DE9117297U1 - Vorrichtung zur Festphasen-Präzipdation - Google Patents
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Description
11. Februar 2000 CHOLESTECH Co&phgr;oration C29155GBMT1 HS/Hc/rö
ANMELDEUNTERLAGEN FÜR DIE VORLIEGENDE
GEBRAUCHSMUSTERANMELDUNG
1. Feld der Erfindung:
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Festphasen-Präzipitationsdiagnose-Vorrichtung und auf ein Verfahren zum Trennen von Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) von Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) in einer Blutflüssigkeitsprobe.
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2. Referenzen:
Arai, F. et al. U.S. Patentnummer 4,826,761, erteilt 2. Mai 1989.
Bachorik, P.S. et al., in Methods in Enzymology, Vol. 129, Academic Press (1986) pp. 78 bis 100.
Figueras et al. U.S. Patentnummer 4,144, 306, erteilt am 13. März 1979.
Goldfarb, A. et al. U.S. Patentnummer 3,464,413, erteilt am 2. September 1969.
Vogel et al. U.S. Patentnummer 4,477,575, erteilt am 16. Oktober 1984.
Zaffaroni, A. U.S. Patentnummer 3,797,494, erteilt am 19. März 1974.
Ziegenhorn et al. U.S. Patentnummer 4,544,630, erteilt am 1. Oktober 1985. 25
3. Hintergrund der Erfindung:
Es gibt einen Trend zu weitverbreiteten Tests von Blut und anderen Körperflüssigkeiten auf Analyten, welche Vorhersagen über den Gesundheitszustand wie
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beispielsweise das Risiko einer Koronar-Erkrankung ermöglichen. Die Menge von Cholesterin, die im Blut vorhanden ist, ist ein Faktor, der mit dem Risiko einer Erkrankung der Koronar-Arterien zusammenhängt.
Cholesterin zirkuliert im Blut überwiegend in einer proteingebundenen Form. Die Proteine, welche Cholesterin transportieren, sind die Lipoproteine, die nach ihrer Dichte in drei Klassen unterteilt werden. Die Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL) sind triglyceridreiche Lipoproteine, die in der Leber synthetisiert werden und letztlich zu Lipoproteinen geringer Dichte (LDL) umgewandelt werden, die das meiste Plasmacholesterin im Menschen transportieren. Die Lipoproteine hoher Dichte (HDL) sind Lipoproteine, die im Katabolismus der triglyceridreichen Lipoproteine und beim Abtransportdes Cholesterins von peripheren Geweben und dem Transport zur Leber involviert sind. Ein inverser Zusammenhang zwischen dem HDL-Pegel im Serum und dem Risiko einer Erkrankung der Koronar-Gefäße wurde festgestellt. Insbesondere dann, wenn der Anteil des dem HDL zugeordneten Cholesterin im Serum gering ist, ist das Risiko einer Erkrankung der Koronar-Gefäße erhöht.
Im Hinblick auf die Bedeutung des relativen Serum-Cholesterin-Spiegels bei der Risikobeurteilung und beim Management arteriogener Erkrankungen wurden beachtliche Bemühungen unternommen, um große Populationen von sowohl normalen als auch hoch gefährdeten Individuen auf den Serumspiegel von HDL, LDL sowie des gesamten Cholesterins und der Triglyceride zu untersuchen. Die Effektivität der Behandlung von hoch gefährdeten Individuen wurde durch regelmäßiges Testen des Serum-Cholesterin-Spiegels der verschiedenen Lipoproteinklassen überwacht.
Eine Methode zum Testen des LDL und des HDL Cholesterin basiert auf der selektiven Präzipitation von nicht-HDL Lipoproteinen im Serum durch polyanioni-
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sehe Verbindungen, wie beispielsweise Dextransulfat, Heparin und Phosphorwolframat in Gegenwart eines Kations der zweiten Hauptgruppe, beispielsweise Mg2+, Mn2+ und Ca2+. Die Spezifität und der Grad der Präzipitation hängen von einer Vielzahl von Faktoren einschließlich des Typs und der Konzentration des Polyanion/Metall-Agens ab. Im allgemeinen ist die Reihenfolge der Präzipitation der Serumcholesterinteile mit ansteigender Konzentration des Polyanions VLDL, LDL und HDL. HDL bleibt gewöhnlich löslich bei Konzentrationen von Heparin oder Dextransulfat, welche Partikel geringerer Dichte vollständig ausfällen, obwohl unbedeutende apoE-Spezies von HDL gemeinsam mit den Partikeln geringer Dichte co-präzipitiert werden können. Durch selektive Präzipitation der Partikel geringer Dichte können HDL Serum-Cholesterin-Spiegel bestimmt werden. Der HDL-Wert kann dann gemeinsam mit den Messungen des gesamten Serumcholesterins und der Triglyceride verwendet werden, um den LDL-Wert nach der folgenden Beziehung auszurechnen:
LDL-Cholesterin = gesamtes Cholesterin - Triglyceride / 5 - HDL-Cholesterin
In einer typischen Lipid-Assay-Methode wird ein kleines Blutvolumen entnommen und zentrifugiert, um eine klare Probe von Plasma- oder Serumflüssigkeit zu erzeugen. Die Flüssigkeitsprobe wird dann in Aliquots auf verschiedene Teströhrchen verteilt, zur Bestimmung (a) des gesamten Serumcholesterins, (b) der Triglyceride und (c) des HDL-Cholesterins. Die HDL-Probe wird wie oben beschrieben präzipitiert und die Partikel geringer Dichte werden durch Filtration oder Zentrifugation vor dem Cholesterinnachweis entfernt. Die Proben werden dann mit einer Enzymmixtur zur Reaktion gebracht, wobei die Mixtur Cholesterin-Esterase, Cholesterin-Oxidase, Peroxidase und einen Farbstoff enthält, der in Gegenwart von H2O2 zu einem klar unterscheidbar gefärbten Produkt oxidiert werden kann. Die Röhrchen können spektophotometrisch abgelesen werden, und
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die gewünschten Cholesterinwerte des gesamten Cholesterins, des HDL und des LDL können somit bestimmt werden.
Trotz der Genauigkeit und Zuverlässigkeit, die mit dem oben beschriebenen Flüssigphasen-Cholesterintest erreicht werden kann, hat der Assay eine Anzahl von Beschränkungen beim Gebrauch für breitangelegte Untersuchungen. Erstens benützt die Methode eine venöse Blutprobe, welche eine trainierte Fachkraft zur Entnahme und Fraktionieren der Blutprobe sowie zum Aufteilen der behandelten Blutprobe in Aliquots auf die Teströhrchen erfordert. Zumindest eines der Probenröhrchen (zur HDL-Bestimmung) muß mit einem Präzipitations-Agens behandelt und weiter prozessiert werden, um das präzipitierte Material zu entfernen. Wenngleich einige dieser Prozeduren automatisiert werden können, sind Analysemaschinen, die zu diesem Zweck entworfen sind, teuer und stehen außerhalb großer Kliniken nicht verbreitet zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung für einen Assay bereit, welche viele der o. g. Schwierigkeiten im Zusammenhang mit den Prozeduren eines Flüssigkeits-Assays im wesentlichen überwindet zum Messen des Serum-Cholesterin-Spiegels bereit. In einer Ausführungsform ist die Vorrichtung entworfen zum Messen der Konzentration des HDL-assoziierten Cholesterins in einer Blutprobe, welche ebenfalls LDL- und VLDL-Partikel enthält. Die Vorrichtung umfaßt eine Siebmatrix, die in der Lage ist, lösbare und präzipitierte Lipoproteine zu trennen, wenn eine flüssige Probe durch die Matrix wandert. Ein mit der Matrix verbundenes Reservoir ist bereitgestellt, um ein Präzipitations-Agens zum selektiven Präzipitieren der LDL und VLDL freizusetzen, wenn eine flüssige Probe in und durch die Matrix gezogen wird. Dies erlaubt eine Trennung des HDLs von den präziptitierten Lipoproteinen basierend auf der schnelleren Migration des HDL durch die Siebmatrix. Die somit von den nicht-HDL Lipoproteinen entvölkerte Flüssigkeitsprobe wird mit einem Assay auf Cholesterin untersucht.
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4. Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung für ein Assay bereitzustellen, welches die o. g. Schwierigkeiten im Zusammenhang mit Flüssigkeits-Assays im wesentlichen reduziert oder überwindet, zum Assay-Nachweis von Serum LDL, HDL und dem gesamten Cholesterinwert.
Eine allgemeine Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte Vorrichtung für ein Festphasen-Assay zum Messen eines löslichen Analyten in einer Flüssigkeitsprobe bereitzustellen, welche ebenfalls eine lösliche Komponente beinhaltet, die den Assay stört. In einer Ausführungsform umfaßt die Erfindung eine Assay-Vorrichtung zum Gebrauch zur Messung von Serumcholesterin, welches spezifisch mit HDL assoziiert ist. Ein Präzipitations-Agens präzipitiert selektiv VLDL und LDL, so daß HDL-assoziiertes Cholesterin ohne Störung durch jene Komponenten gemessen werden kann.
Die erfindungsgemäße Assay-Vorrichtung umfaßt eine Siebmatrix, welche lösliches Material von präzipitiertem Material in der Flüssigkeitsprobe trennt, wenn die Probe vom Probeneintragsort zum Probesammeiort in der Matrix durch die Matrix fließt. Ein Reagenzreservoir in der Vorrichtung ist entworfen, um langsam ein Präzipitations-Agens in die Matrix freizusetzen, wenn die Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Matrix aus Glasfasern zusammengesetzt und das Präzipitations-Agens ist auf die Glasfasern beschichtet. Die langsame Freisetzung des Präzipitations-Agens von dem Reservoir stellt eine Konzentration des Präzipitations-Agens in der Matrix bereit, welches effektiv die störende Verbindung bzw. störenden Verbindungen in der Probe präzipitiert ohne den zu testenden Analyt zu präzipitieren. In der Vorrichtung ist ebenfalls ein Assay-Pad enthalten, auf welches die Flüssigkeitsprobe, die
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am Probensammelort der Matrix gesammelt wird, zur Bestimmung der Konzentration des Analyten in der Flüssigkeitsprobe übertragen werden kann.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform beinhaltet das Präzipitations-Agens die Kombination einer polyanionischen Verbindung und eines Metallkations der zweiten Hauptgruppe, und die Freisetzungsmittel sind wirksam, um die polyanionische Verbindung mit einer Rate freizusetzen, die ausreicht, eine Konzentration der Verbindung bereitzustellen, die die VLDLs und HDLs selektiv präzipitiert. Bevorzugte polyanionische Verbindungen zur Verwendung in dem Reagenzreservoir umfassen sulfatierte Polysaccharide, Heparin und Phosphorwolframsäure, und das Metall der zweiten Hauptgruppe ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mg2+, Mn2+, und Ca2+. Eine bevorzugte Kombination beinhaltet abschließende Konzentrationen von 0,5 bis 1,0 mg/ml Dextransulfat und 0,045 bis 0,15 M Mg2+. Die bevorzugten Zusammensetzungen des Präzipitations-Agens sind besonders geeignet für einen Assay des HDL-assoziierten Cholesterins.
