DE10352384A1

DE10352384A1 - Reagenzien enthaltende Membrane und Laminate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE10352384A1
Application number: DE2003152384
Authority: DE
Inventors: Ronald M. Mountain View Jones
Original assignee: Cholestech Corp
Current assignee: Cholestech Corp
Priority date: 2003-11-10
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2005-06-16
Also published as: WO2005044429A3; TW200526960A; EP1680212A2; WO2005044429A2; CA2545158A1

Abstract

Membranlaminate werden beschrieben, wo zumindest eine Membran in dem Laminat ein Reagens enthält, das auf seine jeweilige Membran beschränkt ist, und es werden Verfahren zum Herstellen derartiger Laminate durch Aufbringen eines Reagens auf eine Membran in einem Laminat beschrieben. Es werden ebenfalls in Beziehung stehende Verfahren des Imprägnierens einer einzelnen Membran mit einem Reagens beschrieben. Die Verfahren verwenden bevorzugt einen Tiefdruckbeschichtungsvorgang. Es werden ebenfalls Laminate zur Verwendung beim Bestimmen von mit HDL in Verbindung stehendem Cholesterin beschrieben sowie Testvorrichtungen, die diese enthalten.

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Imprägnieren einer Membran oder eines Membranlaminats mit einer gleichförmigen und kontrollierten Menge an Reagens. In speziellen Aspekten bezieht sich die Erfindung auf das Herstellen von Membranlaminaten, die imprägnierte Reagenzien enthalten, wobei die Reagenzien jeweils auf eine einzelne Schicht des Laminats beschränkt sind, und die Erfindung bezieht sich auf derartige Reagenzien enthaltende Membrane und Laminate und auf Testvorrichtungen, die selbige enthalten.
2. Hintergrund der Erfindung
Diagnostische Tests bzw. Versuche, die ein Streifenformat verwenden, wo ein poröses Material, wie beispielsweise ein Faserstreifen oder eine Fasermembran, mit diagnostischen Reagenzien imprägniert ist, werden aufgrund ihrer Einfachheit, Geschwindigkeit und aufgrund der verminderten Notwendigkeit der Verarbeitung von Reagenzien durch den Nutzer allgemein verwendet. Das gleichmäßige und reproduzierbare Aufbringen von Reagenzien ist wichtig bei der Herstellung derartiger Vorrichtungen, um die Konsistenz und die Genauigkeit der Testergebnisse sicherzustellen.
Verschiedene Verfahren zum Aufbringen der Reagenzien auf derartige Teststreifen sind verwendet worden. Zum Beispiel kann eine poröse Membran mit einem Reagens einfach durch das Kontaktieren der Membran mit einer Lösung des Reagens imprägniert werden. Um eine gleiehförmige Imprägnierung zu erzielen, wird typischerweise eine sättigende Menge der Lösung verwendet. Diese Herangehensweise produziert jedoch häufig nicht gleichförmige Verteilungen der Reagenzien. Insbesondere ist sie nicht befriedigend für laminierte Membrane, weil im Allgemeinen die Verbreitung des Reagens nicht auf eine einzelne Schicht begrenzt ist, insbesondere wenn die Schichten aus gleichen Materialien bestehen. Die Spritz- oder Sprühbeschichtung eines Reagens auf einer Oberfläche einer Membran oder eines Membranlaminats kann eine bessere Steuerung der Menge des aufgebrachten Reagens bereitstellen, wodurch das Risiko der Verbreitung auf die darunter liegenden Schichten in einem Laminat reduziert wird.
Die Beschichtung mit diesen Verfahren neigt jedoch dazu, nicht gleichmäßig zu sein und einen Konzentrationsgradienten mit mehr Reagens im Zentrum des Anwendungsgebietes zu erzeugen.

Wie es in der EP 13 29 724 A2 und in der DE 102 04 606 beschrieben ist, besteht eine andere Herangehensweise zum Aufbringen der Reagenzien auf unterschiedliche Schichten in einem Laminat darin, die Schichten getrennt zu beschichten oder zu imprägnieren, gefolgt von einem Laminierungs- bzw. Schichtungsprozess. Die obigen Dokumente offenbaren eine Testvorrichtung für Lipoproteine hoher Dichte (High-Density Lipoproteins = HDL), die ein Reagenskissen und eine HDL-Reaktionsmembran enthalten. Dieses Reagenskissen wird durch Ausgeben einer wässrigen Lösung mit Dextransulfat auf eine asymmetrische Membran mit Hilfe einer bestimmten Ausgaberate hergestellt. Unter Verwendung des gleichen Vorgangs wird die HDL-Reaktionsmembran mit einer wässrigen Zusammensetzung imprägniert. Um die obige Testvorrichtung zu vervollständigen, werden die zwei imprägnierten Membrane getrennt oder gleichzeitig durch Ultraschallschweißen befestigt.

Es ist jedoch nachteilig, dass eine derartige Ultraschalllaminierung oder eine thermische Laminierung für hitzeempfindliche Reagenzien ungeeignet sein kann. Weiterhin kann die Verwendung eines Klebstoffes zwischen den Schichten die Notwendigkeit des Erhitzens reduzieren, wobei es jedoch zu möglichen Verschmutzungen der Testchemie führt. Es ist ebenfalls von Bedeutung, die Porosität der porösen Membrane aufrechtzuerhalten, wobei jede dieser Techniken in dieser Hinsicht abträglich sein kann.

Es ist daher das technische Problem der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum gleichförmigen Aufbringen von Reagenzien auf Membrane und insbesondere auf separate Membrane in einem Laminat bereitzustellen, ohne dass eine Querverschmutzung zwischen den Schichten stattfindet und ohne die Reagenzien übermäßiger Hitze auszusetzen. Idealerweise wird ein derartiges Verfahren eine kontrollierte Menge eines Reagens gleichmäßig auf eine oder beide Seiten eines derartigen Laminats aufbringen. Es ist ein weiteres Problem der vorliegenden Erfindung, eine Testvorrichtung bereitzustellen, die gleichmäßig geladene bzw. beschichtete bzw. imprägnierte Membrane zum Bestimmen von verlässlichen Testergebnissen aufweist.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß eines Aspektes stellt die Erfindung ein Verfahren zum Aufbringen eines Reagens auf eine Membran in einem Membranlaminat bereit, wobei das Membranlaminat erste und zweite laminierte Membranen aufweist. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen eines Laminats einer ersten und zweiten Membran mit einer äußeren ersten Membranoberfläche, einer laminierten ersten Membranoberfläche, einer laminierten zweiten Membranoberfläche und einer äußeren zweiten Membranoberfläche;
(b) Aufbringen eines kontrollierten Volumens einer Lösung eines ersten Reagens auf die äußere erste Membranoberfläche durch Kontaktieren der Oberfläche mit einer Unterlage, die eine Oberfläche mit einem Muster aufweist, und
(c) Trocknen der ersten Membran in dem Laminat, um ein Laminat mit der ersten Membran, die mit dem ersten Reagens imprägniert ist, herzustellen, wobei das erste Reagens nicht die zweite Membran in dem Laminat kontaktiert.

Bevorzugt bringt das Verfahren die genannte Lösung mit Hilfe eines Musters auf, das Vertiefungen gefüllt mit dieser Lösung aufweist, oder mit Hilfe eines Musters, das Vorsprünge zum Aufbringen dieser Lösung aufweist. Weiterhin umfasst die Unterlage bevorzugt eine ebene oder zylindrische Form.

Bevorzugt umfasst das Verfahren weiterhin das Imprägnieren der zweiten Schicht mit einem zweiten Reagens durch (d) Aufbringen eines kontrollierten Volumens einer Lösung des zweiten Reagens auf die äußere zweite Membranoberfläche durch Kontaktieren der Oberfläche mit einer festen Unterlage, die mit der Lösung gefüllte Vertiefungen aufweist und (e) Trocknen der zweiten Membran in dem Laminat, um ein Laminat mit der zweiten Membran herzustellen, die mit dem zweiten Reagens imprägniert ist, wobei das zweite Reagens nicht die erste Membran in dem Laminat kontaktiert.

Typischerweise ist die feste Unterlage ein rotierender Gravüre- bzw. Tiefdruckzylinder mit einer Mehrzahl von Vertiefungen und Zellen, die in der Oberfläche gebildet sind, wie weiter unten diskutiert wird. Bevorzugter Weise tritt das Aufbringen gleichzeitig über die gesamte Breite der ersten äußeren Membranoberfläche auf, um ein gleichmäßiges Aufbringen über die Breite der Membran zu erzielen.

