DE60319541T2

DE60319541T2 - Reagenz-Membrane und -Laminate und Verfahren zur deren Herstellung

Info

Publication number: DE60319541T2
Application number: DE60319541T
Authority: DE
Inventors: Ronald M. Mountain View Jones
Original assignee: Cholestech Corp
Current assignee: Alere San Diego Inc
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2023-11-11
Also published as: EP1530045B1; ATE388401T1; DE60319541D1; ES2303882T3; EP1530045A1; HK1076148A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Imprägnieren einer Membran oder einer Membran-Schichtstruktur mit einer gleichmäßigen und bestimmten Menge eines Reagenz. In bestimmten Aspekten bezieht sich die Erfindung auf das Herrichten von Membran-Schichtstrukturen, die imprägnierte Reagenzien umfassen, bei denen die Reagenzien auf eine einzige entsprechende Schicht der Schichtstruktur begrenzt sind und auf solche Reagenzien enthaltenden Membrane und Schichtstrukturen und Analysegeräte, die sie enthalten.
Hintergrund der Erfindung
Diagnostische Analysen, die ein Streifenformat verwenden, bei dem ein poröses Material wie ein Faserstreifen oder eine Membran mit diagnostischen Reagenzien imprägniert wird, sind im allgemeinen Gebrauch wegen ihrer leichten Handhabbarkeit, Geschwindigkeit und des verringerten Bedarfs für eine Handhabung von Reagenzien durch den Benutzer. Gleichförmige und reproduzierbare Anwendung von Reagenzien ist wichtig in der Herstellung von solchen Geräten, um die Konsistenz und Genauigkeit von Testergebnissen zu gewährleisten.
Verschiedene Verfahren sind zum Auftragen von Reagenzien auf solche Teststreifen verwendet worden. Zum Beispiel kann eine poröse Membran mit einem Reagenz imprägniert werden einfach durch das Kontaktieren der Membran mit einer Lösung des Reagenz. Um eine gleichmäßige Imprägnierung zu erreichen, wird typischerweise eine sättigende Menge der Lösung verwendet. Jedoch erzeugt dieser Zugang oft eine nicht gleichmäßige Verteilung der Reagenzien. Insbesondere ist er unbefriedigend für geschichtete Membrane, da er im Allgemeinen die Verteilung des Reagenz nicht auf eine einzige Schicht beschränkt, insbesondere wenn die Schichten aus einem ähnlichen Material sind. Das Auftragen des Reagenz durch Besprühen oder Bespritzen auf eine Oberfläche einer Membran oder einer Schichtstruktur kann eine bessere Steuerung der Menge des aufgetragenen Reagenz liefern, wodurch die Gefahr einer Ausbreitung auf darunterliegende Schichten in einer Schichtstruktur verringert wird. Jedoch hat das Beschichten mit diesem Verfahren auch die Tendenz, ungleichförmig zu sein, wodurch Konzentrationsgradienten erzeugt werden mit einer größeren Menge des Reagenz im Zentrum des Auftragsbereichs.
Wie in der EP 1 329 724 A2 und der DE 102 04 606 beschrieben, ist es ein anderer Zugang zum Auftragen von Reagenzien auf verschiedene Schichten in einer Schichtstruktur, die Schichten separat zu beschichten oder zu imprägnieren, worauf die Schichtung folgt. Die genannten Druckschriften offenbaren ein Analysegerät für Lipoproteine mit hoher Dichte (HDL), welches einen Reagenz-Pad und eine HDL-Reaktionsmembran enthält. Dieser Reagenz-Pad wird hergestellt durch Abgeben einer wässrigen Lösung, die Dextransulfat enthält, auf eine asymmetrische Membran mit einer bestimmten Abgaberate. Unter Verwendung desselben Prozesses wird die HDL-Reaktionsmembran mit einer wässrigen Mischung imprägniert. Um das obige Analysegerät zu vervollständigen, werden die beiden imprägnierten Membrane separat oder gleichzeitig durch Ultraschall-Schweißen verbunden.
Die Druckschrift EP 0 740 157 A2 offenbart die Verwendung eines Gravurbeschichtungsverfahrens, um gekennzeichnete Ligandenbeschichtungen über einer bestimmten Schicht herzustellen. Die Idee der EP'157 ist es, eine Beschichtung bereitzustellen, die direkt über die bestimmte Schicht, zum Beispiel Stoff, aufgetragen werden kann, ohne eine dazwischenkommende Barriereschicht. Diese Druckschrift bezieht sich nicht auf eine Imprägnierung einer Membran oder einer Membran-Schichtstruktur, das heißt die Herstellung einer Schichtstruktur, die eine erste Membran umfasst, die mit einem ersten Reagenz imprägniert ist, wobei das erste Reagenz nicht die zweite Membran in der Schichtstruktur kontaktiert.
Die Druckschrift EP 1 357 383 bezieht sich auf ein Analysegerät und ein Verfahren zum Messen der HDL-Konzentration, die zum Cholesterin in einer Blutprobe gehört. Die EP'383 verwendet zwei Polymer-Membrane, worin die entsprechenden Reagenzien imprägniert werden, und die Membrane werden danach weiterverarbeitet als eine Zwei-Membran-Schicht zur Eingliederung in das Analysegerät. Demnach werden die beiden Polymer-Membrane separat imprägniert.
Es ist jedoch nachteilig, dass solch eine Ultraschall-Beschichtung oder eine thermische Beschichtung ungeeignet ist für wärmeempfindliche Reagenzien. Weiterhin kann zwar die Verwendung eines Klebstoffs zwischen den Schichten die Notwendigkeit einer Erwärmung verringern, aber sie führt zu einer möglichen Kontaminierung der Analysereaktionen. Es ist auch wichtig, die Porosität der porösen Membrane zu erhalten, und jede dieser Techniken kann in dieser Hinsicht nachteilig sein.
Es ist deswegen das technische Problem der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum gleichmäßigen Auftragen von Reagenzien auf Membrane und insbesondere auf verschiedene Membrane in einer Schichtstruktur bereitzustellen ohne die gegenseitige Kontaminierung zwischen den Schichten und ohne die Reagenzien einer übertriebenen Wärme auszusetzen. Idealerweise würde solch ein Verfahren eine bestimmte Menge des Reagenz auf eine oder beide Seiten einer solchen Schichtstruktur auftragen. Es ist ein weiteres Problem der vorliegenden Erfindung, ein Analysegerät bereitzustellen, das gleichförmig beschickte Membrane zum Bestimmen von zuverlässigen Testergebnissen umfasst.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zum Auftragen eines Reagenz auf eine Membran in einer Schichtstruktur aus Membranen, welche erste und zweite beschichtete Membranen umfasst. Das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen einer Schichtstruktur aus ersten und zweiten Membranen, die eine äußere erste Membranoberfläche, eine geschichtete erste Membranoberfläche, eine geschichtete zweite Membranoberfläche und eine äußere zweite Membranoberfläche umfasst;
(b) Auftragen einer bestimmten Menge einer Lösung eines ersten Reagenz auf die äußere erste Membranoberfläche durch Kontaktieren dieser Oberfläche mit einem Träger, der eine Oberfläche, welche ein Muster enthält, umfasst, und
(c) Trocknen der ersten Membran in der Schichtstruktur,

