゼを含む 。

反応に存在する反応成分およびＨＤＬアッセイに使用される参照パッドを表１に まとめて示す。

紅 ＨＤＬ試料（ＨＤＬ）　＋　＋ コレステロールエステラーゼ　＋ コレステロールオキシダーゼ　＋ Ｄ−アミノ酸　十 り−アミノ酸オキシダーゼ　＋ パーオキシダーゼ＋染料　＋　＋ 上記アッセイ装置において、各参照標準に加えられる参照化合物の分量は、限定 された反応混合物の所定容量の存在で、コレステロールオキシダーゼの存在で同 一の条件下にアッセイされた既知濃度のコレステロールに対応する信号水準を生 成するように選択される。アッセイで生成する実際の参照標準はまた（ａ）血清 試料中（ＨＤＬコレステロールの測定を妨害する非ＨＤＬ化合物がら区別される とき）に存在する可溶性妨害化合物の分量、（ｂ）パッド中の反応成分の状態、 および（ｃ）温度および反応時間を含む反応条件にも依存するだろう。

２個の参照バンドの信号値は、参照化合物濃度の関数としてプロットするとき、 図８に示されるような２点標準曲線を与える。

この信号値は、測定された信号の性質とプロットされた信号値との間の既知の関 係を用いる反射率または他の測定された信号の諸性質から計算される。図８の曲 線がグラフの元のものとクロスしないという事実は非線形抑制効果を示している 。

二重のＨＤＬバッドに対して測定された信号値は参照標準曲線上にプロットされ 、参照標準とコレステロールの濃度との間の既知の一致を使用して、これらのパ ッドの各々のコレステロール濃度を決定する。このように計算されたコレステロ ール値は（ａ）標準曲線に基づいて計算され、（ｂ）全部で４個の反応バンドが これらの因子において同し変量に委ねられると仮定すると、反応条件における変 量、および共通経路成分の抑制効果と活性のロスに対して自動補正されることは 高く評価されるだろう。ＨＤＬと結合したコレステロールの濃度は２個のＨＤＬ 試料パッドから測定されるコレステロール濃度の平均から計算することができる 。あるいはコレステロール濃度を、単一の参照標準、または反射率が歴史的に得 られる標準、と比較される単一のＨＤＬ試料パッドから得られる反射率から決定 することができる。

Ｃ，マルチ″−８アッセイ このセクションは、ＨＤＬコレステロールを含み、さらに１種またはそれ以上の 次の分析物：全血清コレステロール、ＬＤＬコレステロール、および血清トリグ リセリドを含む、血清成分のマルチ分析物測定のために設計されるアッセイ装置 の実施例を記載する。

１ｆｆ１９ａはアッセイ装置における２つの部分マトリックス７６．７８の上面 の平面図であり、点線７２はマトリックスの試料適用領域の下にある篩分はバン ド領域の縁部を示す。繊維３８およびこの繊維上に含まれる沈澱剤３６の沈積物 は、この装置内の貯蔵器７４から成るマトリックス７６の右側部のみを表層部で 切り取って内部を見せた図で示している。マトリックス７６の方へ引き出される 流体試料はこの貯蔵器を通過し、沈澱剤を徐々に放出させ、試料物質中の非ＨＤ Ｌリポタンパク質を沈澱させる。マトリックス７８の左側の方へ篩分はバンドか ら流れる物質は沈澱剤にはさらされない。図９ｂは、マトリックス７６．７８の ２つの部分の間の区分、および装置の左側ではなく右側の貯蔵器内に点画によっ て示される沈澱剤８２の存在を示す試料通用領域における装置の断片的な断面図 を示す。貯蔵器の両側と装置のマトリックスとの間の区分は図９３および９ｂに おいて空間として示される：代りに、物理的防壁、例えば流体試料を透さず従っ て篩分はマトリックスの２つの部分の間の拡散を妨げるプラスチックシートを装 置内に使用することができる。試薬貯蔵器に対応する装置の左側に８０で示した 領域はウェブ祿試薬貯蔵器マトリックスを含むか、または分離マトリックス７８ によって占領されることができる。全体のマトリ、クス７６．７８は、上記のよ うに、好ましくは親水性ポリマーまたはシリル化剤を用いて被覆される。

