ES2303882T3 - Membranas y laminados que contienen reactivos y sus procedimientos de preparacion. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de aplicación de un reactivo a una membrana (12, 14) en un laminado de membrana (10), comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar un laminado (10) de primera (12) y segunda membranas (14), teniendo dicho laminado (10) una superficie de la primera membrana externa (16), una superficie de la primera membrana laminada (18), una superficie de la segunda membrana laminada (20), y una superficie de la segunda membrana externa (22), (b) aplicar un volumen controlado de una solución de un primer reactivo a dicha superficie de la primera membrana externa (16), poniendo en contacto dicha superficie (16) con un soporte plano o cilíndrico (36) que tiene una superficie que contiene un patrón de huecos llenos con dicha solución, y (c) secar dicha primera membrana (12) de dicho laminado (10), para producir un laminado (10) que contiene dicha primera membrana (12) impregnada con dicho primer reactivo, en el que dicho primer reactivo no entra en contacto con la segunda membrana (14) en dicho laminado (10).

Description

Membranas y laminados que contienen reactivos y sus procedimientos de preparación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para impregnar una membrana o un laminado de membrana con una cantidad uniforme y controlada de reactivo. En aspectos particulares, la invención se refiere a la preparación de laminados de membrana que contienen reactivos impregnados, donde los reactivos se limitan a una única capa respectiva del laminado y a dichas membranas y laminados que contienen reactivo y dispositivos de ensayo que los contienen.

Antecedentes de la invención

Los ensayos de diagnóstico que emplean un formato de tira, donde un material poroso tal como una tira o membrana fibrosa se impregna con reactivos de diagnóstico, son de uso común debido a su comodidad, velocidad y necesidad reducida de manipulación de reactivos por parte del usuario. La aplicación uniforme y reproducible de reactivo es importante en la producción de dichos dispositivos, para asegurar la consistencia y precisión de los resultados de ensayo.

Se han empleado diversos procedimientos para aplicar reactivos a dichas tiras de ensayo. Por ejemplo, una membrana porosa puede impregnarse con un reactivo simplemente poniendo en contacto la membrana con una solución del reactivo. Para conseguir una impregnación uniforme, típicamente se usa una cantidad de saturación de solución. Sin embargo, este enfoque a menudo produce una distribución no uniforme de los reactivos. En particular, es insatisfactorio para membranas laminadas ya que generalmente no limita la dispersión del reactivo a una sola capa, particularmente si las capas son de materiales similares. El recubrimiento por pulverización o el recubrimiento por jeringa de reactivo a una superficie de una membrana o laminado puede proporcionar un mejor control de la cantidad de reactivo aplicada, reduciendo de esta manera el riesgo de dispersión a las capas subyacentes en un laminado. Sin embargo, el recubrimiento por estos procedimientos tiende también a ser no uniforme, produciendo gradientes de concentración con más reactivo en el centro del área de aplicación.

Como se describe en el documento EP 1 329 724 A2 y el documento DE 102 04 606, otro enfoque para aplicar reactivos a diferentes capas en un laminado es recubrir o impregnar las capas por separado, seguido de laminación. Los documentos anteriores divulgan un dispositivo de ensayo de lipoproteína de alta densidad (HDL) que contiene un tampón de reactivo y una membrana de reacción con HDL. Dicho tampón de reactivo se produce administrando solución acuosa que contiene sulfato de dextrano sobre una membrana asimétrica a una cierta velocidad de suministro. Usando el mismo procedimiento, la membrana de reacción con HDL se impregna con una formulación acuosa. Para completar el dispositivo de ensayo anterior, las dos membranas impregnadas se unen por separado o simultáneamente por soldadura ultrasónica.

El documento EP 0 740 157 A2 divulga el uso de un procedimiento de recubrimiento por grabado para producir recubrimientos de ligando marcados sobre una capa particulada. La idea del documento EP'157 es proporcionar un recubrimiento que pueda recubrirse directamente sobre la capa particulada, por ejemplo un tejido sin una capa de barrera interpuesta. Este documento no hace referencia a la impregnación de una membrana de un laminado de membrana, es decir, a producir un laminado que contiene una primera membrana impregnada con un primer reactivo, donde dicho primer reactivo no entra en contacto con la segunda membrana en dicho laminado.

El documento EP 1 357 383 se refiere a un dispositivo de ensayo y un procedimiento para medir la concentración de HDL asociado con colesterol en una muestra de fluido sanguíneo. El documento EP'383 utiliza dos membranas poliméricas, en las que se impregnan los reactivos apropiados y las membranas posteriormente se procesan como una capa de dos membranas para incorporar en el dispositivo de ensayo. De esta manera, las dos membranas poliméricas se impregnan por separado.

Sin embargo, esto no es ventajoso puesto que dicha laminación ultrasónica o una laminación térmica puede ser inadecuada para reactivos sensibles al calor. Adicionalmente, el uso de un adhesivo entre las capas puede reducir la necesidad de calentamiento aunque conduce a una posible contaminación de los compuestos químicos de ensayo. También es importante retener la porosidad de las membranas porosas y cualquiera de estas técnicas puede ser perjudicial en este respecto.

Por lo tanto, el problema técnico de la presente invención es proporcionar un procedimiento para aplicación uniforme de reactivos a membranas y en particular a membranas separadas en un laminado, sin contaminación cruzada entre las capas, y sin exponer los reactivos a un calor excesivo. Idealmente, dicho procedimiento aplicaría uniformemente un volumen controlado de reactivo a uno o a ambos lados de dicho laminado. Otro problema adicional de la presente invención es proporcionar un dispositivo de ensayo que comprenda membranas cargadas uniformemente para determinar resultados de ensayo fiables.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de aplicación de un reactivo a una membrana en un laminado de membrana, que comprende una primera y segunda membranas laminadas. El procedimiento comprende:

(a) proporcionar un laminado de la primera y segunda membranas que tienen una superficie de la primera membrana externa, una superficie de la primera membrana laminada, una superficie de la segunda membrana laminada, y una superficie de la segunda membrana externa;

(b) aplicar un volumen controlado de una solución de un primer reactivo a la superficie de la primera membrana externa, poniendo en contacto la superficie con un soporte que tiene una superficie que contiene un patrón, y

(c) secar la primera membrana del laminado,

para producir un laminado que contiene la primera membrana impregnada con el primer reactivo, en el que el primer reactivo no entra en contacto con la segunda membrana del laminado.

