JP2005509882A - 細胞分析のための光バイオディスクおよび流体回路ならびにそれに関連する方法 - Google Patents

細胞分析のための光バイオディスクおよび流体回路ならびにそれに関連する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、臨床診断のための光バイオディスク、方法、および光ディスクドライブを対象とする。本発明はさらに、オンディスクのサンプル調製および処理、捕捉領域への前処理済みサンプルの供給、捕捉領域に結合していないサンプルの部分の除去、および結合した細胞の計数を含む、生体サンプルにおける特定の型の血球の量を測定する方法を対象とする。また、光バイオディスクにおいてクラスタ指定マーカ検定に用いるための血液サンプルを処理する流体回路も開示される。

Description

［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、包括的には、生物学的検定法および診断検定法（diagnostic assay）に関し、特に、光バイオディスク上で行うこのような検定に関する。詳細には、本発明はさらに、細胞検定および関連の光バイオディスクシステムで用いるサンプル調製方法に関する。ただし、本発明は、実施の最良の形態に従って後述する特定の実施の形態に限定されるものではない。
［関連出願の相互参照］
この出願は、２００１年１１月２０日に出願された米国特許出願第０９／９８８，７２８号の部分継続出願である。
また、この出願は、２００２年１月１７日に出願された米国仮出願第６０／３４９，３９２号、２００２年１月１８日に出願された米国仮出願第６０／３４９，４４９号、２００２年２月５日に出願された米国仮出願第６０／３５５，６４４号、２００２年２月１９日に出願された米国仮出願第６０／３５８，４７９号、および２００２年５月２２日に出願された米国仮出願第６０／３８２，３２７号からの優先権の利益も主張する。これらの出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
本発明は、本発明の譲受人に譲渡され、同時係属中の以下の特許出願に開示されたディスク、検定法、およびシステムのいずれとも組み合わせて有利に使用することができる。その以下の特許出願とは、すなわち、２００１年７月３日に出願された「Clinical Diagnostic Optical Bio-Disc And Related Methods For Selection And Detection Of Lymphocytes Including Helper-Inducer/Suppressor-Cytotoxic Cells」と題する米国仮出願第６０／３０２，７５７号、２００１年７月１７日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３０６，０３５号、２００１年７月１７日に出願された「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３０５，９９３号、２００１年７月１９日に出願された「Methods for Imaging Blood Cells, Blood-Borne Parasites and Pathogens, and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３０６，５９２号、２００１年７月２３日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３０７，２６３号、２００２年８月３０日に出願された「Capture Layer Assemblies for Cellular Assays Including Related Optical Analysis Discs and Methods」と題する米国特許出願第１０／２３３，３２２号、および２００２年９月６日に出願された「Nuclear Morphology Based Identification and Quantification of White Blood Cell Types Using Optical Bio-Disc Systems」と題する米国特許出願第１０／２３６，８５７号である。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
２．関連技術の説明
血球計数は、診断、処置、および患者の健康を判断するための追跡調査の期間中に使用される。全血球計数（ＣＢＣ（complete blood count））は、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球容積、血小板
計数、および白血球計数を含む試験の集合体である。血球計数は、１立方ｍｍの全血あたりの赤血球および白血球を数えあげることである。
白血球計数（ＷＢＣ（white blood cell count）、白血球）は、血液の標準サンプルの白血球の総数である。正常な健康人では、通常、ＷＢＣ計数は、１マイクロリットル（μｌ）あたり４０００〜１０８００個の細胞である。例えば運動、ストレス、および病気といった要因により、これらの値は影響を受ける可能性がある。ＷＢＣが高いということは、感染症、白血病、または組織の損傷を示すことがある。ＷＢＣ計数が１マイクロリットルあたり１０００個の細胞未満になると、感染症の危険が増加する。
分画白血球計数試験（leukocyte differential testing）は、白血球計数自体から得ることができる情報を越える多くの情報を収集するのに不可欠である。分画白血球計数は、疑わしい新たな感染症または熱（ＣＢＣが正常な場合であっても）、異常に関連した疾患の疑い、異常な白血球計数、疑いのある白血病、および例えば好酸球増加症、単球増加症、または好塩基球増加症といった他の異常を見極めるのに使用される。重度の白血球減少症がある場合（例えば薬物治療の副次的なものとして）には、白血球または分画白血球計数の試験が、繰り返し実行されることがある。処置の間、例えば化学治療または放射線治療の間、その処置が、癌細胞に加えて健康な血球を欠乏させているかどうかを判断するのに、血球計数は非常に重要である。化学治療は、血球の産生に影響を与えるので、血液中のさまざまな種類の細胞の量をチェックすることは重要である。
分画白血球計数は、コンピュータ化された細胞計数計測装置によって求めることができる。このような装置は、５つの主要な白血球の型の総計数および割合を求める。正常な個人では、大多数の好中球（５０〜６０％）、それに次ぐリンパ球（２０〜４０％）、次いで単球（２〜９％）が、わずかな好酸球（１〜４％）および好塩基球（０．５％〜２％）と共に存在する。
リンパ球のカテゴリ内では、さらに、細胞のサブタイプが存在する。例えば、リンパ球は、大きくは、Ｔ細胞（胸腺由来リンパ球）およびＢ細胞（滑液等価リンパ球（bursal-equivalent lymphocyte））に分けることができる。Ｔ細胞およびＢ細胞は、主として、それぞれ細胞免疫および体液性免疫を担っている。白血球内のグループを分類するのに、形態学的特徴が使用されてきたが、形態だけでは、リンパ球のサブタイプの多くの機能を区別するのに不十分であることが分かってきた。さまざまな機能を有するリンパ球を区別するために、ロゼット（rosetting）による分析、免疫蛍光顕微鏡検査による分析、酵素組織化学による分析、および特異的な細胞表面のマーカに対する最近のモノクローナル抗体による分析を含む技法が開発された。
Ｔ細胞は、例えばＣＤ４およびＣＤ８といった主な２つの細胞表面抗原の一方が存在することによりさらに区別されることが多い。ＣＤ４＋型細胞は、ヘルパＴ細胞と呼ばれ、抗体免疫に関与する。これらのＴ細胞は、Ｂ細胞によって提示された抗原に結合して、プラズマ細胞のクローンの発生を引き起こし、プラズマ細胞は、抗原物質に対する抗体を分泌する。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞免疫にも不可欠である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば食作用を有するマクロファージおよび樹状細胞といった抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示された抗原に結合して、他の免疫細胞をその区域に引き付けるリンフォカインを放出すると理解されている。その結果、炎症が生じ、抗原物質を囲んで破壊しようとする細胞および分子の蓄積が生じる。
型ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞またはキラーＴ細胞と呼ばれる。これらのＴ細胞は、結合した細胞を破壊する分子を分泌する。感染した細胞が、他の細胞に感染できる新たなウィルスの集団を放出する前に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それら感染した細胞を破壊す
るので、このＣＤ８＋Ｔ細胞の分子の分泌は、ウィルス感染との闘いにおいて重要である。
ヒト免疫不全ウイルスは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する高い親和性を有するレトロウィルスであり、したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、このウィルスの有力な標的である。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、免疫におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の重要性の鮮明で悲劇的な実例を提供する。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ＣＤ４＋分子に結合し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に侵入および感染する。この病気が進行すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、その正常な範囲である１マイクロリットル（μｌ）あたり約１０００個よりも少なくなる。１つの説明は、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が、感染したＣＤ４＋細胞を絶え間なく破壊しようとすることであり得る。あるいは、感染していないＣＤ４＋細胞は、自滅（アポトーシス）を誘導され得る。
ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が１マイクロリットルあたり４００個よりも少なくなると、免疫応答を高める患者の能力が劇的に低下する。患者は、身体に侵入する病原体（通常は我々に危害を加えることなく我々の組織に存在する微生物、特にウイルスおよび菌類を含む）からの感染に過敏になるだけではない。最終的には、患者は、カンジダ症、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューモシスティス・カリニ肺炎、トキソプラズマ症、結核その他のような日和見感染症で死亡する。
ＣＤ４およびＣＤ８に加えて、リンパ球のサブタイプの識別に使用できる他の多くの細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５、およびＣＤ５６）が存在する。抗体技法によってこれらの細胞表面抗原を検出できることにより、診断病理学には新しい局面が加えられ、さまざまな技法を、ヘマトリンパ球（hematolymphoid）疾患（例えば、ＡＩＤＳ、白血病、およびリンパ腫）の免疫表現型（immunophenotype）の研究に利用することができる。例えば放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）といった従来のマイクロ免疫検定法（microimmuno-assay）は、同位体、酵素、または蛍光物質と特異的にそれぞれ反応する、対応した抗体または抗原の存否を検出するために、当該同位体、酵素、または蛍光物質をそれぞれ使用する。
血液の標準サンプル中の血小板の数は、通常、１マイクロリットル（μｌ）あたり１３３，０００から３３３，０００である。血小板の数が過剰であることは、血小板血症と呼ばれる。血小板計数は、事後対応の（reactive）反応または骨髄障害により、正常な血小板計数を越えることがある。事後対応の反応は、通常、出血、感染、腫瘍、および骨髄増殖性疾患が原因で引き起こされる。骨髄障害は、通常、汎血球減少症として知られている血球の損失を伴う。他方、血小板計数の減少は、免疫性血小板減少症によるものである。血小板減少症は、血小板計数が３０，０００未満になると発生する。その結果、異常な出血が発生する。計数が５０００未満になると、命にかかわると考えられる。
プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インテグラ−ゼ阻害剤およびその他を含む幾つかの治療手法が、ＡＩＤＳの治療に用いられる。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の数およびそれらの比（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔリンパ球）の概算は、免疫不全症を有する人間の患者の免疫の健康状態を評価するためおよび治療の効力を評価するために重要である。
抗体技法によって細胞関連抗原を検出できることにより、診断病理学には新しい局面が加えられた。さまざまな技法を、ヘマトリンパ球疾患の免疫表現型の研究に利用することができる。放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）のような従来のマイクロ免疫検定法は、同位体、酵素、または蛍光物質と特異的にそれぞれ反応する、対応した抗体または抗原の存否を検出するために、当該同位体、酵
素、または蛍光物質をそれぞれ使用する。しかしながら、上記の方法には限界および欠点がある。ＲＩＡは、特別な設備、予備対策、半減期の制限、および種々の他の要因を必要とする。着色または発光により標識を測定する際に酵素または蛍光物質を用いる方法は、過剰な未結合かつ未反応の試薬を除去するために幾つかの洗浄ステップを必要とすることに加えて、比色または蛍光反応を検出するために高精度で複雑な機器を必要とする。さらに、細胞（特にリンパ球および癌細胞）および同様の試料を検出する上記の方法の適用には、高性能な調製、検出、および分析の技術の改良が必要である。
細胞表面抗原に特異的な蛍光抗体の使用に関して開発された手段は、フローサイトメトリの蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の技法である。これは、非常に信頼性が高く、高速かつ高精度の方法である。フローサイトメトリ分析は、ＲＢＣ溶解を受ける全血サンプルに対して行われ、白血球は無傷のままに保たれる。次に、対象となる白血球は、ＦＡＣＳスキャナでの識別のために蛍光マーカで標識される。フローサイトメトリ分析のためのサンプルの主要な要件は、サンプルが単分散性の懸濁液中にあり、所望の細胞が蛍光マーカで標識されることである。これは非常に高価な試験であり、システム全体が、臨床分析実験室および高価な機器において、訓練された技術者により扱われる必要がある。フローサイトメトリの別の欠点は、一度分析された細胞を繰り返し分析またはさらなる調査（例えば希少細胞（rare event cells）の顕微鏡検査）に利用できないことである。
表面マーカ分析は非常に有用な実験手段であり、特に、白血病、リンパ腫、および免疫不全症の研究において非常に有用である。抗体ベースのマイクロアレイ技術は、確かに、特に臨床診断における、サンプル中の特異的抗原の識別に関する最新技術である。ほとんどの診断試験は、限られた検体集団（癌、白血病、リンパ腫、甲状腺疾患など）のみの判定を必要とする。したがって、１回の試験において臨床的に関連するすべてのパラメータを同時に測定するにあたり、技術の小型化によりごく少量の血液サンプルしか必要でないこと、および実験室職員の時間および費用が節約されることは、その費用効率、労働効率、および簡単さにより、病院の実験室およびポイントオブケア設備にとって極めて魅力的である可能性が高い。
本発明者等は、従来の方法と比較してわずかな時間および費用で特異的な細胞表面を分析し、かつデータ分析を行う、簡単で安価なシステムを開発した。このシステムは、特別に作成した光バイオディスクと、関連の検出アセンブリと、支援ソフトウェアおよび処理方法とを用いる。
血液サンプルは、分析前にＦＡＣＳスキャナに用いるプロトコルと同様の処理を必要とする。赤血球（red cell）は、その数が豊富であることにより、白血球（white cell）の特異的結合の邪魔をする可能性がある。したがって、ＦＡＣＳスキャナでサンプルを分析する前に、白血球を排除する赤血球を破壊するＲＢＣ溶解緩衝液を用いて血液サンプルを培養する。
本発明の譲受人に譲渡された、２００１年７月２７日に出願された米国仮出願第６０／３０８，１９７号では、本発明者等は、密度勾配プロトコルを用いて単核球を全血から単離することにより光バイオディスク上でヘルパ／インデューサ−サプレッサ／細胞障害性検定を行うように開発および設計された方法を記載している。本発明では、本発明者等は、ディスク上で溶解処置を行うために用いることができるマイクロ流体チャンバまたは回路を記載し、白血球物質の残りは、ヘルパ／インデューサ−サプレッサ／細胞傷害性検定に特異的な捕捉抗体が積層された検定または分析チャンバ内に消散される（dispelled）。この特定のチャンバの構造は、相互接続された２つのチャンバを含んでいてもよい。チャンバ１は、溶解緩衝液を含む。分析するべき血液サンプルを「溶解」チャンバに注入する。１５分間培養して溶解を完了させる。溶解が完了すると、特異的な捕捉抗体で被覆さ
れた分析チャンバに残りの白血球が入ることを可能にするように、ディスクをスピンさせる。細胞サンプルと共に化学物質（chemistry）を３０分間培養した後に、レーザ光学装置（laser optics）を用いてディスクの読み取りおよび画像化を行い、適当なソフトウェアで画像を解析する。
［発明の概要］
本発明は、包括的には、臨床診断検定および関連の光バイオディスクに関する。より詳細には、本発明は、ＣＤ（クラスタ指定（cluster designation））マーカ検定を含む細胞型決定（cell typing）に関する。ただし、本発明は、実施の最良の形態に従って後述する特定の実施の形態に限定されるものではない。本発明のＣＤマーカ検定は、サンプル中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の数を決定するための細胞捕捉検定である。本発明はさらに、全血および関連の光バイオディスクを用いた、ヘルパ／インデューサ−サプレッサ／細胞毒性Ｔリンパ球のＲＢＣ溶解、細胞分離、および評価を対象とする。
サンプル（血液、髄液、痰、尿、大腸上皮細胞（colonocytes）、または任意の他の生物学的供給源など）の分析を、適時に費用効率的に、かつ技術的に適切な方法で実行する改良された方法および装置が提供される。特に、種々の型の白血球、または他の細胞型、寄生虫、病原体、および生体物質の相対レベルを定量するためのより簡単で効率的な方法が必要である。本発明はこの必要性に応じるものである。さらに、本発明は、血球を画像化すること、分画白血球計数を行うこと、および関連の処理方法およびソフトウェアに関する。
試験は、ディスク上の特異的な位置の局在細胞を捕捉するという原理に基づく。特定のリンパ球（白血球）抗原に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に基づく捕捉化学物質を局在塗布することにより、幾つかの特異的な細胞捕捉領域をディスク上に作製する。
検定は、特異的抗体が固相に取り付けられたフローチャンバを含むバイオディスク内で行われる。ＣＤマーカ検定またはヘルパ−インデューサ／サプレッサ−細胞障害性試験により、捕捉または標的領域で特異的抗体により捕捉されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ４５＋リンパ球を含む標的細胞の絶対数を求める。
光ディスクドライブアセンブリは、ディスクの回転、ディスク上に記憶された任意の符号化情報の読み出しおよび処理、ならびにバイオディスクのフローチャンバの細胞捕捉領域の分析に使用される。光ディスクドライブには、バイオディスクを回転させるモータと、ディスクの回転速度を制御するコントローラと、ディスクからの帰還信号を処理するプロセッサと、処理された信号を分析する分析装置とが設けられる。回転速度は、可変であり、回転の速さおよび時間の双方に応じて厳密に回転速度を制御することができる。また、光ディスクドライブは、フローチャンバおよび標的領域の試験物質が、ドライブの読み取りビームによって呼びかけを受け、分析装置によって分析される前またはその後に、当該バイオディスクに情報を書き込むことに利用することもできる。バイオディスクは、ディスクの回転を制御する符号化情報と、行われる免疫タイピング（immunotyping）検定の型に特有の情報の処理を提供する符号化情報と、その結果をドライブに関連したモニタに表示する符号化情報とを含むことができる。
本発明の一態様は、光分析ディスクと共同で検定を行って、細胞の検出および計数を行う方法および装置を提供することである。本発明のさらなる態様は、光分析ディスクと共同で検定を行って、リンパ球を検出する方法および装置を提供することである。
本発明の別の態様によると、ディスク表面内またはディスク表面上にサンプルを供給することを含む方法が提供される。このディスクは、光学式読み取り装置によって読み取り可能な符号化情報を有する。この情報は、読み取り装置の走査をディスクに対して制御するために使用することができる。
ディスクを光学式読み取り装置にロードし、放射源からの電磁放射入射ビームをディスクに送る。中心軸の回りにディスクを回転させ、かつ、入射ビームを中心軸に対して半径方向に移動させることにより、このビームをディスク全体にわたって走査させる。ディスクを透過するか、または、ディスクから反射した電磁放射ビームを検出して分析し、サンプルに特徴的な情報を抽出する。
また、本発明の実施の形態は、チャンバを形成するために間隔をあけて配置された基板およびキャップを有するディスクも含む。例えば細胞を有する血液といった物質のサンプルをこのチャンバに供給する。ディスクを回転させると、サンプルは、捕捉領域を通過する。捕捉領域は、対象となる細胞の型の細胞表面マーカである例えばＣＤ４およびＣＤ８といった抗原に結合する抗体または他の特異的結合相手を有する捕捉層を備える。１回の試験を使用して、血液サンプル中のＣＤ４およびＣＤ８ならびに他の抗原を画像化できることが好ましい。本発明の別の態様によると、捕捉領域が位置する視界窓に光を送り、透過光または反射光を検出して捕捉された細胞の識別および計数を行うディスク読み取り装置が提供される。これらのＣＤ４計数およびＣＤ８計数、ならびにそれらの比は、例えばＡＩＤＳといった症状を監視するのに有益である。
試験サンプルをディスク内のチャンバに供給することが好ましい。単一のチャンバは、複数の捕捉区域を有することが好ましく、複数の捕捉区域のそれぞれは、１つまたは複数の抗体を有することができる。一実施の形態では、単一のチャンバが、各捕捉領域が異なる型の抗体を有する複数の捕捉領域を有し、制御領域としての機能を果たす捕捉領域を有することができる。これらの捕捉領域は、ディスクの１つまたは複数の半径方向に沿って並べることができる。検出方法は、その特徴の遷移を検出すること、または、視界窓を画像化し、画像認識ソフトウェアを使用して捕捉された細胞を計数することを含む。計数は、直接的なものであってもよいし、間接的なものであってもよい。直接的なものは、例えば、所望の細胞を計数することである。間接的なものは、例えば、所望の細胞および所望でない細胞の集まりを計数し、所望でない細胞を計数し、そして、減算を行って所望の細胞の計数を得ることである。捕捉領域は、抗体の１つまたは複数の層を有することができる。
細胞のサンプルをディスクに供給すると、ディスクを１段階または２段階以上で回転させて、細胞を捕捉領域に移動させ、次いで、結合していない細胞を捕捉領域から除去することができる。他の方法でサンプルを処理することもできる。例えば、検出用に使用される光源によってサンプルを培養または加熱することができる。マイクロフルイディクスを使用して、サンプルのディスク上での処理に望ましい場合がある染色液または他の任意の液体を加えることができる。この処理は、ディスク上の情報記憶区域の符号化情報で指定されることが好ましい。他の中間的なステップ、例えば培養を行うと共に、ドライブおよび読み取り装置を所望の速度で所望の時間の間、回転させるのに、記憶された情報を有利に使用することができる。
マイクロ技術は、細胞型、寄生虫、病原体、および他の生体物質の識別を行うための臨床診断において特に有用である。本発明は、マイクロ技術を利用して、光バイオディスク上の全血中の分画白血球計数を行う。さらに、本発明は、血球を画像化すること、分画白血球計数を行うこと、ならびに関連した処理方法およびソフトウェアを対象とする。
本発明による別の試験または検定は、少なくとも２つの方法で実行することができる。第１の方法は、光バイオディスク上に配置された特別な流路内の血球を光学的に画像化する原理に基づくものである。約５〜２０マイクロリットルの全血を、ディスク上に特別に設計された流路に注入する。画像は、さまざまな白血球のサブタイプを識別して分画白血球計数を生成する細胞認識ソフトウェアによって分析される。第２の方法は、特異的な細胞に対する細胞特異的な抗体を使用した特異的な細胞捕捉に基づくものである。この特定の実施の形態では、抗体は、例えば、リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、および好酸球（ＣＤ１５）に対するものを対象とする。上述した関連する検定と同様に、これらの白血球のサブタイプ特異的抗体を、フローチャンバを備えるバイオディスク内の固体面に集め／付着させる。
バイオディスクドライブアセンブリは、ディスクの回転、ディスク上に記憶された任意の符号化情報の読み出しおよび処理、ならびにバイオディスクのフローチャンバの細胞捕捉領域の分析に使用される。バイオディスクドライブには、バイオディスクを回転させるモータと、ディスクの回転速度を制御するコントローラと、ディスクからの帰還信号を処理するプロセッサと、処理された信号を分析する分析装置とが設けられる。回転速度は、可変であり、回転の速さ、時間、および回転方向の双方に応じて厳密に回転速度を制御することができる。また、バイオディスクは、フローチャンバおよび標的領域の試験物質が、ドライブの読み取りビームによって呼びかけを受け、分析装置によって分析される前、その最中、またはその後のいずれかにおいて、当該バイオディスクに情報を書き込むことに利用することもできる。バイオディスクは、ディスクの回転を制御する符号化情報と、行われる免疫タイピング検定の型に特有の情報の処理を提供する符号化情報と、その結果をバイオドライブに関連したモニタに表示する符号化情報とを含むことができる。