図９３の実施例で示される４個のテスト反応テストパッドは全コレステロール（ ＴＣｈ）　、）リグリセリド脂質（ＴＧ）　、およびＨＤＬコレステロール（Ｈ ＤＬ）を測定するために設計され、参照標準テストバンド（Ｂ１）を含む。各パ ッドは、Ｈ２０□をはっきりと着色された信号反応生成物に変えるため上述の共 通経路の成分を含む。参照標準パッドは既知の分量の参照化合物、例えばＤ−ア ミノ酸、および、上述のように、対応するオキシダーゼを含む。

全コレステロールおよびＨＤＬテストパッドの各々は、共通経路の成分に加えて 、ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬ粒子を含む血清リポタンパク質から遊離コレ ステロール形態でエステル化コレステロールを放出するためのコレステロールエ ステラーゼ、および流体試料中の遊離コレステロールとの反応によってＨｚＯ□ を生成するためのコレステロールオキシダーゼを含む。

トリグリセリドテストパッドは、共通経路の成分に加えて、リパーゼ、Ｌ−グリ セロールキナーゼ、およびＨｔＯ□をトリグリセリドから生成するため、Ｌ−グ リセロール−３−ホスフェートオキシダーゼを含む。これら３種の酵素はトリグ リセリド基質をＬ−グリセロール−３−ホスフェートに変えて、後者の化合物を Ｈ，Ｏ□の発生と共に酸化する働きがある。ＴＧパッドに引き入れた血清試料は すべての血清リポタンパク質を含むので、ＴＧ倍信号全血清トリグリセリドを表 わす。

アッセイ中の参照！１．準パッドは図１０に示されるような単一点標準曲線を構 成するために用いられる。この標準曲線はコレステロールおよびトリグリセリド の予定された濃度に対応し、従って測定された信号値から分析物濃度を決定する ためのプロットを与える。上述のように、標準曲線はまた共通経路成分中の酵素 活性のロスに対して、また、非線形抑制効果は補正されないが、反応条件の変化 に対して分析物の示数を補正するように働く。図８に示されるように、２点標準 曲線は勿論５個のバンドのアッセイ装置を用いて構成することができる。

全コレステロール、トリグリセリド、およびＨＤＬに対する信号値は標準曲線上 にプロットされ、３個の分析物パッドに対する自動補正された分析物濃度値を決 定する。これらの数値から、ＬＤＬコレステロールを次の関係式から計算するこ とができる：ＬＤＬコレステロール＝全コレステロール〜全トリグリセリド１５ −ＨＤＬコレステロール上述のことから、本発明の種々の目的および特徴に如何 に合致しているかが認められるだろう。アッセイ装置は、流体試料を予備処理ま たは遠心分離する必要がなく、選択的に沈澱できる妨害化合物を含有する流体試 料中の分析物をアッセイするために簡単な１段階方法を提供する。この特徴は特 に妨害化合物を除去するために実際に予備処理することができない少量の多数の 分析物をアッセイするために有用である。特に、この方法は少なくとも１種の分 析物、例えばＨＤＬ、が関係するりボタンバク賞を選択的に除去する必要がある マルチ分析物アッセイに用いられるような一般的には５０．ｃｒｌ以下の少量の 血液を用いることを可能にする。

次の実施例はコレステロールおよび他の脂質テストのためのアッセイ装置の作成 と使用を示す。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を制限 するものではない。