Preferiblemente, el procedimiento aplica dicha solución mediante un patrón que comprende huecos llenos con dicha solución o mediante un patrón que comprende proyecciones que aplican dicha solución. Adicionalmente, dicho soporte comprende preferiblemente una forma plana o cilíndrica.

Preferiblemente, el procedimiento comprende también impregnar la segunda capa con un segundo reactivo, (d) aplicando un volumen controlado de una solución del segundo reactivo a la superficie de la segunda membrana externa, poniendo en contacto la superficie con un soporte sólido que contiene huecos llenos con la solución, y (e) secando la segunda membrana en los laminados para producir un laminado que contiene la segunda membrana impregnada con el segundo reactivo, en el que el segundo reactivo no entra en contacto con la primera membrana del laminado.

Típicamente, el soporte sólido es un cilindro de grabado rotatorio que tiene una pluralidad de huecos o células formadas en la superficie, como se analiza posteriormente. Preferiblemente dicha aplicación ocurre simultáneamente en toda la anchura de la superficie de la primera membrana externa, para producir una aplicación uniforme por toda la anchura de la membrana.

El "volumen controlado" de solución generalmente no es más que una cantidad de saturación de la solución, con respecto a la capacidad absorbente de la membrana respectiva y típicamente es una cantidad de subsaturación como se define a continuación. En ciertas realizaciones, un reactivo dado (primero o segundo) no entra en contacto con la superficie laminada de la membrana respectiva en el laminado acabado; es decir, penetra sólo parcialmente a través de la profundidad de la membrana respectiva. En otras realizaciones, un reactivo dado (primero o segundo) entra en contacto con la superficie laminada de la membrana respectiva en el laminado terminado; es decir, impregna todo el espesor de la membrana respectiva aunque no entra en contacto con la otra membrana del laminado.

En una realización, al menos la primera membrana es una membrana asimétrica, es decir, tiene una superficie con poros pequeños y una superficie con poros grandes. La segunda membrana puede ser también una membrana asimétrica. En las realizaciones seleccionadas, la superficie de la primera membrana externa es la superficie de poros grandes de la primera membrana. En otra realización, la superficie de la segunda membrana externa es la superficie de poros pequeñas de la segunda membrana. Dicha realización se ilustra en la Figura 1 que muestra un laminado (10) de la primera membrana (12) y de la segunda capa (14), que tiene superficie de la primera membrana externa (16), superficie de la primera membrana laminada (18), superficie de la segunda membrana laminada (20) y superficie de la segunda membrana externa (22). La superficie de la primera membrana laminada y la superficie de la segunda membrana laminada forman conjuntamente una interfaz del laminado.

Al menos uno de los reactivos puede ser un reactivo sensible al calor, de manera que laminar una membrana que contiene dicho reactivo a otra membrana produciría un cambio perjudicial en el reactivo. En una realización, el primer reactivo comprende reactivos eficaces para retirar selectivamente las lipoproteínas no HDL de una muestra de fluido sanguíneo que pasa a través de la primera membrana, y el segundo reactivo comprende reactivos eficaces para producir una señal detectable ópticamente proporcional a la cantidad de colesterol asociado a HDL en la segunda membrana.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona un procedimiento de aplicación de un reactivo a una membrana, aplicando un volumen controlado de una solución de dicho reactivo a una primera superficie de la membrana, poniendo en contacto la superficie con un soporte plano o cilíndrico que tiene una superficie que contiene un patrón de huecos llenos con la solución. De nuevo, el soporte es típicamente un cilindro de grabado rotatorio. Adicionalmente, se usan preferiblemente las técnicas y aparatos que están descritos para aplicar reactivos a una membrana en un laminado de membrana.

La cantidad controlada de reactivo puede ser una cantidad de subsaturación. En una realización, después de la aplicación de reactivo y, preferiblemente, su secado, el reactivo no entra en contacto con la superficie opuesta de dicha membrana; es decir, penetra sólo parcialmente a través de la profundidad de la membrana. La aplicación del reactivo preferiblemente ocurre simultáneamente por toda la anchura de la primera superficie de la membrana. Por consiguiente, la concentración de reactivo es preferiblemente uniforme a través de la longitud y anchura de dicha membrana.

La membrana puede ser una membrana asimétrica que tiene una superficie de poros pequeños y una superficie de poros grandes; en una realización, la primera superficie, a la que se aplica el reactivo, es la superficie de poros grandes. En otras realizaciones, la primera superficie es la superficie de poros pequeños. En una realización preferida, el reactivo comprende reactivos eficaces para retirar selectivamente lipoproteínas no HDL de una muestra de fluido sanguíneo que pasa a través de la membrana; como alternativa, el reactivo incluye reactivos eficaces para precipitar selectivamente partículas de lipoproteína no HDL (LDL y VLDL) en la muestra, y se evita por filtración que las partículas de LDL y VLDL precipitadas pasen a través de la membrana. En esta realización, cuando la membrana es una membrana asimétrica, el reactivo se aplica a la superficie de poros grandes. En otra realización preferida, el reactivo comprende reactivos eficaces para producir una señal detectable ópticamente proporcional a la cantidad de colesterol asociado con HDL en la membrana. En esta realización, cuando la membrana es una membrana asimétrica, el reactivo se aplica a la superficie de poros pequeños. En otro aspecto, la invención proporciona un laminado de membrana para usar en un ensayo de diagnóstico que comprende primera y segunda membranas laminadas que se unen en una interfaz del laminado, donde la primera membrana en dicho laminado está impregnada con un primer reactivo, la segunda membrana está impregnada con un segundo reactivo y el reactivo en al menos una de las membranas está ausente en una región laminar de esta membrana adyacente a la interfaz del laminado, de manera que los reactivos en las dos membranas están separados físicamente por al menos esta región laminar. Preferiblemente, la concentración de cada reactivo o sistema de reactivo es uniforme a través de la longitud y anchura de la membrana respectiva.

En las realizaciones seleccionadas, al menos uno de dichos reactivos es sensible al calor, de manera que laminar una membrana que contiene dicho reactivo a una membrana adicional produciría un cambio perjudicial en el reactivo.