Das "gesteuerte Volumen" der Lösung ist im Allgemeinen nicht mehr als eine sättigende bzw. tränkende Menge der Lösung im Hinblick auf die absorbierende Kapazität der jeweiligen Membran und es ist typischerweise eine untersättigende Menge, wie unten definiert ist. In bestimmten Ausführungsformen kontaktiert ein gegebenes (erstes oder zweites) Reagens nicht die laminierte Oberfläche der jeweiligen Membran in dem fertigen Laminat, d.h. es dringt nur teilweise in die Tiefe der jeweiligen Membran ein. In anderen Ausführungsformen kontaktiert ein gegebenes (erstes oder zweites) Reagens die laminierte Oberfläche der jeweiligen Membran in dem fertigen Laminat, d.h. es imprägniert die vollständige Dicke der jeweiligen Membran, wobei es jedoch nicht die andere Membran in dem Laminat kontaktiert.

In einer Ausführungsform ist zumindest die erste Membran eine asymmetrische Membran, d.h. sie besitzt eine kleinporige Oberfläche und eine großporige Oberfläche. Die zweite Membran kann ebenfalls eine asymmetrische Membran sein. In ausgewählten Ausführungsformen ist die äußere erste Membranoberfläche die großporige Oberfläche der ersten Membran. In einer weiteren Ausführungsform ist die äußere zweite Membranoberfläche die kleinporige Oberfläche der zweiten Membran. Ein derartiges Ausführungsbeispiel ist in 1 dargestellt, die ein Laminat 10 einer ersten Membran 12 und einer zweiten Schicht 14 mit einer äußeren ersten Membranoberfläche 16, einer laminierten ersten Membranoberfläche 18, einer laminierten zweiten Membranoberfläche 20 und einer äußeren zweiten Membranoberfläche 22 zeigt. Die laminierte erste Membranoberfläche und die laminierte zweite Membranoberfläche bilden verbunden eine Laminatgrenzfläche.

Zumindest eines der Reagenzien kann ein hitzeempfindliches Reagens sein, so dass das Laminieren bzw. Beschichten einer Membran mit diesem Reagens auf eine weitere Membran eine nachteilige Änderung in dem Reagens erzeugen würde.

In einer Ausführungsform umfasst das erste Reagens Reagenzien, die zum gezielten Entfernen von Nicht-HDL-Lipoproteinen aus einer flüssigen Blutprobe wirksam sind, wenn sich die flüssige Blutprobe durch die erste Membran bewegt, und das zweite Reagens umfasst Reagenzien, die zum Erzeugen eines optisch wahrnehmbaren Signals proportional zu einer Menge des mit dem HDL in Verbindung stehenden Cholesterin in der zweiten Membran dienen.

Gemäß einem in Beziehung stehenden Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Aufbringen eines Reagens auf eine Membran durch das Aufbringen eines kontrollierten Volumens einer Lösung des Reagens auf eine erste Oberfläche der Membran bereit, in dem die Oberfläche mit einer planaren oder zylindrischen Unterlage kontaktiert wird, wobei die Unterlage eine Oberfläche mit einem Muster von Vertiefungen, gefüllt mit der Lösung, aufweist. Wieder ist die Unterlage typischerweise ein rotierender Gravüre- bzw. Tiefdruckzylinder. Des Weiteren werden bevorzugt Techniken und Vorrichtungen verwendet, die zum Aufbringen von Reagenzien auf eine Membran in einem Membranlaminat beschrieben worden sind.

Die kontrollierte Menge des Reagens kann eine untersättigende Menge sein. Dem Aufbringen des Reagens und dem bevorzugten Trocknen folgend kontaktiert in einer Ausführungsform das Reagens nicht die gegenüberliegende Oberfläche der Membran, d.h. es dringt nur teilweise in die Tiefe der Membran ein. Das Aufbringen des Reagens tritt bevorzugt gleichzeitig über die gesamte Breite der ersten Oberfläche der Membran auf. Demgemäss ist die Konzentration des Reagens bevorzugt gleichförmig über die Länge und Breite der Membran.

Die Membran kann eine asymmetrische Membran mit einer kleinporigen Oberfläche und einer großporigen Oberfläche sein, wobei in einer Ausführungsform die erste Oberfläche, auf die das Reagens aufgebracht wird, die großporige Oberfläche ist. In anderen Ausführungsformen ist die erste Oberfläche die kleinporige Oberfläche. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagens Reagenzien, die zum gezielten Entfernen von Nicht-HDL-Lipoproteinen aus einer flüssigen Blutprobe geeignet sind, wenn sich die flüssige Blutprobe durch die Membran bewegt, wobei alternativ das Reagens Reagenzien umfasst, die zum gezielten Ausfällen von Nicht-HDL-(LDL- und VLDL-)-Lipoproteinteilchen in der Probe wirksam sind, und wobei durch Filtration verhindert wird, dass sich die ausgefällten LDL- und VLDL-Teilchen durch die Membran bewegen. In dieser Ausführungsform wird, wenn die Membran eine asymmetrische Membran ist, das Reagens auf die großporige Oberfläche aufgebracht. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagens Reagenzien, die zum Erzeugen eines optisch feststellbaren Signals proportional zu einer Menge an mit HDL in Verbindung stehendem Cholesterin in der Membran wirksam sind. In dieser Ausführungsform wird, wenn die Membran eine asymmetrische Membran ist, das Reagens auf die kleinporige Oberfläche aufgebracht. Gemäß eines anderen Aspekts stellt die Erfindung ein Membranlaminat zur Verwendung in einer diagnostischen Testvorrichtung bzw. Assay-Vorrichtung bereit, das eine erste und eine zweite laminierte Membran aufweist, die an einer Laminatgrenzfläche verbunden sind, wobei die erste Membran in dem Laminat mit einem ersten Reagens imprägniert ist, die zweite Membran mit einem zweiten Reagens imprägniert ist und wobei das Reagens in zumindest einer der Membranen in einer laminaren Region dieser Membran angrenzend an die Laminatgrenzfläche nicht vorhanden ist, so dass die Reagenzien in den zwei Membranen physikalisch durch zumindest jene laminare Region voneinander getrennt sind. Bevorzugter Weise ist die Konzentration jedes Reagens oder jedes Reagenssystems gleichförmig über die Länge und die Breite der jeweiligen Membran.

In ausgewählten Ausführungsformen ist zumindest ein Reagens wärmeempfindlich, so dass das Laminieren einer Membran mit dem Reagens auf eine weitere Membran eine nachteilige Änderung in dem Reagens erzeugen würde.

Bevorzugt ist zumindest die erste Membran eine asymmetrische Membran mit einer kleinporigen Oberfläche und einer großporigen Oberfläche. In ausgewählten Ausführungsformen zeigt die kleinporige Oberfläche zu der Laminatgrenzfläche. Die zweite Membran kann ebenfalls eine asymmetrische Membran sein, wobei in ausgewählten Ausführungsformen ihre großporige Oberfläche zu der Laminatgrenzfläche zeigt.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erste Reagens Reagenzien, die zum selektiven Entfernen von Nicht-HDL-Lipoproteinen aus einer flüssigen Blutprobe geeignet sind, wenn sich die flüssige Blutprobe durch die erste Membran bewegt, wobei alternativ das erste Reagens Reagenzien beinhalten kann, die zum gezielten Ausfällen von Nicht-HDL-(LDL- und VLDL)-Lipoproteinteilchen in der Probe wirksam sind und wobei durch Filtration die ausgefällten bzw. präzipitierten LDL- und VLDL-Teilchen vom Durchlaufen der Laminatgrenzfläche abgehalten werden. In diesen Ausführungsformen umfasst das zweite Reagens Reagenzien, die zum Erzeugen eines optisch wahrnehmbaren Signals in der zweiten Membran geeignet sind, wobei das optisch wahrnehmbare Signal einer Menge an mit HDL in Verbindung stehendem Cholesterin proportional ist. In einem derartigen Laminat ist das Reagens in der zweiten Membran bevorzugt nicht in einer laminaren Region jener Membran angrenzend an die Laminatgrenzfläche vorhanden.