In einer anderen Ausfuhrungsform beinhaltet die Vorrichtung ein auf die Matrix aufgetragenes Beschichtungsmaterial, welches das Binden des lösliches Analyten an die Matrix in Gegenwart des Präzipitations-Agens verhindert. Bevorzugte Be-Schichtungen, die wirksam sind, das Binden von HDLs an Glasfasern zu verhindern, umfassen hydrophile Polymere wie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidin, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, Polyethylenemin, Polyvinylsulfonsäure, Poly(3-Hydroxybuttersäure), Polyacrylsäure, Poly(3-Hydroxyvaleriansäure), Poly(4-Styrolsulfonsäure), Poly(2-Acrylamidosulfonsäure) oder Poly-L-Glutamat.
Eine andere bevorzugte Beschichtung für eine Matrix aus einem Glasfasernetzwerk mit Oberflächensilylgruppen ist eine solche, bei der die Beschichtung einschließlich der Oberflächensilylgruppen zusammengesetzt ist aus Silylethem, ins-
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besondere Silylmono- oder -diethern von Bis(Hydroxyethyl)-Aminopropyltriethoxysilan.
In einem Verfahren zum Trennen von HDLs, von LDLs und VLDLs in einer Blutflüssigkeitsprobe wird die Blutflüssigkeitsprobe mit einer Menge eines Präzipitations-Agens gemischt, welche selektiv die LDLs und VLDLs präzipitiert. Die Probe wird dann durch eine Matrix von Glasfasern geleitet, die eine Beschichtung haben, welche das Binden des HDL an die Glasfasern verhindert.
Das vorzugsweise bei dem Verfahren verwendete Präzipitations-Agens umfaßt eine polyanionische Verbindung und ein Metallkation der zweiten Hauptgruppe. Polyanionische Verbindungen, welche für die erfindungsgemäße Methode besonders geeignet sind, umfassen sulfatierte Polysaccharide, Heparin und Wolframphosphorsäure. Das Metall der zweiten Hauptgruppe ist vorzugsweise Mg2+, Mn2+, oder Ca2+.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Methode ist die Beschichtung, welche benutzt wird, um das Binden des löslichen HDL an die Glasfasermatrix in Gegenwart des Präzipitations-Agens zu verhindern, vorzugsweise ein hydrophiles Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidin, Polyethylenglycol, Polyacrylsäure, Poly(3-Hydroxyvaleriansäure), Polypropylenglycol, Poylethylenemin, Polyvinylsulfonsäure, Poly(3-Hydroxybuttersäure), Poly(4-Styrensulfonsäure), Poly(2-Acrylamidosulfonsäure) oder Poly-L-Glutamat.
In einer anderen Ausfuhrungsform umfaßt die Matrix Glasfasern mit Oberflächensilylgruppen, und die Beschichtung ist aus Silylethern zusammengesetzt. Bevorzugte Silylether umfassen Silylmono- oder di-ether von Bis(Hydroxyethyl)-Aminopropyltriethoxysilan.
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5. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Figuren IA und IB zeigen eine Seitenansicht bzw. einen Querschnitt durch die Seitenansicht entlang der angezeigten Linie von einer Vorrichtung für einen MuIi-Analyt-Assay, die in Übereinstimmung mit der Erfindung konstruiert ist;
Figur 2 ist eine vergrößerte Teilansicht des zentralen Streifenbereiches der in Figur 1 gezeigten Assay-Vorrichtung;
Figuren 3a, 3b und 3c sind vergrößerte Ansichten von drei Typen eines Reservoirs zur langsamen Freisetzung, welches in der Vorrichtung verwendet wird;
Figur 4 illustriert die Freisetzung eines Präzipitations-Agens und die Präzipitation von LDL (offene Quadrate) und VLDL (offene Dreiecke) in einer Serumprobe (linke Seite der Figur) und die Trennung von HDL-Partikeln (volle Kreise) von dem präzipitierten LDL und VLDL, welche sich nach der Migration durch den Streifen in der Vorrichtung bilden (Mitte der Figur);
Figuren 5A bis 5C illustrieren Methoden zur Beschichtung einer Glasfaseroberfläche (5A) mit einem silylierenden Agens (5B) oder mit einem hydrophilen Polymer (5C);
Figur 6 ist ein Balkendiagramm, welches die gemessenen Werte für HDL-Cholesterin nach der HDL-Trennung in einer Glasfasermatrix mit verschiedenen Behandlungen und Glasfaserbeschichtungen zeigt;
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Figur 7 ist eine Aufsicht auf einen Streifen in der Assay-Vorrichtung, der entworfen ist, zur Bestimmung des Serumcholesterins, welches mit HDL assoziiert ist;
Figur 8 ist ein Plot, der die Bestimmung von HDL-Cholesterinkonzentrationen unter Verwendung einer Standardkurve mit zwei Referenzwerten illustriert in Übereinstimmung mit dem Gebrauch der Methode und der Vorrichtung der Erfindung;
Figuren 9a und 9b illustrieren eine Aufsicht auf einen Streifen bzw. einen Teilquerschnitt durch den Streifen in der Assay-Vorrichtung, der entworfen ist zur Bestimmung von mehreren Analyten, von denen einer HDL ist;
Figur 10 ist ein Plot, der die Bestimmung des gesamten Cholesterins, des HDLs und des Serumtnglycerins von der Assay-Vorrichtung in Übereinstimmung mit der Methode der Erfindung illustriert; und
Figur 11 ist ein Plot, der die HDL-Cholesterinwerte, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gemessen wurden, mit Meßergebnissen nach der Standardflüssigphasen-Methode vergleicht, wobei die gerade Linie in der Figur ideale Übereinstimmung zwischen den beiden Tests anzeigt.
6. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
A. Assay-Vorrichtung
A. Assay-Vorrichtung
Dieser Abschnitt beschreibt eine zum Gebrauch mit einem einzelnen oder mehreren Analyten geeignete Assay-Vorrichtung, die zur Messung eines löslichen Analyten in einer Flüssigkeitsprobe, die ebenfalls eine oder mehrere störende
• ·
• ·
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Verbindungen enthält, entworfen wurde. Eine störende Verbindung kann eine solche sein, die mit den Reagenzien reagiert, welche zum Nachweis des interessierenden Analyten verwendet werden, die solche Reagenzien behindert, oder die unspezifisch die Höhe des Signals stört, das in der analyt-spezifischen Reaktion erzeugt wird. Die störende Verbindung kann ebenfalls eine solche sein, die selektiv präzipitiert (oder aggregiert) werden kann unter Bedingungen, die nicht das lösliche Analytmolekül oder den molekularen Komplex präzipitieren. Selektive Präzipitation wird erzielt, in dem die Probe einem Präzipitations-Agens innerhalb eines vorgegebenen Konzentrationsbereichs ausgesetzt wird. Die störende Verbindung kann unterhalb des Konzentrationsbereichs unvollständig präzipitiert werden; oberhalb dieses Bereichs kann Präzipitation des Analyten auftreten.
Ein exemplarischer Analyt zum Nachweis durch die vorliegende Erfindung ist das dem Lipoprotein hoher Dichte zugeordnete Cholesterin (HDL-Cholesterin). Wie oben diskutiert, ist HDL eine Klasse der Lipoproteine, welche Cholesterin im Blut transportiert. Cholesterinspiegel, die mit dem HDL und den Lipoproteinen geringer Dichte (LDL) assoziiert sind, weisen eine starke Korrelation mit Erkrankungen der Herzgefäß auf. Verbindungen, die im HDL-Assay stören, sind insbesondere die nicht-HDL-Serumlipoproteine, einschließlich der Chylo mikronen, VLDL und LDL. Wie weiter unten dargelegt wird, können die nicht-HDL-Lipoproteine selektiv präzipitiert werden durch eine Vielzahl polyanionischer Verbindungen in Kombination mit Metallkationen der zweiten Hauptgruppe in ausgewählten Konzentrationsbereichen der präzipitierenden Komponenten.
Figur la zeigt eine Vorrichtung für einen Assay für multiple Analyten, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde. Die Vorrichtung ist insbesondere entworfen zur Bestimmung multipler Analyten unter Verwendung eines geringen Volumens einer Blutprobe, typischerweise zwischen 10 bis 50 &mgr;&idiagr; Blut. Die generelle Assay-Konfiguration wurde beschrieben in der dem gleichen Anmelder gehörenden US-Patentanmeldung für „Multi-Analyte
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Assay Device", Seriennummer 503,371, angemeldet am 02. April 1990, welche hiermit durch Rückbezug einbezogen wird. Diese Assay-Vorrichtung ist besonders geeignet zur Bestimmung von multiplen Blutproben-Assays.
Die Vorrichtung 14 umfaßt generell einen Täger 15, der ein Reservoir 16 definiert, welches dimensioniert und abgemessen ist, um eine Blutprobe von typischerweise zwischen 25 und 50 &mgr;&idiagr; Blut aufzunehmen. Ein Kapillarkanal 18, der in der Platte geformt ist, wird an der Basis des Reservoirs bereitgestellt und steht mit der vertieften Region 20 in Verbindung, die im oberen Rand des Trägers gebildet ist. Der Träger ist vorzugsweise eine dünne Plastikplatte oder ähnliches, wobei das Reservoir, das Röhrchen und die gekerbte Region mit Standardmethoden zur Formgebung oder Bearbeitung gebildet werden.
Ein im Bereich 20 getragenes Siebpad 22 dient dazu, teilweise aus großen Partikein bestehendes Material (einschließlich Blutzellen) zu entfernen, wenn die Probe von dem Reservoir weg von unten nach oben durch die Matrix wandert, wie es in Figur la dargestellt ist. Das Siebpad 22 ist aus einem faserförmigen Matrixmaterial gebildet, welches entworfen ist, um eine wässrige Flüssigkeit durch Oberflächenbenetzung anzuziehen, und die Bewegung von Blutzellen zu verzögern, wenn die Blutprobe durch die Matrix gezogen wird. Das heißt, das Siebpad wirkt als ein chromatographisches Medium zum Trennen zellgroßer Partikel von löslichen Serumkomponenten auf der Basis unterschiedlicher Migrationsraten durch das Medium.
Eine Vielzahl von Fasermaterialien wie beispielsweise Zellulose, Zelluloseacetat und Glasfasermatrizen werden für Fasermattenfilter eingesetzt und sind geeignete Materialien für das Siebpad. Die Fasern können falls gewünscht quervernetzt (crosslinked) durch chemisches Quervernetzen, Hitzeschmelzen oder ähnliches. Ebenso sind poröse Substrate geeignet wie beispielsweise gesintertes Glas zu-
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sammengeschmolzene Polymerperlen oder ähnliches, wobei deren Benetzbarkeit und die Dimension der Zwischenräume so beschaffen sein müssen, daß die Bewegung des wässrigen Mediums in die Matrix durch Oberflächenbenetzung gefördert wird. Ein Beispiel für einen Filter ist ein Glasfaserfilter wie ein GF/D oder PD008 Filter, der von Whatman geliefert wird, und der eine Packungsdichte von etwa 0,16 g/cm3 aufweist. Der Streifen ist auf Seitenabmessungen von 3x8 mm und eine Dicke von etwa 1 mm zugeschnitten. Das Pad ist so bemessen, daß sie ein definiertes Volumen einer Flüssigkeitsprobe absorbieren kann, das typischerweise zwischen ungefähr 3 bis 25 &mgr;&idiagr; und vorzugsweise zwischen 15 und 25 &mgr;&idiagr; beträgt.