全体として分画細胞計数プロトコルは、また特に分画白血球計数プロトコルは、ＣＤフォーマット、ＣＤ−Ｒフォーマット、またはＤＶＤフォーマット、これらのフォーマットの変更版、およびそれらの代替物に対して開発される。ドライブの読み取りビームまたは呼びかけビームは、分析サンプル内のさまざまな細胞を検出し、分画細胞計数ソフトウェアにより分析を受けることができる画像を生成する。
これらの単調で根気のいる細胞計数検定を行うには、顕微鏡的方法または高機能な細胞計数器が不可欠である。本方法は、光バイオディスクおよび関連するアセンブリを使用する。分析チャンバ内で結合されていない（free）さまざまな白血球のサブタイプの光画像、または、特異的抗体法によって捕捉されたそれらサブタイプの光画像が、細胞認識ソフトウェアプログラムによって生成され分析される。この細胞認識ソフトウェアプログラムは、血液または他の体液内のさまざまな細胞要素をそれらの光散乱特性により識別する。この帰還光は、入射ビームと対象サンプルとの光／物質相互作用後に検出される。検出された帰還光信号は処理されて、識別可能な信号シグネチャまたはデジタルＩＤを提供する。従来技術の方法は、通常、例えば細胞染色、ＲＢＣ削除、または他の根気のいるプロトコルといった準備を要するが、本方法の実施の形態は、サンプルの前処理をなんら要しないようにできる。これらの方法は、上部検出器、底部検出器、イベント計数器、もしくは細胞計数器を使用するＣＤ型読み取り装置または光ディスク読み取り装置における顕微鏡的分析または細胞検出を含む。
以下のパラグラフでは、バイオディスクの製造を対象とする本発明のある特定の好ましい実施の形態による主要な方法のステップの概要を提示する。
ディスクの準備：エアガンを使用して、金反射型ディスクまたは透過型ディスクをクリーニングし、あらゆる塵粒を除去する。スピンコータを使用して、ディスクをイソプロパ
ノールで２回すすぎ洗いする。ディスク上に２％ポリスチレンをスピンコートして、非常に厚いコーティングを全体に与える。
化学物質の堆積：一実施の形態は、ストレプトアビジンの３０分間の培養と、ビオチン化１次抗体の６０分間の培養と、２次捕捉抗体の３０分間の培養とを行う３つのステップの堆積プロトコルを含む。これらのすべてのステップは、堆積の間に、ストリンジェントな洗浄／乾燥ステップを使用する恒湿チャンバ（humidity chamber）内で、室温で行う。
簡潔には、リン酸緩衝生理食塩水中の１μｌの１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンを各窓上に層化して、３０分間培養する。蒸留水を使用して過剰なストレプトアビジンをすすぎ洗いし、ディスクを乾燥させる。等しい体積のビオチン化ＩｇＧ（ＰＢＳ中の１２５μｇ／ｍｌ）とアルデヒド活性化デキストラン（２００μｇ／ｍｌ）とを結合することにより、ビオチン化ＩｇＧデキストラン複合体を調製する。デキストランアルデヒドビオチン化ＩｇＧ複合体を各捕捉窓のストレプトアビジン上に層化して、冷蔵庫で６０分間または一晩培養する。過剰な試薬をすすぎ洗いし、ディスクをスピン乾燥させる。バイオディスクスロット上の指定されたスポットに捕捉抗体を層化することにより、特定のバーコード捕捉パターンを生成する。分画計数用に、抗好中球（ＣＤ１２８またはそれ以外のもの）、抗リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ５６、およびそれ以外のもの）、抗好酸球（ＣＤ１５）、抗単球（ＣＤ１４）、抗塩基球（ＣＤ６３）、および抗血小板（ＣＤ３２およびＣＤ１５１）を、例えば、各スロットの指定されたスポットに層化する。以下の表１は、捕捉層アセンブリの捕捉パターンの変化例を一覧にしている。冷蔵庫で３０分間または一晩培養する。２５μｍ、５０μｍ、または１００μｍ（５０μｍ流路は、２５μｍチャンバに必要なサンプルの２倍の体積のサンプルを必要とする）の直線状、Ｕ字形、もしくは他の流路形式と、透明カバーディスク（上部検出器と共に使用される）または反射カバーディスク（底部検出器と共に使用される）とを使用してディスクを組み立てる。
Figure 2005509882
ディスクの漏れチェックおよび望ましくない細胞の非特異的結合の遮断：血液というバイオハザード物質を分析しているので、本発明の品質管理製造態様の一部として、ディスクの漏れをチェックし、サンプルが本来の場所にある状態で、ディスクのスピン中にチャ
ンバの漏れがないことを確かめる。各流路を、市販の遮断剤であるＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄで満たし、１時間の間、遮断することが好ましい。ディスクを５０００ｒｐｍで５分間スピンさせ、漏れおよびディスクの安定性を検査する。漏れのチェック後、ディスクを真空チャンバに２４時間入れる。真空処理後、使用するまで、チャンバをＰＢＳ緩衝水で満たすか、または、空の状態で真空パウチに入れて、冷蔵庫で保管する。
全血からの軟膜（buffy-coat）層の分離：脱線維素静脈血を遠心分離管で２５分間２８００ｒｐｍで遠心分離することにより軟膜を調製する。上清の血漿を細いピペットを用いて注意深く除去する。次いで、白血球および血小板を含んだ下にある白色層をピペットで取る。遠心分離を行わないで血液から軟膜を得る別の方法としては、フィブリノゲン、デキストラン、アラビアゴム、Ｆｉｃｏｌｌ、またはメチルセルロースといった沈殿増進剤を用いて血液の沈殿を可能にするものがある。Ｂｏｙｕｍ試薬（メチルセルロースおよびナトリウムメトリゾエート）が、赤血球による混入のない白血球の調製物を得るのに特に適している。あるいは、正の選択もしくは負の選択、または溶血方法により、リンパ球を全血から分離することもできる。
ディスクでの検定−基礎技術の説明：分画白血球計数ディスク試験の好ましい一実施の形態は、（１）化学的性質を有する基本ディスク、（２）流路層、および（３）カバーディスクの３つの個別の構成要素を備える。
軟膜を、好ましくはＰＢＳで希釈して、ディスクチャンバ内に注入し、チャンバの注入ポートおよび排出ポートをテープで密閉して、ディスクを所望の時間の間、好ましくは室温で培養する。本発明の譲受人に譲渡された他の関連のバイオディスクを用いる細胞検定では、全血をバイオディスクの流体回路に直接加え、全血サンプルで分析を行う。しかしながら、本発明では、以下に述べる理由から精製したＴリンパ球細胞サンプルを用いることが好ましい。精製したサンプルおよび全血のいずれの方法に関しても、ディスク上の所与の区域（例えば１ミリメートル四方の区域）が、上部検出器および底部検出器を有する光ドライブの標準的な７８０ｎｍレーザを使用して走査される。関連した細胞認識ソフトウェアは、例えば、好ましくは１ミリメートル四方に等しい捕捉画像から分画計数を与えるように自動化されている。この細胞認識ソフトウェアは、本譲受人によって開発され、２００２年３月１２日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including
Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３６３，９４９号および２００２年８月２１日に出願された「Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same」と題する米国仮出願第６０／４０４，９２１号に開示されている。第２の方法の場合、ディスクは、標準的な７８０ｎｍレーザを使用して走査され、リンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板を含み得る捕捉領域が画像化される。本譲受人によって開発された細胞認識ソフトウェアは、次のルーチン、すなわち（ａ）ディスクを遠心分離して、結合していない過剰な細胞をスピン除去すること、（ｂ）特定の区域または特定の捕捉領域を画像化すること、および（ｃ）各捕捉領域の特異的に捕捉された細胞を計数することと、白血球の分画部分集合の数を導き出すこととを含むデータ処理、を実行するように自動化されている。
この処理ステップ中、認識ソフトウェアは、各捕捉領域にわたって読み取りを行い、遭遇した細胞に印を付ける。各捕捉領域から得られたデータの処理に続いて、ソフトウェアは、１マイクロリットルの体積の血液あたりのリンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板の領域の数を表示する。光ドライブへのディスクの挿入から、対象となる結果の表示までのプロセス全体に要する時間は、約１０〜１５分である。
本発明に関連した開示は、２００１年７月２３日に出願された「Capture Layer Assemb
lies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３０７，２６２号、２００１年７月２３日に出願された「Methods for Imaging Blood Cells,
Blood-Borne Parasites and Pathogens, and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３０７，２６４号、２００１年７月２３日に出願された「Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymphocytes」と題する米国仮出願第６０／３０７，５６２号、および２００１年７月２４日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３０７，４８７号にも提示されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
以下のパラグラフでは、本発明のある特定の好ましい実施の形態によるディスクの仕様の主要な要素の概要を提示する。
トラック設計：本発明の好ましい一実施の形態では、ディスクは、３００ｎｍの金で被覆されたフォワードＷｏｂｂｌｅ Ｓｅｔ ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０である。この反射型ディスク上に、サイズ２×１ｍｍの楕円形のデータ窓をリソグラフィーによってエッチングする。「Ｕ」字型流路を使用して、高さ２５μｍのチャンバを生成する。注入ポートおよび排出ポートを備えたチャンバ全体を満たすには、約７μｌのサンプルが必要となる。４つの窓／４つの流路の形式を使用できることが好ましい。一方、反射型ディスク上には、データ窓をエッチングせずに、ディスク全体を使用することができる。
接着および接合：好ましい一実施の形態では、本「Ｕ字」型流体回路を備える接着層または流路層を、Ｆｒａｙｌｏｃｋ接着ＤＢＬ ２０１ Ｒｅｖ Ｃ ３Ｍ９４６６１から作成する。あるいは、直線状流路を使用してチャンバを生成する。
カバーディスク：半径２６ｍｍにおける等距離の場所に直径０．０４０インチの４８個のサンプル注入口を有する十分に反射型の透明ディスクが、本ディスクアセンブリの特定の一実施の形態で使用される。
データの取り込みおよび処理：データディスクは、本譲受人の細胞認識ソフトウェアを使用して、好ましい４倍速および２．６７ＭＨｚのサンプリングレートでソフトウェアにより走査され読み取られる。
ソフトウェア：本発明は、処理方法ならびに関連した細胞認識および画像化のソフトウェアをさらに含む。このソフトウェアは、細胞の計数および分画細胞の計数を行い、それらの計数を表示することを対象とする。本ソフトウェアは、光ディスクドライブ読み取り装置において光バイオディスクに記憶することができるか、あるいは、安全なサーバから光学式読み取り装置によってのみアクセス可能にすることができる。このサーバは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）といったコンピュータネットワークで実施することもできるし、それ以外に、所定の契約条件のもとでインターネットを介して利用可能にすることもできる。このような分散方法は、本発明の譲受人に譲渡された次の出願に開示されている。すなわち、２０００年１１月８日に出願された「Interactive Method and System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Medical Information Using Specially Prepared Bio-Optical Disc, Optical Disc Drive, and Internet Connections」と題する米国仮出願第６０／２４６，８２４号、および２００１年１１月７日に出願された「Interactive System for Analyzing
Biological Samples and Processing Related Information and the Use Thereof」と題
する関連する米国特許出願第０９／９８６，０７８号に開示されている。これらの出願の双方は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
用具：本明細書で開示されるさまざまな好ましい実施の形態を実践するのに使用される用具は、フォワードウォブル金メタライズドフォトレジストディスク、透過型金メタライズドディスク、ピペットおよびチップ、スピンコータ、遠心機、回転ロータ、例えばクエン酸ナトリウムまたはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）といった抗凝血剤を有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ＣＰＴ管、恒湿チャンバ、ディスクプレス、接着剤、カバーディスク、透明カバーディスク、テープまたは同等のもの、真空装置、イエローチップ、ならびに真空チャンバを含む。
試薬：本発明の一定の方法に従って細胞の計数を行うのに使用される試薬には、リン酸緩衝生理食塩水、イソプロピルアルコール、蒸留水、およびＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄが含まれる。
既知の技術の限界を克服することが、本発明の目的である。本発明のもう１つの目的は、既知の光ディスクシステムを、光バイオディスク上の全血内の分画白血球計数を行うように適合させることである。血球を画像化して、分画白血球計数を行うことが本発明のさらなる目的である。
本発明のこれらおよび他の目的および利点は、光検定ディスクと、光源と、光ディスクドライブの光検出器回路、および、プロセッサ、を含むクラスタ指定計数を行う光ディスクおよびドライブシステムにおいて達成される。光検定ディスクは、基板と、基板上に堆積された活性層、および、接着または流路部材により活性層に一体的に取り付けられたカバーディスクまたはキャップ部とを含む。接着部材からは、１つまたは複数の部分が除去され、それによって、１つまたは複数の捕捉剤が固定されるチャンバが形成される。捕捉剤は、活性層上およびチャンバ内に固定されており、別個の捕捉領域を画定する。光源はディスクの捕捉領域に向けて光を送る。光ディスクドライブの光検出器回路は、ディスクから反射した光またはディスクを透過した光を検出して、光ディスクアセンブリから情報を保持した信号を供給するように構成される。プロセッサは、光検出器回路に結合されて、光ディスクシステムを動作させるためおよび捕捉剤に結合したサンプル中のアイテムを計数するために用いられる動作情報を情報を保持した信号から得る。
このシステムの１つの特定の態様によると、プロセッサは、細胞を検出および画像化する画像認識ソフトウェアを含む。一実施の形態では、光検出器は、ディスクの光源と同じ側にあり、捕捉領域から反射する光を検出する。代替の実施の形態では、光検出器は、ディスクの光源とは反対側にあり、捕捉領域を透過する光を検出する。
本発明は、光ディスクおよびディスクドライブでクラスタ指定計数を行う方法も対象とする。本方法は、分離勾配液を含む第１の管に血液サンプルを供給し、血液サンプルを層に分離するのに十分な時間および速度で第１の管を回転させ、Ｔ細胞を含むＭＮＣ層を再懸濁し、それによりＭＮＣ懸濁液を形成し、ＭＮＣ懸濁液のサンプルを、少なくとも１つの捕捉剤を有する少なくとも１つの捕捉領域を備えた光ディスクの表面に供給し、ディスクを光学式読み取り装置にロードし、ディスクを回転させ、電磁放射入射ビームを捕捉領域に送り、捕捉領域においてディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、検出したビームを出力信号に変換し、そして出力信号を分析し、それにより、捕捉領域において捕捉された細胞の数に関する情報を抽出する、ステップを含む。この方法の一実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が反射されるような反射層により構築される。この方法の別の実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が光ディスクを透過するように構築される。サ
ンプル中の細胞集団の濃度を求めることに関する他の関連態様は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年５月３０日に出願された「Optical Disc Systems For Determining The Concentration Of Cells or Particles In A Sample And Methods Relating Thereto」と題する米国仮出願第６０／３８４，２０５号に開示されている。この出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
この方法の別の態様によると、ディスク表面は第１の群の捕捉剤で被覆される。この方法の一実施の形態では、捕捉剤は、クロスリンクシステムによりディスク表面上に固定される。代替の実施の形態では、捕捉剤はディスク表面上に直接固定される。
この方法のさらに別の態様によると、捕捉剤は、１つまたは複数の別個の捕捉領域を画定する。この方法の１つの特定の実施の形態では、１つまたは複数の捕捉領域は、光ディスク内の１つまたは複数のチャンバ内に位置する。この方法の別の実施の形態では、捕捉剤は、細胞表面抗原に対する選択的な親和性を有する。代替の実施の形態では、捕捉剤は、細胞表面抗原に対する選択的な親和性を有する一次捕捉剤と結合するためのものである。好ましい実施の形態では、細胞表面抗原は、ＣＤファミリーの抗原から独立して選択される。より好ましい実施の形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５からなる群から選択される。
この方法のさらに別の態様によると、回転は、細胞が捕捉剤と結合する機会を有するのに十分な期間および十分な速度で回転させることを含む。この方法のこの態様の一実施の形態では、回転はさらに、結合していない細胞が捕捉領域から除去されるのに十分な期間および十分な速度で回転させることを含む。この方法のこの態様の好ましい実施の形態では、回転は単一の速度で行われる。
本発明のこれらの態様による方法の実施の形態はさらに、ＭＮＣ細胞のサンプルを捕捉剤の近傍に送り、捕捉剤の存在下で細胞を培養し、細胞が捕捉剤と特異的に結合することを可能にするステップ、を含むことが有利である。この方法の一実施の形態はさらに、捕捉した細胞の数を分析するステップであって、それにより、サンプル中の細胞の濃度を求める、分析するステップを含む。この実施の形態の一態様では、分析は、ディスクから反射した光またはディスクを透過した光のレベルの十分に大きい変化を検出することを含む。この実施の形態の別の態様では、分析は、捕捉した細胞を計数するために画像認識を用いることを含む。この方法の好ましい実施の形態では、画像認識は、１つの型の白血球から別の型の白血球を区別する。
この方法の別の実施の形態はさらに、捕捉領域それぞれにおいて捕捉した細胞を計数するステップと、細胞計数を含む出力を供給するステップとを含む。この実施の形態の一態様では、出力は、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の計数、ならびにＣＤ８細胞に対するＣＤ４細胞の比を含む。
この発明のさらに別の主な態様によると、クラスタ指定計数を行う代替の方法が提供される。この代替の方法は、（１）分離勾配液を含む管に血液サンプルを供給し、（２）この血液サンプルを層に分離するのに十分な時間および速度で管を回転させ、（３）Ｔ細胞を含むＭＮＣ層を再懸濁し、それによりＭＮＣ懸濁液を形成し、（４）一次抗体をＭＮＣ懸濁液に加え一次抗体Ｔ細胞複合体を形成し、（５）一次抗体Ｔ細胞複合体のサンプルを、少なくとも１つの捕捉剤を有する少なくとも１つの捕捉領域を備えたディスク表面に供給し、（６）ディスクを光学式読み取り装置にロードするステップと、（７）電磁放射入射ビームを捕捉領域に送り、（８）捕捉領域においてディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、（９）検出したビームを出力信号に変換し、（１０）出力信号を分析し、それにより、捕捉領域において捕捉された細胞の数に関する情報を抽出す
る、ステップを含む。
同様に、この代替の方法の一実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が反射されるような反射層により構築される。この方法の別の実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が光ディスクを透過するように構築される。
この方法の一態様によると、ディスク表面は第１の群の捕捉剤で被覆される。この方法の一実施の形態では、捕捉剤は、クロスリンクシステムによりディスク表面上に固定される。代替の実施の形態では、捕捉剤はディスク表面上に直接固定される。
この方法のさらに別の態様によると、捕捉剤は、１つまたは複数の別個の捕捉領域を画定する。この方法の１つの特定の実施の形態では、１つまたは複数の捕捉領域は、光ディスク内の１つまたは複数のチャンバ内に位置する。この方法の別の実施の形態では、捕捉剤は、細胞表面抗原と結合するためのものである。代替の実施の形態では、捕捉剤は、細胞表面抗原に対する選択的な親和性を有する第２の群の捕捉剤と結合するためのものである。好ましい実施の形態では、細胞表面抗原は、ＣＤファミリーの抗原から独立して選択される。より好ましい実施の形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５からなる群から選択される。
この方法のさらに別の態様によると、回転は、細胞が捕捉剤と結合する機会を有するのに十分な期間および十分な速度で回転させることを含む。この方法のこの態様の一実施の形態では、回転はさらに、結合していない細胞が捕捉領域から除去されるのに十分な期間および十分な速度で回転させることを含む。この方法のこの態様の好ましい実施の形態では、回転は単一の速度で行われる。
本発明のこれらの態様による方法の実施の形態はさらに、一次抗体Ｔ細胞複合体のサンプルを捕捉剤の近傍に送り、捕捉剤の存在下で複合体を培養し、複合体が捕捉剤と特異的に結合することを可能にするステップ、を含むことが有利である。この方法の一実施の形態はさらに、捕捉した複合体の数を分析し、サンプル中の細胞の濃度を求める、ステップを含む。この実施の形態の一態様では、分析は、ディスクから反射した光またはディスクを透過した光のレベルの十分に大きい変化を検出することを含む。この実施の形態の別の態様では、分析は、捕捉した複合体を計数するために画像認識を用いることを含む。この方法の好ましい実施の形態では、画像認識は、１つの型の白血球を別の型の白血球から区別する。
この方法の別の実施の形態はさらに、捕捉領域それぞれにおいて捕捉した細胞を計数し、細胞計数を含む出力を供給するステップとを含む。この実施の形態の一態様では、出力は、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の計数、ならびにＣＤ８細胞に対するＣＤ４細胞の比を含む。
上記の方法のいずれにおいても、管はさらに抗凝固物質を含んでいてもよい。さらに、これらの方法の特定の実施態様および実施の形態の多くでは、捕捉剤が固定される表面は、ディスクの内部にあり、基板およびキャップに両面が接している。
この発明の製造態様によると、クラスタ指定計数を行う光検定ディスクを作成する方法が提供される。この光検定ディスクを作成する方法は、管にクロスリンカを提供し、管に捕捉剤を加え、クロスリンカと捕捉剤とを結合（複合体の形成）させ、基板を設け、活性層により基板を被覆し、複合体を活性層上に堆積させ、そして接着部材を使用して活性層にカバーディスクまたはキャップ部を取り付ける、ステップを含む。この実施の形態では
、クロスリンカは、アルデヒド活性化デキストランである。捕捉剤は、細胞表面抗原と結合するためのものである。
この方法の一態様によると、堆積は、複合体を所定位置に堆積することにより、捕捉領域を形成することを含む。この方法の一実施の形態では、取り付けは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が反射されるような反射層を有する、カバーディスクまたはキャップ部を取り付けることを含む。この方法の代替の実施の形態では、取り付けは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が光ディスクを透過するような半反射層を有するカバーディスクまたはキャップ部を取り付けることを含む。
代替の実施の形態では、捕捉剤は、一次捕捉抗体および二次捕捉抗体を含む。二次捕捉抗体は、ディスク表面に結合し、一次捕捉抗体に対する特異的親和性を有する。この実施の形態では、一次捕捉抗体は、対象となる細胞表面抗原に対する選択的な親和性を有する。本発明の好ましい実施の形態では、細胞表面抗原は、ＣＤファミリーの抗原から選択される。より好ましい実施の形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５からなる群から選択される。
また、この発明の製造態様によると、クラスタ指定計数を行う光検定ディスクを作成する代替の方法が提供される。この光検定ディスクを作成する代替の方法は、基板を設け、活性層により基板を被覆し、捕捉剤を活性層上に堆積させ（捕捉領域を形成し）、基板を培養し、基板を回転させ、そして、接着部材を使用して活性層にカバーディスクまたはキャップ部を取り付けるステップを含む。この方法の１つの特定の実施の形態では、培養するステップは、捕捉剤を活性層上に固定することができるのに十分な期間および十分な温度で培養することを含む。この方法の別の実施の形態では、回転させるステップは、固定されていない捕捉剤が捕捉領域から除去されるのに十分な期間および十分な速度で回転させることを含む。
この方法の別の態様によると、捕捉剤は、ＩｇＧ、ビオチン化ＩｇＧ、抗ＣＤ３抗体、ビオチン化抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、ビオチン化抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、ビオチン化抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５抗体、およびビオチン化抗ＣＤ４５抗体からなる群から選択される。この態様の一実施の形態では、捕捉剤は一次捕捉剤である。代替の実施の態様では、捕捉剤は二次捕捉剤である。この代替の実施の形態の一態様によると、本方法はさらに、回転させるステップの後に、一次捕捉剤を二次捕捉剤上に堆積させるステップを含む。この代替の実施の形態の別の態様では、本方法はさらに、一次捕捉剤を二次捕捉剤上に堆積させた後に、基板を培養するステップと、基板を回転させるステップとを含む。