Vorzugsweise trägt das Verfahren diese Lösung mit Hilfe eines Musters auf, welches Vertiefungen umfasst, die mit dieser Lösung gefüllt sind oder durch ein Muster, das Vorsprünge umfasst, die diese Lösung auftragen. Weiterhin hat dieser Träger vorzugsweise eine ebene oder zylindrische Form.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren weiterhin das Imprägnieren der zweiten Schicht mit einem zweiten Reagenz durch (d) Auftragen einer bestimmten Menge einer Lösung des zweiten Reagenz auf die äußere zweite Membranoberfläche durch Kontaktieren der Oberfläche mit einem festen Träger, der Vertiefungen umfasst, die mit der Lösung gefüllt sind, und (e) Trocknen der zweiten Membran in der Schichtstruktur, um eine Schichtstruktur herzustellen, die die zweite Membran enthält, welche mit dem zweiten Reagenz imprägniert ist, wobei das zweite Reagenz nicht die erste Membran in der Schichtstruktur kontaktiert.
Typischerweise ist der feste Träger eine rotierende Gravurwalze, die eine Mehrzahl von Vertiefungen oder Zellen aufweist, die in ihrer Oberfläche ausgebildet sind, wie weiter unten diskutiert wird. Vorzugsweise geschieht dieses Auftragen gleichzeitig über die gesamte Breite der äußeren Oberfläche der ersten Membran, um ein gleichmäßiges Auftragen über die Breite der Membran zu erzeugen.
Die „bestimmte Menge" der Lösung ist im Allgemeinen nicht mehr als eine sättigende Menge der Lösung hinsichtlich der Absorptionskapazität der entsprechenden Membran und ist typischerweise eine nicht-sättigende Menge, wie sie unten definiert wird. In verschiedenen Ausführungsformen kontaktiert ein gegebenes (erstes oder zweites) Reagenz nicht die beschichtete Oberfläche der entsprechenden Membran in der fertigen Schichtstruktur; das bedeutet, dass es nur teilweise durch die Tiefe der entsprechenden Membran hindurch dringt. In anderen Ausführungsformen kontaktiert ein gegebenes (erstes oder zweites) Reagenz die geschichtete Oberfläche der entsprechenden Membran in der fertigen Schichtstruktur; das heißt, es imprägniert die volle Tiefe der entsprechenden Membran, aber es kontaktiert nicht die andere Membran in der Schichtstruktur.
In einer Ausführungsform ist mindestens die erste Membran eine asymmetrische Membran, das heißt, sie hat eine Oberfläche mit kleinen Poren und eine Oberfläche mit großen Poren. Die zweite Membran kann auch eine asymmetrische Membran sein. In ausgewählten Ausführungsformen ist die äußere Oberfläche der ersten Membran die Oberfläche mit den großen Poren. In einer weiteren Ausführungsform ist die äußere Oberfläche der zweiten Membran die Oberfläche mit den kleinen Poren. Solch eine Ausführungsform wird in 1 gezeigt, die eine Schichtstruktur 10 der ersten Membran 12 und der zweiten Schicht 14 zeigt, die eine äußere Oberfläche 16 der ersten Membran aufweist, eine geschichtete Oberfläche 18 der ersten Membran, eine geschichtete Oberfläche der zweiten Membran 20 und eine äußere Oberfläche 22 der zweiten Membran. Die geschichtete Oberfläche der ersten Membran und die geschichtete Oberfläche der zweiten Membran bilden gemeinsam eine Grenzfläche der Schichtstruktur.
Mindestens eines der Reagenzien kann ein wärmeempfindliches Reagenz sein, so dass das Beschichten einer Membran, die dieses Reagenz enthält, an eine weitere Membran eine nachteilige Veränderung in dem Reagenz erzeugen würde. In einer Ausführungsform umfasst das erste Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-Lipoproteine aus einer Blutprobe zu entfernen, welche durch die erste Membran hindurch läuft und das zweite Reagenz umfasst Reagenzien, die wirksam sind, um ein optisch nachweisbares Signal zu erzeugen, das proportional zu einer Menge eines HDL-assoziierten Cholesterins in der zweiten Membran ist.
In einem verwandten Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zum Auftragen eines Reagenz auf eine Membran durch Auftragen einer bestimmten Menge einer Lösung des Reagenz auf eine erste Oberfläche der Membran, durch Kontaktieren der Oberfläche mit einem ebenen oder zylindrischen Träger, der eine Oberfläche hat, die ein Muster von Vertiefungen aufweist, die mit der Lösung befüllt sind. Wieder ist der Träger typischerweise eine drehende Gravurwalze. Weiterhin werden die Techniken und Vorrichtungen, die beschrieben werden, verwendet zum Auftragen von Reagenzien auf eine Membran in einer Schichtstruktur aus Membranen.
Die bestimmte Menge des Reagenz kann eine nicht sättigende Menge sein. In einer Ausführungsform kontaktiert nach dem Auftragen des Reagenz das Reagenz nicht die gegenüberliegende Oberfläche der Membran und dem vorzugsweisen Trocknen; das heißt es dringt nur teilweise durch die Tiefe der Membran. Die Anwendung des Reagenz geschieht vorzugsweise gleichzeitig über die gesamte Breite der ersten Oberfläche der Membran. Demgemäß ist die Konzentration des Reagenz vorzugsweise gleichmäßig über die Länge und Breite der Membran.
Die Membran kann eine asymmetrische Membran sein, die eine Oberfläche mit kleinen Poren und eine Oberfläche mit großen Poren hat. In einer Ausführungsform ist die erste Oberfläche, auf die das Reagenz aufgetragen wird, die Oberfläche mit den großen Poren. In anderen Ausführungsformen ist die erste Oberfläche die Oberfläche mit den kleinen Poren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-Lipoproteine aus einer Blutprobe zu entfernen, die durch die Membran hindurch läuft; alternativ umfasst das Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-(LDL und VLDL)-Lipoprotein-Teilchen in der Probe auszufällen, und die ausgefällten LDL- und VLDL-Teilchen werden durch Filtrierung am Durchlaufen durch die Membran gehindert. In dieser Ausführungsform wird, wenn die Membran eine asymmetrische Membran ist, das Reagenz auf die Oberfläche mit den großen Poren aufgetragen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um ein optisch nachweisbares Signal zu erzeugen, welches proportional zu einer Menge von HDL-assoziiertem Cholesterin in der Membran ist. In dieser Ausführungsform wird das Reagenz, wenn die Membran eine asymmetrische Membran ist, auf die Oberfläche mit den kleinen Poren aufgetragen. In einem anderen Aspekt liefert die Erfindung eine Schichtstruktur aus Membranen zur Verwendung in einer diagnostischen Analyse, die erste und zweite geschichtete Membrane umfasst, die an einer Grenzfläche der Schichtstruktur verbunden sind, wobei die erste Membran in der Schichtstruktur mit einem ersten Reagenz imprägniert ist, die zweite Membran mit einem zweiten Reagenz imprägniert ist, und das Reagenz in mindestens einer der Membrane ist nicht vorhanden in einem geschichteten Bereich jener Membran, der zur Grenzfläche der Schichtstruktur benachbart ist, so dass die Reagenzien in den beiden Membranen physikalisch getrennt sind durch mindestens jenen geschichteten Bereich. Vorzugsweise ist die Konzentration von jedem Reagenz oder Reagenzsystem gleichmäßig über die Länge und Breite der entsprechenden Membran verteilt.
In ausgewählten Ausführungsformen ist mindestens eine der Reagenzien wärmeempfindlich, so dass das Beschichten einer Membran, die das Reagenz enthält, an eine andere Membran eine nachteilige Veränderung in dem Reagenz bewirken würde.
Vorzugsweise ist mindestens die erste Membran eine asymmetrische Membran, die eine Oberfläche mit kleinen Poren und eine Oberfläche mit großen Poren hat. In ausgewählten Ausführungsformen ist die Oberfläche mit kleinen Poren zur Grenzfläche der Schichtstruktur ausgerichtet. Die zweite Membran kann auch eine asymmetrische Membran sein; in ausgewählten Ausführungsformen ist die Oberfläche mit großen Poren zur Grenzfläche der Schichtstruktur hin ausgerichtet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erste Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-Lipoproteine aus einer Blutprobe zu entfernen, die durch die erste Membran hindurchläuft. Alternativ umfasst das erste Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-(LDL und VLDL)-Lipoprotein-Partikel in der Probe auszufällen und die ausgefällten LDL- und VLDL-Teilchen werden durch Filtrierung am Durchlaufen durch die Grenzfläche der Schichtstruktur gehindert. In diesen Ausführungsformen umfasst das zweite Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um ein optisch nachweisbares Signal zu erzeugen, das proportional zu einer Menge von HDL-assoziiertem Cholesterin in der zweiten Membran ist. Vorzugsweise ist in einer solchen Schichtstruktur das Reagenz in der zweiten Membran nicht vorhanden in einem geschichteten Bereich jener Membran, der benachbart zu der Grenzfläche der Schichtstruktur ist.
In einem verwandten Aspekt kann die Erfindung verwendet werden, um ein Analysegerät bereitzustellen zum Analysieren von HDL in einer Blut- oder Serumprobe aufweisend