Preferiblemente, al menos la primera membrana es una membrana asimétrica que tiene una superficie de poros pequeños y una superficie de poros grandes. En las realizaciones seleccionadas, la superficie de poros pequeños está orientada hacia la interfaz del laminado. La segunda membrana puede ser también una membrana asimétrica; en las realizaciones seleccionadas, su superficie de poros grandes está orientada hacia la interfaz del laminado.

En una realización preferida, el primer reactivo comprende reactivos eficaces para retirar selectivamente lipoproteínas no HDL de una muestra de fluido sanguíneo que pasa a través de dicha primera membrana; como alternativa, el primer reactivo incluye reactivos eficaces para precipitar selectivamente partículas de lipoproteína no HDL (LDL y VLDL) en la muestra, y se evita por filtración que las partículas de LDL y VLDL precipitadas pasen a través de la interfaz del laminado. En estas realizaciones, el segundo reactivo comprende reactivos eficaces para producir una señal detectable ópticamente proporcional a una cantidad de colesterol asociado con HDL en la segunda membrana. Preferiblemente, en dicho laminado, el reactivo en la segunda membrana está ausente en una región laminar de esta membrana adyacente a la interfaz del laminado.

En un aspecto relacionado, la invención puede usarse para proporcionar un dispositivo de ensayo para ensayar HDL en una muestra de sangre o suero, que comprende

(a) un sustrato que tiene un pocillo de recepción de muestra para recibir una alícuota de la muestra,

(b) un laminado de membrana que comprende primera y segunda membranas laminadas que están unidas en una interfaz del laminado, en el que

(i)

la primera membrana está impregnada con reactivos eficaces para precipitar selectivamente partículas de lipoproteínas LDL y VLDL en la muestra, y se evita por filtración que las partículas de LDL y VLDL precipitadas pasen a través de la interfaz del laminado;

(ii)

la segunda membrana está impregnada con reactivos eficaces para producir una señal detectable ópticamente proporcional a una cantidad de colesterol asociado con HDL en la segunda membrana; y

(iii)

el reactivo en al menos una de las membranas, y preferiblemente la segunda membrana, está ausente en una región laminar de esta membrana adyacente a la interfaz del laminado, de manera que los reactivos de las dos membranas están separados físicamente por al menos esta región laminar.

En el laminado, como se ha descrito anteriormente, la concentración de cada reactivo es preferiblemente uniforme en toda la longitud y anchura de la membrana. El dispositivo comprende también (c) un filtro entre el pocillo de recepción de muestra y la primera membrana del laminado, para retirar los glóbulos rojos sanguíneos en la muestra cuando la muestra migra desde el pocillo de recepción de muestra al laminado, en el que el pocillo, el filtro y el laminado están o pueden ponerse en comunicación fluida entre sí.

Estos y otros objetos y características de la invención resultarán más evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención junto con los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una vista de sección transversal de dos membranas asimétricas laminadas a las que pueden aplicarse los reactivos de acuerdo con una realización de la invención;

La Figura 2 es un diagrama esquemático que muestra un sistema de recubrimiento para aplicación de reactivos a un laminado, de acuerdo con una realización de la invención; y

La Figura 3 es una vista lateral de un dispositivo de ensayo que incorpora un laminado de membrana de acuerdo con una realización de la invención.

Descripción detallada de la invención I. Procedimiento de aplicación de reactivo

La invención proporciona procedimientos de impregnación o de recubrimiento de un laminado de al menos dos membranas con al menos un reactivo, de manera que cada reactivo está confinado a su membrana respectiva. Preferiblemente, el laminado incluye al menos dos membranas, conteniendo cada una un reactivo o sistema de reactivo diferente.

Un ejemplo de dicho laminado es un ensamblaje de membrana usado en un dispositivo diseñado para medir la concentración de colesterol asociado con HDL en una muestra de sangre que contiene también partículas de LDL y VLDL. Véase por ejemplo Jones et al., Publicación de Solicitud de Estados Unidos Nº 20030166291 y Solicitud de Estados Unidos con Nº de Serie 10/410.671. Sin embargo, la invención es útil para cualquier aplicación que emplee un laminado como se ha descrito anteriormente, que tiene reactivos impregnados en al menos una y preferiblemente dos capas de membrana, donde cada reactivo debe confinarse a su capa respectiva.

El laminado de ensayo de HDL ejemplar, como se describe adicionalmente a continuación, incluye una membrana de ensayo de HDL, en la que se mide la concentración de HDL, y una membrana de reactivo, que contiene un reactivo de unión y/o precipitación, de manera que la membrana es eficaz para retirar selectivamente las lipoproteínas no HDL de la muestra fluida, antes de que la muestra entre en contacto con la membrana de ensayo.

Preferiblemente, cada una de las membranas en el laminado es una membrana asimétrica porosa; es decir, una membrana que tiene una gradiente de tamaño de poros a través de su espesor. En la Figura 1 se muestra en sección transversal una capa de dos membranas ejemplar (10) que comprende dos membranas asimétricas (12) y (14), mostrando la orientación preferida, con los poros mayores en (24) y los poros más pequeños en (26) en la membrana (12).

Para que el ensayo de HDL funcione con precisión, el reactivo de ensayo de HDL debe restringirse a su capa respectiva. Si el reactivo para HDL está presente en la capa de reactivo, el color desarrollado en la reacción de ensayo generalmente representará una fracción del colesterol no HDL además del analito, el colesterol asociado a HDL.

Los solicitantes han descubierto que un procedimiento de impresión por grabado, en el que el fluido se aplica a un sustrato desde los huecos en una placa sólida que tiene una forma plana o arbitraria, o típicamente un cilindro rotatorio, permite depositar un volumen controlado de diferentes reactivos a superficies opuestas de una membrana laminada. Controlando el volumen de depósito, cada reactivo puede limitarse a su capa respectiva en el laminado.

De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, los reactivos se aplican a membranas separadas o laminados de membrana mediante una técnica de impresión tipográfica. Para ello, el soporte tiene una configuración plana o arbitraria adecuada, preferiblemente la configuración de un cilindro. Dicho soporte comprende un patrón de proyecciones de aplicación de los reactivos a la membrana. Preferiblemente, dichos reactivos se proporcionan teniendo una consistencia para adherirse temporalmente a dichas proyecciones de manera que se aplican de una manera controlada.