この発明のさらに別の主な態様によると、クラスタ指定計数を行う光検定ディスクが提供される。光検定ディスクは、基板と、基板上に堆積された活性層と、接着部材により活性層に一体的に付着したカバーディスクまたはキャップ部（１つまたは複数の部分が除去されて、その間に１つまたは複数のチャンバが画定される）と、活性層上に固定された１つまたは複数の捕捉剤とを含む。捕捉剤は、１つまたは複数のチャンバ内に別個の捕捉領域を画定する。この検定ディスクの一実施の形態では、捕捉剤はクロスリンクシステムにより固定される。この検定ディスクの代替の実施の形態では、捕捉剤は活性層により固定される。
この光検定ディスクの１つの特定の実施の形態では、捕捉剤は、細胞表面抗原に対する選択的な親和性を有する抗体である。好ましい実施の形態では、捕捉剤は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５の抗体からなる群から選択される。この光検定ディスクの別の実施の形態では、捕捉剤は、細胞表面抗原に対する選択的な親和性を有する一次抗体に対する選択的な親和性を有する抗体である。同様に、光検定ディスクのこの態様の好まし
い実施の形態では、一次抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８，およびＣＤ４５の抗体からなる群から選択される。光検定ディスクのこの実施の形態では、一次捕捉剤は、マウス内で産生された抗ヒト抗体であり、二次抗体は、ヤギ内で産生された抗マウス抗体である。
本発明に関する技術的態様は、次の出願にも記載されている。すなわち、２００１年７月２４日に出願された「Optical Analysis Discs Including Microfluidic Circuits for
Performing Cell Counts」と題する米国仮出願第６０／３０７，４８９号、２００１年７月２５日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin, Plasma, or Poly-Lysine」と題する米国仮出願第６０／３０７，８２５号、２００１年７月２５日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents」と題する米国仮出願第６０／３０７，７６２号、２００１年７月２５日に出願された「Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs」と題する米国仮出願第６０／３０７，７６４号、２００１年７月２７日に出願された「Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３０８，２１４号、および２００１年７月２７日に出願された「Methods for Calculating Qualitative and Quantitative
Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３０８，１９７号にも記載されている。これらの出願のすべては、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。ここで、より詳細には、本発明はさらに、細胞検定を行うための光バイオディスクを対象とする。本発明の光バイオディスクは、以下の構成要素：回転可能な基板と、基板に関連したキャップ部と、上記基板と上記キャップ部の間に形成された流体回路とを含み得る。流体回路は、基板に関連した、注入ポートを含む混合チャンバと、混合チャンバと流体連通している精製チャンバと、当該精製チャンバに関連したフィルタ手段と、精製チャンバと流体連通している捕捉領域を有する分析チャンバと、分析チャンバに関連した排出ポートとを含むことができる。フィルタ手段は、微小球または細胞ふるい（cellular sieve）からできていてもよい。微小球は、精製剤で被覆されていてもよい。精製剤は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、オリゴヌクレオチド、リガンド、受容体、および結合剤を含むことができ、モノクローナル抗体は、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ３１抗体、および抗ＣＤ４３抗体であり得る。捕捉領域は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、オリゴヌクレオチド、リガンド、受容体、または結合剤であり得る捕捉剤で被覆される。モノクローナル抗体は、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、および抗ＣＤ２抗体であってよい。
光バイオディスクはまた、溶解緩衝液槽と、溶解緩衝液槽を混合チャンバに接続する流体流路の中に（between）溶解緩衝液弁とを有することができる。溶解緩衝液槽には、溶解緩衝液が予め充填されていてもよい。光バイオディスクはまた、分析緩衝液槽と、分析緩衝液槽を精製チャンバに接続する流体流路の中に分析緩衝液弁とを含むことができる。分析緩衝液槽には、分析緩衝液が予め充填されていてもよい。光バイオディスクはさらに、分析チャンバおよび排出ポートと流体連通している廃液(waste)チャンバを含んでいてもよい。光バイオディスクは、混合チャンバと精製チャンバとを接続する流体回路に位置するサンプル混合弁を有することもできる。本発明の上記の光バイオディスクに関するさらなる詳細は、図５９および図６０と共に以下で説明する。
上述の光バイオディスクは、混合チャンバと精製チャンバとを接続するＲＢＣ捕捉領域を含んでいてもよく、それにより、サンプルが混合チャンバにロードされるとサンプルが精製チャンバに入る前にＲＢＣ捕捉領域を通って流れるようになる。ＲＢＣ捕捉領域は、
ＲＢＣ捕捉領域全体に分布する支柱(pier post)を含んでいてもよい。ＲＢＣ捕捉領域は直線状の流路であってもよい。ＲＢＣ捕捉領域は、蛇行状、波状、または正弦曲線状（sinusoidal）であってもよい。ＲＢＣ捕捉領域は、レクチンを含むＲＢＣ捕捉剤で被覆され得る。このタイプの流体回路の例は、図６１Ａ、図６１Ｂ、および図６１Ｃに関して以下で説明する。
本発明はまた、以下の：全血サンプルを注入ポートを通して混合チャンバにロードし、バイオディスクを光読み取り装置にロードし、溶解緩衝液弁を開いて血液サンプルを含む混合チャンバに溶解緩衝液を放出するのに十分な第１の速度でバイオディスクを回転させ、サンプル中の赤血球が溶解されるのに十分な時間、上記溶解緩衝液中でサンプルを培養し、サンプル混合弁を開いて、サンプルを、不要な細胞が捕捉される精製チャンバを通して、特定の細胞が捕捉領域で捕捉される分析チャンバに移動させるのに十分な第２の速度でバイオディスクを回転させるステップ、を含む上述の光バイオディスクを使用する方法を対象とする。細胞が分析チャンバを通って移動すると、次に電磁放射入射ビームが捕捉領域に送られ得る。捕捉領域においてディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームは、その後検出され、次に、収集された信号が出力信号に変換されて分析され、捕捉領域において捕捉された細胞の数に関する情報が出力信号から抽出される。
本発明はまた、以下の：全血サンプルを上述の光バイオディスクの注入ポートを通して混合チャンバにロードし、バイオディスクを光読み取り装置にロードし、サンプルを、サンプル中の赤血球が捕捉されるＲＢＣ捕捉領域を通して、サンプル中の不要な細胞が捕捉される精製領域を通して、そして特定の細胞が捕捉領域で捕捉される分析チャンバに移動させるのに十分な速度で十分な時間の間、バイオディスクを回転させ、電磁放射入射ビームを捕捉領域に送り、捕捉領域においてディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、検出されたビームを出力信号に変換し、出力信号を分析し、それにより、捕捉領域において捕捉された細胞の数に関する情報を出力信号から抽出する、ステップ、を含む細胞検定を行う別の方法を対象とする。
本発明の光バイオディスクの別の実施の形態は、回転可能な基板と、基板に取り付けられたマイクロ流体カセット、およびマイクロ流体カセット内に形成された流体回路とを含む。マイクロ流体カセットは、組み立てられてマイクロ流体カセットを形成した時に、注入ポート、混合チャンバ、フロー流路、および精製チャンバを含む流体回路の種々の構成要素を形成する、種々の切取部分を有する板から形成される。マイクロ流体カセットに関するさらなる詳細は、図６２Ａ、図６２Ｂ、図６２Ｃ、および図６３に関して以下で説明する。
本発明はさらに、基板と、基板に平行なキャップと、混合チャンバと、精製チャンバ、および捕捉領域を有する分析チャンバの間に画定された分析チャンバ、および第１の捕捉領域が第１の細胞捕捉剤を有し、第２の捕捉領域が第２の捕捉剤を有するように、捕捉領域における基板上に配置された捕捉層、を有するバイオディスクを含む、サンプルを受け取るための光ディスクおよびドライブシステムを開示する。本システムは、ディスクの捕捉領域に向けて光を送る光源と、ディスクから反射した光またはディスクを透過した光を検出して、信号を供給する検出器と、信号を用いて捕捉分子に結合したサンプル中のアイテムを計数するプロセッサを有する光ディスクドライブを含む。
本発明のさらに別の態様は、細胞検定において用いる光バイオディスクを作成する方法を含む。このバイオディスクを作成する方法は、以下の：回転可能な光ディスク基板を形成し、基板と同様の寸法を有するカバーディスクを形成し、流体回路を形成する切取部分を有する流路層を形成し、ここで、流体回路は、注入口と、混合チャンバと、精製チャンバと、分析チャンバと、排出ポートとを含み、上記分析チャンバは捕捉領域を含む。本方
法はさらに、捕捉プローブを捕捉領域に結合させ、基板に流路層を取り付け、フィルタ手段を精製チャンバにロードし、流路層にカバーディスクを取り付け、それにより光バイオディスクを形成するステップ、を含む。カバーディスク、流路層、および基板の取り付けは、接着剤およびプラスチック溶接を用いて行うことができる。フィルタ手段は、精製剤で被覆された微小球および細胞ふるいからなっていてもよい。
上記説明した方法および装置は、１つまたは複数の利点を有することができる。これらの利点には、経験を積んだ技術者が試験を行う必要のない簡単で迅速なディスク上の処理、少ないサンプル容積、安価な用具の使用、ならびに既知の光ディスクフォーマットおよびドライブの製造の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの特徴および利点ならびに他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を添付図面の図および技術例と共に参照することにより、より良く理解される。
本発明のさらに別の目的は、当該目的に寄与する別の特徴および当該目的から生じる利点と共に、以下の本発明の好ましい実施の形態の説明から明らかになる。この好ましい実施の形態は、添付図面に示される。添付図面では、全体を通して、同じ参照番号は同じ構成要素を示す。
［発明の詳細な説明］
本発明は、ディスクドライブシステム、光バイオディスク、細胞検定および関連した細胞計数方法、画像処理技法、ならびに関連したソフトウェアを対象とする。以下では、本発明のこれらの態様のそれぞれをさらに詳細に論考する。
本明細書に開示されるディスクドライブシステム、光バイオディスク、細胞検定および関連した細胞計数方法、画像処理技法、ならびに関連したソフトウェアに関する本発明の態様は、以下の出願にも提示されている。すなわち、２００１年１１月１３日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including
Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３３８，６７９号、２００１年１１月１４日に出願された「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３３２，００１号、２００１年１１月３０日に出願された「Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３３４，１３１号、２００２年1月３１日に出願された「Methods
for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３５３，３００号、２００２年３月１２日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３６３，９４９号、および２００２年８月２１日に出願された「Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same」と題する米国仮出願第６０／４０４，９２１号にも提示されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
ドライブシステムおよび関連したディスク
図１は、本明細書で開示される細胞計数および分画細胞計数を行うために実施される本発明による光バイオディスク１１０の斜視図である。本光バイオディスク１１０は、光ディスクドライブ１１２および表示モニタ１１４と共に示される。このタイプのディスクドライブおよびディスク分析システムに関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００１年１１月９日に出願された「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs」と題する米国特許出願第１０／００８，１５６号、２００
２年１月１０日に出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題する米国特許出願第１０／０４３，６８８号、および２００２年１０月２４日に出願された「Segmented Area Detector for Biodrive and Methods Relating Thereto」と題する米国特許出願第１０／２７９，６７７号に開示されている。これらの出願のすべては、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
図２は、光バイオディスク１１０の一実施の形態の主要な構造上の要素の分解斜視図である。図２は、本発明で使用することができる反射領域の光バイオディスク１１０（以下「反射型ディスク」という）の例である。主要な構造上の要素には、カバーディスクまたはキャップ部１１６と、接着部材または流路層１１８と、基板１２０とが含まれる。カバーディスク１１６は、１つまたは複数の注入ポート１２２および１つまたは複数の排出ポート１２４を備える。カバーディスク１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図２の斜視図から見られるように、その底部は、反射面１４６（図４）で被覆されることが好ましい。好ましい実施の形態では、トリガマークまたはトリガマーキング１２６が、反射層１４２（図４）の表面上に備えられる。トリガマーキング１２６には、バイオディスクの３つの層すべての透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域が含まれ得る。これらの透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域は、情報により符号化される。この情報は、図１０に示すように、プロセッサ１６６にデータを送信し、次に、図６および図１０に示すように、呼びかけビームまたは入射ビーム１５２の操作機能とやり取りを行う。
図２に示す第２の要素は、流体回路１２８、すなわちＵ字型流路が形成された接着部材または流路層１１８である。この流体回路１２８は、膜に刻印するか、または、膜を切り取ってプラスチック薄膜を除去し、図示するような形状を形成することにより形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フロー流路または分析チャンバ１３０および帰還流路１３２を備える。図２に示す流体回路１２８の幾つかは、混合チャンバ１３４を備える。２つの異なる型の混合チャンバ１３４が示されている。第１のものは、フロー流路または分析チャンバ１３０に対して対称的に形成される対称混合チャンバ１３６である。第２のものは、オフセット混合チャンバ１３８である。このオフセット混合チャンバ１３８は、図示するように、フロー流路または分析チャンバ１３０の一方の側に形成される。
図２に示す第３の要素は、標的領域または捕捉領域１４０を備えた基板１２０である。基板１２０は、ポリカーボネート製であることが好ましく、図４に示すように、その最上部には反射層１４２が堆積されている。標的領域１４０は、図示した形状、あるいは、任意の所望の形状に反射層１４２を除去することにより形成される。あるいは、標的領域１４０は、反射層１４２を施す前に標的領域１４０区域をマスクすることを含むマスク技法によって形成することもできる。反射層１４２は、例えばアルミニウムまたは金といった金属から形成することができる。
図３は、図２に示す光バイオディスク１１０の平面図であり、ディスク内に位置する流体回路１２８、標的領域１４０、およびトリガマーキング１２６が見えるように、反射層１４２が、透明で示されたカバーディスクまたはキャップ部１１６上に示されている。
図４は、本発明の一実施の形態による反射領域型の光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。この図は、光バイオディスク１１０のさまざまな層の一部を含み、この一部は、それぞれの主要な層、基板、コーティング、または膜の部分断面図を示すために切り取られている。図４は、反射層１４２で被覆された基板１２０を示す。反射層１４２上には、活性層１４４が施される。好ましい実施の形態では、活性層１４４は、ポリスチレンから形成することができる。あるいは、ポリカーボネート、金、活性ガラス（activated gl
ass）、変性ガラス（modified glass）、または変性ポリスチレン、例えばポリスチレン無水マレイン酸（polystyrene-co-maleic anhydride）を使用することができる。さらに、ヒドロゲルを使用することができる。あるいは、この実施の形態に示すように、活性層１４４上には、プラスチック接着部材１１８を施す。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、切り取られたか、または、刻印されたＵ字型を示し、このＵ字型が流体回路１２８を生成する。本バイオディスクのこの反射領域の実施の形態の最後の主要な構造上の層は、カバーディスクまたはキャップ部１１６である。キャップ部１１６は、その底部に反射面１４６を備える。反射面１４６は、アルミニウムまたは金といった金属から作成することができる。
次に図５を参照して、本発明による透過型の光バイオディスク１１０の主要な構造上の要素の分解斜視図を示す。この透過型の光バイオディスク１１０の主要な構造上の要素も、同様に、カバーディスクまたはキャップ部１１６と、接着部材または流路部材１１８と、基板１２０の層を備える。カバーディスク１１６は、１つまたは複数の注入ポート１２２および１つまたは複数の排出ポート１２４を備える。カバーディスク１１６は、ポリカーボネート層から形成することができる。図６および図９に最もよく示すように、オプションのトリガマーキング１２６を、薄い半反射層１４３の表面に備えることができる。トリガマーキング１２６には、バイオディスクの３つの層すべての透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域が含まれ得る。これらの透明窓、不透明区域、または反射区域もしくは半反射区域は、情報により符号化される。この情報は、図１０に示すように、プロセッサ１６６にデータを送信し、次に、図６および図１０に示すように、呼びかけビーム１５２の操作機能とやり取りを行う。
図５に示す第２の要素は、流体回路１２８、すなわちＵ字型流路が形成された接着部材または流路層１１８である。この流体回路１２８は、膜に刻印するか、または、膜を切り取ってプラスチック薄膜を除去し、図示するような形状を形成することにより形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フロー流路または分析チャンバ１３０および帰還流路１３２を備える。図５に示す流体回路１２８の幾つかは、混合チャンバ１３４を備える。２つの異なる型の混合チャンバ１３４が示されている。第１のものは、フロー流路または分析チャンバ１３０に対して対称的に形成される対称混合チャンバ１３６である。第２のものは、オフセット混合チャンバ１３８である。このオフセット混合チャンバ１３８は、図示するように、フロー流路または分析チャンバ１３０の一方の側に形成される。
図５に示す第３の要素は、標的領域または捕捉領域１４０を備えることができる基板１２０である。基板１２０は、ポリカーボネート製であることが好ましく、図６に示すように、その最上部には薄い半反射層１４３が堆積されている。図５および図６に示すディスク１１０の基板１２０に関連した半反射層１４３は、図２、図３、および図４に示す反射型ディスク１１０の基板１２０上の反射層１４２よりもかなり薄くなっている。この薄い半反射層１４３により、呼びかけビーム１５２の一部は、図６および図１２に示すように、透過型ディスクの構造上の層を透過することができる。薄い半反射層１４３は、例えばアルミニウムまたは金といった金属から形成することができる。
図６は、図５に示す光バイオディスク１１０の透過型の実施の形態の基板１２０および半反射層１４３の拡大斜視図である。薄い半反射層１４３は、例えばアルミニウムまたは金といった金属から作成することができる。好ましい実施の形態では、図５および図６に示す透過型ディスクの薄い半反射層１４３は、約１００〜３００Åの厚さであり、４００Åを越えない。この薄い半反射層１４３により、入射ビームまたは呼びかけビーム１５２の一部は、半反射層１４３を貫通して、通過することが可能になり、それによって、図１０および図１２に示す上部検出器１５８によって検出される。一方、その光の一部が反射されて、すなわち入射経路に沿って戻される。以下に示すように、表２は、金の薄膜の厚
さに対する反射特性および透過特性を示している。金の薄膜層は、８００Åよりも厚くなると、完全反射となる。一方、光が金の薄膜を透過する閾値不透明度は、約４００Åである。
表２に加えて、図７は、金の厚さに基づく薄い半反射層１４３の反射特性および透過特性の逆の関係のグラフ表示を提供する。図７に示すグラフで使用される反射値および透過値は、絶対値である。
Figure 2005509882
次に図８を参照して、図５および図６に示す透過型光バイオディスク１１０の平面図を示す。透明なカバーディスクまたはキャップ部１１６は、ディスク内に位置する流体流路、トリガマーキング１２６、および標的領域１４０を見せている。
図９は、本発明の透過型ディスクの実施の形態による光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。このディスク１１０は、そのさまざまな層の一部が、それぞれの主要な層、基板、コーティング、または膜の部分断面図を示すために切り取られて示されている。図９は、透明なカバーディスクまたはキャップ部１１６と、基板１２０上の薄い半反射層１４３と、トリガマーキング１２６とを有する透過型ディスクフォーマットを示している。この実施の形態では、トリガマーキング１２６は、キャップの上部に配置された不透明材を備える。あるいは、トリガマーキング１２６は、ディスクの薄い反射層１４３にエッチングされた透明な非反射窓、または、図１０に示すトリガ検出器１６０から到来する信号を吸収する、すなわち反射しない任意のマークによって形成することができる。また、図９は、図示した形状、あるいは、任意の所望の形状で、指定した区域をマーキングすることにより形成される標的領域１４０も示している。標的領域１４０を示すマーキングは、基板１２０上の薄い半反射層１４３または（ディスクの下の）基板１２０の底部に作成す
ることができる。あるいは、標的領域１４０は、標的領域１４０を除く薄い半反射層１４３全体をマスクすることを含むマスク技法によって形成することもできる。この実施の形態では、標的領域１４０は、薄い半反射層１４３上のシルクスクリーンインクによって作成することができる。図５、図８、および図９に示す透過型ディスクフォーマットでは、別の方法として、標的領域１４０の範囲を、ディスクに符号化されたアドレス情報によって画定することができる。この実施の形態では、標的領域１４０は、物理的に見分けることができる端部境界を含まない。
図９を続けて参照して、薄い半反射層１４３上に施された活性層１４４を示す。好ましい実施の形態では、活性層１４４は、２％のポリスチレンからなる４０〜２００μｍの厚さの層である。あるいは、ポリカーボネート、金、活性ガラス、変性ガラス、または変性ポリスチレン、例えばポリスチレン無水マレイン酸を使用することができる。さらに、ヒドロゲルを使用することができる。この実施の形態に示すように、活性層１４４上には、プラスチック接着部材１１８が施される。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、切り取られたか、または、刻印されたＵ字型を示し、このＵ字型が流体回路１２８を生成する。
本バイオディスク１１０のこの透過型の実施の形態の最後の主要な構造上の層は、透明な非反射カバーディスクまたはキャップ部１１６である。このキャップ部１１６は、注入ポート１２２および排出ポート１２４を備える。
次に図１０を参照して、光コンポーネント１４８と、入射ビームまたは呼びかけビーム１５２を生成する光源１５０と、帰還ビーム１５４、そして透過ビーム１５６とを示すブロック斜視図を表示する。図４に示す反射バイオディスクの場合、帰還ビーム１５４は、光バイオディスク１１０のカバーディスク１１６の反射面１４６から反射される。本光バイオディスク１１０のこの反射型の実施の形態では、帰還ビーム１５４は、底部検出器１５７によって検出され、信号要素が存在する場合には分析される。他方、透過バイオディスクフォーマットでは、透過ビーム１５６が、上部検出器１５８によって検出され、信号要素が存在する場合には分析も行われる。透過型の実施の形態では、上部検出器１５８として、光検出器を使用することができる。
また、図１０は、ディスク上のトリガマーキング１２６とトリガ検出器１６０とを含むハードウェアトリガメカニズムも示している。このハードウェアトリガメカニズムは、反射バイオディスク（図４）および透過バイオディスク（図９）の双方で使用される。トリガメカニズムにより、プロセッサ１６６は、呼びかけビーム１５２がそれぞれの標的領域１４０にある場合にのみデータを収集することが可能になる。さらに、透過バイオディスクシステムでは、ソフトウェアトリガも使用することができる。このソフトウェアトリガは、呼びかけビーム１５２が、それぞれの標的領域１４０の端部に当たるとすぐに、底部検出器を使用して、プロセッサ１６６に信号を送り、データを収集する。さらに、図１０は、駆動モータ１６２と、光バイオディスク１１０の回転を制御するコントローラ１６４とを示している。また、図１０は、別の場合に実施されるプロセッサ１６６および分析装置１６８を示しており、これらは、帰還ビーム１５４と、透過型光バイオディスクに関連した透過ビーム１５６とを処理する。