(a) ein Substrat, das eine die Probe empfangende Vertiefung aufweist zum Empfangen einer Teilprobe der Probe,
(b) eine Schichtstruktur aus Membranen, die erste und zweite beschichtete Membrane aufweist, die an einer Grenzfläche der Schichtstruktur verbunden sind, wobei (i) die erste Membran mit Reagenzien imprägniert ist, die wirksam sind, um selektiv LDL- und VLDL-Lipoprotein-Partikel in der Probe auszufällen und die ausgefällten LDL- und VLDL-Teilchen werden durch Filtrierung am Hindurchlaufen durch die Grenzfläche der Schichtstruktur gehindert; (ii) die zweite Membran imprägniert wird mit Reagenzien, die wirksam sind, um ein optisch nachweisbares Signal zu erzeugen, das proportional zu einer Menge von HDL-assoziiertem Cholesterin in der zweiten Membran ist; und (iii) das Reagenz in mindestens einer der Membrane und vorzugsweise der zweiten Membran nicht vorhanden ist in einem beschichteten Bereich jener Membran, der zu der Grenzschicht der Schichtstruktur benachbart ist, so dass die Reagenzien in den beiden Membranen physikalisch getrennt sind durch mindestens diesen beschichteten Bereich.

In der Schichtstruktur wie oben beschrieben ist die Konzentration von jedem Reagenz vorzugsweise gleichmäßig über die Länge und Breite der Membran. Die Vorrichtung umfasst auch (c) einen Filter zwischen der die Probe empfangenden Vertiefung und der ersten Membran der Schichtstruktur, um rote Blutkörperchen in der Probe zu entfernen, wenn die Probe sich von der die Probe empfangenden Vertiefung zu der Schichtstruktur bewegt, wobei die Vertiefung, der Filter und die Schichtstruktur in Flüssigkeitskommunikation miteinander sind oder platziert werden können.
Diese und andere Ziele und Merkmale der Erfindung werden deutlicher, wenn die nachfolgende detaillierte Beschreibung gelesen wird in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Querschnittsansicht von zwei beschichteten asymmetrischen Membranen, auf die Reagenzien aufgetragen werden in Einklang mit einer Ausführungsform der Erfindung;
2 ist ein schematisches Diagramm, das ein Beschichtungssystem zum Auftragen von Reagenzien auf eine Schichtstruktur zeigt in Einklang mit einer Ausführungsform der Erfindung; und
3 ist eine Seitenansicht eines Analysegeräts, das eine Schichtstruktur aus Membranen umfasst in Einklang mit einer Ausführungsform der Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Verfahren zum Auftragen von Reagenzien
Die Erfindung stellt Verfahren zum Imprägnieren oder Beschichten einer Schichtstruktur von mindestens zwei Membranen mit mindestens einem Reagenz bereit, so dass jedes Reagenz auf seine entsprechende Membran beschränkt wird. Vorzugsweise umfasst die Schichtstruktur mindestens zwei Membrane, wobei jede ein verschiedenes Reagenz oder Reagenzsystem enthält.
Ein Beispiel einer solchen Schichtstruktur ist eine Membrananordnung, die in einem Gerät verwendet wird, das zum Messen der Konzentration von HDL-assoziiertem Cholesterin in einer Blutprobe konstruiert ist, die ebenfalls LDL- und VLDL-Teilchen enthält. Siehe zum Beispiel Jones et al., US-Anmelde-Veröffentlichungsnummer 20030166291 und US-Anmelde-Seriennummer 10/410,671. Jedoch ist die Erfindung auch für jede Anwendung nützlich, die eine Schichtstruktur wie oben beschrieben verwendet, die Reagenzien in mindestens einer und vorzugsweise zwei Membranschichten imprägniert hat, wobei jedes Reagenz auf seine entsprechende Schicht beschränkt sein muss.
Die beispielhafte HDL-Analyse-Schichtstruktur, wie sie weiter unten beschrieben wird, umfasst eine HDL-Testmembran, in der die HDL-Konzentration gemessen wird, und eine Reagenzmembran, die eine bindende und/oder ausfällende Reagenz enthält, so dass die Membran wirksam ist, um Nicht-HDL-Lipoproteine aus der Flüssigkeitsprobe zu entfernen, bevor die Probe die Testmembran kontaktiert.
Vorzugsweise ist jede der Membrane in der Schichtstruktur eine poröse asymmetrische Membran; d. h. eine Membran, die einen Gradient in der Porengröße über ihre Dicke aufweist. Eine exemplarische Zwei-Membran-Schicht 10, die zwei asymmetrische Membrane 12 und 14 umfasst, wird als Querschnitt in 1 gezeigt, wobei sie in der bevorzugten Orientierung gezeigt wird mit größeren Poren bei 24 und kleineren Poren bei 26 in der Membran 12.
Damit die HDL-Analyse genau arbeitet, muss das HDL-Testreagenz auf seine entsprechenden Schicht beschränkt sein. Wenn das HDL-Reagenz in der Reagenzschicht vorhanden ist, wird die Farbe, die sich in der Analysereaktion entwickelt, im Allgemeinen einen Anteil von Nicht-HDL-Cholesterin repräsentieren zusätzlich zu dem Analyt, dem HDL-assoziierten Cholesterin.
Die Anmelderin hat erkannt, dass ein Gravurdruckverfahren, bei dem Flüssigkeit auf ein Substrat von Vertiefungen in einer massiven Platte aufgetragen wird, die eine ebene oder eine beliebige Form haben kann oder typischerweise die von einem rotierenden Zylinder, die Auftragung von einem bestimmten Volumen von verschiedenen Reagenzien auf gegenüberliegende Oberflächen einer geschichteten Membran erlaubt. Durch Steuern des Abgabevolumens kann jedes Reagenz auf seine entsprechende Schicht in der Schichtstruktur beschränkt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Reagenzien auf verschiedene Membrane oder Schichtstrukturen aus Membranen durch eine Hochdrucktechnik aufgetragen. Zu diesem Zweck hat der Träger eine ebene oder beliebige geeignete Ausgestaltung, vorzugsweise die Ausgestaltung in einem Zylinder. Dieser Träger umfasst ein Muster von Vorsprüngen, die die Reagenzien auf die Membran auftragen. Vorzugsweise werden solche Reagenzien geliefert, die eine Konsistenz haben, um zeitweise an diesen Vorsprüngen zu haften, so dass sie in einer kontrollierten Weise aufgetragen werden.
Beim Gravurbeschichten wird ein Netzwerk von Vertiefungen, typischerweise eng benachbarte Zellen, auf die Oberfläche eines Metallzylinders geritzt. Die Zellen werden mit Flüssigkeit gefüllt und der rotierende Zylinder überträgt die Flüssigkeit auf ein Substrat. Die Zellen haben ein definiertes Volumen und begrenzen auf diese Weise die Flüssigkeitsmenge, die zu dem Substrat übertragen werden kann. Typischerweise hat ein Zylinder ein Volumen von ungefähr 30–50 μl pro Quadrat-Inch einer Zylinderoberfläche (ungefähr 4,5–8 μl pro cm²). (In diesem Zusammenhang nimmt „Zylinderoberfläche" eine glatte Oberfläche an, die der Fläche der Oberfläche des Substrats entspricht, das durch den Zylinder kontaktiert wird. Sie umfasst nicht die zusätzliche Oberfläche, die durch die Vertiefungen selbst geliefert wird.) Andere Mengenkapazitäten können auch verwendet werden. Die Vertiefungen sind im Allgemeinen gleichförmig dimensioniert und eng beabstandet, so dass nach der Übertragung der Flüssigkeitstropfen auf die Membran diese zu einer gleichförmigen Flüssigkeitsschicht zusammenwachsen.
Ein Gravurbeschichtungssystem, das bei der Durchführung der hier beschriebenen Prozesse verwendet werden kann, wird in der Einheit 30 in 2 gezeigt. (Wie hier verwendet, umfasst das „Beschichten" einer Membran das Auftragen eines Reagenz, so dass es unterhalb der Oberfläche eindringt und es die gesamte Dicke der Membran imprägnieren kann.)
Die geschichtete Membran oder „Gewebe" 32 wird von einer Rolle 34 zugeführt. Der Gravurzylinder 36 ist typischerweise aus Kupfer oder kupferbeschichtetem Stahl oder Aluminium; eine dünne Schicht von Chrom wird oft für die Haltbarkeit aufgetragen. Wie oben beschrieben, ist die Oberfläche des Zylinders geritzt mit einer Vielzahl von kleinen Zellen, die dazu dienen, eine bestimmte Menge der Flüssigkeit aufzunehmen. Ein Zylinder wird mit einem Muster von Vertiefungen gewählt, das wirksam ist, eine gleichförmige Beschichtung mit einem gegebenen Beschichtungssystem aufzutragen. Der Zylinder kann teilweise in ein Bad oder eine Schale der Flüssigkeit, die aufzutragen ist, eingetaucht sein. Alternativ, wie es für das gegenwärtige Verfahren bevorzugt ist, kann eine Reagenzkammer 38 verwendet werden, um Reagenzlösung an den Zylinder durch Röhren 40 zu liefern. Die Kammer verringert das Aussetzen der Reagenzien an die Luft.