大施炎上 ＨＤＬのためのアノ］Ａ 図１に示したようなアッセイ装置を、セクションＡに述べた好ましいフィルター 材料を用いて作成した。ストック溶液Ａは２ｇ／１００ｍ１の５０，０００ダル トンのデキストランサルフェートを含んでいた。ストック溶液ＢはＩＭの酢酸マ グネシウムを含んでいた。　１／８”と５７１６″と１５０ミクロン厚さのグラ スファイバーフィルターにストック溶液ＡおよびＢを各々０．７５μｌおよび２ ．２１μｌの水を加えた。フィルターを２０分間５０℃で乾燥し、上述のように 、沈澱側含有貯蔵器として装置に組み入れた。

装置内の４個のテストパッドは上記のセクションＢに記述した試薬を含んでいた 。各反応パッドは、２Ｘ４１１１１の長方形に切断された１５０　ミクロン厚さ のポリスルホンフィルター（ＴＲ４５０；ゲルマン・サイエンシーズ、アン・ア ーボア、Ｍｌ）から作成した。

コレステロール測定のための２個の反応パッドは、１５０Ｕ／ｍｌのコレステロ ールエステルヒドロラーゼ、ｌ０ＩＪ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼ、８ ０Ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ、および２０ｍＭの４−アミノアンチピリン（４ −ＡＡＰ）と８０ｍＭのＮ−エチル−Ｎ−スルホヒドロキシプロピル−Ｍ−）ル イジン（ＴＯＯ５）を、濃縮された形で、中性ｐＨのホスフェート緩衝液中に含 む１０μ夏の試薬溶液を浸出させた。参照標準用の２個の反応パッドは、４００ ／ｍｌのＤ−アミノ酸オキシダーゼ、８０１Ｊ／ｍｌのパーオキシダーゼ、およ び２０ｍＭの４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）と８０ｍＭのＴＯＯ５を、 濃縮された形で、ホスフェート緩衝液中に浸出させて、乾燥した層を含んでいた 。次に３μｍの２０ｍＭのＤ−アミノ酸エタノール溶液を加えて、パッドを゛乾 燥させた。参照標準の分量を、限定された反応緩衝液を含む液相アッセイ中で、 限定された反応条件下に換算し、非イオン性洗剤中の予定された容量の既知濃度 のコレステロール溶液から、同様に測定されたコレステロール濃度と比べた。減 圧下に乾燥さゼた後、反応パッドを集めて装置中の反応パッドプレートに取付け た。

ヒトのテスト対象からの全血液試料を従来通りに得て、４個のテストバンドを湿 らせるに十分な分量で装置内のウェルに塗布した。湿らセたパッドを室温で９０ 秒間、またはさらに着色の発生が観察されなくなるまでインキュベートした。

分析物関連の信号を、５００〜７００ｎｍの照明波長で、反射率分光光度計によ って読み取った。参照標準パッドのための数値をプロットして、コレステロール の示度を計算する２点自動補正標準曲線を与えた。

ｆｌＪＬＬ ′　ＨＤＬアッセイ 使用したアッセイ装置は図１を参照して述べたものと似ており、実施例１に記載 したように、貯蔵器を使用して作成し、中性ｐＨでデキストランサルフェート（ ＭＷ５０，０００）　−Ｍｇ沈澱剤を含ませた。

反応バンドの配合は、コレステロールの酵素による測定のため、実施例１に記載 したものと同じであった。１７８”と５７１６”と１５０　ミクロンの厚さのグ ラスファイバフィルターを、５重量％のポリビニルアルコールを用いて被覆し、 その他は上記実施例１と同様に用いた。

５種類の試料を、既知分量のＨＤＬコレステロールを１５〜１００ｍｇ／ｄｔの 範囲で濃度を変化させて、均一に間隔をあけた稀釈度で含むように、ヒト血清か ら調製した。全試料のＨＤＬコレステロールをアッセイ装置中で３回測定し、そ の結果を表２に示した。

表２ １　２２．８　２２．８ 計夏値または理論値（Ｙ軸）を、図１１に示すように、本発明のアッセイ装置で 測定したときの試料に対して得られた結果に対してプロットした。