図１１に示すように、本発明による光バイオディスク１１０の反射型ディスクの実施の形態の部分断面図が表されている。図１１は、基板１２０および反射層１４２を示している。上述したように、反射層１４２は、例えば、アルミニウム、金、または他の適切な反射材といった材料から作成することができる。この実施の形態では、基板１２０の上面は滑らかになっている。また、図１１は、反射層１４２上に施される活性層１４４も示している。また、図１１に示すように、標的領域１４０は、所望の場所の反射層１４２の区域
または一部を除去することによるか、あるいは、反射層１４２を施す前に所望の区域をマスクすることにより形成される。図１１にさらに示すように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４上に施される。また、図１１は、カバーディスク１１６、および、当該カバーディスク１１６に関連した反射面１４６も示している。したがって、カバーディスク１１６が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に貼付されると、それによって、フロー流路または分析チャンバ１３０が形成される。図１１に示す矢印により図示するように、入射ビーム１５２の経路は、最初、ディスク１１０の下から基板１２０の方向に向けられている。次いで、この入射ビームは、反射層１４２の近くの一点にフォーカシングする。このフォーカシングは、反射層１４２が存在しない場所では、標的領域１４０で起こるので、入射は、活性層１４４を通ってフロー流路または分析チャンバ１３０内に入る経路に沿って進み続ける。その後、入射ビーム１５２は、上方に進み続けてフロー流路を横切り、最終的には反射面１４６に入射する。この時点で、入射ビーム１５２は、入射経路に沿って戻され、すなわち反射されて帰還し、それによって帰還ビーム１５４を形成する。
図１２は、本発明によるバイオディスク１１０の透過型の実施の形態の部分断面図である。図１２は、透明カバーディスク１１６と、基板１２０上の薄い半反射層１４３とを有する透過型ディスクフォーマットを示している。また、図１２は、薄い半反射層１４３上に施された活性層１４４も示している。好ましい実施の形態では、この透過型ディスクは、約１００〜３００オングストロームの厚さの例えばアルミニウムまたは金といった金属から作成された薄い半反射層１４３を有し、４００オングストロームを越えることはない。この薄い半反射層１４３により、図１０に示す光源１５０からの入射ビームまたは呼びかけビーム１５２の一部は、ディスクを貫通して上方に通過することが可能になり、上部検出器１５８によって検出される。一方、光の一部は、反射され、入射ビームと同じ経路に沿って逆方向に戻る。この配置では、帰還ビームまたは反射ビーム１５４は、半反射層１４３から反射される。したがって、このようにして、帰還ビーム１５４はフロー流路または分析チャンバ１３０に入ることはない。反射光または帰還ビーム１５４は、図１３および図１４と共に、より詳細に説明するように、半反射層１４３内または半反射層１４３上に形成される事前に記録された情報トラック上の入射ビーム１５２を追跡するために使用することができる。図１２に示すディスクの実施の形態では、物理的に画定された標的領域１４０が存在してもよいし、存在しなくてもよい。標的領域１４０は、基板１２０上の薄い半反射層１４３上に作成される直接マーキングによって生成することができる。これらのマーキングは、シルクスクリーニングまたは任意の同等の方法を使用して形成することができる。標的領域を画定するのに物理的な印が使用されない（例えば、符号化されたソフトウェアアドレス指定が利用される場合）別の実施の形態では、フロー流路または分析チャンバ１３０は、実際には、検査特徴（investigational feature）の検査が行われる限られた標的区域として使用されてもよい。
図１３は、本発明によるバイオディスク１１０の反射型ディスクの実施の形態のトラックを横切った断面図である。この図は、ディスクの半径およびフロー流路に沿って縦方向に描かれている。図１３は、基板１２０および反射層１４２を含む。この実施の形態では、基板１２０は一連の溝１７０を備える。これらの溝１７０は、ディスクの中心近くから外側端部に向かって伸びる螺旋形状である。溝１７０は、呼びかけビーム１５２がディスクの螺旋溝１７０に沿って追従できるように実施される。この型の溝１７０は、「ウォブル溝」として知られている。波状の、または、波打つ側壁を有する底部は、溝１７０を形成する一方、高くなった、または、立ち上がった部分は、隣接する溝１７０を螺旋状に分離する。この実施の形態で溝１７０上に施された反射層１４２は、図示するように、性質上等角である。また、図１３は、反射層１４２上に施された活性層１４４も示している。図１３に示すように、標的領域１４０は、所望の場所の反射層１４２の区域または一部を除去することによるか、あるいは、反射層１４２を施す前に所望の区域をマスクすること
により形成される。図１３にさらに示すように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４上に施される。また、図１３は、カバーディスクまたはキャップ部１１６、および、当該カバーディスク１１６に関連した反射面１４６も示している。したがって、カバーディスク１１６が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に貼付されると、それによって、フロー流路または分析チャンバ１３０が形成される。
図１４は、例えば図１２に示すような本発明によるバイオディスク１１０の透過型ディスクの実施の形態のトラックを横切った断面図である。この図は、ディスクの半径およびフロー流路に沿って縦方向に描かれている。図１４は、基板１２０および薄い半反射層１４３を示している。この薄い半反射層１４３により、光源１５０からの入射ビームまたは呼びかけビーム１５２は、ディスクを貫通して通過することが可能になり、上部検出器１５８によって検出される。一方、光の一部が反射され、帰還ビーム１５４の形で戻る。薄い半反射層１４３の厚さは、ディスク読み取り装置がその追跡能力を維持するのに必要とされる反射光の最小量によって決定される。この実施の形態の基板１２０は、図１３で論考した基板と同様に、一連の溝１７０を備える。この実施の形態の溝１７０も、ディスクの中心近くから外側端部に向かって伸びる螺旋形状であることが好ましい。溝１７０は、呼びかけビーム１５２がこの螺旋に沿って追従できるように実施される。また、図１４は、薄い半反射層１４３上に施された活性層１４４も示している。図１４にさらに示すように、プラスチック接着部材または流路層１１８が、活性層１４４上に施される。また、図１４は、反射面１４６を有さないカバーディスクまたはキャップ部１１６も示している。したがって、キャップ部が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に貼付されると、それによって、フロー流路または分析チャンバ１３０が形成され、入射ビーム１５２の一部は、ほぼ反射されることなく、フロー流路１３０を通過することができる。
図１５は、反射型ディスクの全層と、反射型ディスクの最初の反射特性とを示す図１１と同様の図である。図１６は、透過型ディスクの全層と、透過型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１２と同様の図である。これらの切断面は、溝１７０に沿って切断されたものであるので、図１５および図１６には、溝１７０は見えない。図１５および図１６は、これらの実施の形態の溝１７０に垂直に位置する狭いフロー流路または分析チャンバ１３０が存在することを示している。図１３、図１４、図１５、および図１６は、それぞれの反射型ディスクおよび透過型ディスクの全層を示している。これらの図では、入射ビーム１５２が、最初に、基板１２０と相互作用することが示されている。基板１２０は、入射ビームの経路を図示するように変更して、反射層１４２または薄い半反射層１４３上でビーム１５２のフォーカシングを提供する屈折特性を有する。
細胞検定
血液サンプル中のＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の個体群の絶対数ならびにＣＤ４＋／ＣＤ８＋のリンパ球比を高速に求める汎用的な均質固相細胞捕捉検定法（generic homogeneous solid phase cell capture assay）が、本発明の方法を利用して実行可能である。この試験は、バイオディスクに組み込まれた小さなフロー流路内で行われ、全血から分離された７〜１５μｌの単核球（ＭＮＣ）において、捕捉領域上の特異的な抗体により捕捉されたＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ２＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、およびＣＤ４５＋細胞の数を求める。この試験は、ディスク上の特定の場所における局所的な細胞捕捉の原理に基づいている。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に基づく捕捉化学反応を特異的な血球表面の抗原に局所的に適用することにより、幾つかの特異的な細胞捕捉領域が、ディスク上に生成される。ＭＮＣ血液（１０，０００〜３０，０００細胞／μｌ）により２５〜１００μｌのチャンバを溢れさせると、ＣＤ４抗原、ＣＤ８抗原、ＣＤ２抗原、ＣＤ３抗原、ＣＤ１９抗原、およびＣＤ４５抗原を発現する細胞が、ディスク内の捕捉領域に捕捉される。また、捕捉領域には、画定したネガ
ティブコントロール区域も組み込まれる。サンプル中の細胞の分類および分析を対象とする他の関連態様は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年７月２５日に出願された「Optical Bio-disc Cell Sorter and Analyser」と題する米国仮出願第６０／３９８，４６４号に開示されている。この出願はその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
図１７Ａは、血液サンプルの分析を示す、イラストで表したフローチャートである。ステップ１で、４ｍｌまたは８ｍｌのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＣＰＴ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）および抗凝血剤内に血液（４〜８ｍｌ）を直接収集し、抗凝血剤としては、例えばＥＤＴＡ、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）、またはヘパリンといったものがある。本発明の別の実施の形態の等価なステップでは、抗凝血剤内の３ｍｌの血液を、例えばＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）１０７７といった分離勾配液１７６を含む管１７２内に、当該液の上に覆うように入れる。いずれの場合も、収集から２時間以内に血液サンプル１７４を使用することが好ましい。血液サンプル１７４が上を覆った分離勾配液１７６を含む管１７２を、水平ロータおよび回転動翼を有するバイオハザード遠心機内において、室温で３０分間、４００×ｇで遠心分離する。遠心分離後、単核球（ＭＮＣ）部１８０の上にある約２ｍｍの血漿を残して、血漿層１７８を除去する（ステップ２）。ＭＮＣ層１８０を収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって洗浄する。細胞を、室温で１０分間、２５０×ｇで遠心分離することによりペレットにして、残っているあらゆる血小板を除去する。上清液を除去し、管をそっと軽く叩くことによって、ＭＮＣペレット１８０を再度、ＰＢＳ内に懸濁させる。この最終的なペレット１８０を、バイオディスク１１０のフロー流路または分析チャンバ１３０の高さに応じて、１０，０００〜３０，０００細胞／μｌの細胞計数に再懸濁する（ステップ３）。
バイオディスク１１０のフロー流路または分析チャンバ１３０を、７μｌのＭＮＣ懸濁液で溢れさせ、混合チャンバの注入ポート１２２および排出ポート１２４（図３および図８）を接着タブまたは他の適切な密閉部材で密閉する（ステップ４）。バイオディスク１１０を室温で１５分間培養し、その後、バイオディスク１１０は、光ドライブ１１２の７８０ｎｍレーザを使用して走査され、捕捉フィールドが画像化される（ステップ５）。透過バイオディスク１１０を使用する場合、光ドライブ１１２は、任意選択で、捕捉フィールドを画像化するために上部検出器１５８（図１０）を備えることが理解されるべきである。ソフトウェアが、ディスクに符号化されて、以下のタスクを自動的に実行するようにドライブに指令することが好ましい。このタスクは、すなわち、（ａ）１つまたは複数の段階でディスクに遠心力を作用させて、結合していない過剰な細胞をスピン除去すること、（ｂ）特定の捕捉窓を表示モニタ１１４に画像化すること、および（ｃ）データを処理することである。データの処理には、各捕捉領域に特異的に捕捉された細胞を計数すること、および、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の比または求めるようにプログラムされたいずれかの比を導出することが含まれるが、これらに限定されるものではない。他の所望の比は、本発明の別の実施の形態によって容易に提供することができる。
図１７Ａにさらに示すように、本発明は、光ディスクおよびディスクドライブシステムを用いてクラスタ指定計数を行う方法を対象とする。この方法は、分離勾配液を含む第１の管に血液サンプルを供給し、この血液サンプルを層に分離するのに十分な時間および速度で第１の管を回転させ、Ｔ細胞を含むＭＮＣ層を再懸濁して、ＭＮＣ懸濁液を形成し、少なくとも１つの捕捉剤を含んだ少なくとも１つの捕捉領域を備えるディスク表面にＭＮＣ懸濁液のサンプルを供給し、このディスクを光学式読み取り装置にロードし、このディスクを回転させ、電磁放射入射ビームを捕捉領域に送り、捕捉領域でディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、この検出したビームを出力信号に変換し、この出力信号を分析し、捕捉領域で捕捉された細胞の数に関する情報を抽出するステップとを含む。この方法の一実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突
しなかった光が反射されるような反射層により構築される。この方法の別の実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が光ディスクを透過するように構築される。
分析／処理ステップの間、ソフトウェアは、各捕捉領域の画像を全体にわたって読み取り、細胞の画像に遭遇した時にその細胞の画像に印を付ける。例えば、ソフトウェアは、捕捉されたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の数の計数に続いて、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の細胞比を計算し、ＣＤ４＋捕捉領域、ＣＤ８＋捕捉領域、ＣＤ３＋捕捉領域、およびＣＤ４５＋捕捉領域の全血の１マイクロリットルあたりの細胞の絶対数と、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋の細胞比との双方を表示する。ディスクを光ドライブに挿入してから数および比を得るまでのプロセス全体に要する時間は、約１２分である。サンプル中の特定の細胞集団の定量に関する他の関連態様は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年５月２２日に出願された「Methods For Calculating Specific Populations Of Cells Captured In An Optical Bio-Disc」と題する米国仮出願第６０／３８２，３１９号、および２００２年５月２４日に出願された「Methods and Apparatus for Use in Detection and Qantitation of Cell Populations and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３８２，９４４号に開示されている。これらの出願はその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
一実施の形態では、ディスクは、符号化情報層として３００ｎｍの金で被覆されたフォワードＷｏｂｂｌｅ Ｓｅｔ ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０のＣＤ−Ｒディスクである。反射型ディスク上に、サイズ２×１ｍｍの楕円形の視界窓を、既知のリソグラフィー技法によって、反射層からエッチングする。透過型ディスクの設計の中には、個別の視界窓をエッチングせずに、ディスク全体を使用できるものがある。特定の一実施の形態では、接着層は、Ｆｒａｙｌｏｃｋ接着ＤＢＬ ２０１ Ｒｅｖ Ｃ３Ｍ９４６６１である。そのカバーは、半径２６ｍｍにおいて等距離に配置された直径０．０４０インチの４８個のサンプル注入口を有する透明ディスクである。このデータディスクは、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋計数ソフトウェアを使用して、４倍速および２．６７ＭＨｚのサンプリングレートでソフトウェアにより走査され読み取られる。
図１７Ｂを参照して、本発明の一実施の形態では、厚いポリスチレン層１１８を基板１２０上に形成し、（任意選択で）ストレプトアビジン１８２の層を形成する。細胞捕捉抗体は、ビオチンを通じてストレプトアビジン１８２に結び付く。これらの抗体には、捕捉抗体用の十分な数の結合部位を生成するために、ストレプトアビジン上に被覆されたデキストラン活性化アルデヒドと結び付いたビオチン化抗体が含まれ得る。これは、白血球（ＷＢＣ）と強固な接合を特異的に形成できる強力な捕捉化学反応を生み出す。
図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃは、本発明の一実施の形態で使用されるクロスリンクまたは結合システムのイラスト表現である。クロスリンクシステムには、１つまたは複数の高分子部分（macromolecular moiety）を別の高分子部分にクロスリンクする１つまたは複数のクロスリンク剤、受容体リガンド剤、または共役剤が必要であることが理解されるべきである。クロスリンクは、２つの間の共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよく、通常、２つの高分子のフリーラジカルが結合する時に形成され得る。クロスリンクを実現する化学修飾または共役プロセスは、ある官能基と別の官能基との反応を伴い、その結果、化学結合が形成される。反応型官能基または選択的な反応型官能基を有するバイオ共役（bioconjugate）試薬を生成することにより、標的分子の簡単で再現可能なクロスリンクまたはタグ付けの基礎が形成される（「Bioconjugate Techniques」, Greg T. Hermanson, Academic Press, San Diego, CA, (1996)）。
クロスリンク剤には、同種二機能性リンカ（homobifunctional linker）、異種二機能
性リンカ（heterobifunctional linker）、およびゼロレングスクロスリンカ（zero-length cross-linker）が含まれるが、これらに限定されるものではない。同種二機能性リンカは、同じ機能の２つの反応部位を有するリンカであり、例えばグルタルアルデヒドなどがある。これらの試薬は、双方の分子上の同じ共通基と反応して共有結合することにより、あるタンパク質を別のタンパク質に結合することができる。異種二機能性共役試薬は、タンパク質および他の高分子上の２つの異なる官能標的に結合できる２つの異なる反応基を含む。例えば、クロスリンカのある部分は、アミン活性基を含むことができる一方、別の部分は、スルフヒドリル活性基から構成することができる。その結果、クロスリンク反応を標的分子の選択部分に向けることができ、したがって、共役プロセス全体にわたってより良い制御を得ることができる。ゼロレングスクロスリンカは、原子を追加しない化学結合を形成することにより、２つの分子の共役を仲介する。したがって、分子の１つの原子は、リンカまたはスペーサが介在することなく、第２の分子の原子に共有結合によって結び付く。当業者は、クロスリンク剤の詳細な説明を得るために、「Bioconjugate Techniques」, Greg T. Hermanson, Academic Press, San Diego, CA, (1996)を参照することができる。
本発明では、クロスリンク剤をバイオディスクの表面に結合させて、標的領域内に捕捉剤を固定する。好ましいクロスリンクまたは結合システムは、ビオチンおよびアビジンからなる異種二機能性、すなわち、アビジン結合基板に結合したビオチン化捕捉剤である。図１８Ａは、アビジン１８２のイラスト表現である。制限なく、アビジンには、ストレプトアビジン、ニュートラビジン（neutravidin）、およびそれらを修飾したものが含まれる。図示するように、タンパク質は４つのサブユニットを備える。これらのサブユニットのそれぞれは、ビオチン用の１つの結合部位を含む（Hermanson）。アビジン１８２は、さまざまな化学反応によって、例えばポリスチレンといったプラスチックに結合することができる。アビジン１８２は、理想的には、バイオディスクの活性層１４４（図４および図９）に結び付き、ビオチン化検知分子（例えば抗体）に本質的に非可逆結合する。
図１８Ｂは、ビオチン１８４のイラスト表現である。ビオチン（すなわち、ビタミンＨ）は、あらゆる細胞内に少量存在する、自然に発生する成長因子である。ビオチンのタンパク質アビジン、ニュートラビジン、およびストレプトアビジンとの相互作用は、知られている最も強い非共有結合の１つである。ビオチン分子１８４は、そのバレリアン酸側鎖を介してタンパク質に直接結び付くこともできるし、スペーサアームおよびさまざまな反応基を生成する他の有機成分により誘導（derivitize）することもできる。アミン基、カルボン酸塩基、メルカプト基、および糖質基は、ビオチン誘導体の適切な選択を通じて特異的にビオチン化の標的にすることができる（Hermanson）。図１８Ｃは、ビオチン１８４がアビジン１８２と相互作用したものからなるクロスリンクシステムのイラスト表現である。
本発明の実施の形態の実施態様は、捕捉剤を利用して、本明細書に説明する検定を実行する。捕捉剤は、検体を検出するあらゆる高分子をいうことが理解されるべきである。本発明の捕捉剤には、対象となる検体に対して優先選択性を有する高分子、すなわち、対象となる検体に対して選択的な結合親和性を有する高分子が含まれる。捕捉剤には、合成核酸またはバイオ生成された核酸、および、合成タンパク質またはバイオ生成されたタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明が使用できる捕捉剤の例には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応生成物、またはこれらのヌクレオチドを結合したもの（キメラ）、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、細胞膜受容体、ならびに特異的な（例えばウィルス、細胞、または他の物質の）抗原決定基、薬物、ペプチド、コファクタ、レクチン、多糖類、細胞、細胞膜、および細胞小器官と反応する抗血清が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の捕捉剤は、抗体であることが好ましい。
抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、および組み換え生成された抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体は、生体内で産生することもできるし、生体外で産生することもできる。抗体の産生方法は、当業者に既知である。例えば、Antibody Production: Essential Techniques, Peter Delves (Ed.), John Wiley & Son Ltd, ISBN: 0471970107 (1997)を参照されたい。この出版物は、参照によりその全内容が本明細書に援用される。あるいは、抗体は、民間の供給源から得ることができ、例えば、ニュージャージー州フランダースのプレサントヒル通り０７８３６にあるResearch Diagnostics Inc.から得ることができる。本発明の抗体は、任意の１つの特定の種の抗体に限定されることが意図されているわけではなく、例えば、ヒト、マウス、ラット、およびヤギの抗体のすべてが、本発明によって検討される。本発明の一次抗体は、マウス内で産生された抗ヒト抗体であり、二次抗体は、ヤギ内で産生された抗マウス抗体であることが好ましい。
また、任意の、または、すべての抗体の型は、細胞表面抗原に結合するのに使用することができるので、用語「抗体」は、抗体の任意のクラスまたは任意のサブクラスをも含む。医療診断の技術における抗体の使用は、当業者に既知である。例えば、Diagnostic and
Therapeutic Antibodies (Methods in Molecular Medicine), Andrew J. T. George and
Catherine E. Urch (Eds.), Humana Press; ISBN: 0896037983 (2000)、および、Antibodies in Diagnosis and Therapy: Technologies, Mechanisms and Clinical Data (Studies in Chemistry Series), Siegfried Matzku and Rolf A. Stahel (Eds.), Harwood Academic Pub.; ISBN: 9057023105 (1999)を参照されたい。これらは、参照によりその全内容が本明細書に援用される。
本発明の少なくとも幾つかの実施の形態では、複数の捕捉剤を使用して、対象となる検体が検出される。図１８Ｄは、本発明の方法において二次捕捉剤１８６として使用されるＩｇＧクラスの抗体のイラスト表現である。本発明の二次捕捉剤には、別の捕捉剤に対する親和性を有し、対象となる検体に対する親和性を有する薬剤が含まれるが、これに限定されるものでないことが理解されるべきである。図１８Ｅは、ビオチン分子１８４に結合した二次捕捉剤ＩｇＧ１８６を示し、ビオチン分子に結合した二次捕捉剤ＩｇＧを、以下、ビオチン化ＩｇＧと呼ぶ。