Wenn sich der Zylinder dreht, wird die überschüssige Lösung durch eine flexible Rakel 41, die den Zylinder zwischen der Reagenzkammer oder der Schale und der Membran 32 kontaktiert, von dem Zylinder abgewischt. Die Lösung, die in den vertieften Zellen verbleibt, wird dann auf die gewünschte Oberfläche der Membran übertragen.
In einer Ausführungsform wird die Membran 32 in tangentialem Kontakt (das heißt Kontaktieren von ein paar Grad des Umfangs des Zylinders) mit dem Gravurzylinder durch einen Aufnahmezylinder 42 gehalten, ein Prozess, der als „Kuss"-Gravur bezeichnet wird. Alternativ kann das Gewebe zwischen dem Gravurzylinder 36 und einem Druck- oder „Stütz"-Zylinder durchlaufen, wie es in 42' gezeigt ist. Bei diesem Prozess ist ein Aufnahme-Zylinder 42 allgemein nicht vorhanden. In einem Offset-Tiefdruckprozess (nicht gezeigt) wird die Flüssigkeit von dem Gravurzylinder zu einer mit Gummi beschichteten Transferwalze übertragen, welche die Lösung dann auf das Substrat aufträgt.
Das Substrat wird dann durch einen Trockner 44, vorzugsweise einem Infrarot-Trocknergebläse hindurchgefahren und wird von der Aufnahmewalze 46 aufgenommen. Die andere Oberfläche der Schichtstruktur wird dann in einer ähnlichen Weise beschichtet.
Der Gravur-Beschichtungsprozess kann in einem direkten Modus ausgeführt werden, bei dem der Zylinder in derselben Richtung wie die Membranzufuhr rotiert. Alternativ kann bei einem Rückwärts-Gravurverfahren, wie es in 2 dargestellt wird, die Drehrichtung des Zylinders entgegengesetzt zu der Vorschubrichtung der Membran sein. Diese Anordnung führt zu einer Scherkraft, die auf die Lösung ausgeübt wird, wenn sie auf das Substrat übertragen wird, was zu einer glatteren Beschichtung führen kann.
Das Volumen der Reagenz-Lösung, das auf die Membran aufgetragen wird, wenn sie den Gravurzylinder kontaktiert, ist durch das Volumen der Zellen auf der Zylinderoberfläche begrenzt, wie oben bemerkt wurde. Die Menge, die tatsächlich von den Zellen auf die Membran übertragen wird, hängt von zusätzlichen Faktoren wie der Zylindergeschwindigkeit, dem Walzendruck, der Gewebegeschwindigkeit und Lösungsbestandteilen ab. Demgemäß kann die Menge, die auf die Membran übertragen wird, weiter gesteuert werden durch die richtige Auswahl der Systemkonfiguration, der Kontaktzeit zwischen der Membran und dem Zylinder (die bestimmt wird durch die Gewebegeschwindigkeit und -richtung relativ zu der Drehgeschwindigkeit und- richtung der Gravurwalze) und der Konzentration von Tensiden. Ein Tensid wird hinzugefügt, um den Übertrag der Lösung auf die Membranoberfläche zu erleichtern, die andernfalls eine wässrige Lösung abweisen könnte, abhängig von dem Grad der Hydrophobie des Membranmaterials.
Für asymmetrische Membrane hängt das Eindringen des Reagenz in die Membrane auch von der Porengröße und -verteilung ab. Zum Beispiel mit Bezug auf 1 wird eine Lösung, die auf die Oberfläche 16 (mit großen Poren) aufgetragen wird, durch Kapillarwirkung in die Membran in einem signifikant größeren Umfang hineingezogen als die Lösung, die auf die Oberfläche 22 (mit kleinen Poren) aufgetragen wird.
Demgemäß erzeugt der Auftrag einer bestimmten Menge einer Reagenz-Lösung auf eine Seite einer Membran auf der äußeren Oberfläche einer Schichtstruktur mit nachfolgendem Trocknen eine Schichtstruktur, bei der das Reagenz nicht weiter als in jene Membran eindringt. Die bestimmte Menge kann eine nicht sättigende Menge sein. Das bedeutet, dass es sich um eine Menge der Lösung handelt, die geringer ist als jene, die, wenn sie auf eine ausgewählte Membran aufgetragen wird, die gesamte Membran durch Kapillarfluss durchdringen würde.
In einigen Fällen kann eine sättigende oder nahezu sättigende Menge verwendet werden.
Im Einklang mit der Erfindung wird eine Menge von Reagenz-Lösung auf die Membran aufgetragen, um den gewünschten Grad von Durchdringung in die Dicke oder Tiefe der Membran zu erreichen. Durch gleichzeitiges Auftragen der bestimmten Menge der Lösung über die Breite der Membran liefert das Auftrageerfahren eine gleichmäßige Konzentration des Reagenz über die Länge und Breite der Membran. „Gleichförmig" bedeutet, dass es keine signifikanten Konzentrationsgradienten oder -änderungen über die Länge oder Breite der Membran gibt. Diese Gleichmäßigkeit ist wirksam, um konsistente Analyseergebnisse für Proben zu erhalten, die auf verschiedene Punkte auf der Oberfläche der Schichtstruktur aufgetragen werden. Vorzugsweise variiert nach dem Auftragen von Reagenz und dem Trocknen die Menge von Reagenz, die auf verschiedenen Punkten der Oberfläche einer Membran in der Schichtstruktur vorhanden ist oder an verschiedenen Punkten auf einer gegebenen Schichtstruktur-Oberfläche parallel zu dieser Oberfläche um nicht mehr als ungefähr 5%.
Das Auftrag-Verfahren ist nützlich bei wärmeempfindlichen Reagenzien, bei denen die Beschichtung einer Membran, welche das Reagenz enthält, bei normalen thermischen Beschichtungsbedingungen eine nachteilige Veränderung in dem Reagenz und/oder seiner Funktion in einer Analyse bewirken würde, die auf der Schichtstruktur durchgeführt wird. Solch eine Veränderung könnte eine Veränderung in der Morphologie oder Verteilung des Reagenz wie auch chemische Veränderung in dem Reagenz umfassen.
Das Auftrag-Verfahren kann auch vorteilhaft verwendet werden, um eine bestimmte Menge des Reagenz in einer gleichmäßigen Weise auf eine einzige Membran aufzutragen durch Kontaktieren der Oberfläche der Membran mit einem ebenen oder zylindrischen Träger, der eine Oberfläche hat, die ein Muster von Vertiefungen, die mit der Lösung gefüllt sind, enthält. Wieder ist der Träger typischerweise ein sich drehender Gravurzylinder wie oben beschrieben. Wie beim Beschichten einer Schichtstruktur erfolgt der Auftrag des Reagenz durch dieses Verfahren vorzugsweise gleichzeitig über die gesamte Breite der ersten Oberfläche der Membran; demgemäß ist die Konzentration des Reagenz im Wesentlichen gleichmäßig über die Länge und Breite der Membran.
Die bestimmte Menge des Reagenz kann eine nicht sättigende Menge sein. In einer Ausführungsform kontaktiert das Reagenz nach dem Auftragen des Reagenz und dem vorzugsweisen Trocknen nicht die entgegengesetzte Oberfläche der Membran, das heißt, es dringt nur teilweise durch die Tiefe der Membran ein.
Das Verfahren ist vorteilhaft sogar, wenn eine sättigende Menge aufgetragen wird, indem es eine Membran erzeugt, bei der Reagenzien gleichmäßiger imprägniert sind, wenn sie mit Verfahren des Standes der Technik wie dem Eintauchen in eine sättigende Menge der Lösung oder dem Sprüh-Beschichten verglichen werden.
Die Erfindung liefert auch Membrane, die mit Reagenzien im Einklang mit diesem Verfahren imprägniert werden. Von besonderem Interesse sind Membrane zum Gebrauch in diagnostischen Analysen.
Die Membran kann eine asymmetrische Membran sein, die eine Oberfläche mit kleinen Poren und einer Oberfläche mit großen Poren hat; das Reagenz kann auf jede der beiden Oberflächen aufgetragen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-Lipoproteine aus einer Blutprobe zu entfernen, die durch die Membran hindurchläuft. Alternativ umfasst das Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-(LDL und VLDL)-Lipoprotein-Teilchen in der Probe auszufällen, und die ausgefällten LDL- und VLDL-Teilchen werden durch Filtrierung am Durchlaufen durch die Membran gehindert. In diesen Ausführungsformen wird das Reagenz, wenn die Membran eine asymmetrische Membran ist, vorzugsweise auf die Oberfläche mit großen Poren aufgetragen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagenz Reagenzien, die wirksam sind, um ein optisch detektierbares Signal zu erzeugen, das proportional zu einer Menge von HDL-assoziiertem Cholesterin in der Membran ist. In dieser Ausführungsform wird das Reagenz, wenn die Membran eine asymmetrische Membran ist, vorzugsweise auf die Oberfläche mit kleinen Poren aufgetragen.