この実施例によって示されるように、本発明の改良されたアッセイ装置は、本発 明との対比で、静脈血試料を必要として液体試料の取扱いを含む液相テストと同 じ正確度を有するＨＤＬ測定値を与える。

大施炎主 血ｍじ一二１± このアッセイ装置は、図９を参照して述べたものと類似しており、下にある篩分 はパッド半分だけに近い試料適用領域中に沈澱試薬貯蔵器を有し、実施例１に記 載した貯蔵器および反応テストパッドの配合を用いて作成される。

反応パッドのための値は上記のように５００〜７００ｎ１１で測定される。５番 目のパッドからの反射率の測定は標準曲線を構成するために用いられ、この曲線 は実施例１に記載したように既知のコレステロールとトリグリセリド濃度に対し て標準化される。最初の４個のバンドからの信号値はこの曲線上にプロットされ 、補正された分析物濃度は濃度軸上の対応する位置から読み取られる。

全血清コレステロール、ＨＤＬ、遊離コレステロールおよびトリグリセリドは標 準曲線から測定され、これらの数値は上述のようにＬＤＬを計算するために用い られる。

本発明は特定の実施例と構成を参照して記載したが、種々の変化および変更が本 発明から離れることなく行われることは当業者によって高（評価されるだろう。

Ｆｉｇ、５Ｃ ｐ、ｊｇ、５　ＤＬ（コントロールの％）アッセイ装！によって測定したＨ　Ｄ 　Ｌ　（ｍｇ／ｄｌ）Ｆｉｇ、９ａ Ｆｉｇ、９ｂ 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＡＵ 、ＣＡ、ＦＩ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎ。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．予定された濃度の沈澱剤にさらされる際に、選択的に沈澱させることができ る可溶性アッセイ妨害化合物も含む流体試料中の可溶性分析物を測定するための アッセイ装置が、該試料が篩分けマトリックスを通って該マトリックス中の試料 適用位置から試料収集位置まで流れるとき、該流体試料中の沈澱物質から可溶物 を分離することができる該篩分けマトリックス、このような予定された濃度の範 囲内にある該流体試料中に該沈澱剤濃度を生じさせるために有効な該マトリック スに流体試料が流入しこれを通過するとき、試薬貯蔵器から該マトリックス中に 該剤を放出する速度を生み出すための放出装置および該沈澱剤を含む該試薬貯蔵 器、および 該試料収集位置にて収集される流体試料をアッセイすることができるアッセイパ ッド から成る前記アッセイ装置。
2. ２．該マトリックスがグラスファイバの網状組織から成り、該試薬貯蔵器が該フ ァイバ上に被覆されている、請求項１記載の装置。
3. ３．該沈澱剤がポリアニオン性化合物および第ＩＩ族の金属カチオンを含み、流 体試料と接触して、極めて低密度のリボタンパク質、および低密度のリボタンパ ク質を選択的に沈澱するために有効な該化合物の濃度を生じさせる速度にて、該 放出装置が該ポリアニオン性化合物を放出するために有効である、請求項１記載 の装置。
4. ４．該ポリアニオン性化合物が硫化多糖類、ヘパリン、およびリンタングステン 酸から成る群から選ばれ、第ＩＩ族金属がＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣａ２＋ から成る群から選ばれる、請求項３記載の装置。
5. ５．該ポリアニオン性化合物がデキストランサルフェートであり、該第ＩＩ族金 属がＭｇ２＋であり、そして該マトリックス中の該沈澱剤の濃度が、該流体試料 と接触後、デキストランサルフェートに対して約０．５と１．０ｍｇ／ｍｌの間 であり、約０．０４５ないし０．１５ＭのＭｇ２＋の間にある、請求項４記載の 装置。
6. ６．該マトリックスが、このような沈澱剤の存在で該マトリックスに該可溶性分 析物を結合することを妨げるために有効なコーティング物質を含む、請求項１記 載の装置。
7. ７．高密度のリボタンパク質と特異的に結合した血清コレステロールを測定する 際に使用するため、該沈澱剤はポリアニオン性化合物と第ＩＩ族金属カチオンを 含有し、流体試料と接触して、極めて低密度のリボタンパク質、および低密度の リボタンパク質を選択的に沈澱するために有効な該化合物の濃度を生じさせる速 度にて、該放出装置が該ポリアニオン性化合物を放出するために有効である、請 求項１記載の装置。