En el recubrimiento por grabado, una red de depresiones, típicamente células espaciadas próximas, se graba sobre la superficie de un cilindro metálico. Las células se cargan con fluido y el cilindro rotatorio transfiere el fluido a un sustrato. Las células tienen un volumen definido, limitando de esta manera la cantidad de líquido que puede transferirse al sustrato. Típicamente, un cilindro tiene un volumen de aproximadamente 30-50 \mul por pulgada cuadrada de superficie de cilindro (aproximadamente 4,5-8 \mul por cm^{2}). (En este sentido, la "superficie del cilindro" se supone una superficie lisa, correspondiente al área superficial del sustrato en contacto con el cilindro. No incluye el área superficial adicional proporcionada por los propios huecos.) Pueden usarse también otras capacidades de volumen. Los huecos generalmente son de tamaño uniforme y están espaciados próximos, de manera que tras la transferencia de gotas de líquido a la membrana, coalescen en una capa uniforme de líquido.

Un sistema de recubrimiento por grabado que puede usarse para realizar los procedimientos descritos en este documento se muestra como (30) en la Figura 2. (Como se usa en este documento, "recubrir" una membrana incluye aplicar un reactivo de manera que penetre más allá de la superficie y pueda impregnar todo el espesor de la membrana).

La membrana o "banda" laminada (32) se suministra desde un rodillo (34). El cilindro de grabado (36) es típicamente de cobre, o de acero o aluminio metalizado con cobre; una capa fina de cromo se aplica a menudo para proporcionar durabilidad. Como se ha descrito anteriormente, la superficie del cilindro se graba con una pluralidad de pequeñas células eficaces para contener una cantidad definida de líquido. Se elige un cilindro con un patrón de pocillos que es eficaz para aplicar un recubrimiento uniforme con el sistema de recubrimiento dado. El cilindro puede estar parcialmente sumergido en un baño o bandeja del fluido a aplicar. Como alternativa, como se prefiere para el presente procedimiento, puede usarse una cámara de reactivo (38) para suministrar solución de reactivo al cilindro mediante los conductos (40). La cámara reduce la exposición de los reactivos a la atmósfera.

Según gira el cilindro, el exceso de solución se quita del cilindro mediante una rasqueta flexible (41) que entra en contacto con el cilindro entre la cámara de reactivo o bandeja y la membrana (32). La solución restante en las células huecas se transfiere entonces a la superficie deseada de la membrana.

En una realización, la membrana (32) se mantiene en contacto tangencial (es decir, contactando unos pocos grados de la circunferencia de cilindro) con el cilindro de grabado mediante un cilindro tensor (42), un procedimiento al que se hace referencia como "beso" del grabado. Como alternativa, la banda puede pasar entre el cilindro de grabado (36) y un cilindro de impresión o "reserva" como se muestra en (42'). En este procedimiento, el cilindro tensor (42) generalmente está ausente. En un procedimiento de grabado por transferencia (no mostrado) el fluido se transfiere desde el
cilindro de grabado a un rodillo de transferencia recubierto con goma, que aplica después la solución al sustrato.

El sustrato se hace pasar después a través de un secador (44), preferiblemente una soplante de secado IR y se lleva al rodillo tensor (46). La otra superficie de laminado se recubre entonces de una manera similar.

El procedimiento de recubrimiento por grabado puede realizarse de un modo directo, donde el cilindro gira en la misma dirección que el suministro de la membrana. Como alternativa, en un grabado inverso como se ilustra en la Figura 2, la dirección rotacional del cilindro es opuesta a la dirección de desplazamiento de la membrana. Esta disposición da como resultado una fuerza de cizalla que se aplica a la solución según se transfiera el sustrato, que puede dar como resultado un recubrimiento más liso.

El volumen de la solución de reactivo aplicado a la membrana que contacta con el rodillo de grabado está limitado por el volumen de las células en la superficie del cilindro, como se ha observado anteriormente. La cantidad realmente transferida desde las células a la membrana depende de factores adicionales, tales como velocidad del cilindro, presión del rodillo, velocidad de la banda y componentes de la solución. Por consiguiente, la cantidad transferida a la membrana puede controlarse adicionalmente mediante la selección apropiada de la configuración del sistema, el tiempo de contacto entre la membrana y el cilindro (determinado por la velocidad de la banda y la dirección relativa de la velocidad y dirección de la rotación de grabado) y el nivel de tensioactivo. El tensioactivo se incluye para facilitar la transferencia de la solución a la superficie de la membrana, que por otro lado podría repeler una solución acuosa, dependiendo de la hidrofobicidad del material de membrana.

Para membranas asimétricas, la penetración de reactivo en las membranas también depende del tamaño y distribución de los poros. Por ejemplo, con referencia a la Figura 1, la solución aplicada a la superficie (16) (poros grandes) se arrastrará hacia la membrana por la acción capilar en una extensión mayor significativa que la solución aplicada a la superficie (22) (poros pequeños).

Por consiguiente, la aplicación de un volumen controlado de solución de reactivo a un lado de una membrana en la superficie extrema de un laminado, seguido de secado, produce un laminado en el que el reactivo no penetra más allá de esta membrana. La cantidad controlada puede ser una cantidad de sub-saturación; es decir, un volumen de la solución que es menor que el que, si se aplicara a una membrana seleccionada, penetraría toda la membrana por flujo capilar. En algunos casos, puede usarse un volumen de saturación o casi-saturación.

De acuerdo con la invención, una cantidad de solución de reactivos se aplica a la membrana para dar la cantidad deseada de penetración en el espesor o profundidad de la membrana. Aplicando simultáneamente la cantidad controlada de solución a través de la anchura de la membrana, el procedimiento de aplicación proporciona también una concentración uniforme de reactivo a través de la longitud y anchura de la membrana. Por "uniforme" se entiende que no hay gradientes de concentración significativos o cambios a través de la longitud o anchura de la membrana. Esta uniformidad es eficaz para dar lecturas de ensayo consistentes para la muestra presentada en diferentes puntos sobre la superficie del laminado. Preferiblemente, después de la aplicación de reactivo y secado, la cantidad de reactivo presente en diferentes puntos en la superficie de una membrana del laminado o en diferentes puntos en una superficie laminar dada paralela a esta superficie, varía en no más de aproximadamente el 5%.