II. Membran-Schichtstrukturen
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung geschichtete Membrane bereit, die Reagenzien umfassen, die in mindestens einer und vorzugsweise zwei Membranschichten imprägniert sind, wobei jedes Reagenz (oder Reagenzsystem) auf seine entsprechende Schicht beschränkt ist. Im Allgemeinen enthalten verschiedene Schichten verschiedene Reagenzsysteme. Vorzugsweise wird das Reagenz auf eine geschichtete Membran im Einklang mit den oben beschriebenen Verfahren aufgetragen. Von besonderem Interesse sind Membran-Schichtstrukturen zur Verwendung bei diagnostischen Analysen.
Solch eine Schichtstruktur umfasst erste und zweite geschichtete Membrane, die mit ersten bzw. zweiten Reagenzien imprägniert sind, die an einer Grenzfläche der Schichtstruktur verbunden werden. Mindestens eine der ersten und zweiten Reagenzien ist nicht vorhanden in einem geschichteten Bereich der entsprechenden Membran, der zu der Grenzfläche der Schichtstruktur benachbart ist, so dass die Reagenzien in den beiden Membranen durch mindestens jenen geschichteten Bereich physikalisch getrennt sind.
Vorzugsweise ist die Konzentration von jedem Reagenz gleichmäßig über die Länge und Breite der entsprechenden Membran, die das Reagenz enthält. Diese Gleichmäßigkeit führt zu konsistenten Analyseergebnissen für eine Probe, die auf verschiedene Punkte auf der Oberfläche der Schichtstruktur aufgetragen wird. Vorzugsweise variiert die Menge des Reagenz, die bei verschiedenen Punkten auf der Oberfläche einer Membran in der Schichtstruktur oder bei verschiedenen Punkten auf einer gegebenen geschichteten Oberfläche, die parallel zu dieser Oberfläche ist, vorhanden ist, um nicht mehr als ungefähr 5%.
In einer Ausführungsform ist die Schichtstruktur eine, die zum Gebrauch beim Bestimmen der Konzentration von HDL-assoziiertem Cholesterin in einer Blutprobe entworfen wird. Siehe zum Beispiel Jones et al., US-Anmelde-Veröffentlichungsnummer 20030166291 und US-Anmelde-Seriennummer 10/410,671, die oben zitiert wurden. In diesem Fall enthält die erste Membran Reagenzien, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-Lipoproteine aus einer Blutprobe zu entfernen, die durch die Membran hindurchläuft. Die Nicht-HDL-Lipoproteine können zum Beispiel entfernt werden durch das selektive Binden an ein Reagenz, das innerhalb der Membran vorhanden ist oder immobilisiert wird. Alternativ oder zusätzlich werden diese Komponenten durch selektive Ausfällung durch das Reagenz entfernt und werden durch Filtrierung am Durchlaufen durch die Grenzfläche der Schichtstruktur in die zweite Membran hinein gehindert.
Solche Reagenzien umfassen polyanionische Verbindungen, wie geschwefelte Polysaccharide, Heparin oder Phosphotungstat in Verbindung mit einem Kation der Gruppe II wie Mg²⁺, Mn²⁺ oder Ca²⁺. Ein bevorzugtes Reagenz ist ein geschwefeltes Polysaccharid wie zum Beispielt ein Dextransulfat, das ein typisches Molekulargewicht von 50–500 KDa hat, in Kombination mit einem Magnesiumacetat oder -chlorid, das optional gepuffert ist, um einen neutralen pH-Wert aufrecht zu erhalten. Die Reagenzien können auch in der Membran immobilisiert werden.
Die HDL-Testmembran enthält Reagenzien zur Quantifizierung von HDL-assoziiertem Cholesterin, wie es dem Fachmann bekannt ist. Siehe zum Beispiel die US-Patente Nr. 5,213,964 , 5,213,965 , 5,316,196 und 5,451,370 . Typischerweise umfassen die Analyse-Reagenzien Cholesterin-Esterase zum Freigeben von freiem Cholesterin aus HDL, Cholesterin-Oxidase zum Erzeugen von H₂O₂ durch Reaktion mit dem freien Cholesterin, Peroxidase und ein gekoppeltes Färbungssystem, das beim Vorhandensein von Peroxidase und H₂O₂ in ein deutlich gefärbtes Signal-Reaktionsprodukt umgewandelt wird. Analyse-Reagenzien sind dem Fachmann bekannt zur Konzentrationsbestimmung von anderen Blutkomponenten, zum Beispiel solche für das gesamte Cholesterin, Triglyceriden oder Glucose enthalten ähnliche Enzyme/angekoppelte Färbungssysteme.
Vorzugsweise ist mindestens die erste Membran eine asymmetrische Membran, die eine Oberfläche mit kleinen Poren und eine Oberfläche mit großen Poren hat. Die Oberfläche mit kleinen Poren liegt vorzugsweise in Richtung der Grenzfläche der Schichtstruktur, so dass die Oberfläche mit den großen Poren auf der äußeren Oberfläche der Schichtstruktur ist. Diese Orientierung erlaubt den freien Zugang der Probe in die Membran durch die größeren Poren und verhindert durch die kleineren Poren den Durchgang von irgendwelchen ausgefällten oder anderem festen Material. Die zweite Membran kann auch eine asymmetrische Membran sein, die vorzugsweise ihre Oberfläche mit großen Poren zur Grenzfläche der Schichtstruktur hin ausgerichtet hat und die Oberfläche mit kleinen Poren zur anderen Oberfläche der Schichtstruktur. Diese Orientierung präsentiert die gleichmäßigere Oberfläche der Membran für das optische Abtasten und die Quantifizierung der Analyseergebnisse.
Die Herstellung von asymmetrischer Membranen wird zum Beispiel in den US-Patenten mit den Nummern 4,629,563 , 5,171,455 , 5,886,059 , 5,536,408 , 5,562,826 und 4,774,192 ; und in D. R. Lloyd, „Materials Science of Synthetic Membranes", ACS Symposium 269: 1–21 (1985) beschrieben. Sie sind kommerziell erhältlich in einer Vielzahl von Porengrößen und Größenverhältnissen von Porengrößen. Herstellungsmaterialien umfassen Polysulfone, Polyethersulfone, Polyamide, Polyetheramide, Polyurethane, Zelluloseacetate, Polyvinyl-Pyrrolidone, Polystyrole und modifizierte Polystyrole wie auch Mischungen, Copolymere und geschichtete Verbundwerkstoffe. Zur weiteren Beschreibung von bevorzugten Membrantypen siehe z. B. US-Anmelde-Veröffentlichungsnummer 20030166291 und US-Anmelde-Seriennummer 10/410,671, die oben zitiert wurden. Eine beispielhafte asymmetrische Membran ist eine Polysulfon- oder Polyethersulfon-Membran wie die BTS 83-Membrane, die von der Pall Corporation (San Diego, CA) geliefert werden.
In der beispielhaften HDL-Analyse-Schichtstruktur hat jede Membran typischerweise eine Dicke von ungefähr 100–150 μm und eine Absorptionskapazität von ungefähr 80 μl/Quadratinch (ungefähr 12,4 μl/cm²). Minimale Porengrößen liegen typischerweise zwischen 0,01 und 10 μm mit Verhältnissen von maximaler/minimaler Porengröße von bis zu 100 und mehr.
In einer Ausführungsform umfasst die Schichtstruktur mindestens ein Reagenz, das wärmeempfindlich ist, so dass das Beschichten einer Membran, die das Reagenz enthält, an eine weitere Membran eine nachteilige Veränderung in dem Reagenz erzeugt. Die nachteilige Veränderung könnte irgendeine oder alle oder eine Änderung in Morphologie, Verteilung oder die tatsächliche chemische Struktur des Reagenz betreffen. Solche Schichtstrukturen werden vorteilhafterweise durch die hier beschriebenen Verfahren zum Auftragen eines Reagenz hergestellt.
III. Analysegeräte
Membran-Schichtstrukturen zur Verwendung in diagnostischen Analysen sowie die HDL-Analyse-Schichtstruktur, die hier beschrieben wird, werden typischerweise in ein Analysegerät zur bequemen Verwendung integriert. Die Erfindung kann dementsprechend verwendet werden, um Analysegeräte bereitzustellen, die die hier beschriebenen Membran-Schichtstrukturen enthalten. Zum Beispiel umfasst ein Analysegerät für die Analyse von HDL in einer Blut- oder Serumprobe:

(a) ein Substrat, das eine die Probe empfangende Vertiefung hat zum Empfangen eines Teils einer Blutprobe,
(b) eine Membran-Schichtstruktur, die erste und zweite geschichtete Membrane umfasst, die an einer Grenzfläche der Schichtstruktur verbunden sind, und
(c) einen Filter zwischen der die Probe empfangenden Vertiefung und der ersten Membran der Schichtstruktur zum Entfernen von roten Blutkörperchen in der Blutprobe, wenn die Probe von der die Probe empfangenden Vertiefung zu der Schichtstruktur wandert. Die Membran-Schichtstruktur nach (b) ist eine Schichtstruktur wie oben beschrieben, bei der die erste Membran mit Reagenzien imprägniert ist, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-(LDL- und VLDL)-Lipoprotein-Teilchen in der Probe auszufällen und die ausgefüllten LDL- und VLDL-Teilchen werden durch Filtrierung am Durchlaufen durch die Grenzfläche der Schichtstruktur gehindert; die zweite Membran wird mit Reagenzien imprägniert, die wirksam sind, ein optisch nachweisbares Signal zu erzeugen, das proportional zu einer Menge von HDL-assoziiertem Cholesterin in der zweiten Membran ist; und das Reagenz in mindestens einer dieser Membrane ist nicht vorhanden in einem geschichteten Bereich jener Membran, der zu der Grenzfläche der Schichtstruktur benachbart ist, so dass die Reagenzien in den beiden Membranen durch mindestens diesen geschichteten Bereich physikalisch getrennt sind. Es ist besonders bevorzugt, dass die HDL-Analyse-Reagenzien nicht vorhanden sind einem geschichteten Bereich der zweiten Membran, der zu der Grenzfläche der Schichtstruktur benachbart ist.