Das Siebpad 22 kann zusätzlich Reagenzien zum Fangen roter Blutkörper beinhalten, wie beispielsweise Lektine, Antikörper, die spezifisch für Oberflächenmembranproteine der roten Blutkörper sind, Trombin oder ionenaustauschende Agenzien. Alternativ dazu kann die obere Oberfläche des Siebpads 22 mit einer mikroporösen Membran bedeckt werden, welche entworfen ist, um Blutzellen und anderes partikelförmiges Material, welches in der Flüssigkeitsprobe enthalten ist, herauszufiltern. Bei einer Verwendung der Vorrichtung für einen Assay für das gesamte Cholesterin oder für andere Lipidkomponenten, die mit den großen Lipoproteinkörpern im Blut assoziiert sein können, z. B. HDL, LDL und VLDL, sind die Porengrößen einer solchen Membran so gewählt, daß sie Blutzellen herausfiltern, aber das Passieren dieser Moleküle erlauben. Eine bevorzugte Membran ist eine von Nucleopore (Livermore, CA) erhältliche Polykarbonatmembran mit einer Porengröße von 1 &mgr;&eegr;&igr;. Unter Bezugnahme insbesondere auf Figur 2, die eine Vergrößerung des Zentralbereichs der Assay-Vorrichtung wiedergibt, zeigt sich, daß das Siebpad 22 wiederum mit einem länglichen Streifen oder einer Matrix 26 bedeckt ist, welche sich entlang eines inneren Bereiches des oberen Randes der Platte erstreckt und daran befestigt ist. Eine Matrix 26 dient dazu, die Flüssigkeitsprobe von dem zentralen Probenauftragungsbereich des Matrizenstreifens zu den Probensammelbereichen 30, 32 zu verteilen, die an die Enden der Matrix (Fi-
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gur 1) angrenzen. Die Matrix ist vorzugsweise aus einem fasrigem Material geformt, das in der Fläche 22 verwendet wird und welches geeignet ist, Flüssigkeit mit Kapillarfluß durch den Streifen zu ziehen. Die Packungsdichte und die Dicke der Matrix sind so beschaffen, daß kleine Flüssigkeitsvolumina beispielsweise 10 bis 25 &mgr;&idiagr;, die dem Probeneintragsbereich des Streifens eingegeben wurden, absorbiert und zu den Probensammelbereichen des Streifens verteilt werden. Die Matrix hat eine bevorzugte Packungsdichte zwischen ungefähr 0,16 g/cm3 und 4,0 g/cm3. Ein exemplarisches Matrixmaterial ist der BSB 20 Glasfaserfilter, der von Whatman erhältlich ist und eine Packungsdichte von etwa 0,2 g/cm3, eine Breite von etwa 3 mm, eine Länge von etwa 3 cm und eine Dicke von ungefähr 0,12 mm aufweist. Die Glasfasern in der Trennungsmatrix sind präpariert, um eine Beschichtung zu enthalten, welche wirksam ist, das Binden von HDL an die Glasfasern in der Gegenwart eines Präzipitations-Agens zu verhindern, wie weiter unten beschrieben wird.
Im folgenden wird weiterhin auf Figur 2 Bezug genommen. Ein Reagenzreservoir 34 in der Vorrichtung enthält ein Präzipitations-Agens, welches zur selektiven Präzipitation störender Verbindungen wie beispielsweise LDL- und VLDL-Partikel in der Flüssigkeitsprobe verwendet wird, wenn die Flüssigkeitsprobe in den Probeneingäbebereich der Matrix gezogen wird. Reservoir 34 umfaßt ein fasriges Netzwerk (dargestellt in Figuren 3 a, 3b und 3 c), welches zwischen dem Siebpad 22 und dem zentralen Probeneingäbebereich 28 der Matrix 26 angeordnet ist. Das Netzwerk erstreckt sich etwas jenseits der Ränder des Bereichs 20, wie in der Figur zu erkennen ist, wodurch gewährleistet wird, daß die von dem Pad 22 in die Matrix 26 gezogene Flüssigkeitsprobe ebenfalls durch das Reservoir gezogen wird. Das Netzwerk kann aus einem fasrigen Filtermaterial gebildet werden, wie es in dem Filterpad 22 oder der Matrix 26 verwendet wird. Ein beispielhaftes Material ist ein Glasfaserfilter mit einer Packungsdichte von etwa 0,2 g/cm3, einer Dicke von etwa 0,12 mm und Längen- bzw. Breitenabmessungen von etwa 4 bzw.
3 mm. Wie im folgenden im einzelnen beschrieben sein wird, zeigen Figuren 3a,
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3b und 3c vergrößerte Bereiche einer Ausführungsform des Reagenzreservoirs, wobei dessen Netzwerkaufbau illustriert ist. Wenngleich das Reservoir hier von der Matrix 26 getrennt dargestellt ist, ist anzuerkennen, daß das Reservoir einstückig mit der Matrix ausgebildet werden kann, in dem das Präzipitations-Agens in einen zentralen Bereich der Matrix inkorporiert wird.
Reagenzreservoir 34 ist entworfen, um das Präzipitations-Agens mit einer Rate freizusetzen, welche die Konzentration des Agens in der Flüssigkeitsprobe, welche in die Matrix eintritt, aufrechterhält. Genauer gesagt, mindestens die ersten 10 % und vorzugsweise 20 bis 40 % der gesamten Flüssigkeitsproben, welche zwischen dem Probeneintragsbereich und den Probensammelbereichen auf der Matrix in die Matrix gezogen wird, werden in einem Konzentrationsbereich gehalten, der wirksam ist, um selektiv die nicht-HDL-Verbindungen in der Flüssigkeitsprobe zu präzipitieren oder zu aggregieren.
Das Präzipitations-Agens kann jede chemische Komponente oder Komponenten sein (a), dessen Fähigkeit zum Präzipitieren der störenden Verbindungen konzentrationsabhängig ist und (b) welche vom Reservoir in die Flüssigkeitsprobe in löslicher Form abgegeben wird. Das Agens kann ein Salz sein, welches eine SaIzfällungsreaktion bewirkt, eine Säure oder eine Base, welche einen selektiven ph-Wert-abhängigen Präzipitationseffekt erzielt, oder typischer, eine Verbindung oder Verbindungen, welche intermolekulare Aggregate mit der störenden Verbindung bzw. den störenden Verbindungen bilden. Das bevorzugte Präzipitations-Agens für die Verwendung zur selektiven Präzipitation von nicht-HDL-Serum-Lipoproteinen ist ein sulfoniertes Polysaccharid wie beispielsweise Dextranulfat, (welches ein typisches Molekulargewicht von etwa 50.000 Dalton hat) in Kombination mit Magnesiumacetat oder -chlorid, wobei es gepuffert ist, um einen neutralen ph-Wert aufrechtzuerhalten.
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Wie oben diskutiert wurde, können Lipoproteine durch eine Vielzahl von Präzipitations-Agenzien, welche Kombinationen von ausgewählten polyanionischen Verbindungen und divalenten Kationen umfassen, selektiv präzipitiert werden. Die Verwendung dieser Agenzien zur Präzipitation von Lipoproteinen ist in einem Übersichtsartikel zusammengefaßt (Bachorik, P.S., et al., in Methods in Enzymology, Academic Press (1986), pp 78-100). Die Agenzien, die meistens verwendet werden sind (a) Heparin-Mn2+ oder Heparin-Ca2+, (b) Dextransulfat-Mg2+, (c) Phosphorwolframat-Mg2+, und (d) Polyethylenglycol.
Das Heparin-Agens umfassend Heparin und ein divalentes Metall ist bei einer Heparin-Konzentration von 1 mg/ml wirksam und eine Konzentration von bis zu 1 mg/ml präzipitiert nicht HDL. Mn2+, das typischerweise in der Form eines MnC^-Salzes vorliegt, sollte mindestens etwa 0,04 M sein, um komplette Präzipitation von nicht-HDL (apoB-enthaltenden) Lipoproteinen zu gewährleisten, und vorzugsweise zwischen ungefähr 0,006 und 0,092 M Mn2+. Ähnliche Konzentrationen von Ca2+ können als Ersatz für Mg2+ dienen.
Das Dextransulfat-Agens einschließlich Dextransulfat und Mg2+ verwendet vorzugsweise Dextransulfat von einem molekularen Gewicht von etwa 50 kD (KiIodaltons). Bei höheren Molekulargewichten von beispielsweise 500 kD wird eine beachtliche Menge von HDL präzipitiert. Bei geringen Molekulargewichten wie beispielsweise 15 kD werden die apoB-Lipoproteine unvollständig präzipitiert. Die optimale Dextransulfatkonzentration zum selektiven Präzipitieren der nicht-HDL-Partikel beträgt ungefähr 0,91 mg/ml und Konzentrationen bis zu 10 mg/ml präzipitieren kein HDL. Die Konzentration von Mg2+, welches typischerweise in der Form von welches typischerweise in der Form von MgC^ vorliegt, beträgt zwischen etwa 0,045 und 0,15 M.
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Das Phosphorwolframat-Agens beinhaltet ein wasserlösliches Phosphorwolframat und Mg2+, das typischerweise als MgC^ vorliegt. Konzentrationen des Agens die zur selektiven Präzipitation von nicht-HDL-Liproproteinen wirksam sind, betragen zwischen 2-8 mg/ml Phosphorwolframat und zwischen etwa 0,025 und 0,075 M Mg Salz.
Das Präzipitations-Agens wird typischerweise in einem wässrigen Puffer, beispielsweise einem HEPES-Puffer mit einer gewünschten Konzentration zubereitet, die eine Infusion des Reservoirnetzwerks mit einer gewählten Menge des Präzipitations-Agens erlaubt. Die Gesamtmenge des Agens im Reservoir wird aus dem geschätzten Volumen der Fließmittelfront in der Assayvorrichtung berechnet, die das Präzipitations-Agens enthalten wird, und zwar in der gewünschten Konzentration des Präzipitations-Agens und die Gesamtmenge des Präzipitations-Agens, welche erforderlich ist, um diese Konzentration zu erzielen. Die dem Netzwerk eingegebene Zubereitung kann einen Binder enthalten, wie im Folgenden unter Bezugnahme auf Figur 3a beschrieben wird oder das Präzipitations-Agens allein, welches mit einer langsam freisetzenden Beschichtung aufgetragen wird. Einzelheiten eines Reservoirs, welches eine Dextransulfat-MgCl2 Präzipitations-Agens enthält, werden in Beispiel 1 angegeben.
Das Bindematerial und das Verhältnis des Binders zum Präzipitationsagens in der Zubereitung sind so gewählt, um graduelle Partikellösung über die Zeit zu gewährleisten, in der die Flüssigkeitsprobe in die Matrix gezogen wird, und insbesondere, wenn die ersten 10 - 40 % oder mehr der gesamten Flüssigkeitsprobe in die Matrix gezogen wird. Bevorzugter Polymerbinder sind lineare Polyoxide, Polypropylenoxide, Polyethylenimine, Polyacrylsäure, Polyacrylamide, PoIymethacrylamide, Polymethacrylsäure, Polyvinylacetat, Polyvinylpyrolidon, Polyvinyloxatsolidon, und eine Vielzahl von wasserlöslichen Hydroxylpolymeren wie beispielsweise natürliche Gummis, Gelatine und wasserlösliche Zelluloseverbindungen, wie beispielsweise Methylzellulose und Hydroxymethylzellulose, und
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Copolymere und Mischungen dieser Polymere. Diese Polymere sind im allgemeinen kommerziell in einer Vielfalt von Molekulargewichten erhältlich. Binderzubereitungen können durch Mischen des Binders mit dem Präzipitations-Agens typischerweise in einem Gewichtsverhältnis zwischen etwa 1:10 bis 1:1 Präzipitations-Agens zu Binder hergestellt werden. Die getrocknete Binderzubereitung enthält typisch zwischen etwa 1:10 bis 1:1 Agens zu Binder, gemäß der Natur des Binders und der gewünschten Lösungsrate des Reservoirs. Es sei jedoch angemerkt, daß der Binder selbst das Präzipitations-Agens oder eine der Komponenten des Agens sein kann, wie beispielsweise ein Dextransulfatpolymer in einem Präzipitations-Agens, das aus Dextransulfat und Mg2+ zusammengesetzt ist.