El procedimiento de aplicación es útil para reactivos sensibles al calor, donde la laminación de una membrana que contiene el reactivo, en condiciones de laminación térmica normales, produciría un cambio perjudicial en el reactivo y/o en su función en un ensayo realizado en el laminado. Dicho cambio podría incluir un cambio en la morfología o distribución del reactivo así como cambios químicos en el reactivo.

El procedimiento de aplicación puede usarse también ventajosamente para aplicar una cantidad controlada de reactivo de una manera uniforme a una sola membrana, poniendo en contacto la superficie de la membrana con un soporte plano o cilíndrico que tiene una superficie que contiene un patrón de huecos llenos con la solución. De nuevo, el soporte es típicamente un cilindro de grabado rotatorio, como se ha descrito anteriormente. Como en el recubrimiento del laminado, la aplicación de reactivo por este procedimiento ocurre preferiblemente simultáneamente en toda la anchura de la superficie de la primera membrana; por consiguiente, la concentración de reactivo es sustancialmente uniforme a través de la longitud y anchura de la membrana.

La cantidad controlada de reactivo puede ser una cantidad de sub-saturación. En una realización, después de la aplicación de reactivo y, preferiblemente, de su secado, el reactivo no entra en contacto con la superficie opuesta de la membrana; es decir, penetra sólo parcialmente a través de la profundidad de la membrana.

El procedimiento es ventajoso incluso cuando debe aplicarse una cantidad de saturación, en que produce una membrana en la que los reactivos están impregnados más uniformemente, comparado con los procedimientos de la técnica anterior, tal como inmersión en una cantidad de saturación de solución o recubrimiento por pulverización.

La invención proporciona también membranas impregnadas con reactivos de acuerdo con este procedimiento. Son de particular interés las membranas para usar en ensayos de diagnóstico.

La membrana puede ser una membrana asimétrica que tiene una superficie de poros pequeños y una superficie de poros grandes; el reactivo puede aplicarse a cualquiera de las superficies. En una realización preferida, el reactivo comprende reactivos eficaces para retirar selectivamente lipoproteínas no HDL de una muestra de fluido sanguíneo que pasa a través de la membrana; como alternativa, el reactivo incluye reactivos eficaces para precipitar selectivamente partículas de lipoproteína no HDL (LDL y VLDL) en la muestra, y se evita por filtración que las partículas de LDL y VLDL precipitadas pasen a través de la membrana. En estas realizaciones, cuando la membrana es una membrana asimétrica, el reactivo se aplica preferiblemente a la superficie de poros grandes. En otra realización preferida, el reactivo comprende reactivos eficaces para producir una señal detectable ópticamente proporcional a una cantidad de colesterol asociado a HDL en la membrana. En esta realización, cuando la membrana es una membrana asimétrica, el reactivo se aplica preferiblemente a la superficie de poros pequeños.

II. Laminados de Membrana

En otro aspecto, la invención proporciona membranas laminadas que tienen reactivos impregnados en al menos una y preferiblemente dos capas de membrana, donde cada reactivo (o sistema de reactivos) está confinado a su capa respectiva. En general, diferentes capas contienen diferentes sistemas de reactivo. Preferiblemente, el reactivo se aplica a una membrana o laminado de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente. Son de particular interés los laminados de membrana que se usan en ensayos de diagnóstico.

Dicho laminado comprende primera y segunda membranas laminadas impregnadas con primer y segundo reactivos, respectivamente, que se unen a una interfaz del laminado. Al menos uno del primer y segundo reactivos está ausente en una región laminar de la membrana respectiva adyacente a la interfaz del laminado, de manera que los reactivos en las dos membranas están separados físicamente por al menos esta región laminar.

Preferiblemente, la concentración de cada uno de dichos reactivos es uniforme a través de la longitud y anchura de la membrana respectiva que contiene este reactivo. Esta uniformidad es eficaz para dar consistencia a las lecturas del ensayo para la muestra presentada en diferentes puntos sobre la superficie del laminado. Preferiblemente, la cantidad de reactivo presente en diferentes puntos en el sustrato de la membrana del laminado o en diferentes puntos en una superficie laminar dada paralela a esa superficie, varía en no más de aproximadamente el 5%.

En una realización, el laminado es uno diseñado para usar en la determinación del nivel de colesterol asociado a HDL en una muestra de fluido. Véase por ejemplo Jones et al., Publicación de Solicitud de Estados Unidos Nº 20030166291 y Solicitud de Estados Unidos con Nº de Serie 10/410.671 citadas anteriormente. En este caso, la primera membrana contiene reactivos eficaces para retirar selectivamente lipoproteínas no HDL de una muestra de fluido sanguíneo que pasa a través de la membrana. Las lipoproteínas no HDL pueden retirarse por ejemplo uniéndose selectivamente a un reactivo contenido o inmovilizado en la membrana. Como alternativa o además, estos componentes se retiran por precipitación selectiva mediante el reactivo y se evita por filtración que pasen a través de la interfaz del laminado hacia la segunda membrana.

Dichos reactivos incluyen compuestos polianiónicos tales como polisacáridos sulfatados, heparina o fosfotungstato, en combinación con un catión del grupo II tal como Mg^{2+}, Mn^{2+} o Ca^{2+}. Un reactivo preferido es un polisacárido sulfatado tal como sulfato de dextrano, que tiene un peso molecular típico de 50-500 KDa, en combinación con acetato o cloruro de magnesio, tamponado opcionalmente para mantener un pH neutro. Los reactivos pueden inmovilizarse también a la membrana.

La membrana de ensayo de HDL contiene reactivos para la cuantificación de colesterol asociado a HDL como se sabe en la técnica. Véanse por ejemplo las patentes de Estados Unidos de cesión común 5.213.964, 5.213.965, 5.316.196 y 5.451.370. Típicamente, los reactivos de ensayo incluyen colesterol esterasa, para liberar el colesterol libre de HDL, colesterol oxidasa, para producir H_{2}O_{2} por reacción con el colesterol libre, peroxidasa y un sistema colorante acoplado que se convierte en presencia de peroxidasa y H_{2}O_{2}, en un producto de reacción con señal coloreada distintiva. Se conocen en la técnica reactivos de ensayo para cuantificación de otros componentes sanguíneos, por ejemplo co-
lesterol total, triglicéridos o glucosa y comprenden frecuentemente sistemas de encima/colorante acoplado similares.