Gemäß eines in Beziehung stehenden Aspektes stellt die Erfindung eine Testvorrichtung zum Untersuchen von HDL in einer Blut- oder Serumprobe bereit, aufweisend:

(a) ein Substrat mit einer Probe aufnehmenden Vertiefung zum Aufnehmen eines Aliquots der Probe,
(b) ein Membranlaminat aufweisend eine erste und eine zweite laminierte Membran, die an einer Laminatgrenzfläche verbunden sind, wobei (i) die erste Membran mit Reagenzien imprägniert ist, die für das gezielte Ausfällen von LDL- und VLDL-Lipoproteinteilchen in der Probe wirksam sind, und wobei die präzipitierten LDL- und VLDL-Teilchen durch Filtration davon abgehalten werden, durch die Laminatgrenzfläche zu wandern; (ii) die zweite Membran mit Reagenzien imprägniert ist, die zum Erzeugen eines optisch bestimmbaren Signals in der zweiten Membran wirksam sind, wobei das optisch detektierbare Signal einer Menge an mit HDL in Verbindung stehendem Cholesterin proportional ist, und (iii) das Reagens in zumindest einer der Membranen und vorzugsweise in der zweiten Membran in einer laminaren Region jener Membran angrenzend an die Laminatgrenzfläche nicht vorhanden ist, so dass die Reagenzien in den zwei Membranen durch zumindest jene laminare Region physikalisch getrennt sind.

In dem oben beschriebenen Laminat ist die Konzentration jedes Reagens bevorzugt gleichmäßig über die Länge und die Breite der Membran. Die Vorrichtung umfasst ebenfalls (c) einen Filter zwischen der die Probe aufnehmenden Vertiefung und der ersten Membran des Laminats zum Entfernen von roten Blutkörperchen in der Probe, wenn sich die Probe von der Probeaufnahmevertiefung zu dem Laminat bewegt, wobei die Vertiefung, der Filter und das Laminat in Flüssigkeitskontakt miteinander platziert sind oder platziert werden können.

Diese und andere Ziele und Merkmale der Erfindung werden vollständiger offenbar werden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.

4. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Querschnittsansicht von zwei laminierten asymmetrischen Membranen, auf die Reagenzien in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung aufgebracht werden können;
2 ist ein schematisches Diagramm, das ein Beschichtungssystem zum Aufbringen von Reagenzien auf ein Laminat in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung zeigt; und
3 ist eine seitliche Ansicht einer Testvorrichtung, die ein Membranlaminat enthält in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung.
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Verfahren zum Aufbringen von Reagenzien
Die Erfindung stellt Verfahren zum Imprägnieren oder Beschichten eines Laminats mit zumindest zwei Membranen mit zumindest einem Reagens bereit, so dass jedes Reagens auf seine jeweilige Membran beschränkt ist. Bevorzugter Weise umfasst das Laminat zumindest zwei Membranen, wobei jede Membran ein unterschiedliches Reagens oder ein unterschiedliches Reagenziensystem enthält.
Ein Beispiel für ein derartiges Laminat ist eine Membrananordnung, die in einer Vorrichtung verwendet wird, die zum Messen der Konzentration von mit HDL in Verbindung stehendem Cholesterin in einer Blutprobe konstruiert ist, wobei die Blutprobe ebenfalls LDL- und VLDL-Teilchen enthält. Siehe z.B. Jones et al., US-Publikationsnummer der Anmeldung 20030166291 und die US-Anmeldung mit der Seriennummer 10/410,671, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die Erfindung ist jedoch für jede Anwendung nützlich, die ein oben beschriebenes Laminat mit Reagenzien verwendet, wobei die Reagenzien in zumindest einer und bevorzugt in zwei Membranschichten imprägniert sind, wo jedes Reagens auf seine jeweilige Schicht beschränkt sein muss.
Das beispielhafte HDL-Testlaminat, wie es weiter unten beschrieben ist, umfasst eine HDL-Testmembran, in der die HDL-Konzentration gemessen wird, und eine Reagensmembran mit einem bindenden und/oder Präzipitationsreagens, so dass die Membran wirksam ist, um gezielt Nicht-HDL-Lipoproteine aus der flüssigen Probe zu entfernen, bevor die Probe mit der Testmembran in Kontakt tritt.
Jede Membran in dem Laminat ist bevorzugt eine poröse asymmetrische Membran, d.h. eine Membran mit einem Porengrößegradienten über ihre Dicke. Eine beispielhafte Zwei-Membran-Schicht 10 umfassend zwei asymmetrische Membranen 12 und 14 ist im Querschnitt in 1 gezeigt, wobei die bevorzugte Orientierung mit den größeren Poren an dem Bezugszeichen 24 und den kleineren Poren an dem Bezugszeichen 26 in der Membran 12 gezeigt ist.
Um für den HDL-Test genau zu funktionieren, muss das HDL-Testreagens auf seine jeweilige Schicht begrenzt sein. Wenn das HDL-Reagens in der Reagensschicht vorhanden ist, wird die in der Testreaktion entwickelte Farbe im Allgemeinen einen Anteil an Nicht-HDL-Cholesterin in Ergänzung zu dem Analyten des mit dem HDL in Verbindung stehenden Cholesterin repräsentieren.
Die Anmelder haben herausgefunden, dass ein Gravüredruckprozess bzw. ein Tiefdruckprozess, in dem Flüssigkeit aus Vertiefungen in einer festen Platte mit ebener oder beliebiger Form oder typischerweise in einem rotierenden Zylinder auf ein Substrat aufgebracht wird, das Aufbringen eines kontrollierten Volumens unterschiedlicher Reagenzien auf gegenüberliegende Oberflächen einer laminierten Membran gestattet. Durch das Steuern des aufzubringenden Volumens bzw. des abzulagernden Volumens kann jedes Reagens auf seine jeweilige Schicht in dem Laminat begrenzt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Reagenzien auf getrennte Membrane oder Membranlaminate mit Hilfe einer Hochdrucktechnik aufgebracht. Zu diesem Zweck weist die Unterlage eine ebene oder beliebige geeignete Konfiguration auf, bevorzugt die Konfiguration eines Zylinders. Die Unterlage umfasst ein Muster mit Vorsprüngen, die die Reagenzien auf die Membranen aufbringen. Bevorzugt werden die Reagenzien mit einer derartigen Konsistenz bereitgestellt, dass sie zeitweilig an den Vorsprüngen anhaften, so dass sie in einer kontrollierten Art und Weise aufgebracht werden.
Bei der Tiefdruckbeschichtung wird ein Netzwerk von Vertiefungen, typischerweise eng beabstandete Zellen, in die Oberfläche eines Metallzylinders geätzt. Die Zellen werden mit Flüssigkeit gefüllt bzw. geladen und der rotierende Zylinder überträgt die Flüssigkeit auf ein Substrat. Die Zellen weisen ein definiertes Volumen auf, wodurch die Menge der Flüssigkeit begrenzt ist, die auf das Substrat übertragen werden kann. Typischerweise fasst ein Zylinder ein Volumen von ungefähr 30-50 μl/inch² der Zylinderoberfläche (ungefähr 4,5-8 μl/cm²). (In diesem Sinne bezeichnet "Zylinderoberfläche" eine glatte Oberfläche entsprechend des Oberflächengebietes des Substrats, das mit dem Zylinder in Berührung kommt. Sie beinhaltet nicht das zusätzliche Oberflächengebiet, das durch die Vertiefungen selbst bereitgestellt wird). Andere Volumenkapazitäten können ebenfalls verwendet werden. Die Vertiefungen sind im Allgemeinen in ihrer Größe gleichförmig ausgebildet und nahe beabstandet, so dass sie sich über die Übertragung der Flüssigkeitstropfen auf die Membran zu einer gleichförmigen Flüssigkeitsschicht verbinden.
Ein Tiefdruckbeschichtungssystem, das zum Ausführen der hierin beschriebenen Vorgänge verwendet werden kann, ist an dem Bezugszeichen 30 in 2 gezeigt (so, wie es hierin verwendet wird, beinhaltet das "Beschichten" einer Membran das Aufbringen eines Reagens derart, dass es über die Oberfläche hinaus eindringt und die gesamte Dicke der Membran imprägnieren kann.) Die laminierte Membran oder die "Lage" 32 wird von einer Rolle 34 zugeführt. Der Tiefdruckzylinder 36 besteht typischerweise aus Kupfer oder aus mit Kupfer ummanteltem Stahl oder Aluminium, wobei aus Gründen der Haltbarkeit eine dünne Chrom schicht oftmals aufgebracht ist. Wie oben beschrieben ist, ist in die Oberfläche des Zylinders eine Mehrzahl von kleinen Zellen geätzt, die dazu geeignet sind, eine definierte Menge einer Flüssigkeit aufzunehmen bzw. zu halten. Es wird ein Zylinder mit einem Muster von Vertiefungen ausgewählt, das zum Aufbringen einer gleichförmigen Beschichtung mit dem gegebenen Beschichtungssystem geeignet ist. Der Zylinder kann teilweise in ein Bad oder eine Schale der aufzubringenden Flüssigkeit eintauchen. Alternativ kann, wie es für das vorliegende Verfahren bevorzugt ist, eine Reagenzienkammer 38 verwendet werden, um die Reagenslösung an den Zylinder über Leitungen 40 zu liefern. Die Kammer schränkt ein, dass die Reagenzien der Atmosphäre ausgesetzt werden.
Wenn sich der Zylinder dreht, wird die überschüssige Lösung von dem Zylinder durch eine flexible Klinge 41 abgestrichen, die den Zylinder zwischen der Reagenskammer oder der Schale und der Membran 32 berührt. Die Lösung, die in den vertieften Zellen verbleibt, wird dann auf die gewünschte Oberfläche der Membran übertragen.
In einer Ausführungsform wird die Membran 32 in tangentialem Kontakt (d.h. sie kontaktiert einige Grad des Umfanges des Zylinders) mit dem Tiefdruckzylinder durch einen Aufnahmezylinder 42 gehalten, wobei dies ein Vorgang ist, auf den als Kuss-Tiefdruck Bezug genommen wird (kiss gravure). Alternativ kann das Gewebe zwischen dem Tiefdruckzylinder 36 und einem Druckzylinder oder Backup-Zylinder, wie er an dem Bezugszeichen 42' gezeigt ist, hindurchlaufen. Bei diesem Vorgang ist der Aufnahmezylinder 42 im Allgemeinen nicht vorhanden. In einem Offset-Tiefdruckvorgang (nicht gezeigt) wird die Flüssigkeit von dem Tiefdruckzylinder zu einer gummibeschichteten Übertragungsrolle übertragen, die dann die Lösung auf das Substrat aufbringt.