Figuren 3a, 3b und 3c zeigen vergrößerte Ansichten von Ausfuhrungsformen des Reservoirs 34, die insbesondere die netzwerkartige Konstruktion des bevorzugten Ausführungsbeispiels illustrieren. In der in Figur 3 a illustrierten Ausführungsform ist das Präzipitations-Agens in einem Binder zubereitet und auf den Fasern des Netzwerks getrocknet. D.h. die als 38 bezeichneten Fasern des Netzwerks sind in eine getrocknete irreguläre Ablagerung 36 einer Mischung aus Binder und Präzipitations-Agens eingeschlossen. Das Bindermaterial und das Verhältnis von Bindern zu Präzipitations-Agens in der Zubereitung sind so gewählt, um eine graduelle Partikelfreisetzung über die Zeit zu gewährleisten, in der eine Flüssigkeitsprobe in die Matrix gezogen wird, und genauer, wenn die ersten 10 - 40 % oder mehr der gesamten Flüssigkeitsprobe in die Matrix gezogen werden. Um das Reservoir zu präparieren wird das Netzwerk mit einer Suspension der Binderzubereitung getränkt, die eine bekannte Menge des Präzipitations-Agens enthält. Das Netzwerk wird dann beispielsweise unter Vakuum oder durch Erhitzen getrocknet, was zu einer Beschichtung des Netzwerks führt wie in Figur 3 a gezeigt ist. Beispiel 1 beschreibt die Zubereitung eines Reservoirs dieses Typs, welches Dextransulfat und MgCb enthält.
-&iacgr;&dgr;In einer zweiten in Figur 3 b illustrierten Ausfuhrungsform wird das Präzipitations-Agens in das Netzwerk eingebracht und dehydriert, wodurch eine Ablagerung 45 auf den Fasern des Netzwerks gebildet wird. Diese Ablagerung wird dann mit einem wasserlöslichen Material beschichtet, das typisch ein wasserlösliches Polymer der oben erwähnten Art ist, und welches eine langsam freisetzende Beschichtung 46 bildet (in gepunkteten Linien dargestellt) die bewirkt, daß die Lösung der Ablagerung nach Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe verzögert wird. Die Beschichtung kann durch Sprühen, Eintauchen oder Dehydration einer nicht wässrigen Lösungsmischung auf das Netzwerk und die Ablagerung aufgetragen werden. Die Beschichtung wird vorzugsweise so aufgetragen, daß unterschiedliche Dicken der Beschichtung durch das ganze Netzwerk erzielt werden, um ein Kontinuum von freigesetztem Agens zu erzeugen, wenn das Probenmaterial durch das Reservoir fließt.
Figur 3 c illustriert einen Mikrosphären- oder Mikrokapsel-Typ eines Reservoirpartikels 48 im Reservoir. Die Mikrosphären sind aus einer mikroporösen polymerischen äußeren Schale 49 und einer eingekapselten inneren Region 51, die das Präzipitations-Agens enthält, zusammengesetzt. Die Mikrosphären mit dem eingeschlossenen Agens werden nach bekannten Methoden hergestellt wie sie beschrieben sind in den US Patenten Nr. 3,797,494 und 3,464,413, und anschließend in das Netzwerk eingebettet. Die Porosität der Mikrosphären ist so beschaffen, daß die Analytverbindung von Interesse ausgeschlossen wird, um zu verhindern, daß das Analyt der hohen Konzentration des Präzipitations-Agens innerhalb der Mikrosphären ausgesetzt wird.
Figur 4 illustriert die Betriebsweisen der selektiven Präzipitation und Trennung, die zwischen dem Probeneintragsbereichen und den Probensammelbereichen in der Matrix 26 während eines Assays zur Bestimmung des HDL in einer Serumprobe erfolgen. Die unterschiedlichen Lipoproteine in der Probe sind dargestellt mit vollen Kreisen (HDL), offenen Quadraten (VLDL), offenen Dreiecken (LDL)
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und Clustern der Einheiten (Aggregate). Eine Flüssigkeitsprobe fließt durch die Matrix von links nach rechts wie durch die Pfeile angedeutet ist.
Der linke Teil der Figur 4 zeigt den Probeneintragsbereich 28 auf der Matrix, wobei der ausgeschnittene Bereich die Fasern 38 des Reagenzreservoirs 34 in der Matrix und Bereiche 36 des Präzipitations-Agens zeigt, welches in den Fasern enthalten ist. Die Flüssigkeitsprobe in diesem Bereich enthält alle der ursprünglichen Lipoproteinkomponenten mit den ursprünglichen Lipoproteinkonzentrationen wie angedeutet.
Der zentrale Bereich der Figur zeigt einen Abschnitt 44 der Matrix 46, der stromabwärts vom Reagenzreservoir zwischen dem Probeneingabereich 28 und einem Probensammelbereich 32 liegt. Die Ablagerung auf dem Netzwerk wird langsam aufgelöst wobei das Präzipitations-Agens in die Probe freigesetzt wird, wenn die Flüssigkeitsprobe durch das Netzwerk in dem Reservoir gezogen wird. Die aggregierten und nicht-aggregierten Partikel werden chromatografisch getrennt, wenn die Cholesterin enthaltenden Partikel in der Fließmittelfront zum Probensammelbereich auf der rechten Seite der Figur gezogen werden. Wie im zentralen ausgeschnittenen Bereich angedeutet ist, liegen LDL und VLDL Lipoproteine weitgehend in präzipitierter oder aggregierter Form vor.
Der rechte Abschnitt der Figur zeigt einen Abschnitt der Matrix im Probensammelbereich 32. Hier ist die Zusammensetzung der Flüssigkeitsprobe, welche zuerst die Probensammelregion erreicht im wesentlich frei von nicht-HDL-Partikeln, aber sie enthält HDL-Partikel in der Konzentration die in der ursprünglich eingegebenen Blutprobe vorliegt.
Nach einem Aspekt der Erfindung ist entdeckt worden, daß die Behandlung von Blut mit Agenzien, die zur selektiven Präzipitation von nicht-HDL-Blutlipoproteinen verwendet werden, zur Bindung eines Teils der HDL in der Blutprobe an Glasfasern des Typs führt, der in kommerziell erhältlichen Glasfiltern geliefert wird. Die Reduktion im gemessenen HDL-Cholesterin, die aus dieser Bindung an die Glasfasern folgt, wird weiter unten aus den Daten in Figur 6 ersichtlich werden. Eine solche Bindung kann durch Zugabe einer Beschichtung der Fasern der Trennungsmatrix 26 effektiv eliminiert werden.
Zwei bevorzugte Typen der Beschichtung und die Methode ihrer Präparation werden in den Figuren 5 a bis 5 c gezeigt.
Figur 5 a zeigt einen fragmentarischen Oberflächenbereich einer Glasfaser 50 mit einer Silyl- hydroxyl (Si-OH) Oberflächengruppe, wie die Gruppen 52. Die Silylhydroxyl-Gruppen sind typisch für Glasfaseroberflächen in kommerziellen Glasfiltern und ähnlichen. Obwohl hier nicht gezeigt, kann die Faser auch so zusammengesetzt sein, daß sie einen geringen Prozentsatz (weniger als etwa 2 Gewichts-%) eines Polymers enthält, beispielsweise als Polyvinylalkohol (PVA), welches mit dem Glas vor der Formung zubereitet wird, um die Packungseigenschaft in der Glasfaser zu verbessern. In der in Figur 5 b gezeigten Beschichtungsmethode wird der Glasfilter beschichtet durch chemisches Reagieren der Oberflächensilylhydroxyl-Gruppen mit einem hydrophilen Silylierungsagens, welches die allgemeine Form R-Si(OX)n aufweist, wobei R eine hydrophile Gruppe, X ein niederes Alkyl vorzugsweise Methyl- oder Ethylradikal und N gleich 2 oder 3 ist. Beispielhafte Silylierungsagenzien umfassen Silylmono und di-Ether von bis (Hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan.
Die Reaktion wird nach bekannten Methoden zur Silydierung von Glas durchgeführt. In einer typischen Prozedur wird eine 2 %ige wässrige „Arbeits"-Lösung
des Silylierungsreagenz wie beispielsweise bis (Hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan von einer 62 %igen Vorratslösung bereitet, die kommerziell erhältlich ist, z.B. von Hüls Amerika (Petrarch Systems, Bristol, PA). Der die Matrix formende Glasfilter wird in die frisch präparierte Arbeitslösung für mindestens 10 Minuten eingetaucht mit 95 %igen Ethanol gewaschen und getrocknet in einem Ofen bei 50 0C für fünf Minuten. Wie in Figur 5 b zu erkennen ist, kann das Silylierungsreagenz mit jeder von zwei Si-OH-Oberflächengruppen reagieren unter Bildung einer Silyimono-oder di-Ether-Beschichtung, die unter Bezugsziffer 54 gezeigt ist. Diese Beschichtung maskiert die Oberflächen-Si-OH-Grupen des unbehandelten Glases, in dem diese Gruppen durch hydrophyle R-Gruppen des oben bezeichneten Typs ersetzt werden.
In einem zweiten generellen Ausführungsbeispiel, welches in der Figur 5 c dargestellt ist, wird der Glasfilter mit einem hydrophilen Polymer beschichtet, wie unter Bezugszeichen 56 angedeutet ist. In einer bevorzugten Methode zum Auftragen der Polymerbeschichtung wird der die Matrix formende Glasfilter in eine Lösung von Polyvinylalkohol (PVA) getaucht, gefolgt von einem Trocknungsschritt bei erhöhter Temperatur (etwa 90 0C) für einige Minuten. Die abschließende Inkorporierung von Polymer beträgt ungefähr 5 % des Trockengewichts nach einer Ab-Schätzung durch Vergleich der Masse vor und nach Flammverdampfung der organischen Verbindung vom Glasfilter. Figur 5 c zeigt die resultierende Polymerbeschichtung 58, die aus Polymerfasern gebildet ist. Wie bei der chemischen Modifizierungsmethode ist die Beschichtung wirksam die Oberflächen Si-OH-Gruppen zu maskieren und sie zu ersetzen durch hydrophile Gruppen der Polymeruntereinheiten. Bevorzugte Polymere zum Gebrauch in der Erfindung umfassen Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrolidin, Polyethylenglykol, Polypropylenglylkol, Polyethylenimin, Polyvinylsulfonsäure, Poly(3-Hydroxybuttersäure), Polyacrylsäure, Poly(3-Hydroxyvaleriansäure), Poly(4-Styrolsulfonsäure), Poly(2-Acrylamidosulfonsäure) oder Poly-L-Glutamat. Bevorzugte Polymermolekulargewichte liegen etwa zwischen 10-200 Kilodaltons. Der genaue bevorzugte Poly-
merinhalt ist abhängig von dem Typ der Glasfasermatrix und insbesondere seiner Faserdichte. Wie im folgenden gezeigt wird, beträgt der bevorzugte Polymerinhalt beim Gebrauch einer Whatman BSB-20 Membran mehr als 4 % Polymer gemessen nach der oben beschriebenen Methode mit Bezug auf Polyvinylalkohol als Standard.