Preferiblemente, al menos la primera membrana es una membrana asimétrica que tiene una superficie de poros pequeños y una superficie de poros grandes. La superficie de poros pequeños está orientada preferiblemente hacia la interfaz del laminado, de manera que la superficie de poros grandes está en la superficie externa del laminado. Esta orientación permite el acceso libre de la muestra hacia la membrana a través de los poros más grandes y evita el paso de cualquier precipitado u otro material sólido a través de los poros más pequeños. La segunda membrana puede ser también una membrana asimétrica que tiene preferiblemente su superficie de poros grandes orientada hacia la interfaz del laminado, y la superficie de poros pequeños en la otra superficie del laminado. Esta orientación presenta la superficie más uniforme de la membrana para exploración óptica y cuantificación de los resultados de ensayo.

La preparación de membranas asimétricas se describe por ejemplo en las patentes de Estados Unidos Nº 4.629.563, 5.171.445, 5.886.059, 5.536.408, 5.562.826 y 4.774.192; en D.R. Lloyd, "Materials Science of Synthetic Membranes", ACS Symposium 269: 1-21 (1985). Están disponibles en el mercado con diversos tamaños de poro y proporciones de tamaño de poro. Los materiales de fabricación incluyen polisulfonas, polietersulfonas, poliamidas, polieteramidas, poliuretanos, acetato de celulosa, polivinilpirrolidona, poliestirenos y poliestirenos modificados, así como mezclas, copolímeros y compuestos laminares. Para una descripción adicional de los tipos de membrana preferidos véase por ejemplo la Publicación de Solicitud de Estados Unidos Nº 20030166291 y la Solicitud de Estados Unidos con Nº de Serie 10/410.671, citadas anteriormente. Una membrana asimétrica ejemplar es una membrana de polisulfona o de polietersulfona tal como las membranas BTS 83 proporcionadas por Pall Corporation (San Diego, CA).

En el laminado de ensayo de HDL ejemplar, cada membrana típicamente tiene un espesor de aproximadamente 100-150 \mum y una capacidad de absorción de aproximadamente 80 \mul/pulgada cuadrada (aproximadamente 12,4 \mul/cm^{2}). Los tamaños de poro mínimos típicamente varían de 0,01 a 10 \mum, con proporciones de tamaño de poro máximo/mínimo de hasta 100 o más.

En una realización, el laminado incluye al menos un reactivo que es sensible al calor, de manera que laminar una membrana que contiene el reactivo a otra membrana produce un cambio perjudicial en el reactivo. El cambio perjudicial podría incluir cualquiera o todos o un cambio en la morfología, distribución o la estructura química real del reactivo. Dichos laminados se preparan ventajosamente mediante los procedimientos de aplicación de reactivos descritos en este documento.

III. Dispositivos de Ensayo

Los laminados de membrana que se usan en ensayos de diagnóstico tales como el laminado de ensayo de HDL descrito en este documento, se incorporan típicamente en un dispositivo de ensayo para un uso conveniente. La invención, por consiguiente, puede usarse para proporcionar dispositivos de ensayo que contienen laminados de membrana como se ha descrito en este documento. Por ejemplo, un dispositivo de ensayo para ensayar HDL en una muestra de sangre o suero comprende:

(a) un sustrato que tiene un pocillo de recepción de muestra para recibir una alícuota de una muestra de fluido sanguíneo,

(b) un laminado de membrana que comprende primera y segunda membranas laminadas que se unen en una interfaz del laminado, y

(c) un filtro entre el pocillo de recepción de muestra y la primera membrana del laminado, para retirar los glóbulos rojos sanguíneos en la muestra, cuando la muestra migra desde el pocillo de recepción de muestra hacia el laminado. El laminado de membrana de (b) es un laminado como se ha descrito anteriormente, donde la primera membrana está impregnada con reactivos eficaces para precipitar selectivamente las partículas de lipoproteínas no HDL (LDL y VLDL) en dicha muestra, y las partículas de LDL y VLDL precipitadas se evita por filtración que pasan a través de la interfaz del laminado; la segunda membrana está impregnada con reactivos eficaces para producir una señal detectable ópticamente proporcional a una cantidad de colesterol asociado a HDL en dicha segunda membrana; y el reactivo en al menos una de estas membranas está ausente en una región laminar de esta membrana adyacente a la interfaz del laminado de manera que los reactivos en las dos membranas están separados físicamente por al menos esta región laminar. Se prefiere particularmente que los reactivos de ensayo de HDL estén ausentes en una región laminar de la segunda membrana adyacente a la interfaz del laminado.

Preferiblemente, la concentración de cada reactivo es uniforme a través de la longitud y anchura de la membrana que contiene el reactivo, como se ha descrito anteriormente. Las membranas son preferiblemente membranas asimétricas, orientadas como se ha descrito anteriormente, donde la superficie extrema de la membrana de reactivo es la superficie de poros grandes (sin brillo) y la superficie exterior de la membrana de ensayo es la superficie de poros pequeños (brillante).

El pocillo de muestra, filtro y laminado de los apartados (a)-(c) anteriores están o pueden ponerse en comunicación fluida entre sí. Por ejemplo, estos elementos pueden residir en un sustrato común o pueden residir en uno o más sustratos separados y ponerse en comunicación fluida durante el transcurso del ensayo. Diferentes realizaciones de dicho dispositivo de ensayo incluyen aquellas descritas en Jones et al., Publicación de Solicitud de Estados Unidos Nº 20030166291 y Solicitud de Estados Unidos con Nº de Serie 10/410.671, citada anteriormente.

En la Figura 3 se muestra una realización. El aparato (50) incluye un cuerpo principal o soporte (52) que define el pocillo de muestra (54). El pocillo está en contacto fluido con un tampón de tamizado (60) que puede llevarse en una región con muesca (58) formada en el borde superior del soporte. El contacto del fluido puede ser directo o como en el dispositivo mostrado en la Figura 3, proporcionarse mediante un conducto capilar (56) formado en la placa en la base del pocillo. El soporte es preferiblemente una placa de plástico, con el pocillo, la región con muesca y/o capilar formándose por procedimientos convencionales de moldeo o mecanizado.