Vorzugsweise ist die Konzentration von jedem Reagenz gleichmäßig über die Länge und Breite der Membran, die das Reagenz enthält, wie oben beschrieben. Die Membrane sind vorzugsweise asymmetrische Membrane, die wie oben beschrieben orientiert sind, wobei die äußere Oberfläche der Reagenz-Membran die Oberfläche mit großen Poren (stumpf) und die äußere Oberfläche der Analyse-Membran die Oberfläche mit kleinen Poren (glänzend) ist.
Die Vertiefung für die Probe, der Filter und die Schichtstruktur gemäß (a)–(c) oben werden platziert oder können platziert werden in Flüssigkeitskommunikation miteinander. Zum Beispiel können diese Elemente sich in einem gemeinsamen Substrat befinden oder sie können sich auf einem oder mehr getrennten Substraten befinden und können während des Vorgangs der Analyse in Flüssigkeitskommunikation gebracht werden. Verschiedene Ausführungsformen von solch einem Analysegerät umfassen jene, die in Jones et al., US-Anmelde-Veröffentlichungsnummer 20030166291 und US-Anmelde-Seriennummer 10/410,671 beschrieben werden, die oben zitiert wurden.
Eine Ausführungsform wird in 3 gezeigt. Die Vorrichtung 50 umfasst einen Hauptkörper oder Träger 52, der die Vertiefung für die Probe 54 definiert. Die Vertiefung ist in Flüssigkeitskontakt mit einem Sieb-Kissen 60, das in einem eingekerbten Bereich 58 getragen werden kann, der am oberen Rand des Trägers gebildet wird. Der Flüssigkeitskontakt kann direkt sein oder, wie es in dem Gerät in 3 gezeigt wird, durch eine Kapillarleitung 56 gebildet werden, die in der Platte am Boden der Vertiefung gebildet wird. Der Träger ist vorzugsweise eine Kunststoffplatte, wobei die Vertiefung, der eingekerbte Bereich und/oder die Kapillare durch Standard-Guss- oder -Bearbeitungsverfahren gebildet werden.
Das Sieb-Kissen 60, das im Bereich 58 getragen wird, arbeitet, um große teilchenförmige Materie (einschließlich Blutkörperchen) teilweise zu entfernen, wenn die Probe durch die Kissen-Matrix in eine Richtung von unten nach oben wandert, wie es in der Figur gezeigt ist. Das Kissen 60 wird vorzugsweise aus einer Glasfasermatrix von Material gebildet, das dazu bestimmt ist, um wässrige Flüssigkeit durch Oberflächenbenetzung zu ziehen und die Bewegung von Blutkörperchen zurückzuhalten, wenn die Blutprobe durch die Matrix gezogen wird. Ein beispielhaftes Kissen ist ein Glasfaser-Filter wie ein GF/D- oder PD008-Filter, der von Whatman geliefert wird. Das Kissen ist so bemessen, um ein bestimmtes Volumen der Probeflüssigkeit, z. B. ungefähr 15–25 μl zu absorbieren. Das Sieb-Kissen 60 kann zusätzlich Reagenzien zum Einfangen von roten Blutkörperchen enthalten, wie Lektine, Antikörper, die spezifisch für Membranproteine auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen sind, Thrombin oder Ionenaustauschmittel.
Das Sieb-Kissen 60 wiederum kontaktiert einen länglichen Streifen oder eine Matrix 62 zur Verteilung der Probe, die sich entlang des oberen Randes der Platte 52 erstreckt. Dieser Streifen kann auch durch Schaumpolster oder andere Unterstützungen unterstützt werden. Die Matrix 62 dient dazu, die Probeflüssigkeit von einem zentralen Bereich zum Auftragen der Flüssigkeit 64, der in Flüssigkeitskontakt mit dem Kissen 60 ist, zu Bereichen zum Sammeln der Flüssigkeit wie 66, 68 innerhalb der Matrix zu verteilen. Die Matrix wird vorzugsweise aus Glasfasern gebildet. Die Packungsdichte und Dicke der Matrix sind so, dass sie Mengen von der Probeflüssigkeit, z. B. 10–25 μl, absorbiert und verteilt, die von dem Bereich des Streifens zum Auftragen der Probe an die Bereiche des Streifens zum Sammeln der Probe geliefert wird. Ein beispielhaftes Streifenmaterial ist ein F-165-25A-Glasfaserfilter, der von Whatman erhältlich ist, der eine Packungsdichte von ungefähr 0,2 gm/cm³ und eine Dicke von ungefähr 0,12 mm hat.
Die Vorrichtung 50 umfasst auch einen Reaktionsstab 70, der aus einer langgestreckten Unterstützung 72 und ein oder mehr multiplen, benetzbaren, absorbierenden Reaktionsteststreifen besteht, die als 74, 76, 78 und 80 gezeigt werden, getragen auf der unteren Oberfläche der Unterstützung wie gezeigt. Die Elemente 74 und 86 bilden eine Membran-Schichtstruktur wie hier beschrieben, bei der 74 eine HDL-Analyse-Membran und 86 die Reaktionsmembran ist.
Die Unterstützung 72 ist durchsichtig oder hat Fenster oder Öffnungen, die es erlauben, dass die Kissen durch die Unterstützung angeschaut werden können. Jedes Test-Kissen, das in einer bestimmten Analyse verwendet wird, umfasst vom Analyt abhängige Reagenzien, die wirksam sind, um eine vom Analyten abhängige Veränderung in dem Kissen zu erzeugen, die in einer bekannten Weise nachgewiesen werden kann.
Der Reaktionsstreifen ist an dem Träger 52 durch Befestigungsmittel befestigt, die wirksam sind, um (a) das Gerät in einer Position zum Verteilen der Probe zu halten, bei welcher die Schichtstruktur aus Test-Membranen/Reagenz-Membranen von der Matrix zum Verteilen der Probe einen Abstand hat und um (b) das Gerät in eine Test-Position zu überführen, bei der die Schichtstruktur aus Test-Membranen/Reagenz-Membranen und die Matrix zur Verteilung der Probe in Flüssigkeitskommunikation sind. Die Befestigungsmittel können auch verwendet werden, um eine solche Flüssigkeitskommunikation zu unterbrechen, nachdem eine bestimmte Menge der Probe in das Test-Kissen gelangt ist und/oder nach einer bestimmten Kontaktzeit, indem das Gerät von der Test-Position zu einer Position überführt wird, bei der der/die Test-Streifen nicht in Flüssigkeitskommunikation mit der Matrix zur Verteilung der Probe sind (welche dieselbe sein kann wie die Position zur „Verteilung der Probe"). Solch ein Überführen kann durch das Überwachen des Reflektionsgrades an der oberen Oberfläche des Test-Kissens gesteuert werden, der den Grad der Benetzung anzeigt, wie es im US-Patent Nr. 5,114,350 beschrieben wird. Alternativ kann die Menge der Probe mit hinreichender Genauigkeit gesteuert werden durch Verwendung einer vorherbestimmten Kontaktzeit, wenn die Absorptionskapazität und die Aufnahmerate der Probe des Kissenmaterials bekannt sind.
Die Befestigungsmittel können zum Beispiel ein Paar von Federelementen, wie zum Beispiel die elastomeren Blöcke 82, 84, umfassen, die bewirken, dass die Schichtstruktur aus Test-Membran/Reagenz-Membran zu einer Nicht-Transfer-Position oder Proben-Verteilungsposition vorgespannt ist, bei der die Schichtstruktur einen Abstand von der Matrix zur Verteilung der Probe hat. Durch Zusammendrücken oder Freigeben der Federelemente kann eine Flüssigkeitskommunikation zwischen der Matrix 62 zur Verteilung der Probe und der Schichtstruktur selektiv hergestellt werden und getrennt werden. Die Flüssigkeitskommunikation kann über direkten Kontakt oder durch ein dazwischen liegendes Element erfolgen. Die Unterstützungsblöcke könnten zusammengedrückt werden mittels Federn oder einer kolbenartigen Bewegung.
Alternativ könnten externe mechanische Geräte den Baukörper 52 und/oder die Unterstützung 62 ergreifen und sie aufeinander zu bewegen. Ein beispielhaftes System ist der Cholestech LDX^®-Analysator, ein unabhängiger, automatisierter Analysator, der für den Gebrauch mit Analysegeräten wie den hier beschriebenen vorteilhaft ist.
BEISPIELE
Beispielhafte HDL-Analyse-Schichtstrukturen wurden herstellt durch Gravurbeschichten, wie hier offenbart, und HDL-Analysen von bekannten Standards wurden durchgeführt unter Verwendung der Schichtstrukturen. Die Daten zeigten eine exzellente Genauigkeit, die die Effizienz des offenbarten Verfahrens zum Anwenden von bestimmten und gleichmäßigen Mengen der Analyse-Reagenzien zeigen.
Die verwendete Schichtstruktur aus Membranen war eine Schichtstruktur von zwei BTS-83-Polysulfon-asymmetrischen Membranen, die geschichtet war mit der kleinporigen (glänzenden) Seite der einen Membran, die die grobporige (stumpfe) Seite der zweiten Membran kontaktiert, welche von der Pall Corporation, San Diego, CA hergestellt wurde. Weiten von ungefähr 5 Inch wurden zum Beschichten verwendet.
Standard-Ausfällungs- und HDL-Analyse-Reagenzien-Mischungen wurden verwendet. Die Ausfällungslösung umfasste 3,9 mg/ml Dextransulfat (500.000 MW) und 7,9 mM Mg(OAc)₂ in Wasser. Ein Tensid (Pluronic L64, das von BASF hergestellt wurde, mit einer Konzentration von 0,05%) wurde ebenfalls hinzugefügt, um die Aufnahme in die Membran hinein zu erleichtern. Die HDL-Analyse-Reagenzflüssigkeit enthielt 80,3 U/ml Cholesterin-Oxidase, 473 U/ml Cholesterol-Esterase, 440 U/ml Meerrettich-Peroxidase, 4,14 mg/ml 4-Aminoantipyrin und 26,5 mg/ml TOOS (3-[Ethyl(3-methylphenyl)amino]-2-Hydroxylpropansulfonsäure) in Wasser mit 3 mg/ml CHAPS, das als Tensid hinzugefügt wurde.
Eine flexographische Presse mit Gravurzylinder wurde verwendet, um eine konstante Menge der Reagenzlösung auf eine Gummiwalze aufzutragen, die in Kontakt mit der Schichtstruktur aus Membranen war (Offset-Tiefdruckverfahren).
Der Zylinder, der für dieses Experiment verwendet wurde, war eine Walze mit 65 Linien/Inch und 30 BCM, wobei sich BCM auf eine Milliarde Kubikmikrometer oder Mikroliter pro Quadrat-Inch der Oberfläche bezieht.
Die Ausfällungsreagenzien wurden zuerst auf die stumpfe Seite der ersten Membran aufgetragen.
Nach dem Auftragen wurde die Membran mit einem Infrarot-Trocknergebläse getrocknet. Die Analyse-Reagenzien zur HDL-Farbmessung wurden dann in einer ähnlichen Weise auf die glänzende Seite der zweiten Membran der Schichtstruktur aufgetragen und mit einem Infrarot-Trocknergebläse getrocknet.
Die folgenden HDL-Analysedaten sind von einer geschichteten Membran, die wie oben beschrieben worden ist, die in Teilstücke mit 0,22 Inch geschnitten wurde und in Analysekassetten zusammengebaut wurde, wie es in US-Veröffentlichungsnummer 20030166291 und US-Anmelde-Seriennummer 10/410,671, die oben zitiert wurden, beschrieben ist. Analysen wurden durchgeführt gemäß Standardverfahren. Die Proben (acht HDL-Standards) wurden in einem LDX^®-Analysator analysiert und der Mittelwert der acht Kassetten wurde für jeden Standard gebildet. Exzellente Genauigkeit und Korrelation mit den Standardwerten wurde erhalten.