Der Effekt der verschiedenen Glaskompositionen und Oberflächenbeschichtungen auf die Bindung des HDL an die Glasfilterfasern ist aus einer Studie ersichtlich, deren Ergebnisse in Figur 6 wiedergegeben sind. In dieser Studie wurde jeder von sechs Glasfiltern als Siebmatrix benutzt, nachdem sie wie im folgenden beschrieben, behandelt wurden. In jedem Fall wurde eine Serumprobe, die zuvor mit Dextransulfat als Präzipitations-Agens zum Entfernen von VLDL und LDL behandelt wurde, durch den Filter geleitet und dann nach HDL assoziiertem Cholesterin mittels eines konventionellen Cholesterin-Assays analysiert. Zur Kontrolle wurde die gleiche Probe direkt durch die Lösungsphasenmethode ohne Passage durch den Filter untersucht. Die HDL-Cholesterinkonzentration für das gefilterte Material wurde dann ausgedrückt in Prozent des ungefilterten Materials. Wie im oberen Balken (a) in dem Diagramm der Figur 6 a ersichtlich ist, resultierte der Durchlauf einer Serumprobe durch unbehandelte Glasfaserns (Whatman BSB-20) in einem Verlust von etwa 15 % des HDL-Cholesterininhalts aufgrund von Bindung des HDL an das Glas der Matrix. Nach den Spezifikationen des Herstellers werden die Glasfasern dieses Filters mit etwa 1 % PVA, welches bei der Formung in den Glasfilter inkorporiert wird, hergestellt, um die Matteneigenschaften der Fasern zu verbessern.
Das gleiche Filtermaterial zeigt nach einer Silylierung mit Bis-(Hydroxyethyl)aminopropyl triethoxysylan fast keine Bindung von HDL, wie aus dem zur Kontrollprobe äquivalenten Gehalt an HDL-Cholesterin offensichtlich ist (b). Das gleiche Filtermaterial zeigt weniger Bindung als unbehandelte Fasern aber zeigte dennoch Bindung von HDL, wenn es mit einer Lösung von PVA mit
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weniger als 4 Gew.-% Polymer beschichtet wurde (c). Filter mit 4 - 5 Gew-% PVA-Beschichtung (d) wiesen keine beachtenswerte HDL-Bindung auf. Aufgrund dieser Ergebnisse kann festgestellt werden, daß für die in dieser Studie verwendeten Faserkomposition (Whatman BSB-20) eine 4 - 5 % PVA-Beschichtung ausreichend war, um Bindung von HDL an das Filtermaterial zu verhindern. Weitere Studien legten nahe, daß die genau erforderliche Menge von PVA-Beschichtung von der Komposition und insbesondere der Glasfaserdichte des verwendeten Filtermaterials abhängt. Ebenso ist in Figur 6 das Ergebnis der Filtration einer Probe durch vom Hersteller gebildete Glasfilter gezeigt, welche 6 Gew.-% PVA enthalten. Diese Filter waren nicht spezifisch mit PVA-Oberflächen beschichtet, nach der oben beschriebenen Methode. Durchlauf der Probe durch diesen Filter resultierte in einem leichtem Rückgang des HDL-Cholesterininhalts des Filtrats (e). Die reduzierte HDL-Bindung an diesen Filter legt nahe, daß das zugegebene PVA teilweise dazu dient, um Si-OH-Gruppen, die gewöhnlich an der Glasfaseroberfläche vorliegen zu beschichten und zu maskieren. Wenn 6 % PVA verstärktes Fasermaterial zusätzlich silyliert wurde unter der Verwendung der oben beschriebenen Silylierungsmethode, wurde kein beachtenswerter Verlust des HDL-Cholesterininhalts in der Probe aufgrund von Bindung des HDL an den Filter beobachtet (f).
Die Studie zeigt an, daß beide chemische Beschichtung durch hydrophyle Silylierungsgruppen und Polymerbeschichtungen durch ein hydrophyles Polymer (mit einer hinreichenden Polymerkonzentration) wirksam sind, um HDL-Bindung an Glasfasern in der Gegenwart eines Präzipitations-Agens zu verhindern.
Zur Vervollständigung der Beschreibung der Figur 1 wird nun wieder auf diese Bezug genommen. Die Vorrichtung 14 umfaßt eine Testplatte 60 bestehend aus einem länglichen Träger 62, und mehreren benetzbaren absorbierenden Reaktionstestpads 64, 66, 68 und 70, die auf der unteren Oberfläche des Trägers an den gezeigten Positionen getragen werden. Der Träger ist durchsichtig oder er hat
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durchsichtige Fenster, die es ermöglichen, die Testpads durch den Träger zu sehen. Die Pads in der Testplatte sind an Träger durch durchsichtige oder durchscheinendes klebendes Material befestigt, oder durch Ultraschallschweißen oder andere geeignete Bindungsmethoden. Jedes in einem bestimmten Assay verwendete Pad beinhaltet analyt-abhängige Reagenzien, die wirksam sind, um eine analyt-abhängige Veränderung in dem Pad zu erzeugen, die optisch entweder visuell oder durch einen Detektor in bekannter Weise festgestellt werden kann. Alle Pads oder eine integrale Teilmenge der Pads kann in einem bestimmten Assay verwendet werden. Die Natur der Reagenzien für Cholesterin und Triglyzerid-Assays wird im folgenden in Abschnitten B und C beschrieben.
Es ist wünschenswert, daß die Reaktionstestpads poröse geschmolzene Polymeroder mikroporöse Polymermembrane sind, die nach vollständiger Penetration der Flüssigkeit eine Dicke von etwa 100-150 &mgr;&pgr;&igr; aufweisen und Seitenabmessungen von etwa 3 mm. Das Absorbtionsvolumen jedem dieser Pads beträgt vorzugsweise zwischen etwa 0,5 - 2 &mgr;&idiagr;. Ein bevorzugtes Kompositionsmaterial der Reaktionspads ist Polysulfon.
Wenn das Serum die Probensammelbereiche wie den Bereich 32 erreicht, der an die Enden der Matrix 26 angrenzt, wird die Testplatte 60 bewegt bis die Pads 64, 66, 68, 70 in Kontakt mit der Matrix sind. In dieser Position wird die Flüssigkeitsprobe in der Matrix durch Kapillarfluß in das angrenzende Pad gezogen, wobei die Flüssigkeitsbewegung in der Richtung senkrecht zur Testpadoberfläche erfolgt. Die Platte wird in dieser Position gehalten, bis ein gewünschtes Ausmaß an Benetzung der Testpads erreicht ist.
Die analayt-abhängigen Reagenzien in den Testpads erzeugen eine analytabhängige Veränderung in den Testpads, welche optisch entweder visuell oder mit einem Detektor in einer bekannten Art und Weise festgestellt werden kann. Ein
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bevorzugter Apparat zum Ablesen der Signallevel auf den Testpads und zur Berechnung eines korrigierten Analytwerts, der auf dem abgelesenen Wert basiert, ist in der dem gleichen Anmelder gehörenden US-Patentanmeldung „Controlled-Volume Assay Method and Apparatus", Seriennummer 320,474, angemeldet am 08.März 1989, die hierin unter Bezugnahme einbezogen wird, beschrieben. Die Testplatte 60 ist auf den Träger 15 mittels eines Paars von elastischen Elementen, wie beispielsweise elastomerischen Blöcken 71, 72 befestigt. Die Blöcke bewirken eine Vorspannung der Testpads in einer Nicht-Transferposition, in der die Testpads von der Probenübertragungsoberfläche mit einem typischen Abstand von etwa 0,5 bis 1,0 mm beabstandet sind.
HDL-Assay
Zum Betrieb der Vorrichtung in einem Assay zur Bestimmung des HDL in einer kleinen Blutprobe wird die Blutprobe in Reservoir 16 plaziert (Figur la), und die Probe wird durch Kapillarität in und durch das Pad 22 gezogen, wodurch eine zellfreie Serumprobe erhalten wird, die dann durch das Reservoir 34 in die Matrix 26 gezogen wird. Die Ablagerung aus Präzipitations-Agens und Binder auf dem Reservoirnetzwerk wird langsam unter Freisetzung des Präzipitations-Agens in die Flüssigkeitsprobe aufgelöst, wenn die Flüssigkeitsprobe in das Netzwerk des Reservoirs gezogen wird. Wie oben beschrieben, ist das Reservoir so ausgelegt, daß es die gesamte Menge des Präzipitations-Agens über einen ausgewählten Bereich des gesamten Fließmittelflusses des Reservoir freisetzt - typisch über mindestens die ersten 10-40 % des gesamten Fließmittelflusses und vorzugsweise über mindestens die ersten 20 % des Flusses. Die Freisetzungsrate des Präzipitations-Agens ist so, daß eine Konzentration des Agens in der Flüssigkeitsprobe aufrecht erhalten wird, die in dem erforderlichen Bereich liegt, um selektiv die in
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der Probe vorhandenen LDL und VLDL zu präzipitieren ohne nennenswerte Mengen von HDL zu präzipitieren.
Wenn die Cholesterin beinhaltenden Teilchen in den stromabwärtigen Bereich der Fließmittelfront in die Matrix und in Richtung des Probensammelbereiches auf der rechten Seite der Figur gezogen werden, werden die aggregierten und nichtaggregierten Partikel chromatografisch getrennt, wie zuvor beschrieben wurde und in Figur 4 dargestellt ist. Die Flüssigkeitsprobe die zuerst den Probensammelbereich erreicht, ist im wesentlichen frei von nicht-HDL-Partikeln, aber sie hat die gleiche HDL-Konzentration wie das zellfreie (Serum) Flüssigkeitsprobenserum, das in die Matrix eingeführt wird.
Figur 7 ist eine Aufsicht auf die obere Oberfläche der Matrix 26 in der Vorrichtung 14 wie sie durch den Träger 62 gesehen wird, wobei außerdem die vier Reaktionspads gezeigt sind, welche auf der Testplatte 60 getragen werden und als 64, 66, 68 und 70 bezeichnet sind. Die gepunkteten Linien 72 in der Figur zeigen die Ränder des darunterliegenden Bereiches 22 an und nähern sich den Rändern des Reservoirs 34 in der Vorrichtung an, das in dem freigeschnittenen Bereich unterhalb der Matrix 26 gezeigt ist. Das Reservoir ist entworfen zur langsamen Freisetzung von Dextransulfat und Mg2+, welches als eine getrocknete Ablagerung 36 auf den Netzwerkfasern 38 in der Figur dargestellt ist, wie oben beschrieben wurde. Anhand der Figur ist zu erkennen, daß die zu beiden Seiten der Matrix gezogene Flüssigkeitsprobe dem Präzipitations-Agens ausgesetzt ist, so daß nicht-HDL-Partikel auf beiden Seiten der Matrix vom HDL-Analyt getrennt sind, wenn die Flüssigkeitsprobe die Probensammelbereiche unterhalb der Reaktionspads erreicht.