Das Substrat wird dann durch einen Trockner 44, bevorzugt ein IR-Trocknergebläse, geführt und auf einer Aufnahmerolle 46 aufgenommen. Die andere Oberfläche des Laminats wird dann in ähnlicher Weise beschichtet.
Der Tiefdruckbeschichtungsvorgang kann in einer direkten Weise ausgeführt werden, in der sich der Zylinder in der gleichen Richtung dreht, wie die Membranzufuhr. Alternativ ist bei Umkehr-Tiedruck, wie er in 2 dargestellt ist, die Rotationsrichtung des Zylinders entgegengesetzt der Bewegungsrichtung der Membran. Diese Anordnung führt zu einer Scherkraft, die auf die Lösung aufgebracht wird, wenn sie auf das Substrat übertragen wird, was zu einer glatteren Beschichtung führt.
Das Volumen der Reagenslösung, das auf die Membran aufgebracht wird, wenn es mit der Tiefdruckrolle in Berührung kommt, ist durch das Volumen der Zellen auf der Zylinderoberfläche begrenzt, wie oben bemerkt worden ist. Die Menge, die tatsächlich von den Zellen auf die Membran übertragen wird, ist abhängig von zusätzlichen Faktoren, wie beispielsweise der Zylindergeschwindigkeit, dem Rollendruck, der Gewebegeschwindigkeit und der Lösungskomponenten. Demgemäss kann die Menge, die auf die Membran übertragen wird, weiter kontrolliert werden durch geeignete Auswahl der Systemkonfiguration, der Kontaktzeit zwischen der Membran und dem Zylinder (bestimmt durch die Gewebegeschwindigkeit und die Richtung relativ zu der Tiefdruckrotationsgeschwindigkeit und der Tiefdruckrotationsrichtung) und dem Niveau grenzflächenaktiver Stoffe. Ein grenzflächenaktiver Stoff ist vorhanden, um die Übertragung der Lösung auf die Membranoberfläche zu erleichtern, da die Membranoberfläche andernfalls eine wässrige Lösung in Abhängigkeit von der Hydrophobizität des Membranmaterials abstoßen kann.
Für asymmetrische Membranen ist das Eindringen des Reagens in die Membranen ebenfalls abhängig von der Porengröße und der Porenverteilung. Beispielsweise unter Bezugnahme auf 1 wird die auf die Oberfläche 16 (großporig) aufgebrachte Lösung in einem wesentlich größeren Maße durch die Kapillarwirkung in die Membran gezogen werden, als die Lösung, die auf die Oberfläche 22 (kleinporig) aufgebracht wird.
Demgemäss erzeugt das Aufbringen eines kontrollierten Volumens der Reagenslösung auf eine Seite einer Membran an der äußeren Oberfläche eines Laminats gefolgt durch das Trocknen ein Laminat, in dem das Reagens nicht über jene Membran hinaus eindringt. Die kontrollierte Menge kann eine untersättigte Menge sein, d.h. ein Volumen der Lösung, das geringer ist als jenes, das, wenn es auf eine ausgewählte Membran aufgebracht werden würde, in die gesamte Membran durch Kapillarfluss eindringen würde. In einigen Fällen kann ein sättigendes oder annähernd sättigendes Volumen verwendet werden.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird eine Menge der Reagenslösung auf die Membran aufgebracht, um den gewünschten Betrag des Eindringens in die Dicke oder die Tiefe der Membran zu liefern. Durch gleichzeitiges Aufbringen der kontrollierten Menge der Lösung über die Breite der Membran stellt das Aufbringungsverfahren ebenfalls eine gleichmäßige Konzentration des Reagens über die Länge und die Breite der Membran bereit. Mit "gleichmäßig" ist gemeint, dass keine signifikanten Konzentrationsgradienten oder Änderungen über die Länge oder die Breite der Membran vorhanden sind. Diese Gleichmäßigkeit ist wirkungsvoll, um konsistente Testablesungen für Proben zu geben, die an unterschiedlichen Punkten auf der Oberfläche des Laminats vorhanden sind. Dem Aufbringen des Reagens und dem Trocknen folgend variiert die Menge des Reagens, die an verschiedenen Punkten der Oberfläche einer Membran in dem Laminat oder an unterschiedlichen Punkten auf einer gegebenen laminaren Oberfläche parallel zu dieser Oberfläche vorhanden ist, um nicht mehr als 5%.
Das Aufbringungsverfahren ist hilfreich für wärmeempfindliche Reagenzien, wo die Laminierung einer Membran mit dem Reagens unter normalen thermischen Laminierungsbedingungen eine nachteilige Änderung in dem Reagens und/oder in seiner Funktion in einem Test, der auf dem Laminat ausgeführt wird, erzeugen würde.
Eine derartige Änderung könnte eine Änderung in der Morphologie oder in der Verteilung des Reagens sowie chemische Änderungen in dem Reagens beinhalten.
Das Aufbringungsverfahren kann ebenfalls vorteilhaft verwendet werden, um eine kontrollierte Menge eines Reagens in einer gleichförmigen Weise auf eine einzelne Membran aufzubringen, indem die Oberfläche der Membran mit einer ebenen oder zylindrischen Unterlage mit einer Oberfläche mit einem Muster von Vertiefungen die mit der Lösung gefüllt sind, in Berührung gebracht wird. Die Unterlage ist wiederum typischerweise ein rotierender Tiefdruckzylinder, wie er oben beschrieben worden ist. Wie beim Beschichten von Laminaten findet das Aufbringen des Reagens durch dieses Verfahren bevorzugt gleichzeitig über die gesamte Breite der ersten Oberfläche der Membran statt, so dass demgemäss die Konzentration des Reagens im Wesentlichen gleichmäßig ist über die Länge und die Breite der Membran.
Die kontrollierte Menge des Reagens kann eine untersättigte Menge sein. Dem Aufbringen des Reagens und bevorzugt dem Trocknen folgend kommt das Reagens in einer Ausführungsform nicht mit der gegenüberliegenden Oberfläche der Membran in Kontakt, d.h. es dringt nur teilweise in die Tiefe der Membran ein. Das Verfahren ist gerade dann vorteilhaft, wenn eine sättigende Menge aufzubringen ist, d.h. es erzeugt eine Membran, in der die Reagenzien gleichmäßiger imprägniert sind verglichen zu Verfahren des Standes der Technik, wie z.B. das Eintauchen in eine sättigende Menge einer Lösung oder das Sprühbeschichten.
Die Erfindung stellt ebenfalls Membranen bereit, die mit Reagenzien in Übereinstimmung mit diesem Verfahren imprägniert sind. Von besonderem Interesse sind Membranen zur Verwendung in diagnostischen Testvorrichtungen.
Die Membranen können eine asymmetrische Membran mit einer kleinporigen Oberfläche und einer großporigen Oberfläche sein, wobei das Reagens auf die eine oder die andere Oberfläche aufgebracht werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagens Reagenzien, die wirksam sind, um gezielt Nicht-HDL-Lipoproteine aus einer flüssigen Blutprobe zu entfernen, die durch die Membran läuft. Alternativ umfasst das Reagens Reagenzien, die wirksam sind, um gezielt Nicht-HDL-(LDL- und VLDL-)-Lipoproteinteilchen in der Probe auszufällen bzw. zu präzipitieren und durch Filtration wird verhindert, dass die präzipitierten LDL- und VLDL-Teilchen durch die Membran laufen. Wenn die Membran eine asymmetrische Membran ist, wird das Reagens in diesen Ausführungsformen bevorzugt auf die großporige Oberfläche aufgebracht. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagens Reagenzien, die wirksam sind, um in der Membran ein optisch auswertbares Signal zu erzeugen, dass der Menge an mit HDL in Verbindung stehendem Cholesterin proportional ist. Wenn die Membran eine asymmetrische Membran ist, wird das Reagens in dieser Ausführungsform bevorzugt auf die kleinporige Oberfläche aufgebracht.