図１８Ｆは、一次捕捉剤１８８のイラスト表現である。本発明の一次捕捉剤１８８は、対象となる検体に対する選択的な親和性を有することが理解されるべきである。一次捕捉剤は、白血球に対する親和性を有する抗体であることが好ましい。より具体的には、これらの抗体は、リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、好酸球（ＣＤ１５）、および対象となる他の細胞表面のマーカを対象とする。図１８Ｇは、ビオチン分子１８４に結合した一次捕捉剤１８８を示す。ＣＤ４およびＣＤ８に加えて、他の多くの細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ５６）に対する抗体が存在し、それらを使用して、リンパ球のサブタイプを識別することができる。
図１８Ｈは、ＣＤ４＋Ｔ細胞１９０のイラスト表現である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば、食作用を有するマクロファージおよび樹状細胞といった抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現される特異的な抗原に結合し、他の免疫系細胞をその区域に引き付けるリンフォカインを放出する。その結果、炎症が生じ、抗原物質を囲んで破壊しようとする細胞および分子の蓄積が生じる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、その細胞表面全体にわたって多数の抗原１９２を有することが理解されるべきである。一方、図１８Ｈは、４つの抗原１９２を有するＣＤ４＋Ｔ細胞１９０を示しているが、これは例示にすぎない。
図１８Ｉは、ＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のイラスト表現である。これらのＴ細胞は、結合し
た細胞を破壊する分子を分泌する。感染した細胞が、他の細胞に感染できる新たなウィルスの集団を放出する前に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それら感染した細胞を破壊するので、このＣＤ８＋Ｔ細胞の分子の分泌は、ウィルス感染との戦いにおいて重要である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、その細胞表面全体にわたって多数の抗原１９６を有することが理解されるべきである。一方、図１８Ｉは、４つの抗原１９６を有するＣＤ８＋Ｔ細胞１９４を示しているが、これは、例示にすぎない。
図１８Ｊは、アルデヒド活性化デキストランの３次元マトリックス（ＤＣＨＯ）１９８に結合し、それによって、ＤＣＨＯ抗体複合体１９９を形成する二次抗体１８６を示すイラスト表現である。デキストランは、主として、Ｄグルコースの繰り返し単位がグリコシド結合によって互いにリンクしたものからなる直線的な多糖類である。デキストランは、クロスリンク剤として幅広く使用され、その性質上、多価であることから、分子は、ポリマ鎖に沿っていくつかの部位で結び付くことが可能になる（Hermanson）。例示に過ぎないが、図１８Ｋに示すように、デキストラン１９８に結合した抗体１８６を図示する。
本発明の細胞検定に関する態様は、以下の米国仮出願にも開示されている。すなわち、２００１年７月２７日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３０８，１７６号、２００１年８月１５日に出願された「Methods for Quantitative and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells Including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３１２，２４８号、２００１年８月２０日に出願された「Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc Including Same」と題する米国仮出願第６０／３１３，５１４号、２００１年８月２０日に出願された「RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」と題する米国仮出願第６０／３１３，７１５号、２００１年８月２０日に出願された「RBC Sieving Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」と題する米国仮出願第６０／３１３，５３６号、および２００１年８月３０日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３１５，９３７号にも開示されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
実施態様Ｉ
図１９Ａ〜図１９Ｄは、本発明の第１の実施態様の検体捕捉のイラスト表現である。図１９Ａおよび図１９Ｂは、ビオチン化一次抗体（図１８Ｇ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の捕捉を示している。この抗体１８８は、クロスリンク剤のストレプトアビジン１８２によって、バイオディスク１１０の活性層１４４（図４および図９）上に固定される。図１９Ｃおよび図１９Ｄは、クロスリンクシステムを有さない本発明の同じ実施態様の別の実施の形態を示している。この実施の形態では、一次抗体１８８は、バイオディスク１１０の活性層１４４上に直接固定される。
図２０Ａ〜図２０Ｉは、本発明の第１の実施態様の実施の形態の構成を示す断面図である。第１の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用して、バイオディスクのフロー流路内に捕捉剤を固定する反射型ディスクの構成を伴う。図２０Ａを参照して、光バイオディスク１１０の光透過性基板１２０、反射層１４２、および活性層１４４を示す。反射層１４２の複数の部分を除去して（または堆積時に開口部を生成して）、視界窓２００を生成する。この視界窓２００を通って、光は、抗体が固定される捕捉領域１４０の場所に向
かうことができる。図２０Ａは、５つのこのような捕捉領域１４０を示している。その最初のものを捕捉領域１４１として示す。活性層１４４は、ポリスチレンであることが好ましく、反射層１４２の上にスピンコートして、あるいは当該技術分野において知られる方法によって堆積され、約４０〜３００マイクロメートルの厚さを有する滑らかな表面を形成する。次いで、ストレプトアビジン１８２を各捕捉領域１４０および１４１上に堆積させ、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２０Ｂ）。ディスク１１０を洗浄して、結合していないストレプトアビジン１８２を除去し、次いで、ディスク１１０をスピン乾燥して、ディスク１１０の表面から水分を完全に除去する（図２０Ｃ）。基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の捕捉領域１４１上に堆積させて、ビオチン化一次抗体１８８を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上に堆積させる（図２０Ｄおよび図２０Ｅ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する。結合していない抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２０Ｆ）。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる（図２０Ｇ）。カバーディスクまたはキャップ部１１６（図２）は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。カバーディスク１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する（図２０Ｇ）。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路または分析チャンバ１３０内に注入し、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２０Ｈ）。ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間という所定の時間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を真空を介して完全に除去する（図２０Ｉ）。
本発明の第１の実施態様の第２の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する反射型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の窓１４１の上に堆積させ、非ビオチン化一次抗体１８８（図１８Ｆ）を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上の活性層１４４（図２０Ａ）に直接堆積させる。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養する（図２０Ｅ）。結合していない抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２０Ｆ）。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。カバーディスクまたはキャップ部１１６（図２）は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。カバーディスク１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する（図２０Ｇ）。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路または分析チャンバ１３０内に注入して、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２０Ｈ）。ディスクを恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を真空を介して完全に除去する（図２０Ｉ）。図２１は、クロスリンクシステムを使用しない、完成した反射バイオディスク１１０の断面図を示している。
本発明の第１の実施態様の第３の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用してバイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基板１２０と、視界窓２００（図２０Ａ）を有さない半反射層１４３と、活性層１４４とが、図５に示すように設けられる。ストレプトアビジン１８２、ビオチン化一次抗体１８８、基準ドット２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上述したとおりであり、図２０Ｂ〜図２０Ｈに示すとおりである。接着部材１１８をそれぞれ活性層１４４に付着させる。光透過性カバーディスクまたはキャップ部１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成することができる。このカバーディスク１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク１１０内にフロー流路１３０を形成
する（図２０Ｇ）。図２２は、クロスリンクシステムを利用する、完成した透過バイオディスク１１０の断面図を示している。この第１の実施態様の第４の実施の形態は、当業者によって構築可能であることが理解されるべきである。この第４の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成（図２１および図２２）を伴う。
実施態様ＩＩ
図２３Ａ〜図２３Ｄは、本発明の第２の実施態様の検体捕捉のイラスト表現である。図２３Ａおよび図２３Ｂは、一次抗体１８８（図１８Ｆ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の捕捉を示している。この一次抗体１８８は、クロスリンク剤のストレプトアビジン１８２によって、バイオディスク１１０の活性層１４４（図４および図９）上に固定されるビオチン化二次抗体１８６（図１８Ｅ）に結合される。図２３Ｃおよび図２３Ｄは、クロスリンクシステムを有さない本発明の同じ実施態様の別の実施の形態を示している。この実施の形態では、二次抗体１８６は、バイオディスク１１０の活性層１４４上に直接固定される。
図２４Ａ〜図２４Ｌは、本発明の第２の実施態様の実施の形態の構成を示す断面図である。第１の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用して、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する反射型ディスクの構成を伴う。図２４Ａを参照して、光バイオディスク１１０の光透過性基板１２０、反射層１４２、および活性層１４４を示す。反射層１４２の複数の部分を除去して（または堆積時に開口部を生成して）、視界窓２００を生成する。この視界窓２００を通って、光は、抗体が固定される捕捉領域１４０の場所に向かうことができる。図２４Ａは、５つのこのような捕捉領域１４０を示している。その最初のものを捕捉領域１４１として示す。活性層１４４は、ポリスチレンであることが好ましく、反射層１４２の上にスピンコートして、約４０〜３００マイクロメートルの厚さを有する滑らかな表面を形成する。次いで、ストレプトアビジン１８２を各捕捉領域１４０および１４１上に堆積させ、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養する（図２４Ｂ）。ディスク１１０を洗浄して、結合していないストレプトアビジン１８２を除去し、次いで、ディスク１１０をスピン乾燥して、ディスク１１０の表面から水分を完全に除去する（図２４Ｃ）。基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の捕捉領域１４１上に堆積させて、ビオチン化二次抗体１８６を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上に堆積させる（図２４Ｄおよび図２４Ｅ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養する（図２４Ｅ）。結合していない二次抗体１８６をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２４Ｆ）。次いで、一次抗体１８８（図１８Ｆ）を各捕捉領域１４０上に堆積させる（図２４Ｇ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養する（図２４Ｈ）。結合していない一次抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２４Ｉ）。それぞれの接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。カバーディスクまたはキャップ部１１６（図２）は、ポリカーボネートから同様に形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。カバーディスク１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する（図２４Ｊ）。例えば、ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路または分析チャンバ１３０内に注入し、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２４Ｋ）。ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を真空を介して完全に除去する（図２４Ｌ）。
本発明の第２の実施態様の第２の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する反射型ディスク１１０の
構成を伴う。この実施の形態では、基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の窓１４１の上に堆積させ、非ビオチン化二次抗体１８６（図１８Ｄ）を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上の活性層１４４（図２４Ａ）に直接堆積させる。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２４Ｅ）。結合していない二次抗体１８６をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２４Ｆ）。次いで、一次抗体１８８（図１８Ｆ）を各捕捉領域１４０上に堆積させる（図２４Ｇ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２４Ｈ）。結合していない一次抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２４Ｉ）。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。前の実施の形態と同様に、この実施の形態のカバーディスクまたはキャップ部１１６も、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。カバーディスクまたはキャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する（図２４Ｊ）。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路または分析チャンバ１３０内に注入して、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２４Ｋ）。この実施の形態では、ディスクを恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を真空を介して完全に除去する（図２４Ｌ）。図２５は、クロスリンクシステムを使用しない、完成した反射バイオディスク１１０の断面図を示している。
本発明の第２の実施態様の第３の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用してバイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基板１２０と、視界窓２００（図２４Ａ）を有さない半反射層１４３と、活性層１４４とが、図５に示すように設けられる。ストレプトアビジン１８２、ビオチン化二次抗体１８６、一次抗体１８８、基準ドット２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上述したとおりであり、図２４Ｂ〜図２４Ｋに示すとおりである。接着部材１１８を活性層１４４に同様に付着させる。光透過性カバーディスクまたはキャップ部１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成することができる。このカバーディスク１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク１１０内にフロー流路１３０を形成する（図２４Ｊ）。図２６は、クロスリンクシステムを利用する、完成した透過バイオディスク１１０の断面図を示している。この第２の実施態様の第４の実施の形態は、当業者によって構築可能であることが理解されるべきである。この第４の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成（図２１および図２２）を伴う。
実施態様ＩＩＩ
図２７Ａ〜図２７Ｄは、本発明の第３の実施態様による検体捕捉のイラスト表現である。図２７Ａおよび図２７Ｂは、一次抗体１８８（図１８Ｆ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の捕捉を示している。この一次抗体１８８は、二次抗体１８６（図１８Ｄ）に結合し、二次抗体１８６は、ＤＣＨＯ１９８のストランドに結合して、図２８Ａの下に示すようなＤＣＨＯ抗体複合体１９９を形成する。ＤＣＨＯ抗体複合体１９９は、ＤＣＨＯ１９８によってクロスリンクされた１つまたは複数の抗体を含むことができる。バイオディスク１１０（図４および図９）の活性層１４４に二次抗体１８６の幾つかを結合させることを通じて、ＤＣＨＯ抗体複合体１９９を活性層１４４に固定する。図２７Ｃおよび図２７Ｄは、本発明の同じ実施態様の、二次抗体１８６を有さない別の実施の形態を示している。この実施の形態では、一次抗体１８８をＤＣＨＯに直接結合して、ＤＣＨＯ抗体複合体１９９を形成し、そして、このＤＣＨＯ抗体複合体１９９をバイオディスク１１０の活性層１４４に固定する。
図２８Ａは、抗体ＤＣＨＯ複合体の調製を示すイラストの流れ図である一方、図２８Ｂ
〜図２８Ｊは、本発明の第３の実施態様の一実施の形態の構成を示す複数の図である。この第３の実施態様の第１の実施の形態は、クロスリンク剤のＤＣＨＯを利用して、２つまたは３つ以上の捕捉剤をクロスリンクする反射型ディスクの構成を伴う。図２８Ａは、ＤＣＨＯ抗体複合体１９９の調製を示している。等しい濃度のＤＣＨＯ１９８および二次抗体１８６を混合して結合させ、それによって、ＤＣＨＯ抗体（二次）複合体１９９を形成する。図２８Ｂを参照して、光バイオディスク１１０の光透過性基板１２０、反射層１４２、および活性層１４４を示す。反射層１４２の複数の部分を除去して（または堆積時に開口部を生成して）、視界窓２００を生成する。この視界窓２００を通って、光は、抗体が固定される捕捉領域１４０の場所に向かうことができる。図２８Ｂは、５つのこのような捕捉領域１４０を示している。その最初のものを捕捉領域１４１として示す。活性層１４４は、ポリスチレンであることが好ましく、この活性層１４４を反射層１４２の上にスピンコートして、約４０〜３００マイクロメートルの厚さを有する滑らかな表面を形成する。この特定の実施の形態では、次いで、ＤＣＨＯ抗体複合体（二次）１９９を各捕捉領域１４０上に堆積させ、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２８Ｃ）。ディスク１１０を洗浄して、結合していないＤＣＨＯ抗体複合体（二次）１９９を除去し、次いで、ディスク１１０をスピン乾燥して、ディスク１１０の表面から水分を完全に除去する（図２８Ｄ）。基準ドット２０２を最初の捕捉領域１４１上に堆積させて、一次抗体１８８を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上に堆積させる（図２８Ｅ）。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する（図２８Ｆ）。結合していない一次抗体１８８をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する（図２８Ｇ）。接着部材または流路層１１８を活性層１４４に付着させる。上記実施の形態と同様に、図２に概略を示すカバーディスクまたはキャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。本実施の形態では、図２８Ｈに示すように、カバーディスクまたはキャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路または分析チャンバ１３０内に注入し、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する。このステップを図２８Ｉに示す。この実施の形態では、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養し、図２８Ｊに表すように、残っているあらゆる溶液を真空を介して完全に除去する。
本発明の製造態様によると、図２８Ａ〜図２８Ｊは、クラスタ指定の計数を行う光検定ディスクを作成する方法も示している。この光検定ディスクを作成する方法は、管にクロスリンカを提供し、管に捕捉剤を加え、クロスリンカと捕捉剤とを結合（複合体の形成）させ、基板を設け、活性層により基板を被覆し、複合体を活性層上に堆積させ、接着部材を使用して活性層にカバーディスクまたはキャップ部を取り付けるステップとを含む。この実施の形態では、クロスリンカは、アルデヒド活性化デキストランである。捕捉剤は、細胞表面抗原と結合するためのものである。別の実施の形態では、この捕捉剤は、細胞表面抗原に対する選択的な親和性を有する一次捕捉剤と結合するためのものである。好ましい実施の形態では、細胞表面抗原は、ＣＤファミリーの抗原から独立して選択される。より好ましい実施の形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５からなる群から独立して選択される。
本発明の第３の実施態様の第２の実施の形態は、二次抗体を使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に一次捕捉剤を固定する反射型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、等しい濃度のＤＣＨＯ１９８および一次抗体１８８を混合して結合させ、それによって、図２８Ａに表すＤＣＨＯ抗体（一次）複合体１９９を形成する。基準マークまたは検量線作成マーク２０２を最初の窓１４１上に堆積させて、ＤＣＨＯ抗体（一次）複合体１９９を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０にわたって活性層１４
４（図２８Ｃ）上に堆積させる。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養し、結合していないＤＣＨＯ抗体（一次）複合体１９９をＰＢＳ洗浄により除去する。図２８Ｄに示すように、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する。接着部材または流路層１１８を、同様にして、活性層１４４に付着させる。カバーディスクまたはキャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。図２８Ｈに示すように、カバーディスク１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路または分析チャンバ１３０内に注入し、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する（図２８Ｉ）。ディスクを恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養し、図２８Ｊに示すように、残っているあらゆる溶液を真空を介して完全に除去する。図２９は、二次抗体を使用しない、完成した反射バイオディスク１１０の断面図を示している。