HDL-Standard (mg/dL) LDX^®-Mittelwert

32,6 33,9

42,5 40,8

76,2 75,5

62,3 58,9

53,2 52,4

45,7 47,7

49,5 53,0
In dem Tiefdruckprozess, der für das obige Experiment verwendet wird, wurden bis zu vier Arbeitsgänge der Reagenzlösung auf jede Seite der Membran aufgetragen. Das Beschichtungsgewicht für jeden Arbeitsgang wurde bestimmt durch den Gewichtsverlust der Beschichtungslösung und eine gute Konsistenz wurde von einem Arbeitsgang zum nächsten beobachtet.
Es wurde entdeckt, dass ein direkter Gravurprozess die Lösung effizienter als der Tiefdruckprozess aufträgt, was im Allgemeinen die wiederholten Arbeitsgänge für dieses System unnötig macht. In einem bevorzugten Verfahren dreht sich der Gravurzylinder in einer entgegengesetzten Richtung zu der Gewebezuführrichtung (d. h. gegenläufige Gravur wie in 2 gezeigt) und das Gewebe kontaktiert den Zylinder ohne einen Andruckzylinder („Kuss"-Gravur, wie sie in 42 in 2 gezeigt wird). Ein Zylinder wird gewählt mit einem Muster von Vertiefungen, das wirksam ist, um mit dem gegebenen Beschichtungssystem eine gleichmäßige Beschichtung aufzutragen.
Membrane wurden beschichtet unter Verwendung des gegenläufigen Kuss-Gravurverfahrens mit Geschwindigkeiten des Gewebes von 5–10 ft/min und Zylinderdrehgeschwindigkeiten von ungefähr dem Zweifachen der Geschwindigkeit des Gewebes für das Beschichten mit dem Ausfüllungsreagenz und mit ungefähr derselben Geschwindigkeit wie das Gewebe für das Beschichten mit der HDL-Analyse-Reagenz. Die Menge der auf die Membran aufgetragenen Lösung in diesen Testläufen war ungefähr 65% der sättigenden Menge bei den Ausfällungsreagenzien und ungefähr 45% der sättigenden Menge bei die HDL-Analyse-Reagenzien.

Claims

Ein Verfahren zum Auftragen eines Reagenz auf einer Membran (12, 14) in einer Schichtstruktur aus Membranen (10), wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Schichtstruktur (10) aus ersten (12) und zweiten Membranen (14), wobei die Schichtstruktur (10) eine äußere erste Membranoberfläche (16), eine geschichtete erste Membranoberfläche (18), eine geschichtete zweite Membranoberfläche (20) und eine äußere zweite Membranoberfläche (22) aufweist; (b) Auftragen einer bestimmten Menge einer Lösung eines ersten Reagenz auf die äußere erste Membranoberfläche (16) durch Kontaktieren dieser Oberfläche (16) mit einem ebenen oder zylindrischen Träger (36), welcher eine Oberfläche aufweist, die ein Muster von Vertiefungen enthält, welche mit der Lösung gefüllt sind; und (c) Trocknen der ersten Membran (12) in dieser Schichtstruktur (10), um eine Schichtstruktur (10) herzustellen, die die erste Membran (12) umfasst, welche mit dem ersten Reagenz imprägniert ist, wobei das erste Reagenz die zweite Membran (14) in der Schichtstruktur (10) nicht kontaktiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Muster Vorsprünge aufweist, welche die Lösung auftragen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei diese bestimmte Menge eine nicht saturierende Menge ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, weiter umfassend: (d) Auftragen einer bestimmten Menge einer Lösung des zweiten Reagenz auf die äußere zweite Membranoberfläche (22) durch Kontaktieren dieser Oberfläche (22) mit einem festen Träger (36), welcher Vertiefungen enthält, die mit der Lösung gefüllt sind; und e) Trocknen der zweiten Membran (14) in der Schichtstruktur (10), um eine Schichtstruktur (10) herzustellen, welche die zweite Membran (14) enthält, die mit dem zweiten Reagenz imprägniert ist, wobei das zweite Reagenz die erste Membran (12) in der Schichtstruktur (10) nicht kontaktiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei diese bestimmte Menge in (d) eine nicht saturierende Menge ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das zweite Reagenz die beschichtete zweite Membranoberfläche (20) nicht kontaktiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei mindestens die erste Membran (12) eine asymmetrische Membran ist, die eine Oberfläche mit kleinen Poren und eine Oberfläche mit großen Poren aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die äußere erste Membranoberfläche (16) die Oberfläche mit großen Poren ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die zweite Membran (14) eine asymmetrische Membran ist, die eine Oberfläche mit kleinen Poren und eine Oberfläche mit großen Poren aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die äußere zweite Membranoberfläche (22) die Oberfläche mit kleinen Poren ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Träger (36) eine rotierende Gravurwalze ist
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das erste Reagenz Reagenzien umfasst, die wirksam sind, um selektiv Nicht-HDL-Lipoproteine aus einer Blutflüssigkeit-Probe zu entfernen, welche durch die erste Membran (12) läuft.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das erste Reagenz Reagenzien umfasst, die wirksam sind, um Nicht-HDL-Lipoprotein-Teilchen aus einer Blutflüssigkeit-Probe auszufällen, wobei die ausgefällten Teilchen durch Filtrieren daran gehindert werden, durch die geschichtete erste Membranoberfläche (18) hindurchzutreten.
Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das zweite Reagenz Reagenzien umfasst, die wirksam sind, um ein optisch detektierbares Signal zu produzieren, das proportional zu einer Menge von HDL-assoziiertem Cholsterin in der zweiten Membran (14) ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Auftragen gleichzeitig über die gesamte Breite der äußeren Oberfläche (16) der ersten Membran stattfindet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das erste Reagenz wärmeempfindlich ist, so dass das Beschichten einer Membran (12), welche das Reagenz enthält, mit einer anderen Membran (14) eine nachteilige Änderung in dem Reagenz bewirkt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das zweite Reagenz wärmeempfindlich ist.