II. Membranlaminate
Gemäß eines anderen Aspektes stellt die Erfindung laminierte Membranen bereit, wobei die Membranen Reagenzien aufweisen, die in zumindest einer und bevorzugt in zwei Membranschichten imprägniert sind, wobei jedes Reagens (oder Reagenssysteme) auf seine jeweilige Schicht begrenzt ist. Im Allgemeinen enthalten unterschiedliche Schichten unterschiedliche Reagenssysteme. Bevorzugt wird das Reagens auf eine laminierte Membran in Übereinstimmung mit den Verfahren, die oben beschrieben worden sind, aufgebracht. Von besonderer Bedeutung sind Membranlaminate zur Verwendung in diagnostischen Versuchsvorrichtungen.
Ein derartiges Laminat umfasst eine erste und zweite laminierte Membran, die jeweils mit ersten und zweiten Reagenzien imprägniert ist und die an einer Laminatgrenzfläche verbunden sind. Zumindest eines der ersten und zweiten Reagenzien ist in einer laminaren Region der jeweiligen Membran angrenzend an die Laminatgrenzfläche nicht vorhanden, so dass die Reagenzien in den zwei Memb ranen durch zumindest jene laminare Region physikalisch voneinander getrennt sind.
Bevorzugter Weise ist die Konzentration jedes Reagens gleichmäßig über die Länge und Breite der jeweiligen Membran, die jenes Reagens enthält. Diese Gleichförmigkeit ist wirksam, um konsistente Testablesungen für Proben zu liefern, die auf verschiedenen Punkten auf der Oberfläche des Laminats vorhanden sind. Die Menge des Reagens, die an unterschiedlichen Punkten an der Oberfläche einer Membran in dem Laminat vorhanden ist oder die an unterschiedlichen Punkten auf einer gegebenen laminaren Oberfläche parallel zu dieser Oberfläche vorhanden ist, variiert bevorzugt um nicht mehr als ungefähr 5%.
In einer Ausführungsform ist das Laminat konstruiert, um beim Bestimmen des Niveaus des mit HDL in Verbindung stehenden Cholesterin in einer flüssigen Probe verwendet zu werden. Siehe z.B. Jones et al. mit der Publikationsnummer der US-Anmeldung 20030166291 und der US-Anmeldung mit der Seriennummer 10/410,671, die oben zitiert worden sind. In diesem Fall enthält die erste Membran Reagenzien, die wirksam sind, um gezielt Nicht-HDL-Lipoproteine aus der flüssigen Blutprobe zu entfernen, wenn sie durch die Membran läuft. Die Nicht-HDL-Lipoproteine können z.B. durch gezieltes Binden an ein enthaltenes Reagens oder durch Immobilisieren innerhalb der Membran entfernt werden. Alternativ oder in Ergänzung werden diese Komponenten durch selektive Präzipitation bzw. Fällung durch das Reagens entfernt und durch Filtration wird verhindert, dass sie durch die Laminatgrenzfläche in die zweite Membran wandern.
Derartige Reagenzien beinhalten polyanionische Verbindungen, wie beispielsweise sulfonierte Polysacharide, Heparin oder Phosphorwolfram in Kombination mit einem Kation der Gruppe II, wie z.B. Mg²⁺, Mn²⁺ oder Ca²⁺. Ein bevorzugtes Reagens ist ein sulfoniertes Polysacharid, wie beispielsweise Dextransulfat mit einem typischen Molekulargewicht von 50-500 kDa in Kombination mit Magnesi umazetat oder -chlorid, das optional gepuffert ist, um einen neutralen pH-Wert zu erhalten. Die Reagenzien können ebenfalls in der Membran immobilisiert sein.
Die HDL-Testmembran enthält Reagenzien zur Quantifizierung des mit HDL in Verbindung stehenden Cholesterin, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Siehe z.B. die US-Patente mit den Nummern 5,213,964, 5,213,965, 5,316,196 und 5,451,370 der gleichen Anmelderin, die jeweils hierin durch Referenz aufgenommen sind. Typischerweise umfassen die Testreagenzien Cholesterinesterase zum Freigeben des Cholesterins von dem HDL, Cholesterinoxidase zum Erzeugen von H₂O₂ durch Reaktion mit freiem Cholesterin, Peroxidase und ein gekoppeltes Farbstoffsystem, das beim Vorhandensein von Peroxidase und H₂O₂ zu einem Reaktionsprodukt in Form eines unterscheidbaren Farbsignals führt. Die Testreagenzien zum Quantifizieren von anderen Blutkomponenten, wie z.B. Gesamt-Cholesterin, Triglyceride oder Glukose, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen häufig ähnliche Enzyme/gekoppelte Farbstoffsysteme.
Zumindest die erste Membran ist bevorzugt eine asymmetrische Membran mit einer kleinporigen Oberfläche und einer großporigen Oberfläche. Die kleinporige Oberfläche zeigt bevorzugt zu der Laminatgrenzfläche, so dass sich die großporige Oberfläche an der äußeren Oberfläche des Laminats befindet. Diese Orientierung gestattet freien Zugang der Probe in die Membran durch die großen Poren und verhindert den Durchgang jeglicher präzipitierter bzw. ausgefällter oder anderer fester Materialien durch die kleinen Poren. Die zweite Membran kann ebenfalls eine asymmetrische Membran sein, wobei ihre großporige Oberfläche bevorzugt zur Laminatgrenzfläche zeigt und die kleinporige Oberfläche an der anderen Oberfläche des Laminats angeordnet ist. Durch diese Orientierung dient die gleichmäßigere Oberfläche der Membran dem optischen Abtasten und der Quantifizierung der Testergebnisse.
Die Präparation von asymmetrischen Membranen ist z.B. beschrieben in den US-Patenten mit den Nummern 4,629,563, 5,171,445, 5,886,059, 5,536,408, 5,562,826 und 4,774,192; in D.R. Lloyd "Material Science of Synthetic Membranes", ACS Symposium 269:1-21 (1985). Sie sind in einer Vielzahl von Porengrößen und Porengrößenverhältnissen kommerziell erhältlich. Materialien zur Herstellung umfassen Polysulfone, Polyethersulfone, Polyamide, Polyetheramide, Polyurethane, Zelluloseazetat, Polyvinylpyrrolidon, Polysterole und modifizierte Polysterole sowie Mischungen, Kopolymere und Laminarverbundstoffe. Zur weiteren Beschreibung von bevorzugten Membrantypen siehe z.B. die US-Anmeldung mit der Publikationsnummer 20030166291 und die US-Anmeldung mit der Seriennummer 10/410,671, die oben zitiert worden sind. Eine beispielhafte asymmetrische Membran ist eine Polysulfon- oder eine Polyethersulfon-Membran, wie z.B. die BTS 83-Membranen, die durch die Pall Corporation (San Diego, Kalifornien) bereitgestellt werden.
In dem beispielhaften HDL-Testlaminat weist jede Membran typischerweise eine Dicke von ungefähr 100-150 μm und eine Absorptionskapazität von ungefähr 80 μl/in² (ungefähr 12,4 μl/cm²) auf. Minimale Porengrößen variieren typischerweise von 0,01 bis 10 μm mit Verhältnissen von maximaler zu minimaler Porengröße von bis zu 100 oder mehr.
In einer Ausführungsform umfasst das Laminat zumindest ein Reagens, das hitzeempfindlich ist, so dass das Laminieren einer Membran mit diesem Reagens auf eine weitere Membran eine nachteilige Änderung in dem Reagens erzeugt. Die nachteilige Änderung könnte irgendeine oder alle oder eine Änderung in der Morphologie, der Verteilung oder der tatsächlichen chemischen Struktur des Reagens beinhalten. Derartige Laminate werden vorteilhafterweise durch die Verfahren zum Aufbringen des Reagens präpariert, wie sie hierin beschrieben sind.
III. Testvorrichtungen
Membranlaminate zur Verwendung in diagnostischen Versuchen, wie z.B. das HDL-Testlaminat, das hierin beschrieben ist, sind typischerweise in einer Testvor richtung zur einfachen Verwendung eingebaut. Die Erfindung stellt demgemäss eine Testvorrichtung mit Membranlaminaten, wie sie hierin beschrieben sind, bereit. Dies ist z.B. eine Testvorrichtung zum Untersuchen von HDL in einer Blut- oder Serumprobe aufweisend:

(a) ein Substrat mit einer Probenaufnahmevertiefung zum Aufnehmen eines Aliquots einer flüssigen Blutprobe,
(b) ein Membranlaminat umfassend eine erste und eine zweite laminierte Membran, die an einer Laminatgrenzfläche verbunden sind, und
(c) einen Filter zwischen der Probenaufnahmevertiefung und der ersten Membran des Laminats zum Entfernen roter Blutkörperchen in der Probe, wenn sich die Probe von der Probenaufnahmevertiefung zu dem Laminat bewegt.

Das Membranlaminat von (b) ist ein Laminat, wie es oben beschrieben ist, in dem die erste Membran mit Reagenzien imprägniert ist, die wirksam sind, um gezielt Nicht-HDL-(LDL- und VLDL-)-Lipoproteinteilchen in dieser Probe zu präzipitieren bzw. auszufällen, und durch Filtration wird verhindert, dass die präzipitierten LDL- und VLDL-Teilchen durch die Laminatgrenzfläche laufen. Die zweite Membran ist mit Reagenzien imprägniert, die wirksam sind, um ein optisch bestimmbares Signal in der zweiten Membran zu erzeugen, das der Menge der mit dem HDL in Verwindung stehenden Cholesterin proportional ist. Das Reagens in zumindest einer dieser Membranen ist in einer laminaren Region jener Membran angrenzend an die Laminatgrenzfläche nicht vorhanden, so dass die Reagenzien in den zwei Membranen durch zumindest jene laminare Region physikalisch voneinander getrennt sind. Es ist insbesondere bevorzugt, dass die HDL-Testreagenzien in einer laminaren Region der zweiten Membran angrenzend an die Laminatgrenzfläche nicht vorhanden sind.
Bevorzugter Weise ist die Konzentration jedes Reagens über die Länge und die Breite der Membran, die das Reagens enthält, gleichmäßig, wie es oben beschrieben ist. Die Membranen sind bevorzugt asymmetrische Membranen, die so orientiert sind, wie es oben beschrieben ist, wobei die äußere Oberfläche der Reagensmembran die großporige Oberfläche (die trübe Oberfläche) und die äußere Oberfläche der Testmembran die kleinporige Oberfläche (die glänzende Oberfläche) ist.
Die Probenvertiefung, der Filter und das obige Laminat von (a)–(c) sind oder können in Flüssigkeitskontakt miteinander angeordnet sein. Zum Beispiel können sich diese Elemente auf einem gemeinsamen Substrat befinden oder sie können sich auf einem oder mehreren getrennten Substraten befinden und in Flüssigkeitskontakt während des Durchlaufs des Tests gebracht werden. Unterschiedliche Ausführungsformen von derartigen Testvorrichtungen umfassen jene, die in Jones et al. in der US-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 20030166291 und der US-Anmeldung mit der Seriennummer 10/410,671, die oben zitiert worden sind, beschrieben sind.
Eine Ausführungsform ist in 3 gezeigt. Die Vorrichtung 50 umfasst einen Hauptkörper oder einen Träger 52, der die Probenvertiefung 54 definiert. Die Vertiefung ist in Flüssigkeitskontakt mit einem Siebkissen 60, das in einer gekerbten Region 58 gehalten werden kann, die an dem oberen Rand des Trägers gebildet ist. Der Flüssigkeitskontakt kann direkt sein oder, wie in der Vorrichtung der 3 gezeigt, durch eine kapillare Leitung 56 bereitgestellt sein, die in der Platte an der Basis der Vertiefung ausgebildet ist. Der Träger ist bevorzugter Weise eine Kunststoffplatte mit der Vertiefung der gekerbten Region und/oder kapillar gebildet durch Standardspritzguss- oder bearbeitende Verfahren.
Das in der Region 58 getragene Siebkissen 60 arbeitet, um teilweise große, aus Partikeln bestehende Stoffe (umfassend Blutkörperchen) zu entfernen, wenn die Probe durch die Kissenmatrix in einer Von-Unten-Nach-Oben-Richtung wandert, wie es in der Figur gezeigt ist. Das Kissen 60 wird bevorzugt durch eine Glasfasermatrix eines Materials gebildet, das konstruiert ist, um wässrige Flüssigkeiten durch die Oberflächenbenetzung abzuziehen und um die Bewegung der Blutkörperchen zu verzögern, wenn die Blutprobe durch die Matrix gezogen wird. Ein beispielhaftes Kissen ist ein Glasfaserfilter, wie beispielsweise ein GF/D oder ein PD008-Filter, der durch Whatman geliefert wird. Das Kissen ist dimensioniert, um ein definiertes Volumen der Probenflüssigkeit zu absorbieren, z.B. ungefähr 15–25 μl. Das Siebkissen 60 kann zusätzlich Reagenzien zum Fangen von roten Blutkörperchen enthalten, wie zum Beispiel Lektine, Antikörper, die für rote Blutkörperchen spezifisch sind, Proteine, Trombin oder Ionen-Austauschagenzien.
Das Siebkissen 60 steht umgekehrt in Kontakt mit dem länglichen Streifen oder der Probenverteilungsmatrix 62, die sich entlang des oberen Randes der Platte 52 erstreckt. Dieser Streifen kann ebenfalls durch Schaumpolsterungen oder andere Unterstützungen gestützt werden. Die Matrix 62 dient dem Verteilen der Probenflüssigkeit von einer zentralen Probenauftragungsregion 64, die sich im Flüssigkeitskontakt mit dem Kissen 60 befindet, zu Probensammelregionen, wie beispielsweise 66, 68, innerhalb der Matrix. Die Matrix wird bevorzugt aus Glasfasern gebildet. Die Packungsdichte und die Dicke der Matrix sind derart, dass sie Volumina der Probenflüssigkeit, z.B. 10–25 μl absorbieren und verteilen, die von der Probenauftragungsregion des Streifens zu den Probensammelregionen des Streifens geliefert worden sind. Ein beispielhaftes Streifenmaterial ist ein F-165-25A-Glasfaserfilter, der bei Whatman erhältlich ist und eine Packungsdichte von ungefähr 0,2 g/cm³ und eine Dicke von ungefähr 0,12 mm aufweist.
Die Vorrichtung 50 umfasst ebenfalls einen Reaktionsbalken 70, der aus einem länglichen Träger 72 und aus einem oder mehreren mehrfach benetzbaren, absorbierenden Reaktionsteststreifen, gezeigt an den Bezugsziffern 74, 76, 78 und 80, zusammengesetzt ist, die an der unteren Oberfläche des Trägers getragen werden, wie es gezeigt ist. Die Elemente 74 und 86 bilden ein Membranlaminat, wie es hierin beschrieben ist, wobei 74 die HDL-Testmembran und 86 die Reagensmembran ist.
Der Träger 72 ist durchsichtig oder weist Fenster oder Öffnungen auf, die das Betrachten der Kissen durch den Träger gestatten. Jedes in einem speziellen Test verwendete Testkissen enthält analytabhängige Reagenzien, die wirksam sind, um eine analytabhängige Änderung in dem Kissen zu erzeugen, die in einer bekannten Weise wahrgenommen werden kann.
Der Reaktionsbalken ist an dem Träger 52 über Befestigungsmittel befestigt, die wirksam sind, um (a) die Vorrichtung in einer Probenverteilungsposition zu halten, wobei das Laminat aus Testmembran und Reagensmembran von der Probenverteilungsmatrix beabstandet ist, und um (b) die Vorrichtung zu einer Testposition zu bewegen, wo das Laminat aus Testmembran und Reagensmembran und die Probenverteilungsmatrix im Flüssigkeitsaustausch stehen. Die Befestigungsmittel können ebenfalls dazu verwendet werden, um einen derartigen Flüssigkeitsaustausch zu unterbrechen, nachdem eine gewünschte Menge der Probe in die Testkissen eingetreten ist und/oder nach einer bestimmten Kontaktzeit, indem die Vorrichtung von der Testposition zu einer Position bewegt wird, in der der Teststreifen (die Teststreifen) nicht im Flüssigkeitsaustausch mit der Probenverteilungsmatrix stehen (die die gleiche sein kann, wie die "Probenverteilungs"-Position). Ein derartiges Bewegen kann durch das Überwachen der Reflektion an der oberen Oberfläche des Testkissens gesteuert werden, die das Ausmaß der Benetzung wiedergibt, wie es in dem US-Patent mit der Nummer 5,114,350 der gleichen Anmelderin beschrieben ist. Wenn die Absorptionskapazität und die Rate der Probenaufnahme des Kissenmaterials bekannt sind, kann alternativ die Menge der Probe mit ausreichender Genauigkeit unter Verwendung einer vorbestimmten Kontaktzeit gesteuert werden.
Die Befestigungsmittel können z.B. ein Paar federnder Glieder umfassen, wie beispielsweise elastomerische Blöcke 82, 84, die derart wirken, dass sie das La minat aus Testmembran und Reagensmembran in Richtung einer Nicht-Bewegungs- oder Probenverteilungsposition vorspannen, in der das Laminat von der Probenverteilungsmatrix beabstandet ist. Durch Kompression oder Lösen der federnden Glieder kann gezielt der Flüssigkeitsaustausch zwischen der Probenverteilungsmatrix 62 und dem Laminat hergestellt werden und getrennt werden. Der Flüssigkeitsaustausch kann über direkten Kontakt oder durch ein zwischengeordnetes Element stattfinden. Die Unterstützungsblöcke können mit Hilfe von Federn oder einer kolbenähnlichen Bewegung komprimiert werden.
Alternativ können externe mechanische Vorrichtungen mit dem Hauptkörper 52 und/oder dem Träger 62 in Eingriff gebracht werden und zueinander bewegt werden. Ein beispielhaftes System ist der Cholestech LDX^®-Analysierer, der einen abgeschlossenen automatisierten Analysierer darstellt, der zur Verwendung in Verbindung mit Testvorrichtungen, wie sie beispielsweise hierin beschrieben sind, vorteilhaft verwendet wird.
BEISPIELE
Beispielhafte HDL-Testlaminate wurden durch Tiefdruckbeschichtung angefertigt, wie es hierin offenbart ist, und HDL-Versuche mit bekannten Standards wurden unter Verwendung der Laminate durchgeführt. Die Daten zeigten exzellente Genauigkeit und demonstrierten die Effektivität des offenbarten Vorgangs zum Aufbringen kontrollierter und gleichmäßiger Mengen der Testreagenzien.
Das verwendete Membranlaminat war ein Laminat von zwei BTS-83 asymmetrischen Polysulfonmembranen, wie sie durch die Pall Corporation, San Diego, Kalifornien, angefertigt werden, die mit der kleinporigen (glänzenden) Seite einer Membran die großporige (stumpfe) Seite der zweiten Membran berührend laminiert sind. Zum Beschichten wurden Breiten bis zu ungefähr 5 Inches verwendet.
Standardfällungen und Mischungen für HDL-Testreagenzien wurden verwendet. Die Präzipitationslösung umfasste 3,9 mg/ml Dextransulfat (500.000 MW) und 7,9 mM Mg (OAc)₂ in Wasser. Ein grenzflächenaktiver Stoff bzw. ein Tensid (Pluronic L64, hergestellt durch die BASF auf einem Niveau von 0,05 %) wurde ebenfalls hinzugefügt, um das Aufnehmen auf die Membran zu erleichtern. Die Reagenzlösung für den HDL-Test enthielt 80,3 U/ml Cholesterinoxidase, 473 U/ml Cholesterinesterase, 440 U/ml Meerrettich-Peroxidase, 4,14 mg/ml 4-Aminoantipyrin und 26,5 mg/ml TOOS (3-[Ethyl(3methylphenyl)amino]-2-hydroxypropanschwefelsäure) in Wasser mit 2 mg/ml CHAPS, das als Tensid hinzugefügt worden ist.
Es wurde eine Flexodruckmaschine mit Gravürezylinder bzw. Tiefdruckzylinder verwendet, um ein konstantes Volumen der Reagenslösung auf eine Gummiwalze aufzubringen, die mit dem Membranlaminat in Berührung war (Offset-Tiefdruckverfahren). Der für dieses Experiment verwendete Zylinder war eine 65 Linien/Inch, 30 BCM-Walze, wobei sich BCM auf Milliarde Kubikmikron (billion cubic microns) bezieht oder auf Mikroliter pro Quadratinch der Oberfläche.
Die Fällungsreagenzien wurden zuerst auf die stumpfe Seite der ersten Membran aufgebracht. Dem Aufbringen folgend wurde die Membran mit einem IR-Trocknergebläse getrocknet. Die HDL-farbmetrischen Testreagenzien wurden dann auf die glänzende Seite der zweiten Membran des Laminats in einer ähnlichen Weise aufgebracht und mit einem IR-Trocknergebläse getrocknet.
Die folgenden HDL-Testdaten stammen von laminierten Membranen, die gemäß der obigen Beschreibung erstellt worden sind, in 0,22 Inch-Abschnitte geschnitten wurden und in Testkassetten angeordnet worden sind, wie es in der US-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 20030166291 und in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 10/410,671, die oben zitiert worden sind, beschrieben ist. Die Versuche wurden gemäß den Standardverfahren durchgeführt. Die Proben (8 HDL-Standards) wurden in einem LDX^®-Analysierer analysiert und der Mittelwert von 8 Kassetten wurde für jeden Standard genommen. Es wurde eine exzellente Genauigkeit und Korrelation mit den Standardwerten erhalten.
In dem für das obige Experiment verwendeten Tiefdruckvorgang wurden bis zu vier Durchläufe der Reagenzlösung auf jede Seite der Membran aufgebracht. Das Beschichtungsgewicht für jeden Durchlauf wurde durch den Gewichtsverlust der Beschichtungslösung bestimmt und eine gute Übereinstimmung wurde von einem Durchlauf zum nächsten beobachtet.
Es wurde herausgefunden, dass ein direkter Tiefdruckvorgang die Lösung effizienter aufbringt als der Offset-Vorgang, weil im Allgemeinen wiederholte Durchläufe für dieses System unnötig werden. In einem bevorzugten Vorgang dreht sich der Tiefdruckzylinder in einer Richtung entgegengesetzt zu der Zufuhrrichtung des Gewebes (d.h. umgekehrter Tiefdruck, wie er in 2 gezeigt ist) und das Gewebe berührt den Zylinder ohne einen Andruckzylinder (Kuss-Tiefdruck, wie er an dem Bezugszeichen 42 in 2 gezeigt ist). Ein Zylinder mit einem Muster von Vertiefungen wurde ausgewählt, der wirksam ist, um eine gleichförmige Beschichtung mit dem gegebenen Beschichtungssystem aufzubringen.
Membrane wurden unter Verwendung des Umkehrtiefdruckvorgangs bzw. des Kuss-Tiefdruckvorgangs beschichtet mit Gewebegeschwindigkeiten von 5–10 ft/min und mit Rotationsgeschwindigkeiten des Zylinders von ungefähr 2 mal der Gewebegeschwindigkeit für das Beschichten mit Präzipitationsreagenzien und mit ungefähr der gleichen wie der Gewebegeschwindigkeit für das Beschichten mit HDL-Testreagenzien. Die in diesen Durchläufen auf die Membran aufgebrachte Lösungsmenge umfasst im Allgemeinen ungefähr 65% des Sättigungsvolumens für die Fällungsreagenzien und ungefähr 45% des Sättigungsvolumens für die HDL-Testreagenzien.