Zwei der Reaktionspads der in der Figur 7 gezeigten Ausführungsform sind für einen Doppelassay von HDL-Cholesterin (HDLi und HDL2) entworfen, wie unter 66 und 68 in der Figur angedeutet. Zwei Referenzstandardpads Bi und B2 (64 u nd
70) stellen eine selbstkorrigierende Standkurve zur Bestimmung des Cholesterinwerts bereit, wie in der US-Patentanmeldung „Self-Corrected Assay und Method", Seriennummer 396,326, angemeldet am 23. August 1989, die hierin unter Bezugnahme einbezogen wird, beschrieben ist. Es ist zu würdigen, daß eine Anzahl von Konfigurationen der HDL-Testpads und der Referenzstandardtestpads möglich sind, d.h., die Referenzstandardpads könnten alternativ an Positionen 66 und 68, 64 und 66 sowie 68 und 70 angeordnet sein, wobei die HDL-Testpads in jedem Fall an dem alternativen Positionen sein würden. Alternativ dazu kann die Vorrichtung mit nur einem Reaktionstestpad hergestellt werden, die ein cholesterinabhängiges Reagenz enthält. Zusätzlich kann die Vorrichtung ohne ein Referenzstandardpad hergestellt werden, und standartisierte Werte des Reflektionsvermögens können benutzt werden, um die Konzentration des in der getesteten Flüssigkeitsprobe vorliegenden HDL-Cholesterin zu bestimmen.
Wenn das Serum die Probensammelbereiche (30,32) erreicht, die an die Enden der Matrix 26 angrenzen, wird die Testplatte zu ihrer Probenübertragungsposition bewegt, bei der die Testpads in Kontakt mit der Matrix sind. In dieser Position wird die Flüssigkeitsprobe im Dispenser durch Kapillarfluß in die Testpads gezogen, wobei die Fließbewegung in einer Richtung senkrecht zur Oberfläche der Testpads erfolgt. Die Platte wird in dieser Position gehalten bis ein gewünschter Grad an Benetzung der Testpads erzielt wurde.
Die cholesterinabhängigen Reagenzien in den Testpads erzeugen eine Veränderung in den Pads, der entweder visuell oder mit einem Detektor nach bekannter Weise optisch nachgewiesen werden kann. Ein bevorzugter Apparat zum Ablesen des Signalspiegels der Pads und zum Berechnen eines korrigierten Analytwerts basierend auf den gelesenen Werten ist beschrieben in der oben zitierten dem Anmelder gehörenden US-Patentanmeldung „Controlled-Volume Assay Method and Apparatus", Seriennummer 320,474, angemeldet am 08. März 1989, die hierin unter Bezugnahme einbezogen wird.
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Der oben beschriebene Apparat enthält sowohl Pads (HDL) als auch Referenzstandardpads (Bi und B2), da er zur Durchführung des HDL-Assays konfiguriert ist. Die Testpads enthalten übliche Komponenten der Reagenzien des Reaktionswegs zur Umwandlung von H2O2 zu einem farbigen Signalreaktionsprodukt. Die üblichen Reaktionswegkomponenten beinhalten Peroxidase einen Einzelfarbstoff oder ein gekoppeltes Farbstoffsystem, welches durch die Peroxidase in Gegenwart von H2O2 in ein unterscheidbar gefärbtes Signalreaktionsprodukt umgewandelt wird. Enzymatische Farbreaktionen, die eine Vielzahl von substratspezifischen Oxidasen zur enzymatischen Erzeugung von H2O2 und anschließender Oxidation eines Farbstoffs zu einem gefärbten Reaktionsprodukt verwenden, sind wohl bekannt. Die HDL-Testpads enthalten neben den üblichen Reaktionswegkomponenten Cholesterinesterase um freies Cholesterin vom HDL freizusetzen und Cholesterinoxidase um H2O2 durch Reaktion mit dem freien Cholesterol in der Probe zu erzeugen. Die Referenzstandardpads enthalten neben den üblichen Reaktionswegkomponenten unterschiedliche bekannte Mengen einer Nichtcholesterinreferenzverbindung, vorzugsweise einer D-Aminosäure und einer Oxidase, wie einer D-Aminosäureoxidase zur Erzeugung von H2O2, wenn das Pad von der Flüssigkeitsprobe benetzt wird.
Die in den bei dem HDL-Assay verwandten Reaktionspads und Referenzpads vorhandenen Reaktionskomponenten sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt.
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| Komponenten | Pad | Referenz | HDL |
| HDL Probe (HDL) | + | + | |
| Cholesterinesterase | + | ||
| Cho lesterinoxidase | + | ||
| D-Aminosäure | + | ||
| D-Aminosäureoxidase | + | ||
| Peroxidase + Farbstoff (e) | + | + |
In der oben beschriebenen Assay-Vorrichtung ist die Menge einer Referenzverbindung, die zu jedem Referenzstandard zugegeben wird, so gewählt, daß sie in Gegenwart eines gegebenen Volumens einer definierten Reaktionsmixtur einen Signalspiegel erzeugt, der einer bekannten Konzentration von Cholesterin nach einem Assay unter identischen Bedingungen in der Gegenwart von Cholesterinoxidase entspricht. Der tatsächlich in dem Assay erfolgte Referenzstandard wird ebenfalls abhängen von (a) der Menge der löslichen störenden Verbindungen, die in der Serumprobe vorhanden sind (zu unterscheiden von nicht-HDL-Verbindungen, die die Messung von HDL-Cholesterin stören), (b) die Bedingung der Reaktionskomponenten in dem Pad, und (c) Reaktionsbedingungen einschließlich der Temperatur und der Reaktionszeit. Die Signalwerte der beiden Referenzpads ergeben eine Zwei-Punkt-Standardkurve wie sie in Figur 8 gezeigt ist, wenn sie als eine Funktion von der Konzentration der Referenzverbindung geplättet werden. Der Signalwert wird vom Reflektionsvermögen oder anderen gemessenen Signaleigenschaften errechnet in dem bekannte Zusammenhänge zwischen der gemessenen Signaleigenschaft und dem aufgetragenen Signalwert
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verwendet werden. Die Tatsache, daß die Kurve in Figur 8 nicht den Ursprung des Grafen schneidet, deutet einen nicht-linearen Inhibitionseffekt an. Die für die doppelten HDL-Pads gemessenen Werte werden auf der Referenzstandardkurve aufgetragen und dann wird der bekannte Zusammenhang zwischen dem Referenzstandard und den Cholesterinkonzentrationen benutzt um die Cholesterinkonzentration in jedem dieser Testpads zu bestimmen. Hierbei ist zu würdigen, daß die so berechneten Cholesterinwerte (a) auf der Basis einer Standardkurve berechnet sind und (b) selbst korrigiert sind für Abweichungen der Reaktionsbedingungen und für inhibitorische Effekte und Aktivitätsverluste der üblichen Reaktionswegkomponenten unter der Annahme, daß alle vier Reaktionspads den gleichen Variationen bzgl. dieser Faktoren unterworfen sind. Die Konzentration des mit HDL assoziierten Cholesterin kann vom Durchschnitt der in beiden HDL-Probenpads bestimmten Cholesterinkonzentration berechnet werden. Alternativ dazu kann die Cholesterinkonzentration anhand des Refiektionsvermögens bestimmt werden, das von einem einzelnen HDL-Probenpad erhalten und mit einem einzelnen Referenzstandard oder mit einem Standard von historisch erhaltenen Werten des Refiektionsvermögens verglichen wurde.
C Multianalyt Lipid Assay
Dieser Abschnitt beschreibt Ausfuhrungsformen der Assay-Vorrichtungen, welche für Multianalytbestimmung von Serumkomponenten einschließlich HDL-Cholesterin und zusätzlich eines oder mehreren Analyten aus der Gruppe umfassend gesamtes Serumcholesterin, LDL-Cholesterin und Serumtriglyzeride entworfen worden ist.
Figur 9 a ist eine Aufsicht auf die obere Oberfläche einer zweiteiligen Matrix 76, 78 in der Assay-Vorrichtung, wobei die punktierte Linie 72 wiederum die Ränder der Siebpadregion unterhalb des Probeneingabebereichs der Matrix andeutet. Fasern 38 und die Ablagerungen des Präzipitations-Agens 36, die auf den Fasern
enthalten sind, sind in dem freigeschnittetem Ausschnitt nur auf der rechten Seite der Matrix 76 gezeigt, welche in dieser Vorrichtung das Reservoir 74 enthält. Die Flüssigkeitsprobe, welche zur Matrix 76 gezogen ist, passiert dieses Reservoir, wobei sie eine langsame Freisetzung des Präzipitations-Agens und Präzipitation der nicht-HDL-Lipoproteine im Probenmaterial verursacht. Das von dem Siebpad zur linken Seite der Matrix 78 fließende Material ist nicht dem Präzipitations-Agens ausgesetzt. Figur 9 b zeigt eine fragmentarische Querschnittsansicht der Vorrichtung im Probeneingabebereich, wobei die Aufteilung zwischen den beiden Teilen der Matrix 76, 78 und das Vorliegen des Präzipitations-Agens 82 (angedeutet durch Punktierung) in dem Reservoir auf der rechten Seite aber nicht auf der linken Seite der Vorrichtung illustriert ist. Die Aufteilung zwischen den beiden Seiten des Reservoirs und der Matrix der Vorrichtung ist als ein Spalt in Figuren 9 a und 9 b illustriert; als Alternative dazu kann eine physikalische Barriere wie beispielsweise eine Plastikfolie, die für die Flüssigkeitsprobenflüssigkeit undurchlässig ist und die daher die Diffusion zwischen den beiden Teilen der Siebmatrix verhindert, in der Vorrichtung verwendet werden. Der als 80 angedeutete Bereich auf der linken Seite der Vorrichtung, der dem Reagenzreservoir entspricht, kann eine netzwerkartige Reagenzreservoirmatrix enthalten, oder er kann durch die Trennungsmatrix 78 besetzt sein. Die gesamte Matrix 76, 78 ist vorzugsweise mit hydrophylem Polymer oder Silyliemngsagenzien beschichtet wie oben beschrieben wurde.
Die vier Reaktionstestpads der in Figur 9 a gezeigten Ausführungsform sind zur Messung des gesamten Cholesterins (TCh), Triglyzeridlipid (TG), und HDL-Cholesterin (HDL) ausgelegt und umfassen ein Referenzstandardtestpad (Bi). Jedes Pad umfaßt die oben beschriebenen allgemeinen Reaktionswegkomponenten zur Umwandlung von H2O2 zur einem unterscheidbar gefärbten Signalreaktionsprodukt. Das Referenzstandardpad enthält eine bekannte Menge einer Referenzverbindung, wie beispielsweise D-Aminosäure und eine entsprechende Oxidase wie zuvor beschrieben wurde. Die Testpads für das gesamte Cholesterin und fur HDL enthalten jeweils zusätzlich zu den allgemeinen Reaktionswegkompo-
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nenten Cholestennesterase zur Freisetzung des verestherten Cholesterins von den Serumlipoproteinen in freie Cholesterinform, wobei die Lipoproteine HDL, LDL und VLDL Partikel umfassen, und Cholesterinoxidase zur Erzeugung von H2O2 durch die Reaktion mit dem freien Cholesterin in der Flüssigkeitsprobe.