本発明の第３の実施態様の第３の実施の形態は、クロスリンカＤＣＨＯを利用してバイオディスク１１０のフロー流路１３０内の捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基板１２０と、視界窓２００（図２８Ｂ）を有さない半反射層１４３と、活性層１４４とが、図５に示すように設けられる。ＤＣＨＯ抗体（二次）複合体１９９、一次抗体１８８、基準マークまたは基準ドット２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上述したとおりであり、図２８Ｃ〜図２８Ｉに示すとおりである。接着部材または流路層１１８を活性層１４４に付着させる。光透過性カバーディスクまたはキャップ部１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成することができる。このカバーディスクまたはキャップ部１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク１１０内にフロー流路１３０を形成する。図３０は、ＤＣＨＯ抗体（二次）複合体１９９および一次抗体１８８を利用する、完成した透過型バイオディスク１１０の断面図を示している。この第３の実施態様の第４の実施の形態は、当業者によって構築可能であることが理解されるべきである。この第４の実施の形態は、二次抗体を使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路内に一次捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成（図２９および図３０）を伴う。他の実施の形態は、ストレプトアビジン１８２（図１８Ａ）およびビオチン１８４（図１８Ｂ）を使用して、一次抗体または二次抗体をバイオディスク１１０の活性層１４４に固定することを伴うことができる。固定された抗体（一次および二次の双方）は、その後、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内の捕捉剤の濃度を増加させるために、ＤＣＨＯ１９８により複合体にすることができる。
実施態様ＩＶ
図３１Ａは、４つの流体回路１２８を示す光バイオディスク１１０の平面図である。各流体回路は、特異的な細胞表面マーカ用およびネガティブコントロール領域用の数個の捕捉領域１４０を有する。図示するように、各流体回路は、専用化されて、具体的にはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５を対象とする捕捉領域１４０を有する。他のあらゆる所望の細胞表面の抗原のパターンまたは組み合わせ、例えば他のＣＤマーカまたは細胞表面マーカ、を使用することもできる。この特定の実施態様では、それぞれの個別の流体回路について、その捕捉領域１４０のそれぞれは、単一の共通の捕捉剤のみを有することが必要とされる。図３１Ａに示すディスクは、図３１Ｂ〜図３１Ｅ、図４４Ａ〜図４４Ｄ、図４５、および図４６において後述する細胞捕捉化学反応および細胞捕捉方法と共に使用するのに特に適している。図３１Ａに表すバイオディスク１１０は、反射型ディスクであってもよいし、透過型ディスクであってもよい。
次に図３１Ｂ〜図３１Ｅに移って、本発明の第４の実施態様の検体捕捉のイラスト表現を示す。図３１Ｂおよび図３１Ｃは、ＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４の二次抗体１８６による捕捉を示し、これらは、一次抗体１８８（図１８Ｆ）と事前に結合し
て、一次抗体細胞複合体を形成している。一次抗体１８８は、クロスリンク剤のストレプトアビジン１８２によってバイオディスク１１０（図４および図９）の活性層１４４上に固定されたビオチン化二次抗体１８６（図１８Ｅ）に結合する。図３１Ｄおよび図３１Ｅは、本発明の同じ実態態様の、クロスリンクシステムを有さない別の実施の形態を示している。この実施の形態では、二次抗体１８６は、バイオディスク１１０の活性層１４４上に直接固定される。
図３２Ａ〜図３２Ｉは、本発明の第４の実施態様の一実施の形態の構成を示す断面図である。第１の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用して、バイオディスクのフロー流路内に捕捉剤を固定する反射型ディスクの構成を伴う。図３２Ａを参照して、光バイオディスク１１０の光透過性基板１２０、反射層１４２、および活性層１４４を示す。反射層１４２の複数の部分を除去して（または堆積時に開口部を生成して）、視界窓２００を生成する。この視界窓２００を通って、光は、抗体が固定される捕捉領域１４０の場所に向かうことができる。図３２Ａは、５つのこのような捕捉領域１４０を示している。その最初のものを捕捉領域１４１として示す。活性層１４４は、ポリスチレンであることが好ましく、この活性層１４４を反射層１４２の上にスピンコートして、約４０〜３００マイクロメートルの厚さを有する滑らかな表面を形成する。次いで、図３２Ｂに表すように、ストレプトアビジン１８２を各捕捉領域１４０および１４１上に堆積させて、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養する。図３２Ｃに示すように、ディスク１１０を洗浄して、結合していないストレプトアビジン１８２を除去し、次いで、ディスク１１０をスピン乾燥して、ディスク１１０の表面から水分を完全に除去する。基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の捕捉領域１４１上に堆積させて、図３２Ｄおよび図３２Ｅに示すように、ビオチン化二次抗体１８６を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上に堆積させる。次いで、この実施の形態では、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で約３０分間、室温で培養する。このステップを図３２Ｅに示す。結合していない二次抗体１８６をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する。本方法のこのステップを図３２Ｆに表す。接着部材または流路層１１８を活性層１４４に同様に取り付ける。それぞれのカバーディスクまたはキャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成されることが好ましく、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。図３２Ｇに示すように、カバーディスク１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路または分析チャンバ１３０内に注入して、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮断する。このステップを図３２Ｈに示す。ディスク１１０を恒湿チャンバ内で好ましくは３０分間、室温で培養し、図３２Ｉに表すように、残っているあらゆる溶液を真空を介して完全に除去する。
本発明の第４の実施態様の第２の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する反射型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基準マークまたは検量線作成ドット２０２を最初の窓１４１の上に堆積させ、非ビオチン化二次抗体１８６（通常図１８Ｄに示す）を、連続したそれぞれの捕捉領域１４０上の活性層１４４に直接堆積させる。次いで、ディスク１１０を恒湿チャンバ内で３０分間、室温で培養する。結合していない二次抗体１８６をＰＢＳ洗浄により除去し、ディスク１１０をスピン乾燥して、表面の水分を除去する。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。カバーディスクまたはキャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図４に最もよく示すように、その底部を反射面１４６により被覆することが好ましい。カバーディスク１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク内にフロー流路１３０を形成する。例えばＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）といった遮断剤２０４を各フロー流路または分析流路１３０内に注入して、活性層１４４に残っているあらゆる非特異的結合部位を迅速かつ効果的に遮
断する。ディスクを恒湿チャンバ内でおよそ３０分間、室温で培養し、残っているあらゆる溶液を真空を介して完全に除去する。図３３は、クロスリンクシステムを使用しない、完成した反射バイオディスク１１０の断面図を示している。
本発明の第４の実施態様の第３の実施の形態は、クロスリンクシステムを利用してバイオディスク１１０のフロー流路１３０内に捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成を伴う。この実施の形態では、基板１２０と、視界窓２００（図３２Ａ）を有さない半反射層１４３と、活性層１４４とが、図５に示すように設けられる。ストレプトアビジン１８２、ビオチン化一次抗体１８８、基準マーク２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上述したとおりであり、図３２Ｂ〜図３２Ｈに示すとおりである。接着部材１１８を活性層１４４に付着させる。光透過性カバーディスクまたはキャップ部１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成することができる。このカバーディスク１１６を接着部材１１８に一体的に付着させ、それによって、ディスク１１０内にフロー流路１３０を形成する（図３２Ｇ）。図３４は、クロスリンクシステムを利用する、完成した透過バイオディスク１１０の断面図を示している。この第４の実施態様の第４の実施の形態は、当業者によって構築可能であることが理解されるべきである。この第４の実施の形態は、クロスリンクシステムを使用せずに、バイオディスク１１０のフロー流路内に二次捕捉剤を固定する透過型ディスク１１０の構成（図３３および図３４）を伴う。
クラスタ指定の計数−実施態様Ｉ
図３５Ａは、４つの流体回路１２８を示す光バイオディスク１１０の平面図である。各流体回路は、４つの異なる特異的な細胞表面マーカ用および１つのネガティブコントロール領域用の数個の捕捉領域１４０を有する。図示するように、各流体回路は、専用化されて、それぞれの捕捉領域が具体的にはＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＣＤ４５を対象とする４つの捕捉領域１４０を有する。他のあらゆる所望の細胞表面の抗原のパターンまたは組み合わせ、例えば他のＣＤマーカまたは細胞表面マーカ、を使用することもできる。この特定の実施態様では、それぞれの個別の流体回路について、その捕捉領域１４０のそれぞれが、単一の共通の捕捉剤のみを有する必要があるという制限はない。これとは逆に、この実施態様では、捕捉領域は、異なる捕捉剤を有することが望ましい。これらの捕捉領域は、例えば、少なくとも２×２マトリックスを有する配列フォーマットで配置することができる。図３５Ａに示すディスクは、図３５Ｂ〜図３５Ｄ、図３６、図３７、図３８Ａ〜図３８Ｃ、図３９、図４０、図４１Ａ〜図４１Ｃ、図４２、および図４３において後述する細胞捕捉化学反応および細胞捕捉方法と共に使用するのに特に適している。図３５Ａに表すバイオディスク１１０は、反射型ディスクであってもよいし、透過型ディスクであってもよい。
次に図３５Ｂ〜図３５Ｄを参照して、本発明の第１の実施態様のバイオディスクを使用した、精製および洗浄を受けたＭＮＣサンプル（図１７Ａ）の分析を示す。図３５Ｂに表すように、バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、一次抗体１８８との接触を実現する。図３５Ｃに示すように、一次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２０Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、図３５Ｄの捕捉されたＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
図３６は、本発明の第１の実施態様の第２の実施の形態を使用した、図３５Ｂ〜図３５Ｄと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図３５Ｂ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、一次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図３５Ｃ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２０Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図３５Ｄ）と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
図３７は、本発明の第１の実施態様の第３の実施の形態を使用した、図３５Ｂ〜図３５Ｄと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図３５Ｂ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、一次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図３５Ｃ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２０Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図３５Ｄ）と相互作用し、透過ビーム１５６は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて送られる。
クラスタ指定の計数−実施態様ＩＩ
次に図３８Ａ〜図３８Ｃを参照して、本発明の第２の実施態様のバイオディスクを使用した、精製および洗浄を受けたＭＮＣサンプル（図１７Ａ）の分析を示す。図３８Ａに示すように、バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、一次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する。このステップを図３８Ｂに示す。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２４Ｌ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、図３８Ｃの捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
図３９は、本発明の第２の実施態様の第２の実施の形態を使用した、図３８Ａ〜図３８Ｃと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図３８Ａ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、一次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図３８Ｂ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２４Ｌ）から取り除かれる。光ディスク
ドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図３８Ｃ）と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
図４０は、本発明の第２の実施態様の第３の実施の形態を使用した、図３８Ａ〜図３８Ｃと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図３８Ａ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、一次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図３８Ｂ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２４Ｌ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図３８Ｃ）と相互作用し、透過ビーム１５６は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて送られる。
クラスタ指定の計数−実施態様ＩＩＩ
次に図４１Ａ〜図４１Ｃを参照して、本発明の第３の実施態様のバイオディスクを使用した、精製および洗浄を受けたＭＮＣサンプル（図１７Ａ）の分析を示す。図４１Ａに示すように、バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、一次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する。本方法のこのステップを図４１Ｂに示す。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２８Ｊ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、図４１Ｃの捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
図４２は、本発明の第３の実施態様の第２の実施の形態を使用した、図４１Ａ〜図４１Ｃと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図４１Ａ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、一次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図４１Ｂ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２８Ｊ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図４１Ｃ）と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
図４３は、本発明の第３の実施態様の第３の実施の形態を使用した、図４１Ａ〜図４１Ｃと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０をＭＮＣサンプルで溢れさせる（図４１Ａ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して
、一次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体は、試験サンプル内に存在する任意のＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と接触して、これらの細胞を捕捉する（図４１Ｂ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していないＴ細胞が、捕捉領域１４０（図２８Ｊ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４（図４１Ｃ）と相互作用し、透過ビーム１５６は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて送られる。
クラスタ指定の計数−実施態様ＩＶ
次に図４４Ａ〜図４４Ｄを参照して、本発明の第４の実施態様のバイオディスクを使用した、精製および洗浄を受けたＭＮＣサンプル（図１７Ａ）の分析を示す。図４４Ａは、一次抗体Ｔ細胞複合体の調製を示すイラストの流れ図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の双方を含むＭＮＣ懸濁液を一次抗体１８８と混合して、結合させ、それによって、一次抗体Ｔ細胞複合体を形成する。当業者には明らかなように、異なる表面マーカを有する他の細胞にも、現在の実施態様を使用してタグ付けを行うことができる。図４４Ｂに示すように、バイオディスク１１０のフロー流路１３０を一次抗体Ｔ細胞複合体で溢れさせる。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、バイオディスク１１０の活性層１４４に固定された二次抗体１８８との接触を実現する。図４４Ｃに示すように、二次抗体１８６は、一次抗体Ｔ細胞複合体に対する親和性を有し、これらの複合体を捕捉する。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していない複合体が、捕捉領域１４０（図３２Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、図４４Ｄの捕捉された複合体と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
図４４Ａ〜図４４Ｄは、本発明の方法の別の主要な態様も示している。図１７Ａに関連して、クラスタ指定の計数を行う別の方法を提供する。この方法は、（１）分離勾配液を含む管に血液サンプルを供給し、（２）この血液サンプルを層に分離するのに十分な時間および速度でこの管を回転させ、（３）Ｔ細胞を含むＭＮＣ層を再懸濁し、それによりＭＮＣ懸濁液を形成し、（４）このＭＮＣ懸濁液に一次抗体を加えるステップであって、それにより一次抗体Ｔ細胞複合体を形成し、（５）少なくとも１つの捕捉剤を含んだ少なくとも１つの捕捉領域を備えるディスク表面に一次抗体Ｔ細胞複合体のサンプルを供給し、（６）このディスクを光学式読み取り装置にロードし、（７）電磁放射入射ビームを捕捉領域に送り、（８）捕捉領域でディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、（９）この検出したビームを出力信号に変換し、（１０）この出力信号を分析し、それにより捕捉領域で捕捉された細胞の数に関する情報を抽出する、ステップを含む。この方法の一実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が反射されるような反射層により構築される。この方法の別の実施の形態では、光ディスクは、捕捉領域に送られて細胞に衝突しなかった光が光ディスクを透過するように構築される。
図４５は、本発明の第４の実施態様の第２の実施の形態を使用した、図４４Ａ〜図４４Ｄと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０を一次抗体Ｔ細胞複合体で溢れさせる（図４４Ｂ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、バイオディスク１１０の活性層１４４に固定された二次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体Ｔ細胞複合体に対し親和性を有する二次抗体１８６は、複合体を捕捉す
る（図４４Ｃ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していない複合体が、捕捉領域１４０（図３２Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉された複合体（図４４Ｄ）と相互作用し、帰還ビーム１５４は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて反射される。
図４６は、本発明の第４の実施態様の第３の実施の形態を使用した、図４４Ａ〜図４４Ｄと同じ試験サンプルの分析を示している。バイオディスク１１０のフロー流路１３０を一次抗体Ｔ細胞複合体で溢れさせる（図４４Ｂ）。毛管作用、外部アプリケータにより加えられる圧力、および／または遠心力（すなわち、曲線運動する物体に働く力であって、回転の中心もしくは曲率または回転軸から離れる方向に向いた力）が、試験サンプルに作用して、バイオディスク１１０の活性層１４４に固定された二次抗体１８８との接触を実現する。一次抗体Ｔ細胞複合体に対し親和性を有する二次抗体１８６は、複合体を捕捉する（図４４Ｃ）。光ドライブモータ１６２（図１０）が、ディスクをスピンさせ、これにより、結合していない複合体が、捕捉領域１４０（図３２Ｉ）から取り除かれる。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕捉された複合体（図４４Ｄ）と相互作用し、透過ビーム１５６は、処理および分析のために、検出器１５７（図１０）に向けて送られる。
当業者は、これらの教示に鑑みて、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、本発明の方法の１つまたは複数の実施態様の１つまたは複数の実施の形態を組み合わせることが可能であることを理解するであろう。
細胞検出および関連するソフトウェア
図４７を参照して、サンプルを保持するための流体回路１２８を備えた光バイオディスク１１０を示す。また、図４７は、異なる捕捉領域または標的領域１４０および標的領域１４１を示すために拡大した流体回路４７も示している。標的領域１４１は、基準マークまたは検量線作成ドット２０２を備える。この特定の実施の形態では、５つの捕捉領域１４０が使用される。各捕捉領域は、それぞれ、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、およびネガティブコントロールとしてのミオグロビンを捕捉するように実施される。
図４８Ａは、６つの捕捉領域１４０を備えた異なる実施の形態から得られる画像である。各捕捉領域は、それぞれ、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ１５＋細胞、ＣＤ４＋細胞、およびＣＤ８＋細胞をそれぞれ捕捉するように実施されるものと、ＣＤ＋１５細胞用の第２の捕捉領域と、ＣＤ４５＋細胞用の第２の捕捉領域である。この実施の形態では、２つのＣＤ４５捕捉領域およびＣＤ１５捕捉領域を確認制御またはチェックとして使用し、捕捉効率の結果および予想計数の結果が一致していることを検証することができる。また、図４８Ａは、ＣＤ４、ＣＤ８、および制御の拡大図によって一連の細胞表面の抗原を示している。ここに示すように、画像は、背景フィールドに対して示された複数の細胞からなる。図４８Ｂは、本発明によるバイオディスクから得られた画像と比較した実際の顕微鏡画像の制御領域、ＣＤ４捕捉領域、およびＣＤ８捕捉領域の拡大図である。図４９は、実際の顕微鏡画像と、本発明による対応するバイオディスク画像との別の比較を、より詳細に示している。図４８Ｂおよび図４９に表すように、本発明者等は、顕微鏡から得ることができる品質および解像度と比較して、バイオディスク画像が、それに等しい品質および解像度を有することに確認した。したがって、これらの画像は、本発明の装置および方法を使用して、背景に対して個々の細胞を可視化できることを実証している。検査特徴を検出する方法は、本発明の譲受人に譲渡された、共に「Signal Processing Apparatus and Methods for Obtaining Signal Signatures of Investigational Features Detected on a Surface of an Optical Disc Assembly」と題し、それぞれ、２００１年２月２日および２００