Claims

Ein Verfahren zum Aufbringen eines Reagens auf eine Membran (12, 14) in einem Membranlaminat (10), wobei das Verfahren aufweist: (a) Bereitstellen eines Laminats (10) einer ersten (12) und einer zweiten Membran (14), wobei das Laminat (10) eine äußere erste Membranoberfläche (16), eine laminierte erste Membranoberfläche (18), eine laminierte zweite Membranoberfläche (20) und eine äußere zweite Membranoberfläche (22) aufweist; (b) Aufbringen eines kontrollierten Volumens einer Lösung eines ersten Reagens auf die äußere erste Membranoberfläche (16) durch in Kontakt bringen der Oberfläche (16) mit einer Unterlage (34) mit einer Oberfläche, die ein Muster aufweist, und (c) Trocknen der ersten Membran (12) in dem Laminat (10), um ein Laminat (10) herzustellen, das die mit dem ersten Reagens imprägnierte erste Membran (12) enthält, wobei das erste Reagens die zweite Membran (14) in dem Laminat (10) nicht berührt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Muster Vertiefungen aufweist, die mit der Lösung gefüllt sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Muster Vorsprünge aufweist, die die Lösung aufbringen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Unterlage (34) eine ebene oder zylindrische Form aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die kontrollierte Menge eine untersättigende Menge ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, weiterhin aufweisend: (d) Aufbringen eines kontrollierten Volumens einer Lösung des zweiten Reagens auf die äußere zweite Membranoberfläche (22) durch in Kontakt bringen der Oberfläche (22) mit einer festen Unterlage (34), die mit der Lösung gefüllte Vertiefungen aufweist, und (e) Trocknen der zweiten Membran (14) in dem Laminat (10), um ein Laminat (10) herzustellen, das die mit dem zweiten Reagens imprägnierte zweite Membran (14) enthält, wobei das zweite Reagens die erste Membran (12) in dem Laminat (10) nicht berührt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die kontrollierte Menge von (d) eine untersättigende Menge ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das zweite Reagens die laminierte zweite Membranoberfläche (20) nicht berührt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei zumindest die erste Membran (12) eine asymmetrische Membran mit einer kleinporigen Oberfläche und einer großporigen Oberfläche ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die äußere erste Membranoberfläche (16) die großporige Oberfläche ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die zweite Membran (14) eine asymmetrische Membran mit einer kleinporigen Oberfläche und einer großporigen Oberfläche ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die äußere zweite Membranoberfläche (22) die kleinporige Oberfläche ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Unterlage (34) ein rotierender Tiefdruck- bzw. Gravürezylinder ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das erste Reagens Reagenzien umfasst, die wirksam sind, um gezielt Nicht-HDL-Lipoproteine aus einer flüssigen Blutprobe, die sich durch die erste Membran (12) bewegt, zu entfernen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das erste Reagens Reagenzien umfasst, die wirksam sind, um gezielt Nicht-HDL-Lipoproteinteilchen aus einer flüssigen Blutprobe auszufällen, wodurch durch Filtration verhindert wird, dass die ausgefällten Teilchen durch die laminierte erste Membranoberfläche (18) wandern.
Das Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das zweite Reagens Reagenzien umfasst, die wirksam sind, um ein optisch wahrnehmbares Signal in der zweiten Membran (14) zu erzeugen, das einer Menge des mit HDL in Verbindung stehenden Cholesterin proportional ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Aufbringen gleichzeitig über die gesamte Breite der ersten äußeren Membranoberfläche (16) stattfindet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das erste Reagens wärmeempfindlich ist, so dass das Laminieren einer dieses Reagens enthaltenden Membran (12) auf eine weitere Membran (14) eine nachteilige Änderung in dem Reagens erzeugt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das zweite Reagens wärmeempfindlich ist.
Ein Verfahren zum Aufbringen eines Reagens auf eine Membran (12), wobei das Verfahren aufweist: Aufbringen eines kontrollierten Volumens einer Lösung des Reagens auf eine erste Oberfläche (16) der Membran (12) durch in Kontakt bringen der Oberfläche (16) mit einer Unterlage (34), die eine Oberfläche mit einem Muster aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das Muster Vertiefungen aufweist, die mit der Lösung gefüllt sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das Muster Vorsprünge aufweist, die die Lösung aufbringen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Unterlage (34) eine ebene oder zylindrische Form aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die kontrollierte Menge eine untersättigende Menge ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Membran (12) eine asymmetrische Membran mit einer kleinporigen und einer großporigen Oberfläche ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die erste Oberfläche (16) die großporige Oberfläche ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die erste Oberfläche (16) die kleinporige Oberfläche ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Unterlage (34) ein rotierender Tiefdruckzylinder ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei das Aufbringen gleichzeitig über die gesamte Breite der ersten Oberfläche (16) der Membran (12) stattfindet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei nach dem Aufbringen die Konzentration des Reagens gleichmäßig über die Länge und die Breite der Membran (12) ist.
Ein Membranlaminat (10) zur Verwendung in einer diagnostischen Testvorrichtung (50), aufweisend: eine erste (12) und eine zweite laminierte Membran (14), die an einer Laminatgrenzfläche verbunden sind, wobei die erste Membran (12) in dem Laminat (10) mit einem ersten Reagens imprägniert ist, die zweite Membran (14) mit einem zweiten Reagens imprägniert ist, und das Reagens in zumindest einer der Membranen (12, 14) in einer laminaren Region jener Membran (12, 14) angrenzend an die Laminatgrenzfläche nicht vorhanden ist, so dass die Reagenzien in den zwei Membranen (12, 14) durch zumindest jene laminare Region physikalisch voneinander getrennt sind.
Das Membranlaminat (10) gemäß Anspruch 31, wobei die Konzentration jedes Reagens gleichförmig über die Länge und die Breite der Membran (12, 14) ist.
Das Membranlaminat (10) gemäß Anspruch 31, wobei zumindest die erste Membran (12) eine asymmetrische Membran mit einer kleinporigen (20) und einer großporigen Oberfläche (16) ist.
Das Membranlaminat (10) gemäß Anspruch 33, wobei die kleinporige Oberfläche (20) zu der Laminatgrenzfläche zeigt.
Das Membranlaminat (10) gemäß Anspruch 34, wobei die zweite Membran (14) eine asymmetrische Membran mit einer kleinporigen Oberfläche (22) und einer großporigen Oberfläche (18) ist.
Das Membranlaminat (10) gemäß Anspruch 35, wobei die großporige Oberfläche (18) zur Laminatgrenzfläche zeigt.
Das Membranlaminat (10) gemäß Anspruch 31, wobei zumindest eins der Reagenzien hitzeempfindlich ist, so dass das Laminieren einer Membran (12) mit diesem Reagens auf eine weitere Membran (14) eine nachteilige Änderung in dem Reagens erzeugt.
Das Membranlaminat (10) gemäß Anspruch 31, wobei das erste Reagens Reagenzien enthält, die wirksam sind, um gezielt Nicht-HDL-Lipoproteine aus der flüssigen Blutprobe zu entfernen, wenn sie durch die erste Membran (12) wandert.
Das Membranlaminat (10) gemäß Anspruch 31, wobei das erste Reagens Reagenzien umfasst, die wirksam sind, um gezielt LDL- und VLDL-Lipoproteinteilchen in der Probe zu präzipitieren bzw. auszufällen und wobei durch Filtration verhindert wird, dass die präzipitierten LDL- und VLDL-Teilchen durch die Laminatgrenzfläche wandern.
Das Membranlaminat (10) gemäß Anspruch 39, wobei das zweite Reagens Reagenzien aufweist, die wirksam sind, um ein optisch feststellbares Signal in der zweiten Membran (14) zu erzeugen, das der Menge dem mit dem HDL in Verbindung stehenden Cholesterin proportional ist.
Eine Testvorrichtung (50) zum Untersuchen von HDL in einer Blut- oder Serumprobe, aufweisend: (a) einen Träger (52) mit einer Probenaufnahmevertiefung (54) zum Aufnehmen eines Aliquots der Probe, (b) ein Membranlaminat (74, 86), umfassend eine erste (86) und eine zweite laminierte Membran (74), die an einer Laminatgrenzfläche verbunden sind, wobei (i) die erste Membran (86) in dem Laminat (74, 86) mit Reagenzien imprägniert ist, die wirksam sind, um gezielt LDL- und VLDL-Lipoproteinteilchen in der Probe zu präzipitieren, und wobei durch Filtration verhindert wird, dass die präzipitierten LDL- und VLDL-Teilchen durch die Laminatgrenzfläche wandern; (ii) die zweite Membran (74) mit Reagenzien imprägniert ist, die wirksam sind, um ein optisch wahrnehmbares Signal in der zweiten Membran (74) zu erzeugen, das der Menge an mit HDL in Verbindung stehendem Cholesterin proportional ist; und (iii) das Reagens in zumindest einer der Membranen (74, 86) in einer laminaren Region jener Membran (74, 86) angrenzend an die Laminatgrenzfläche nicht vorhanden ist, so dass die Reagenzien in den zwei Membranen (74, 86) durch zumindest jene laminare Region physikalisch voneinander getrennt sind, und (c) einen Filter (60) zwischen der Probenaufnahmevertiefung (54) und der ersten Membran (86) des Laminats (74, 86) zum Entfernen roter Blutkörperchen der Probe, wenn sich die Probe von der Probenaufnahmevertiefung (54) zu dem Laminat (74, 86) bewegt, wobei sich die Vertiefung (54), der Filter (60) und das Laminat (74, 86) in Flüssigkeitsaustausch miteinander befinden oder angeordnet werden können.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 41, wobei die Konzentration jedes der Reagenzien gleichmäßig über die Länge und Breite der Membran (74, 86) ist.