El tampón de tamizado (60) situado en la región (58) funciona para retirar parcialmente la materia particulada grande (incluyendo células sanguíneas) cuando la muestra migra a través de la matriz del tampón en una dirección del fondo hacia la parte superior como se muestra en la figura. El tampón (60) está formado preferiblemente por una matriz de fibras de vidrio de un material diseñado para arrastrar el fluido acuoso por humedecimiento superficial y retardar el movimiento de las células sanguíneas según la muestra de sangre se aspira a través de la matriz. Un tampón ejemplar es un filtro de fibra de vidrio tal como un filtro GF/D o PD008 suministrado por Whatman. El tampón se dimensiona para absorber un volumen definido de fluido de muestra por ejemplo aproximadamente 15-25 \mul. El tampón de tamizado (60) puede contener adicionalmente reactivos de captura de glóbulos rojos sanguíneos tales como lectinas, anticuerpos específicos para las proteínas de membrana de la superficie de los glóbulos rojos sanguíneos, trombina o agentes de intercambio iónico.

El tampón de tamizado (60), a su vez, contacta con una tira alargada o matriz de distribución de muestra (62) que se extiende a lo largo del borde superior de la placa (52). Esta tira puede estar soportada también por almohadillas de espuma u otros soportes. La matriz (62) sirve para distribuir fluido de muestra desde una región de aplicación de muestra (64) que está en contacto fluido con el tampón (60) a las regiones de recogida de muestra tales como (66), (68) dentro de la matriz. La matriz está formada preferiblemente de fibras de vidrio. La densidad de relleno y espesor de la matriz son tales que absorben y distribuyen volúmenes de fluido de muestra, por ejemplo 10-25 \mul suministrados a una región de aplicación de muestra de la tira a las regiones de recogida de muestra de la tira. Un material de tira ejemplar es un filtro de fibra de vidrio F-165-25A disponible en Whatman que tiene una densidad de relleno de aproximadamente 0,2 gm/cm^{3} y un espesor de aproximadamente 0,12 mm.

El dispositivo (50) incluye también una varilla de reacción (70) compuesta por un soporte alargado (72) y una o más tiras de ensayo de reacción múltiples humedecibles, absorbentes mostradas como (74), (76), (78) y (80), llevadas en la superficie inferior del soporte, como se muestra. Los elementos (74) y (86) forman un laminado de membrana como se describe en este documento, donde (74) es la membrana de ensayo de HDL y (86) es la membrana de
reactivo.

El soporte (72) es transparente o tiene ventanillas o aberturas que permiten que los tampones se visualicen a través del soporte. Cada tampón de ensayo usado en un ensayo particular contiene reactivos dependientes del analito eficaces para producir un cambio dependiente del analito en el tampón que puede detectarse de una manera conocida.

La varilla de reacción se monta en un soporte (52) mediante medios de montaje eficaces para (a) mantener el dispositivo en una posición de distribución de muestra, en la que el laminado de membrana de ensayo/membrana de reactivo está separado de la matriz de distribución de muestra y (b) transferir el dispositivo a una posición de ensayo, donde el laminado de membrana de ensayo/membrana de reactivo y la matriz de distribución de muestras están en comunicación fluida. El medio de montaje puede usarse también para romper dicha comunicación fluida después de que una cantidad deseada de muestra haya entrado en los tampones de ensayo, y/o después de un tiempo de contacto determinado, transfiriendo el dispositivo desde la posición de ensayo a una posición en la que la tira o tiras de ensayo no estén en comunicación fluida con la matriz de distribución de muestra (que puede ser la misma que la posición de "distribución de muestra"). Dicha transferencia puede controlarse controlando la reflectancia en la superficie superior del tampón de ensayo, que refleja el grado de humedecimiento como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.114.350, de cesión común con la presente. Como alternativa, cuando se conoce la capacidad de absorción y la velocidad de captación de muestra del material del tampón, la cantidad de muestra puede controlarse con una precisión suficiente usando un tiempo de contacto predeterminado.

El medio de montaje puede incluir, por ejemplo, un par de miembros elásticos tales como los bloques elastoméricos (82), (84) que actúan para desplazar el laminado de membrana de ensayo/membrana de reactivo hacia una posición de no transferencia o de distribución de muestra, en la que el laminado está separado de la matriz de distribución de muestra. Por compresión o liberación de los miembros elásticos, la comunicación fluida entre la matriz de distribución de muestra (62) y el laminado puede establecerse y separarse selectivamente. La comunicación fluida puede ser mediante contacto directo o a través de un elemento intermedio. Los bloques de soporte podrían comprimirse mediante resortes o una acción de tipo pistón. Como alternativa, dispositivos mecánicos externos podrían engranarse con el cuerpo principal (52) y/o soporte (62) y moverse uno hacia el otro. Un sistema ejemplar es el Cholestech LDX®, un analizador au-
tomatizado autocontenido ventajoso para usar con dispositivos de ensayo tales como los descritos en este documento.

Ejemplos

Se prepararon laminados de ensayo de HDL ejemplares por recubrimiento por grabado como se ha descrito en este documento, y se realizaron ensayos de HDL sobre patrones conocidos usando los laminados. Los datos mostraron una precisión excelente, demostrando la eficacia del procedimiento descrito para aplicar cantidades controladas y uniformes de los reactivos de ensayo.

El laminado de membrana empleado era un laminado de dos membranas asimétricas de polisulfona BTS-83, laminadas con el lado de poros pequeños (brillante) de una membrana en contacto con el lado de poros grandes (sin brillo) de la segunda membrana, preparada por Pall Corporation San Diego CA. Se usaron anchuras de hasta aproximadamente 12,7 cm (5 pulgadas) para el recubrimiento.

Se usaron precipitación convencional y mezclas de reactivo de ensayo de HDL. La solución de precipitación incluía 3,9 mg/ml de sulfato de dextrano (PM 500.000) y Mg (OAc)_{2} 7,9 mM en agua. Se añadió también un tensioactivo (Pluronic L64, producido por BSF, a un nivel del 0,05%) para facilitar la captación sobre la membrana. La solución de reactivo de ensayo de HDL contenía 80,3 U/ml de colesterol oxidasa, 473 U/ml de colesterol esterasa, 440 U/ml de peroxidasa de rábano rusticano, 4,14 mg/ml de 4-aminoantipirina y 26,5 mg/ml de TOOS (ácido 3-[etil(3-metilfenil)amino]-2-hidroxi propanosulfónico) en agua, añadiendo 3 mg/ml de CHAPS como tensioactivo.