8. ８．該ポリアニオン性化合物が硫化多糖類、ヘパリン、およびリンタングステン 酸から成る群から選ばれ、該第ＩＩ族金属がＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣａ２ ＋から成る群から選ばれる、請求項７記載の装置。
9. ９．該ポリアニオン性化合物がデキストランサルフェートであり、該第ＩＩ族金 属がＭｇ２＋であり、そして該マトリックス中の該沈澱剤の濃度が、該流体試料 と接触後、デキストランサルフェートに対して約０．５と１．０ｍｇ／ｍｌの間 であり、約０．０４５ないし０．１５ＭのＭｇ２＋の間にある、請求項８記載の 装置。
10. １０．該マトリックスが、このような沈澱剤の存在で該マトリックスに該高密度 リポプロテインを結合することを妨げるために有効なコーティング物質を含む、 請求項７記載の装置。
11. １１．該マトリックスがグラスファイバの網状組織から成り、該コーティング物 質が親水性ポリマーである、請求項１０記載の装置。
12. １２．前記コーティングがポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ポリ エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリビ ニルスルホン酸、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）、ポリアクリル酸、ポリ（３−ヒ ドロキシ吉草酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（２−アクリルアミ ドスルホン酸）、またはポリ−Ｌ−グルタメートから成る群から選ばれる、請求 項１１記載の装置。
13. １３．該マトリックスが表面シリル基を有するグラスファイバの網状組織から成 り、前記コーティングが、該表面シリル基を含み、シリルエーテルから成る、請 求項７記載の装置。
14. １４．コーティングがビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシシ ランのシリルモノまたはジエーテルから成る、請求項１３記載の装置。
15. １５．血液流体試料中の低密度のリボタンパク質と極めて低密度のリボタンパク 質とから高密度のリボタンパク質を分離する方法が、 該低密度のリボタンパク質と極めて低密度のリボタンパク質を選択的に沈澱する ために有効な一定量の沈澱剤と試料を混合し、該試料を、高密度のリボタンパク 質がグラスファイバに結合することを妨げるコーティングを有する該グラスファ イバのマトリックスに通過させる 工程から成る前記方法。
16. １６．該沈澱剤がポリアニオン性化合物および第ＩＩ族金属カチオンを含む、請 求項１５記載の方法。
17. １７．該ポリアニオン性化合物が硫化多糖類、ヘパリン、およびリンタングステ ン酸から成る群から選ばれ、そして該第ＩＩ族金属がＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、およ びＣａ２＋から成る群から選ばれる、請求項１６記載の方法。
18. １８．該マトリックス上の該コーティングがポリビニルアルコール、ポリビニル ピロリジン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレ ンイミン、ポリビニルスルホン酸、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸）、ポリアクリル 酸、ポリ（３−ヒドロキシ吉草酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（ ２−アクリルアミドスルホン酸）、またはポリ−Ｌ−グルタメートから成る群か ら選ばれる、請求項１５記載の方法。
19. １９．該マトリックスが表面シリル基を有するグラスファイバから成り、前記コ ーティングが、表面シリル基を含み、シリルエーテルから成る、請求項１５記載 の方法。
20. ２０．該コーティングがビス（ヒドロキシエチル）アミノプロピルトリエトキシ シランのシリルモノまたはジエーテルから成る、請求項１９記載の方法。