１年５月１８日に出願されている米国仮出願第６０／２７０，０９５号および第６０／２９２，１０８号、ならびに本発明の譲受人に譲渡された「Optical Disc Analysis System
Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題し、２００２年１月１０日に出願されている米国特許出願第１０／０４３，６８８号に、より詳細に記載されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
これらの細胞は、さまざまな異なる方法の１つを通じて検出することができる。この方法は、例えば、エッジ検出ハードウェアまたはエッジ検出ソフトウェアを使用して、透過光または反射光の十分大きなレベルの変化を検出して計数し、したがって、遷移、ゆえに細胞を計数することを含む。以下に、より詳細に説明する別の方法は、画像認識ソフトウェアまたはパターン認識ソフトウェアを使用して、背景に対して細胞を識別するものである。画像認識は、ＷＢＣをＲＢＣと区別することができ、また、好中球、単球、好塩基球、好酸球、顆粒球、およびリンパ球をも区別することができる。
１．６マイクロメートル程度離れたトラックを有する光ディスクを使用して、ディスク上の細胞または集合体を画像化することができる。例えば、白血球は、通常、少なくとも５トラック分から１２トラック分ほどの直径を有するので、その白血球の画像を得ることができる。
このような画像を得るために、図２、図３、および図４に示すタイプの透過型ディスクを使用することができ（ただし、反射型ディスクも使用できる）、トリガセンサ１６０および上部検出器１５８を備えた図１０に示すタイプのディスクドライブシステムを使用することができる。トリガ検出器１５８は、透過型ディスクのトリガマーク１２６を検出し、そのマークが検出されると、データの収集および／または処理を行うコンピュータに信号を供給する。光源が、視界窓のトラックを通過すると、画像が、受信された透過光として得られる。この場合の上部検出器は、単一の検出器であってもよいし、半径方向および／または円周方向に向いた複数の検出器エレメントからなる配列であってもよい。このような検出器および検出方法は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された以下の出願に記載されている。すなわち、２０００年１１月９日に出願された「Optical Disc Drive For Bio-Optical Disc」と題する米国仮出願第６０／２４７，４６５号、２００１年５月２２日に出願された「Disc Drive Assembly For Optical Bio-Discs」と題する米国仮出願第６０／２９３，０９３号、および２００１年１１月９日に出願された「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs」と題する米国特許出願第１０／００８，１５６号に記載されている。これらの出願のそれぞれは、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
図４８Ａ、図４８Ｂ、および図４９のような画像が得られた後、その画像データを、所望の特徴を識別するように設計された画像認識ソフトウェアによってさらに処理することができる。この画像認識ソフトウェアは、細胞を背景と区別する能力だけでなく、ある型の細胞を別の型の細胞と区別する能力を有することがさらに望ましい。
次に図５０を参照して、赤血球および白血球の双方を含む検査データから得られた画像を示す。拡大図に示すように、これらの白血球および赤血球は、明らかに区別可能な特徴を有し、したがって、背景に対して検出することができ、画像認識によって互いを区別することもできる。さらに、リンパ球、単球、好中球、好酸球、顆粒球、および好塩基球を含む白血球の型を、互いに区別することも可能である。
図５１は、多数の細胞を有するサンプルフィールドを示し、プラス記号は、細胞として識別されたそれぞれの対象物を示している。あらゆる領域または任意の数の所望の領域について、細胞の数が検出された後、その結果の細胞計数データは、単一のスクリーンに表
示することができる。このスクリーンは、例えば図５２に示す表現といった見易い表現を提供する。図５２に示すように、具体的な細胞計数は、棒グラフと共に提供され、相対的な細胞数が明示される。ＣＤ４／ＣＤ８分析の場合、システムは、ＣＤ４／ＣＤ８比と共に、他の任意の所望の数学計算または比較も生成することができる。図５３は、画像フィールド内の細胞が、ＣＤ４計数、ＣＤ８計数、および比に変換されているところを示すプロセスの別のビューを提供し、その出力は、比が正常な範囲内にあることを示している。
細胞検出および関連した処理方法に関する本発明の態様は、以下の米国仮出願にも開示されている。すなわち、２００１年８月３１日に出願された「Capture Layer Assemblies
and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３１６，２７３号、２００１年９月７日に出願された「Methods for Imaging Blood cells, Blood-Borne Parasites and Pathogens, and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３１８，０２６号、２００１年９月１４日に出願された「Optical Analysis Discs Including Microfluidic Circuits for Performing Cell Counts」と題する米国仮出願第６０／３２２，５２７号、２００１年９月１１日に出願された「Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including
Lymphocytes」と題する米国仮出願第６０／３２２，０４０号、２００１年９月１２日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of
Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３２２，８６３号、および２００１年９月１７日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin, Plasma, or Poly-Lysine」と題する米国仮出願第６０／３２２，７９３号に開示されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
分画細胞計数方法および関連するソフトウェア
光ディスクデータを使用した白血球計数用の複数の方法および関連するアルゴリズムを本明細書でさらに詳細に論考する。これらの方法および関連するアルゴリズムは、白血球の計数に限定されるものではなく、任意の型の細胞物質の計数を行うことに容易に適用することができる。この細胞物質には、赤血球、白血球、ビーズ（beads）、および光学式読み取り装置によって検出できる同様の光シグネチャ（optical signature）を生成する生物および非生物の双方の他の任意の対象物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
図５４〜図５８を参照して説明する本発明に関する方法およびアルゴリズムの以下の説明は、例示の目的で、白血球の計数を対象とする。幾つかを変更することにより、これらの方法およびアルゴリズムを、他の型の細胞、すなわち白血球と同様のサイズの対象物の計数に適用することができる。この細胞計数方法およびアルゴリズムのデータ評価の態様を本明細書で一般的に説明し、本発明の方法および装置の関連する背景を提供する。光バイオディスクから検査データを取り込んで処理する方法およびアルゴリズムは、一般の広い適用性を有し、本発明の譲受人に譲渡された次の米国仮出願にさらに詳細に開示されている。すなわち、２００１年５月１６日に出願された「Variable Sampling Control For Rendering Pixelation of Analysis Results In Optical Bio-Disc Assembly And Apparatus Relating Thereto」と題する米国仮出願第６０／２９１，２３３号および「Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same」と題する米国仮出願第６０／４０４，９２１号に開示されている。前者の出願は、参照により本明細書に援用され、後者の出願は、上記で援用したものである。以下の論考では、簡単な説明により、これらの方法およびアルゴリズムの基本的な方式を提示する。図１０に示すように、生物試験サンプルの属性に関する情報は、試験サンプルとの相互作用により変更または変調を受けた電磁放射ビームの形で、光バイオディスク１１０
から取り出される。図２、図３、図４、図１１、図１３、および図１５と共に論考した反射型光バイオディスクの場合、帰還ビーム１５４が、生物サンプルに関する情報を運ぶ。上述したように、このような生物サンプルに関する情報は、基本的に、入射ビームが、フロー流路または分析チャンバ１３０または標的領域１４０内にあり、したがって、サンプルと接触した時にのみ、帰還ビーム１５４に含まれる。バイオディスク１１０の反射型の実施の形態では、帰還ビーム１５４は、反射層１４２内もしくは反射層１４２上に符号化された情報、または、それ以外に図１３および図１４に示すウォブル溝１７０に符号化された情報も運ぶことができる。当業者には明らかなように、対応する入射ビームが、反射層１４２と接触した時にのみ、事前に記録された情報が、標的領域を有する反射型ディスクの帰還ビーム１５４に含まれる。情報を有する反射層１４２が除去されている区域、または、それ例外に存在しない区域に、入射ビーム１５２が存在する場合、このような情報は、帰還ビーム１５４に含まれない。図５、図６、図８、図９、図１２、図１４、および図１６と共に論考した透過型光バイオディスクの場合、透過ビーム１５６が、生物サンプルに関する情報を運ぶ。
図１０の参照を続けて、生物試験サンプルに関する情報は、その情報が、反射型ディスクの帰還ビーム１５４から得られようと、透過型ディスクの透過ビーム１５６から得られようと、信号処理用のプロセッサ１６６に送られる。この処理は、底部検出器１５７（反射型ディスク）または上部検出器１５８（透過型ディスク）によって検出されたアナログ信号の離散的なデジタル形式への変換を含む。
次に図５４を参照して、この信号変換は、一定の時間間隔２１２でアナログ信号２１０をサンプリングすること、および、その信号の対応する瞬時アナログ振幅２１４を離散的なバイナリ整数２１６として符号化することを含む。サンプリングは、ある開始時刻２１８で開始され、ある終了時刻２２０で停止される。任意のアナログ−デジタル変換プロセスと関連した２つの共通の値は、サンプリング周波数およびビット深度である。サンプリング周波数は、サンプリングレートとも呼ばれ、単位時間当たりに取り込まれるサンプル数である。サンプリング周波数が高いほど、連続したサンプル間の時間間隔２１２は小さくなり、その結果、元のアナログ信号２１０と比べたデジタル信号２２２の忠実度は高くなる。ビット深度は、アナログ信号２１０のサンプリングされた振幅２１４を符号化するために各サンプル点で使用されるビット数である。ビット深度が大きいほど、バイナリ整数２１６は、元のアナログ振幅２１４をより良く近似することになる。本実施の形態では、サンプリングレートは、８ＭＨｚであり、ビット深度は、１つのサンプル当たり１２ビットである。これにより、０から４０９５（０から（２ｎ−１））の範囲の整数サンプルが可能になる。ここで、ｎは、ビット深度である。この組み合わせは、他の実施の形態で必要な特定の精度に適合するように変更することができる。一例であって、これに限定されるものではないが、一般に細胞よりも小さなビーズを計数する方法を含む実施の形態では、サンプリング周波数を増加させることが望ましいことがある。次いで、サンプリングされたデータは、アナログ／デジタル変換のためにプロセッサ１６６に送信される。
アナログ／デジタル変換の間、レーザの経路に沿って連続したそれぞれのサンプル点２２４は、一次元配列２２６としてディスクまたはメモリに連続的に記憶される。連続したそれぞれのトラックは、独立した一次元配列を与え、この一次元配列は、画像に類似した二次元配列２２８（図５７Ａ）を生成する。
図５５は、本発明の光バイオディスク１１０の斜視図であり、指定部分の拡大詳細斜視図は、捕捉された白血球２３０が、この光バイオディスクのトラック２３２を基準として位置することを示している。図示するように、入射ビーム１５２の白血球２３０との相互作用により、信号を含むビームが、反射型ディスクの帰還ビーム１５４または透過型ディスクの透過ビーム１５６のいずれかの形で生成され、これが、検出器１５７または１５８
のいずれかで検出される。
図５６Ａは、図５５に示す光バイオディスク１１０のトラック２３２を基準にして位置する白血球２３０の別のグラフ表示である。図５５および図５６Ａに示すように、白血球２３０は、約４つのトラックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに及んでいる。図５６Ｂは、図５５および図５６Ａの白血球２１０から得られた一連のシグネチャトレース（signature trace）を示している。図５６Ｂに示すように、検出システムは、トラックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対応した４つのアナログ信号Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを供給する。図５６Ｂにさらに示すように、アナログ信号Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのそれぞれは、白血球２３０に関する特定の情報を運ぶ。したがって、図示するように、白血球２３０を走査することにより、区別可能で（distinct）、かつ、検出および処理が可能な乱れが入射ビームに生じる。次いで、アナログシグネチャトレース（信号）２１０は、図５７Ａおよび図５７Ｃに示すような類似したデジタル信号２２２に変換するためにプロセッサ１６６に送られる。図５７Ａおよび図５７Ｃについては、以下にさらに詳細に論考する。
図５７は、図５７Ａ、図５７Ｂ、図５７Ｃ、および図５７Ｄの間の関係を示すグラフ表示である。図５７Ａ、図５７Ｂ、図５７Ｃ、および図５７Ｄは、図５６Ｂからのシグネチャトレースのデジタル信号２２２への変換のイラストによるグラフ表示である。このデジタル信号２２２は、一次元配列２２６として記憶されており、データ入力２４４用に二次元配列２２８に結合される。
次に図５７Ａを特に参照して、図５５および図５６Ａに示す光バイオディスクのトラックＡおよびＢからのサンプリングされたアナログ信号２１０を示す。プロセッサ１６６は、次に、アナログ信号２１０の対応する瞬時アナログ振幅２１４を、離散的なバイナリ整数２１６として符号化する（図５４参照）。その結果の一連のデータ点が、サンプリングされたアナログ信号２１０に類似したデジタル信号２２２である。
次に図５７Ｂを参照して、トラックＡおよびＢ（図５７Ａ）から得られたデジタル信号２２２は、独立した一次元メモリ配列２２６として記憶される。連続したそれぞれのトラックは、対応する一次元配列を与える。この一次元配列が、先行する一次元配列と結合されると、画像に類似した二次元配列２２８が生成される。次いで、このデジタルデータは、サンプル点２２４（図５４）からなる二次元配列２２８としてメモリまたはディスクに記憶される。サンプル点２２４は、サンプル区域内の特定の点における帰還ビーム１５４または透過ビーム１５６（図５５）の相対的な強度を表すものである。次いで、二次元配列は、図５７Ｂに表すような生のファイルまたは画像ファイル２４０の形でメモリまたはディスクに記憶される。次いで、画像ファイル２４０に記憶されたデータは、取り出されてメモリに与えられ（２４２）、図１０に示す分析装置１６８へのデータ入力２４４として使用される。
図５７Ｃは、図５５および図５６Ａに示す光バイオディスクのトラックＣおよびＤからのサンプリングされたアナログ信号２１０を示している。プロセッサ１６６は、次に、アナログ信号２１０の対応する瞬時アナログ振幅２１４を、離散的なバイナリ整数２１６として符号化する（図５４）。その結果の一連のデータ点が、サンプリングされたアナログ信号２１０に類似したデジタル信号２２２である。
次に図５７Ｄを参照して、トラックＣおよびＤから得られたデジタル信号２２２は、独立した一次元メモリ配列２２６として記憶される。連続したそれぞれのトラックは、対応する一次元配列を与える。この一次元配列が、先行する一次元配列と結合されると、画像に類似した二次元配列２２８が生成される。上述したように、このデジタルデータは、次に、サンプル点２２４（図５４）からなる二次元配列２２８としてメモリまたはディスク
に記憶される。サンプル点２２４は、サンプル区域内の特定の点における帰還ビーム１５４または透過ビーム１５６（図５５）の相対的な強度を表すものである。次いで、二次元配列は、図５７Ｂに表すような生のファイルまたは画像ファイル２４０の形でメモリまたはディスクに記憶される。上記に示したように、画像ファイル２４０に記憶されたデータは、次に、取り出されてメモリに与えられ（２４２）、図１０の分析装置１６８へのデータ入力２４４として使用される。
本発明の計算アルゴリズムおよび処理アルゴリズムは、分析装置１６８（図１０）に記憶され、入力データ２４４に適用されて、有用な出力結果２６２（図５８）を生成する。この出力結果は、表示モニタ１１４（図１０）に表示することができる。次に図５８を参照して、本発明の処理方法および計算アルゴリズムによるデータ評価の主要なステップの論理フローチャートを示す。本処理方法の最初の主要なステップは、入力データ２４４を受信することを含む。上述したように、データ評価は、０から４０９６の範囲の整数の配列から開始する。
次の主要なステップ２４６は、計数を行うディスクの区域を選択することである。この区域が画定されると、次の目的は、画定した区域に含まれる全白血球を実際に計数することになる。ステップ２４６の実施態様は、ディスクの構成またはユーザの選択に依存する。一例であって、これに限定されるものではないが、図２および図５に示す例えば標的領域１４０といった窓を有するディスクを使用する本発明の実施の形態では、ソフトウェアは、その窓を認識し、分析および計数を行うためにその窓の部分をクロッピングする。好ましい一実施の形態、例えば図２に示す実施の形態では、標的領域または窓は、半円形の部分がその各端部にある１×２ｍｍの長方形の形状を有する。この実施の形態では、ソフトウェアは、それぞれの窓の内部に１×２ｍｍの標準長方形の区域をクロッピングする。この実施の形態の一態様では、読み取り装置は、連続した数個のサンプル値を取り込んで、数個の異なる窓での細胞数を比較することができる。
図５、図６、図８、および図９に示すように、窓を有さない透過型ディスクを使用する本発明の実施の形態では、２つの異なる方法の一方でステップ２４６を実行することができる。固定座標を有する点を基準にしてその中心の位置を特定することによるか、または、基準マーク２０２（例えば、図２４Ｌ、図２５、および図２６を参照）を検出することによるかのいずれかで、標準長方形の位置が選択される。この基準マークは、暗い色素の点である。基準マーク２０２が使用される場合には、所望のコントラストを有する色素を、細胞の２つのクラスタに関するディスクの特定の位置１４１（例えば図２０Ｅ）に堆積させる。次いで、光ディスク読み取り装置を、それら細胞のクラスタの一方の中心にスキップするように指示し、次いで、標準長方形を、選択したクラスタの中心にする。
ステップ２４６に関して上述したユーザの選択について、ユーザは、マウス選択または他の方法で直接対話することにより、細胞計数を行う所望のサンプル区域の形状、例えば長方形区域を指定することができる。このソフトウェアの本実施の形態では、これは、マウスを使用して、モニタ１１４に表示される、光バイオディスク導出画像の所望の部分の上に長方形をクリックしてドラッグすることを含む。評価区域の選択方法にかかわらず、それぞれの長方形区域は、次のステップ２４８で計数を行うために評価される。
図５８の３番目の主要なステップは、ステップ２４８であり、このステップは、背景の照度を一様化することを対象にする。このプロセスは、幾つかのハードウェア構成で引き起こされて起こり得る背景の一様性のばらつきを補正する。背景照度の一様化により、背景全体、すなわち細胞でない画像の部分が、ある任意の背景値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを有する平面に近づくように、各サンプル点の強度レベルが補われる。Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、多くの方法で決定することができ、例えば、標準長方形サンプル区域全体にわた
って平均値をとることで決定することができるが、本実施の形態では、その値は２０００に設定される。選択した長方形サンプル区域の各点Ｐの値Ｖは、数（Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ＋（Ｖ−Ｐの近傍の平均値））に置き換えられ、必要に応じて切り捨てられて、実際の可能な範囲の値に適合される。この可能な範囲の値は、本発明の好ましい実施の形態では０から４０９５である。近傍の寸法は、細胞のサイズよりも十分大きく、かつ、標準長方形のサイズよりも十分小さくなるように選択される。
図５８のフローチャートの次のステップは、正規化ステップ２５０である。正規化ステップ２５０を行う際に、平均が２０００で、標準偏差が６００となるように、一次変換が、標準長方形サンプル区域のデータを用いて実行される。必要に応じて、その値は、０から４０９６に適合するように切り捨てられる。背景照度一様化ステップ２４８に加えてこのステップ２５０により、ソフトウェアは、ハードウェアの変更および調整の影響を受けにくくなる。一例であって、これに限定されるものではないが、例えば上部検出器１５８（図５５）といった検出回路の信号利得を、結果の細胞計数に大幅な影響を与えることなく変更することができる。
図５８に示すように、フィルタリングステップ２５２が次に実行される。標準長方形内のそれぞれの点Ｐに対して、ステップ２４８で示した寸法よりも小さな寸法を有するＰの近傍において、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄと十分区別可能な値を有する点の数が算出される。これら算出された点は、画像内の細胞のサイズに近いはずである。この数が十分大きい場合には、Ｐの値はそのままとされ、そうでない場合には、Ｐの値には、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄが割り当てられる。このフィルタリング操作は、雑音を除去するために実行され、最適な場合には、細胞のみが画像内に残る一方、背景は一様にＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに等しくなる。
図５８に示すように、不良な構成要素を除去することを対象にするオプションのステップ２５４を実行することができる。例えば、散乱、気泡、埃、および他の同様のムラといった欠陥が、フィルタリングステップ２５２を通過することがある。これらの欠陥は、直接的に、または、画像のヒストグラムの分布全体に影響を与えることにより、細胞計数のエラーの原因になることがある。通常、これらの欠陥のサイズは、細胞よりも十分に大きく、次のようにしてステップ２５４で除去することができる。まず、選択した領域と同じ寸法を有する２値画像が形成される。この２値画像内の点について、元の画像の対応する点の値がＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄと等しい場合には、その点は白と定められ、そうでない場合には、黒と定められる。次に、黒の点からなる接続された構成要素が抽出される。次いで、後続する浸食および膨張を適用して、構成要素の図が調整される。最後に、定められた閾値よりも大きな構成要素が除去される。このオプションのステップの一実施の形態では、値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを有する元の画像の対応するサンプル点をこの構成要素に割り当てることにより、その構成要素が元の画像から除去される。どの構成要素が計数可能な対象を構成し、どの構成要素を除去するかを決定する閾値は、ユーザが定義した値である。また、この閾値は、計数を行う検査特徴、すなわち白血球、赤血球、または他の生体物質に応じて変化してもよい。オプションのステップ２５４の後、ステップ２４８、２５０、および２５２が繰り返されることが好ましい。
図５８に示す次の主要な処理ステップは、ステップ２５６である。このステップ２５６は、明るい中心によって細胞の計数を行うことを対象とする。計数ステップ２５６は、幾つかのサブステップからなる。これらのサブステップの最初のものは、畳み込み演算を実行することを含む。この畳み込み演算サブステップでは、畳み込み映像（convoluted picture）と呼ばれる補助配列が形成される。点Ｐにおける畳み込み映像の値は、Ｐの円形の近傍でフィルタリングを行った後の映像の積分結果の値である。より正確には、特定の一実施の形態の場合、積分される関数は、ｖが２０００よりも大きい場合には、ｖ−２００
０に等しい関数であり、ｖが２０００以下の場合には、０である。計数ステップ２５６で実行される次のサブステップは、ほぼ細胞のサイズと同じ半径の近傍において、畳み込み映像の極大値を検出することである。次に、互いの閉じた近傍内で同じ値を有する２重の極大値が回避される。計数ステップ２５６の最後のサブステップでは、残りの極大値が、細胞を示すものであると宣言される。
幾つかのハードウェア構成では、幾つかの細胞は、明るい中心を持たないように見えることがある。これらの場合、暗い縁のみが見え、次の２つのオプションのステップ２５８および２６０が役立つ。
ステップ２５８は、検出された細胞を映像から除去することを対象とする。ステップ２５８では、検出された各細胞の中心の周りの円形の領域が、値２０００で埋められ、その結果、明るい中心および暗い縁の双方を有する細胞が、２回検出されることがなくなる。