Se usó una prensa flexográfica con un cilindro de grabado para aplicar un volumen constante de solución de reactivo a un rodillo de caucho que estaba en contacto con el laminado de membrana (procedimiento de grabado por transferencia). El cilindro usado para este experimento era un rodillo de 65 líneas/pulgada, de 30 BCM, donde BCM se refiere a billones de micrómetros cúbicos, o microlitros por pulgada cuadrada de superficie.

Los reactivos de precipitación se aplicaron en primer lugar al lado sin brillo de la primera membrana.

Después de la aplicación, la membrana se secó con una soplante de soplado IR. Los reactivos de ensayo colorimétricos de HDL se aplicaron entonces al lado brillante de la segunda membrana del laminado, de una manera similar y se secaron con la soplante de soplado IR.

Los siguientes datos de ensayo de HDL son de membranas laminadas preparadas como se ha descrito anteriormente cortadas en secciones de 0,56 cm (0,22 pulgadas) y montados en casetes de ensayo tal como se describe en la Publicación de Solicitud de Estados Unidos Nº 20030166291 y en la Solicitud de Estados Unidos con Nº de Serie 10/410.671, citadas anteriormente. Los ensayos se realizaron de acuerdo con procedimientos convencionales. Las muestras (ocho patrones de HDL) se analizaron en un analizador LDX® y se tomó la media de ocho casetes para cada patrón. Se obtuvo una precisión y correlación excelente con los valores patrón.

100

En el procedimiento de grabado por transferencia usado para el experimento anterior, se aplicaron hasta cuatro pasadas de la solución de reactivo a cada lado de la membrana. El peso de recubrimiento para cada pasada se determinó por la pérdida de peso de la solución de recubrimiento y se observó una buena consistencia de una pasada a otra.

Se descubrió que un procedimiento de grabado aplicaba la solución más eficazmente que el procedimiento por transferencia, generalmente realizando pasadas repetidos innecesariamente para este sistema. En un procedimiento preferido, el cilindro de grabado gira en una dirección opuesta a la dirección de suministro de banda (es decir, grabado inverso, como se muestra en la Figura 2) y la banda contacta con el cilindro sin un cilindro de impresión ("beso" de grabado como se muestra en (42) en la Figura 2). Se elige un cilindro con un patrón de pocillos que es eficaz para aplicar un recubrimiento uniforme con el sistema de recubrimiento dado.

Las membranas se recubrieron usando el procedimiento de grabado inverso/beso con velocidades de banda de 1,5-3,04 m/min (5-10 pies/minuto) y velocidades de rotación del cilindro de aproximadamente dos veces la velocidad de la banda para el recubrimiento con el reactivo de precipitación y aproximadamente la misma velocidad de la banda para el recubrimiento con el reactivo de ensayo de HDL. La cantidad de solución aplicada a la membrana en estos ensayos era generalmente aproximadamente el 65% del volumen de saturación para los reactivos de precipitación y aproximadamente el 45% del volumen de saturación para los reactivos de ensayo de HDL.

Claims (17)

1. Un procedimiento de aplicación de un reactivo a una membrana (12, 14) en un laminado de membrana (10), comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un laminado (10) de primera (12) y segunda membranas (14), teniendo dicho laminado (10) una superficie de la primera membrana externa (16), una superficie de la primera membrana laminada (18), una superficie de la segunda membrana laminada (20), y una superficie de la segunda membrana externa (22),

(b) aplicar un volumen controlado de una solución de un primer reactivo a dicha superficie de la primera membrana externa (16), poniendo en contacto dicha superficie (16) con un soporte plano o cilíndrico (36) que tiene una superficie que contiene un patrón de huecos llenos con dicha solución, y

(c) secar dicha primera membrana (12) de dicho laminado (10),

para producir un laminado (10) que contiene dicha primera membrana (12) impregnada con dicho primer reactivo, en el que dicho primer reactivo no entra en contacto con la segunda membrana (14) en dicho laminado (10).

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho patrón comprende proyecciones que aplican dicha solución.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha cantidad controlada es una cantidad de sub-saturación.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

(d) aplicar un volumen controlado de una solución de dicho segundo reactivo a dicha superficie de la segunda membrana externa (22), poniendo en contacto dicha superficie (22) con un soporte sólido (36) que contiene huecos llenos con dicha solución, y

(e) secar dicha segunda membrana (14) en dicho laminado (10), para producir un laminado (10) que contiene dicha segunda membrana (14) impregnada con dicho segundo reactivo, donde dicho segundo reactivo no entra en contacto con la primera membrana (12) de dicho laminado (10).

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicha cantidad controlada de (d) es un cantidad de sub-saturación.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho segundo reactivo no entra en contacto con la superficie de la segunda membrana laminada (20).

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos dicha primera membrana (12) es un membrana asimétrica que tiene una superficie de poros pequeños y una superficie de poros grandes.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha superficie de la primera membrana externa (16) es la superficie de poros grandes.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en la que dicha segunda membrana (14) es una membrana asimétrica que tiene una superficie de poros pequeños y una superficie de poros grandes.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha superficie de la membrana externa (22) es la superficie de poros pequeños.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho soporte (36) es un cilindro de grabado rotatorio.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en la que dicho primer reactivo comprende reactivos eficaces para retirar selectivamente las lipoproteínas no HDL de una muestra de fluido sanguíneo que pasa a través de dicha primera membrana (12).

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho primer reactivo incluye reactivos eficaces para precipitar selectivamente partículas de lipoproteína no HDL de una muestra de fluido sanguíneo, con lo que se evita por filtración que las partículas precipitadas pasen a través de la superficie de la primera membrana laminada (18).

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho segundo reactivo comprende reactivos eficaces para producir una señal detectable ópticamente proporcional a una cantidad de colesterol asociado con HDL en dicha segunda membrana (14).

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha aplicación ocurre simultáneamente en toda la anchura de la superficie de la primera membrana externa (16).

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho primer reactivo es sensible al calor de manera que laminar una membrana (12) que contiene dicho reactivo a una membrana adicional (14) produce un cambio perjudicial en el reactivo.

17. El procedimiento de la reivindicación 4 en el que dicho segundo reactivo es sensible al calor.