Die Triglyzeridtestpads enthalten zusätzlich zu den allgemeinen Reaktionswegtestkomponenten Lipase, L-Glyzerinkinase und L-Glyzerin-3-Phosphatoxidase zur Erzeugung von H2O2 aus Triglycerid. Diese drei Enzyme dienen zur Konvertierung des Triglyzeridsubstrats in L-Glycerin-3-Phosphat und zum Oxidieren der letztgenannten Verbindung unter der Erzeugung von H2O2. Insofern als die in das TG-Pad gezogene Serumprobe alle der Serumlipoproteine enthält, repräsentiert das TG-Signal die gesamten Serumtriglyzeride.
Das Referenzstandardpad in dem Assay wird verwendet zur Erzeugung einer EinPunkt-Standardkurve wie sie in Figur 10 gezeigt ist. Die Standardkurve entspricht vorherbestimmten Konzentrationen von Cholesterin und Triglyceriden und stellt daher einen Plot zur Bestimmung der Analyt-Konzentrationen von den gemessenen Signalwerten bereit. Wie oben beschrieben, ermöglicht die Standardkurve eine Korrektur der gelesenen Analytwerte aufgrund von Verlust der Enzymaktivität in den gemeinsamen Reaktionspfadkomponenten und aufgrund von Schwankungen der Reaktionsbedingungen, obwohl nicht lineare Inhibitionseffekte unkorrigiert bleiben. Selbstverständlich könnte eine Zwei-Punkt-Standardkurve wie sie in Figur 8 gezeigt ist generiert werden, indem eine Assayvorrichtung mit fünf Pads verwendet wird.
Die Signalwerte für das gesamte Cholesterin, Triglyzerid und HDL werden auf der Standardkurve aufgetragen, um die selbstkorrigierten Analytkonzentrationswerte für diese drei Analytpads zu bestimmen. Aus diesen Werten kann das LDL-Cholesterin nach der folgenden Beziehung berechnet werden:
LDL-Cholesterin = gesamtes Cholesterin - gesamte Triglyceride/5
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- HDL-Cholesterin.
- HDL-Cholesterin.
Nach dem Vorhergehenden ist zu würdigen, wie die unterschiedlichen Aufgaben und Merkmale der Erfindung realisiert werden. Die Assay-Vorrichtung stellt eine einfache Einschrittmethode zur Durchführung eines Assays an einem Analyt in einer Flüssigkeitsprobe bereit, die eine selektiv präzipitierbare störende Verbindung enthält, ohne die Notwendigkeit die Probe vorher zu zentrifugieren oder vorzubehandeln. Dieses Merkmal ist besonders nützlich zur Durchführung eines Assays hinsichtlich multipler Analyten in kleinen Volumina, die nicht mit vertretbarem Aufwand vorbehandelt werden können, um die störenden Komponenten zu entfernen. Die Methode ermöglicht insbesondere daß ein kleines Blutvolumen, typischerweise weniger als 50 &mgr;&idiagr;, in einem Multianalytassay eingesetzt werden kann, indem zumindest ein Analyt, beispielsweise HDL, das selektive Entfernen verwandter Lipoproteine verlangt. Die folgenden Beispiele illustrieren die Präparation und die Verwendung der Assayvorrichtung zum Testen auf Cholesterin und andere Lipide. Die Beispiele sind gedacht zur Erläuterung der Erfindung aber nicht zu Beschränkung von deren Umfang.
Beispiel I
HDL-Assay
Eine Assay-Vorrichtung wie die in Figur 1 beschriebene wurde unter Verwendung der bevorzugten Filtermaterialien, die in Abschnitt A beschrieben wurden, präpariert. Die Stammlösung A enthielt 2g/ 100 ml von 50.000 Dalton Dextransulfat. Die Stammlösung B enthielt IM Magnesiumacetat. Einem Glasfaserfilter von 150 &mgr;&idiagr;&eegr; Dicke und Abmessungen von 3,175 mm &khgr; 7,938 mm (1/8 inch x 5/16 inch) wurden jeweils 0,75 &mgr;&idiagr; der Vorratslösungen A und B und 2,21 &mgr;&idiagr; Wasser zugegeben. Der Filter wurde 20 Minuten lang bei 50 0C getrocknet und in die Vorrichtung als das Präzipitations-Agens enthaltende Reservoir wie oben beschrieben, eingebaut. Vier Testpads in der Vorrichtung enthielten die zuvor in Abschnitt B beschriebenen Reagenzien. Jedes Reaktionspad wurde von einem 150 &mgr;&idiagr;&eegr; dicken Polysulfonfilter (TR 450; Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) präpariert und der in 2 mm &khgr; 4 mm Rechtecke zugeschnitten war. Den beiden Reaktionspads zur Cholesterinbestimmung wurden 10 &mgr;&idiagr; einer Reagenzlösung eingegeben, die 150 U/ml Cholesterinesterhydrolase, 10 U/ml Cholesterinoxidase, 80 U/ml Peroxidase, und 20 mM 4-Amino-Antipyrin (4-AAP) sowie 80 mM N-ethyl-N-sulfohydroxypropyl-M-toluidin (TOOS) in reduzierter Form in einem Phosphatpuffer bei neutralem pH enthielt. Die beiden Reaktionspads für die Referenzstandards enthielten eine mit 40 U/ml D-Aminosäurenoxidase, 80 U/ml Peroxidase und 20 mM 4-Aminoantipyrin (4-AAP) und 80 mM TOOS in der reduzierten Form in einem Phosphatpuffer getränkte und dann getrocknete Lagen. Anschließend wurden drei &mgr;&idiagr; von 20 mM D-Aminosäure in Ethanol zugegeben, und das Pad wurde getrocknet. Die Mengen der Referenzstandards wurde in einem Flüssigkeitsphasenassay mit einem definiertem Reaktionspuffer und unter definierten Reaktionsbedingungen kalibriert und mit ähnlich gemessenen Cholesterinkonzentrationen von einem vorherbestimmten Volumen einer Cholesterinlösung bekannter Konzentration in einem nicht-ionischen Detergenz verglichen. Nach Trocknen unter reduziertem Druck wurden die Reaktionspads eingebaut und an der Reaktionspadsplatte der Vorrichtung befestigt.
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Eine Vollblutprobe einer Testperson wurde konventionell erhalten und dem Reservoir in der Vorrichtung in einer hinreichenden Menge eingegeben, um die vier Testpads zu benetzen. Die benetzten Testpads wurden bei Raumtemperatur für 90 Sekunden oder bis keine weitere Farbentwicklung mehr beobachtet wurde inkubiert. Das analytabhängige Signal wurde durch Reflektionsvermögensspektroskopie mit einer Beleuchtungswellenlänge von 500 - 700 nm abgelesen. Die Werte für die Referenzstandardpads wurden aufgetragen um eine selbstkorrigierte Zwei-Punkt-Standardkurve zu erlangen, nach der die für Cholesterin abgelesenen Werte verrechnet wurden.
Beispiel 2
Serum HDL Assay
Serum HDL Assay
Die verwendete Assay-Vorrichtung war ähnlich zu der im Zusammenhang mit Figur 1 beschriebenen und wurde unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Reservoirs präpariert, das ein Dextransulfat (MW 50.000) -Mg Präzipitations-Agens bei neutralem pH enthielt. Die Reaktionspadzubereitungen waren, wie in Beispiel 1 beschrieben, zur enzymatischen Bestimmung von Cholestenn. Die 3,175 mm &khgr; 7,938 mm (1/8 inch &khgr; 5/16 inch) 150 &mgr;&eegr;&igr; dicken Glasfaserfilter wurden mit 5 Gew.-% Polyvinylalkohol beschichtet und ansonsten wie in Beispiel 1 verwendet.
Fünf Proben menschlichen Serums wurden präpariert, um bekannte Mengen von HDL Cholesterin zu enthalten, wobei die Konzentrationen über einen Bereich von 15 - 100 mg/dL mit gleichmäßig beabstandeter Verdünnungen variierten. Das HDL Cholesterin aller Proben wurde dreifach in der Assayvorrichtung mit den in Tabelle 2 wiedergegebenen Ergebnissen gemessen:
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| Proben-Nummer | Gemessenes HDL in mg / dL | Berechnetes HDL in mg / dL |
| 1 | 22,8 | 22,8 |
| 2 | 37,5 | 40,3 |
| 3 | 54,3 | 57,7 |
| 4 | 75,4 | 75,1 |
| 5 | 92,5 | 92,5 |
Die errechneten oder theoretischen Werte (y-Achse) wurden wie in Figur 11 gezeigt, gegen die Ergebnisse für die Proben aufgetragen, die bei Messung mit der erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung erhalten wurden.
Wie durch dieses Beispiel gezeigt wird, liefert die erfindungsgemäß verbesserte Assay-Vorrichtung HDL-Messungen, die die gleiche Genauigkeit haben wie Flüssigkeitsphasentests, die im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung venöse Blutproben und Flüssigkeitsprobenbehandlungen erfordern.
Beispiel 3
Serum Lipid-Assay
Die Assay-Vorrichtung ist ähnlich zu der im Zusammenhang mit Figur 9 beschriebenen und mit einem Präzipitationsreagenzreservoir in dem Probeneintragsbereich, das nur an das halbe unterliegende Siebpad angrenzt, wobei die Vorrich-
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tung unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionstestpadzubereitung präpariert wurde.
Die Werte für die Reaktionspads werden bei 500 - 700 nm wie oben gemessen. Die Messung des Reflektionsvermögens von dem fünften Pad wird verwendet, um eine Standardkurve zu konstruieren, und diese Kurve ist wie in Beispiel 1 beschrieben, auf bekannte Cholesterin und Triglyzeridkonzentrationen standardisiert. Die Signale von den ersten vier Testpads sind auf dieser Kurve aufgetragen und die korrigierte Analytkonzentration wird von der entsprechenden Position auf der Konzentrationsachse ausgelesen.
Das gesamte Serumcholesterin, HDL, freies Cholesterin und Triglyzeride werden nach der Standardkurve bestimmt, und diese Werte werden verwendet um LDL wie oben beschrieben zu berechnen. Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausfuhrungsformen und Konfigurationen beschrieben wurde, ist es für den Fachmann ersichtlich, daß vielfältige Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.
Claims (17)
1. Assay-Vorrichtung zur Messung eines löslichen Analyten in einer Flüssigkeitsprobe, die ebenfalls eine lösliche, den Assay störende Verbindung enthält, die selektiv präzipitiert werden kann, wenn sie einer vorherbestimmten Konzentration eines Fällungsmittels ausgesetzt wird, wobei die Vorrichtung umfaßt
eine Siebmatrix, die geeignet ist, lösliches von präzipitiertem Material in einer solchen Flüssigkeitsprobe zu trennen, wenn die Probe durch die Matrix von einem Probeneintragsort zu einem Probensammelort in der Matrix fließt;
ein Reagenzsreservoir, welches das Fällungsmittel und ein Freisetzungsmittel enthält zum Erzeugen einer Freisetzungsrate des Fällungsmittels von dem Reservoir in die Matrix, wenn die Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt, das wirksam ist, eine Konzentration des Fällungsmittels in der Flüssigkeitsprobe zu erzeugen, die innerhalb des vorherbestimmten Konzentrationsbereich liegt; und
ein Assay-Pad, in dem eine an dem Probensammelort gesammelte Flüssigkeitsprobe analysiert werden kann.
eine Siebmatrix, die geeignet ist, lösliches von präzipitiertem Material in einer solchen Flüssigkeitsprobe zu trennen, wenn die Probe durch die Matrix von einem Probeneintragsort zu einem Probensammelort in der Matrix fließt;
ein Reagenzsreservoir, welches das Fällungsmittel und ein Freisetzungsmittel enthält zum Erzeugen einer Freisetzungsrate des Fällungsmittels von dem Reservoir in die Matrix, wenn die Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt, das wirksam ist, eine Konzentration des Fällungsmittels in der Flüssigkeitsprobe zu erzeugen, die innerhalb des vorherbestimmten Konzentrationsbereich liegt; und
ein Assay-Pad, in dem eine an dem Probensammelort gesammelte Flüssigkeitsprobe analysiert werden kann.
2. Assay-Vorrichtung zur Messung eines löslichen Analyten in einer Flüssigkeitsprobe, die ebenfalls eine lösliche, den Assay störende Verbindung enthält, die selektiv präzipitiert werden kann, wenn sie einer vorherbestimmten Konzentration eines Fällungsmittels ausgesetzt wird, wobei die Vorrichtung umfaßt
ein Mittel, welches dimensioniert und bemessen ist, eine Menge der Flüssigkeitsprobe zu empfangen;
eine mit dem Mittel, welches dimensioniert und bemessen ist, eine Menge der Flüssigkeitsprobe zu empfangen, kommunizierende Siebmatrix, die geeignet ist, lösliches von präzipitiertem Material in einer solchen Flüssigkeitsprobe zu trennen, wenn die Probe durch die Matrix von einem Probeneintragsort zu einem Probensammelort in der Matrix fließt;
ein Reagenzsreservoir, welches das Fällungsmittel und ein Freisetzungsmittel enthält zum Erzeugen einer Freisetzungsrate des Fällungsmittels von dem Reservoir in die Matrix, wenn die Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt, das wirksam ist, eine Konzentration des Fällungsmittels in der Flüssigkeitsprobe zu erzeugen, die innerhalb des vorherbestimmten Konzentrationsbereich liegt; und
ein Assay-Pad, in dem eine an dem Probensammelort gesammelte Flüssigkeitsprobe analysiert werden kann.
ein Mittel, welches dimensioniert und bemessen ist, eine Menge der Flüssigkeitsprobe zu empfangen;
eine mit dem Mittel, welches dimensioniert und bemessen ist, eine Menge der Flüssigkeitsprobe zu empfangen, kommunizierende Siebmatrix, die geeignet ist, lösliches von präzipitiertem Material in einer solchen Flüssigkeitsprobe zu trennen, wenn die Probe durch die Matrix von einem Probeneintragsort zu einem Probensammelort in der Matrix fließt;
ein Reagenzsreservoir, welches das Fällungsmittel und ein Freisetzungsmittel enthält zum Erzeugen einer Freisetzungsrate des Fällungsmittels von dem Reservoir in die Matrix, wenn die Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt, das wirksam ist, eine Konzentration des Fällungsmittels in der Flüssigkeitsprobe zu erzeugen, die innerhalb des vorherbestimmten Konzentrationsbereich liegt; und
ein Assay-Pad, in dem eine an dem Probensammelort gesammelte Flüssigkeitsprobe analysiert werden kann.
3. Assay-Vorrichtung zur Messung eines löslichen Analyten in einer Flüssigkeitsprobe, die ebenfalls eine lösliche, den Assay störende Verbindung enthält, die selektiv präzipitiert werden kann, wenn sie einer vorherbestimmten Konzentration eines Fällungsmittels ausgesetzt wird, wobei die Vorrichtung umfaßt
eine oder mehrere Siebmatrizen, von denen mindestens eine Siebmatrix geeignet ist, lösliches von präzipitiertem Material in einer solchen Flüssigkeitsprobe zu trennen, wenn die Probe durch die Matrix von einem Probeneintragsort zu einem Probensammelort in der Matrix fließt;
ein Mittel, welches dimensioniert und bemessen ist, eine Menge der Flüssigkeitsprobe zu empfangen, welches in Bezug auf die Fließrichtung der Flüssigkeitsprobe stromaufwärts von den Siebmatrizen angeordnet ist;
ein Reagenzsreservoir, welches das Fällungsmittel und ein Freisetzungsmittel enthält zum Erzeugen einer Freisetzungsrate des Fällungsmittels von dem Reservoir in die Matrix, wenn die Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt, das wirksam ist, eine Konzentration des Fällungsmittels in der Flüssigkeitsprobe zu erzeugen, die innerhalb des vorherbestimmten Konzentrationsbereich liegt; und ein Assay-Pad, in dem eine an dem Probensammelort gesammelte Flüssigkeitsprobe analysiert werden kann.
eine oder mehrere Siebmatrizen, von denen mindestens eine Siebmatrix geeignet ist, lösliches von präzipitiertem Material in einer solchen Flüssigkeitsprobe zu trennen, wenn die Probe durch die Matrix von einem Probeneintragsort zu einem Probensammelort in der Matrix fließt;
ein Mittel, welches dimensioniert und bemessen ist, eine Menge der Flüssigkeitsprobe zu empfangen, welches in Bezug auf die Fließrichtung der Flüssigkeitsprobe stromaufwärts von den Siebmatrizen angeordnet ist;
ein Reagenzsreservoir, welches das Fällungsmittel und ein Freisetzungsmittel enthält zum Erzeugen einer Freisetzungsrate des Fällungsmittels von dem Reservoir in die Matrix, wenn die Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt, das wirksam ist, eine Konzentration des Fällungsmittels in der Flüssigkeitsprobe zu erzeugen, die innerhalb des vorherbestimmten Konzentrationsbereich liegt; und ein Assay-Pad, in dem eine an dem Probensammelort gesammelte Flüssigkeitsprobe analysiert werden kann.
4. Assay-Vorrichtung zur Messung eines löslichen Analyten in einer Flüssigkeitsprobe, die ebenfalls eine lösliche, den Assay störende Verbindung enthält, die selektiv präzipitiert werden kann, wenn sie einer vorherbestimmten Konzentration eines Fällungsmittels ausgesetzt wird, wobei die Vorrichtung umfaßt
eine Siebmatrix, die geeignet ist, lösliches von präzipitiertem Material in einer solchen Flüssigkeitsprobe zu trennen, wenn die Probe durch die Matrix von einem Probeneintragsort zu mindestens zwei Probensammelorten in der Matrix fließt;
ein Reagenzsreservoir, welches das Fällungsmittel und ein Freisetzungsmittel enthält zum Erzeugen einer Freisetzungsrate des Fällungsmittels von dem Reservoir in die Matrix, wenn die Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt, das wirksam ist, eine Konzentration des Fällungsmittels in der Flüssigkeitsprobe zu erzeugen, die innerhalb des vorherbestimmten Konzentrationsbereich liegt; und
mindestens zwei Assay-Pads, in denen jeweils die an den mindestens zwei Probensammelorten gesammelte Flüssigkeitsprobe analysiert werden kann.
eine Siebmatrix, die geeignet ist, lösliches von präzipitiertem Material in einer solchen Flüssigkeitsprobe zu trennen, wenn die Probe durch die Matrix von einem Probeneintragsort zu mindestens zwei Probensammelorten in der Matrix fließt;
ein Reagenzsreservoir, welches das Fällungsmittel und ein Freisetzungsmittel enthält zum Erzeugen einer Freisetzungsrate des Fällungsmittels von dem Reservoir in die Matrix, wenn die Flüssigkeitsprobe in und durch die Matrix fließt, das wirksam ist, eine Konzentration des Fällungsmittels in der Flüssigkeitsprobe zu erzeugen, die innerhalb des vorherbestimmten Konzentrationsbereich liegt; und
mindestens zwei Assay-Pads, in denen jeweils die an den mindestens zwei Probensammelorten gesammelte Flüssigkeitsprobe analysiert werden kann.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1-4, wobei die Matrix aus einem Netzwerk von Glasfasern besteht, und das Reagenzreservoir auf die Glasfasern beschichtet ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1-4, wobei das Fällungsmittel eine polyanionische Verbindung und ein Metallkation der zweiten Hauptgruppe beinhaltet, und das Freisetzungsmittel geeignet ist, eine Freisetzung der polyanionischen Verbindung bei Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe in einer Rate freiszusetzen, die eine Konzentration der Verbindung erzeugt, die wirksam ist, um Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL) und Lipoproteine geringer Dichte (LDL) selektiv zu präzipitieren.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die polyanionische Verbindung aus der Gruppe bestehend aus sulfatierten Polysachariden, Heparin, und Wolframphosphorsäure ausgewählt ist und das Metall der zweiten Hauptgruppe aus der Gruppe bestehend aus Mg2+, Mn2+ und Ca2+ ausgewählt ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die polyanionische Verbindung Dextransulfat, das Metall der zweiten Hauptgruppe Mg2+ und die Konzentration des Fällungsmittels in der Matrix nach Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe zwischen etwa 0,5 und 1,0 mg/ml für Dextransulfat und zwischen etwa 0,045 bis 0,15 M Mg2+ ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 1-4, wobei die Matrix ein Beschichtungsmaterial beinhaltet, das wirksam ist, die Bindung des löslichen Analyten an die Matrix in Gegenwart des Fällungsmittels zu verhindern.
10. Vorrichtung nach Anspruch 1-4 zur Verwendung bei der Messung von Serumcholesterin, welches spezifisch mit Lipoproteinen hoher Dichte (HDL) assoziiert ist, wobei das Fällungsmittel eine polyanionische Verbindung und ein Kation der zweiten Hauptgruppe umfaßt, und wobei das Freisetzungsmittel eine Freisetzung der polyanionischen Verbindung bei Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe in einer Rate bewirkt, die eine Konzentration der Verbindung erzeugt, die selektives Präzipitieren der Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL) und der Lipoproteine geringer Dichte (LDL) bewirkt.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die polyanionische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe die besteht aus sulfatierten Polysachariden, Heparin und Wolframphosphorsäure und das Metall der zweiten Hauptgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe die besteht aus Mg2+, Mn2+ und Ca2+.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die polyanionische Komponente Dextransulfat ist, das Metall der zweiten Hauptgruppe Mg2+ ist, und die Konzentration des Fällungsmittels in der Matrix nach Kontakt mit der Flüssigkeitsprobe zwischen etwa 0,5 und 1,0 mg/ml für Dextransulfat und zwischen etwa 0,045 bis 0,15 M Mg2+ beträgt.
13. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Matrix ein Beschichtungsmaterial beinhaltet, das wirksam ist, eine Bindung der Lipoproteine hoher Dichte (HDL) an die Matrix in der Gegenwart des Fällungsmittels verhindern.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei die Matrix aus einem Netzwerk von Glasfasern zusammengesetzt ist und das Beschichtungsmaterial ein hydrophiles Polymer ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei die Beschichtung ausgewählt ist aus der Gruppe die besteht aus Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrolidin, Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Polyethylenimin, Polyvinylsilfonsäure, Poly(3-Hydroxybuttersäure), Polyacrylsäure, Poly(3-Hydroxyvaleriansäure), Poly(4-Styrolsulfonsäure), Poly(2-Acrylamidosulfonsäure) oder Poly-L- Glutamat.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei die Matrix zusammengesetzt ist aus einem Netzwerk von Glasfasern mit Oberflächensilylgruppen, und wobei die Beschichtung, welche die Oberflächensilylgruppen umfaßt aus Silylethern zusammengesetzt ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Beschichtung zusammengesetzt ist aus Silylmono- oder -di-Ethern von Bis (Hydroxyethyl)Aminopropyltriethoxysilan.
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