ステップ２６０は、暗い縁によって細胞を追加計数することを対象とする。ステップ２５８後の画像を用いて、２つの変換が行われる。このルーチンの最初のサブステップであるサブステップ（ａ）では、各点の値ｖが、（２０００−ｖ）に置き換えられ、その結果が負である場合には、その値は、ゼロに置き換えられる。サブステップ（ｂ）では、次に、その結果の映像に対して、内部半径Ｒ１および外部半径Ｒ２のリングを用いて畳み込み演算が行われる。Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、細胞の予想される最小半径および予想される最大半径である。このリングは、サブステップ（ｄ）で、その後、上下左右にシフトされる。サブステップ（ｃ）では、４回のシフトの結果が合計される。この変換後、暗い縁の細胞の画像は、４つの花びらの花のように見える。最後に、サブステップ（ｄ）では、サブステップ（ｃ）で得られた関数の極大値が、計数ステップ２５６で使用された方法と同様に検出される。それらの極大値は、ステップ２５６で除外された細胞を示すものであると宣言される。
計数ステップ２５６の後、または、計数ステップ２６０が任意選択で使用された場合には計数ステップ２６０の後の、図５８に示す最後の主要なステップが、結果出力ステップ２６２である。標準長方形内で検出された細胞の数が、図１および図５に示すモニタ１１４に表示され、識別された各細胞は、表示された光バイオディスク導出画像上で赤の十字形により印が付けられる。
光バイオディスク検定から収集されたデータの処理に関する他の関連する態様は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年９月１１日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software Performing Same」と題する米国特許出願第１０／２４１，５１２号に開示されている。この出願は、本明細書でその全体が繰り返されるのと同様にその内容のすべてが参照により援用される。
全血からＴリンパ球を単離する方法
図１７に関連して上述した勾配法を用いて調製した全血または単核球サンプルを含む細胞サンプルから、Ｔ細胞またはＴリンパ球を単離する方法が必要である。例えば、Ｔリンパ球を単離する１つの方法は、不要な細胞を凝集および沈降させる生体活性試薬の使用である。このような方法の非限定的な例は、Ｔ細胞を単離する「生物学的濃縮分離技術（Biological Enrichment and Separation Technology）」（ＢＥＳＴ）法である。ＢＥＳＴ法で用いられる生体活性試薬は、プレパサイト（Prepacyte）（BioE, Ct. Paul, MN）と呼ばれる。プレパサイトは、顆粒球、血小板、単球、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞を含む不要な細胞を選択的に除去することによる、全血および単核球を含む細胞サンプルからのＴ細胞の単離を可能にする。プレパサイト法を用いて単離されたＴ細胞の回収率および純度の
割合は、勾配法のものよりも著しく高い。不要な細胞の選択的な除去は、不要な細胞に対する特異的親和性を有する抗体の使用により媒介される。
プレパサイトを用いる細胞調製は約３０分を要する。例えば、Ｔ細胞を、以下の手順により全血から単離することができる。まず、抗凝固血を等容量のプレパサイトと混合する。本発明のＣＤマーカの場合の細胞調製には、例えば、１ｍｌの全血を１ｍｌのプレパサイトと混合して検定溶液を作成する。次に、検定溶液を約１５分間穏やかに混合し、不要な細胞を凝集させる。次に、検定溶液を試験管ラックに直立で約１５分間置き、凝集した不要な細胞を沈降させる。不要な細胞の沈降後、次に、Ｔ細胞を含む上清を除去し、新たな容器に入れる。次に、Ｔ細胞をＰＢＳ中で洗浄する。次に、洗浄したＴ細胞を計数し、ＰＢＳ中に再懸濁して所定の細胞濃度にする。次に、Ｔリンパ球懸濁液を分析のために光バイオディスクにロードする。
別法として、Ｔ細胞を含む特定の細胞集団を全血を含む細胞サンプルから単離することは、例えば、細胞捕捉法を用いて実行することができる。細胞捕捉法では、不要な細胞を対象とする抗体を、ビーズ、バイオマトリックス、または膜を含む固相に結合させる。次に、細胞サンプルを固相に通過させて固相と相互作用させ、固相では不要な細胞が結合し、所望の細胞のみが通過する。細胞の分離および精製のためのバイオマトリックスの使用に関連する他の態様に関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年３月１８日に出願された「Methods and Apparatus for Separating Whole Blood Components in an Optical Bio-disc Analysis Chamber for use in Biomedical Assays」と題する米国仮出願第６０／３６５，４６２号に開示されており、この出願はその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
全血および単核球を含むサンプルから対象となる細胞を分離するさらに別の別法は、磁気ビーズ分離の使用である。この方法では、対象となる細胞は、サンプルから正または負の選択を受け得る。負の選択法では、磁気ビーズが不要な細胞に特異的な抗体で被覆される。ビーズをサンプルと混合して培養し、ビーズが不要な細胞と結合するようにする。次に、サンプルに磁界を印加することにより、不要な細胞を除去する。不要な細胞の除去は、バイオディスクの流体回路内で、および／または磁気光学式バイオディスクを用いて実行することができる。これとは反対に、正の選択は、対象となる細胞型／細胞に特異的な抗体を有する磁気ビーズを用いる。ビーズをサンプルと混合して培養し、ビーズが対象となる細胞と結合するようにする。次に、サンプルに磁界を印加することにより、磁気的にタグ付けされた所望の細胞型をサンプルの残りから単離する。対象となる細胞の単離は、バイオディスクの流体回路内で、および／または磁気光学式バイオディスクを用いて実行することができる。磁気光学式バイオディスクに関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年３月１４日に出願された「Dual Bead Assays using Cleavable Spacers and/or Ligation to Improve Specificity including Related Methods and Apparatus」と題する米国特許出願第１０／０９９，２５６号、および２００２年３月１４日に出願された「Use of Restriction Enzymes and other Chemical Methods to Decrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and Related Bio-Discs, Methods, and System Apparatus for Detecting Medical Targets」と題する米国特許出願第１０／０９９，２６６号に開示されており、これらはいずれも参照によりその内容のすべてが援用される。磁気粒子でタグ付けされた細胞の分離に関する詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年７月２５日に出願された「Optical Bio-disc Cell Sorter and Analyser」と題する米国仮出願第６０／３９８，４６４号に開示されており、この出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
細胞を分離するさらに別の別法は、マイクロ流体チャンバに一体化されるふるい装置（
sieving device）を通して赤血球を分離または除去するために用いられ得るマイクロ流体チャンバを用いるものである。約５マイクロメートル（μｍ）の開口を有するふるいは、赤血球を通過させ、赤血球は廃液チャンバに回収される。より大きい（５μｍを超える）白血球は、ヘルパ／インデューサ−サプレッサ／細胞障害性検定に特異的な捕捉抗体が積層された検定チャンバ内に吐出される。この特定のチャンバの構造は、相互接続された２つのスロットまたはチャンバを有する。チャンバ１はふるいを含む。分析するべき血液サンプルは、「ふるい」チャンバに注入される。血球がふるいと接触すると、赤血球は、５μｍ以下の物体を通過させるふるいを通過する。赤血球は、最適な遠心力を用いて排除され、ふるい上に残った白血球は、特異的な捕捉抗体で被覆された「検定」チャンバに押し進められる。抗体−抗原相互作用のために３０分間培養した後、レーザ光学素子を用いてディスクの読み取りおよび画像化を行い、ＣＤ４ＣＤ８ソフトウェアで画像を解析する。
白血球のような対象となる細胞を全血から単離するさらなる別法は、バイオディスク１１０においてＲＢＣ溶解を行うことである。溶解後の白血球物質の残りは、ヘルパ／インデューサ−サプレッサ／細胞障害性検定に特異的な捕捉抗体が積層された分析チャンバに消散される。この特定の流体回路は、相互接続された２つのスロットまたはチャンバを含んでいてもよい。チャンバ１は、溶解緩衝液を含み得る（溶解チャンバ）。分析するべき血液サンプルを「溶解」チャンバに注入する。１５分間培養して溶解を完了させる。溶解が完了すると、特異的な捕捉抗体で被覆された分析チャンバに残りの白血球が入ることを可能にするように、ディスクをスピンさせる。所定の培養期間後に、レーザ光学素子を用いてディスクの読み取りおよび画像化を行い、細胞分析システムで画像を解析する。関連する細胞分析システムに関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された、共に「Bio-disc and Bio-drive Analyser System including Methods Relating Thereto」と題し、それぞれ、２００２年２月１３日、２００２年４月１１日、および２００２年９月９日に出願されている米国仮出願第６０／３５６，９８２号、第６０／３７２，００７号、および第６０／４０８，２２７号、２００２年１０月２４日に出願された「Segmented Area Detector for Biodrive and Methods Relating Thereto」と題する米国特許出願第１０／２７９，６７７号、および２００２年９月１１日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software Performing Same」と題する米国特許出願第１０／２４１，５１２号に開示されている。
上述のように、Ｔ細胞の単離は、光バイオディスクの流体回路において実行することができる。図５９、図６０、図６１Ａ、図６１Ｂ、図６１Ｃ、図６２Ａ、図６２Ｂ、および図６２Ｃは、サンプルから対象となる細胞を精製するために用いられ得る種々の流体回路の例を示す。
図５９を参照して、全血またはＭＮＣサンプルからＴ細胞を単離するための流体回路が示される。流体回路のこの実施の形態では、全血またはＭＮＣサンプルを、注入ポート１２２を通して混合チャンバ１３４に加える。次に、注入ポートを密閉して、不要な細胞が精製チャンバ３００内の捕捉ビーズ３２４に結合するのに十分な時間を与える速度で、サンプル中の細胞が精製チャンバ３００内を移動するように、ディスクを所定の速度でスピンさせる。捕捉ビーズ３２４には、不要な細胞の表面マーカを対象とする抗体が付着している。例えば、捕捉ビーズ３２４には、ＮＫ細胞に対する抗ＣＤ５６、単球に対するＣＤ１４、Ｂ細胞に対するＣＤ１９、血小板に対するＣＤ９、ＣＤ３１、またはＣＤ４１、および顆粒球に対するＣＤ１３、ＣＤ３１、またはＣＤ４３が付着していてもよい。したがって、不要な細胞の大部分は精製チャンバ３００において除去され、Ｔ細胞および赤血球は精製チャンバ３００を通過して分析チャンバ１３０へ進み、分析チャンバ１３０において、上述の方法を用いて種々の型のＴ細胞が分析される。赤血球および過剰な緩衝液は、流路の底部に向かってスピンするため、通常は検定を妨害しない。
次に図６０を参照して、ＲＢＳ溶解および白血球精製ステップを含むＴ細胞を精製および分析するための流体回路が示される。流体回路のこの特定の実施の形態では、全血を、注入ポート１２２を通して混合チャンバ１３４に加える。注入ポートを密閉して、溶解弁３０４が開き、槽３０３内の溶解緩衝液３０２中の溶解緩衝液が混合チャンバ１３４内に移動し、血液サンプルと混合されるような第１の速度で、ディスクをディスクドライブにおいて回転させる。第１の速度により弁３０６が開いてはならない。次に、ディスクドライブを用いてディスクを激しく振盪し（agitated）、溶解の効率を高めることができる。次に、溶解ステップの後に、弁３０６および３１０を開いてサンプルを移動させ、緩衝液槽３０９内の分析緩衝液３０８をサンプルと混合させるのに十分な第２の速度で、ディスクをスピンさせる。不要な細胞が精製チャンバ３００内の捕捉ビーズ３２４と結合するのに十分な時間を与える速度で、サンプル中の細胞が精製チャンバ３００内を移動するように、ディスクを第３の速度でスピンさせる。捕捉ビーズ３２４には、不要な細胞の表面マーカを対象とする精製剤が付着している。例えば、捕捉ビーズ３２４には、例えば、ＤＮＡ、リガンド、受容体、および抗体（ＮＫ細胞に対する抗ＣＤ５６、単球に対するＣＤ１４、Ｂ細胞に対するＣＤ１９、血小板に対するＣＤ９、ＣＤ３１、またはＣＤ４１、および顆粒球に対するＣＤ１３、ＣＤ３１、またはＣＤ４３など）を含む精製剤が付着していてもよい。したがって、不要な細胞の大部分は精製チャンバ３００において除去され、Ｔ細胞は精製チャンバ３００を通過して分析チャンバ１３０へ進み、分析チャンバ１３０において、上述の方法を用いて種々の型のＴ細胞が分析される。過剰な緩衝液およびサンプルは、廃液チャンバ３１２に移動する。ビーズなどの固体支持体にプローブを結合させるために用いられる表面化学物質およびディスクの表面（金表面およびポリカーボネート表面を含む）に関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された、２００２年１月３０日に出願された「Capture Layer Assemblies Including Metal Layer for Immobilization of Receptor Molecules and Related Optical Assay Discs」と題する米国仮出願第６０／３５３，７７０号、２００２年１月３０日に出願された「Capture Layer Assemblies Including Polymer Substrates for Immobilization of Receptor Molecules and Related Optical Assay Discs」と題する米国仮出願第６０，３５３，７４５号、および２００２年７月１２日に出願された「Multi-Purpose Optical Analysis Disc For Conducting Assays And Various Reporting Agents For Use Therewith」と題する米国特許出願第１０／１９４，３９６号に開示されている。これらの出願のすべては、本明細書でその全体が繰り返されるのと同様にその内容のすべてが参照により援用される。
ビーズ３２４は、例えば、カルボキシル官能基、アミノ官能基、アルデヒド官能基、およびヒドラジン官能基を含む、精製剤の結合を促進させる種々の化学的官能性を保持することができる。精製剤は、以下で詳細に説明する種々の化学プロセスによって固相に結合させることができる。チオール活性基またはアミン活性基は、精製剤と共有結合することができ、それにより修飾精製剤が作成される。次に、この修飾精製剤は、例えば金などの金属表面への直接的な共有配位結合（covalent dative binding）により、それに結び付いた活性基を介して直接結合し得る。精製剤がタンパク質である場合、金表面への精製剤の直接結合は、チオールまたはアミンの修飾を必要とせずに、タンパク質上に露出したシステインおよびメチオニン残基の配位結合により行われる。例えば、精製剤とビーズ表面との接合は、ディスク１１０が回転する際に精製剤がビーズに付着したままであるほど十分なものである。
幾つかの方法を用いて、ビーズ表面またはディスク基板１２０のポリカーボネート（ＰＣ）または金表面上に機能活性生化学層を形成することができる。受動的な吸着（passive adsorption）は、生化学的かつ化学的な結合試薬または精製剤をディスク基板１２０のポリマーまたは金属表面と、および微小球またはビーズのポリマー表面とへの結合を達成するのに好ましい１つの方法である。疎水性アミノ酸、炭水化物、および同様の成分のポケットを含む大型の生体分子は、受動的な吸着により非極性ポリマー表面に容易に結合す
る。ポリマーおよび生体分子または精製剤が示す疎水力、ならびに基板と精製剤との間の静電的相互作用により、安定した結合が形成される。ｐＨ、塩濃度、および競合物質の存在は、特に、種々の精製剤がポリマーの平面または金属被覆ポリマー表面に非共有結合する程度を決定する因子である。精製剤がタンパク質である場合、精製剤を含む被覆緩衝液のｐＨは、ポリマー基板または金属層への捕捉剤の結合に影響を及ぼす。被覆緩衝溶液のｐＨが精製剤の等電点に近いと、タンパク質の疎水性が高まり、それによりタンパク質の基板との相互作用が強くなるため、結合が強くなるとともに固定された捕捉剤の密度も高くなる可能性が高い。
別法として、チオール化精製剤は、精製剤へのチオール活性基の配位結合によって金または金属表面に固定され得る。本発明の好ましい一実施の形態では、精製剤はタンパク質であり、これらの精製剤は、配位結合により精製剤または結合タンパク質のシステインまたはメチオニン残基を介して金属有機結合（metalorganic bonds）を形成することにより、コロイド金粒子の金表面に直接的に共有結合することができる。チオール活性基またはメチオニン活性基の配位結合は、水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＣＨＢＨ３）などの穏やかな還元剤により促進され得る。本発明のさらに別の実施の態様では、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、およびＢＳＡビオチンなどのチオール化形態の親和剤が最初に、配位結合によって、これらタンパク質の表面のシステインおよびメチオニン残基を介して直接的に、またはチオール化タンパク質に結び付いたチオール活性基を介して、金表面に結合することができる。ビオチン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、およびアビジンを含む適切な結合対と結合する精製剤は、次に、ビーズまたはナノ粒子と混合され、それぞれの親和剤を有するビーズに結合される。さらに別の実施の形態では、ビオチン化またはストレプトアビジン化されたビーズ表面それぞれをそれぞれのストレプトアビジン化またはビオチン化された精製剤と結合する架橋剤として用いてもよい。
精製剤の受動的な吸着は、ポリマー基板または金属被覆されたポリマー基板の化学的に不活性な表面と受動的に相互作用しない幾つかのバイオポリマーではうまくいかない。これは、非共有結合的相互作用のための部位が欠如している可能性があるためである。低分子量のタンパク質、ポリペプチド、および主にイオン特性を有する分子は、例えば、疎水性または電気的相互作用が存在しないか、または非常にわずかであるため、ポリマー表面に結合しない。
結合タンパク質または精製剤を固体支持体に固定する別の受容な態様は、結合したタンパク質すなわち精製剤の機能的活性の維持である。多くの場合、精製剤は、構造的な再編成およびそれに続く立体配座の変化とそれに伴なう機能的活性部位の変化を含む、固定プロセスにおける変性により、その生化学的特性を失う。酵素、受容体、レクチン、および抗体は、そのようなバイオポリマー、結合タンパク質、または精製剤の例である。
支持体ポリマー基板との受動的な相互作用の欠如または固定プロセスによる機能的活性の損失がある状況では、別の手法が必要である。これらの場合に取られる手法は、生化学試薬の固定が意図されるビーズまたはディスク基板の化学的に不活性な表面の機能化につながる。機能化は、官能基を有する特定の分子またはポリマーを表面に付着させることにより、ビーズ表面、ディスク基板、または金属表面を修飾するプロセスである。この場合、官能基は、結合タンパク質、捕捉抗体、受容体、および他の同様の検定成分などの認識分子を結合するために用いられる。結合タンパク質の、重要な生化学的機能を有さないと知られている分子の領域が構造的に変化することにより、修飾された基板または金属表面から得られる寄与が増す。
ポリマー材料の表面の修飾は以前に行われている。例えば、Braybrook et al., Prog.
Polym. Sci. 15:715-734, 1990を参照されたい。当該技術分野で既知の修飾手順のほとんどは、化学試薬での表面の順次処理を伴なう。例としては、ポリスチレンのスルホン化（Gibson et al., Macromolecules 13:34, 1980）、ポリイミドの塩基加水分解（Lee et al., Macromolecules 23:2097, 1980）、およびポリフッ化ビニリデンの塩基処理（Dias et
al., Macromolecules 17: 2529, 1984）が挙げられる。ポリマー表面を修飾する別の従来の方法は、気相で生成されたナイトレンおよびカルベン中間体を有するポリエチレンなどの炭化水素の表面を露出させることを含む（Breslow in "Azides and Nitrenes", Chapter 10, Academic Press, New York, 1984）。ペルフルオロフェニルアジド（ＰＦＰＡ）は、その非フッ素化類似体にわたるＣＨ結合への挿入に有効であることが示されている（Keana et al., Fluorine Chem. 43:151, 1989）。最近では、ビス−（ＰＦＰＡ）は、ポリスチレンの有効なクロスリンク剤であることが示されている（Cai et al., Chem. Mater. 2: 631, 1990
）。
不活性ポリマー表面の化学修飾は、例えば、ビーズの表面上に薄い補間層（interphase
layer）、活性層、または中間層を堆積することを可能にするグラフト手法によって、効率的に行われる。理想的には、補間層は、ビーズ表面にグラフトされた物質の適切な結合を行い、１つの官能基または化学的に異なる種々の官能基につながるスペーサ分子を含むべきである。これにより、結合タンパク質の構造内の側方向きの付着（side directed attachment）を含む空間的向きの異なる要求に応じて種々の精製剤の共有結合による固定を効率的に行うための、特定の表面化学物質の選択が可能となる。スペーサ分子、特に疎水性スペーサのグラフトの一部としての導入は、固定された精製剤の柔軟性および利用可能性（accessibility）に大きく寄与する。種々の官能基を用いて修飾またはグラフトされた基板の固相と結合タンパク質との間にスペーサ層を配置することにより、官能基とのタンパク質の直接的な接触の潜在的な変性効果がなくなる。
図６１Ａを参照して、全血サンプルからＴ細胞を精製するために実施される流体回路のさらに別の実施の形態を有する、光バイオディスク１１０が示される。「ハンマーヘッド」型流体回路３１４および「ホッケースティック」型流体回路３１６を含む、この実施の形態の２つの例が図６１Ａに示されている。これらの流体回路に関する詳細は、図６１Ｂおよび図６１Ｃに関連して以下で説明する。
次に図６１Ｂを参照すると、Ｔ細胞分析用の「ハンマーヘッド」流体回路３１４が示される。ハンマーヘッド流体回路は、注入ポート１２２を有する混合チャンバ１３４を含む。混合チャンバ１３４は、ＲＢＣ捕捉領域３１８に接続される。図示のＲＢＣ捕捉領域３１８は、ＲＢＣ捕捉領域３０８の全長を増大させるように蛇行状、波状、正弦曲線状であり、それにより表面積が増加する。ＲＢＣ捕捉領域３１８は「支柱」３２０を含んでいてもよく、支柱３２０は、垂直に配置され、かつＲＢＣ捕捉領域３１８全体に分散して捕捉領域３１８の表面積をさらに増加させ、それによりＲＢＣ捕捉効率が最大になる。「支柱」３２０の表面を含むＲＢＣ捕捉領域流路３１８の表面は、レクチンなどのＲＢＣ捕捉剤で覆われており（lined with）、ＲＢＣがＲＢＣ捕捉領域３１８および「支柱」３２０の表面と接触するとＲＢＣがＲＢＣ捕捉領域３１８内に結合されてそのままとなる。ＲＢＣ捕捉領域流路３１８の表面に結合する捕捉剤の濃度または密度は、日常的な実験のみによって当業者により決定され得る。「ハンマーヘッド」流体回路３１４はさらに、図５９および図６０に関連して図示および説明されるものと同様のＴ細胞精製チャンバまたは領域３００を含む。Ｔ細胞精製チャンバまたは領域３００は、障壁３２２により所定位置に保持されるビーズ３２４を含む。ビーズには、不要な細胞の表面マーカを対象とする精製剤が付着している。例えば、捕捉ビーズ３２４は、例えば、ＤＮＡ、リガンド、受容体、および抗体（ＮＫ細胞に対する抗ＣＤ５６、単球に対するＣＤ１４、Ｂ細胞に対するＣＤ１９、血小板に対するＣＤ９、ＣＤ３１、またはＣＤ４１、および顆粒球に対するＣＤ１３
、ＣＤ３１、またはＣＤ４３など）を含む精製剤が付着していてもよい。
使用の際には、全血を、「ハンマーヘッド」流体回路３１４の注入ポート１２２を通して混合チャンバ１３４に加える。次に、サンプルをＲＢＣ捕捉領域３１８に移動させて、ＲＢＣを領域３１８および「支柱」３２０を覆うＲＢＣ捕捉剤と結合させるのに十分な所定の速度および時間で、ディスクをスピンさせる。サンプルがＲＢＣ捕捉領域３１８を通過すると、ＲＢＣの全部ではないとしても大部分が捕捉され、白血球は通過してＴ細胞精製領域３００に入る。白血球がＴ細胞精製領域３００を通過すると、Ｔ細胞精製領域３００内のビーズ３２４により不要な細胞が捕獲すなわち捕捉される。Ｔ細胞精製領域３００を通って移動する細胞は、精製されたＴ細胞となり、分析チャンバ１３０において分析され、分析チャンバ１３０では、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を含む特定の型のＴ細胞が捕捉および定量される。過剰な緩衝液およびサンプルは廃液チャンバ３１２に移動する。
次に図６１Ｂを参照して、「ホッケースティック」と呼ばれるＴ細胞分析用の別の流体回路を示す。「ホッケースティック」は、「ハンマーヘッド」の半径方向の分析チャンバ１３０の代わりに半円形の分析チャンバ３３２があることを除いて、「ハンマーヘッド」と同様である。「ホッケースティック」の別の相違点は、半径方向に直線状に整列した捕捉領域３３４の使用である。
次に図６２Ａを参照すると、マイクロ流体カセット３２６を有する光バイオディスク１１０の別の実施の形態が示される。この実施の形態では、上述の流体回路、流路、および流体槽が、ディスク基板の表面に設けられたマイクロ流体カセット３２６内に形成される。サンプル処理は、カセット３２６内部において実行することができ、基板１２０上の分析はバイオディスク１１０の分析チャンバ１３０において実行することができる。カセット３２６は、半円形３２８（図６２Ｂ）または環状３３０（図６２Ｃ）であってもよい。
次に図６３を参照して、マイクロ流体カセット３２６の一実施の形態の分解斜視図が示される。マイクロ流体カセット３２６は、図示のようにポートおよび流体回路を形成するように切り取られた部分を有する４つの層を有し得る。各層は、ポリカーボネートおよびポリメチルメチルアクリル（ＰＭＭＡ）などのプラスチックまたは任意の生体適合性材料から形成することができる。層は、ＵＶ接着剤を含む接着剤により、またはレーザおよび超音波溶接などのプラスチック溶接により繋ぎ合わせることができる。マイクロ流体カセット３２６は、近位端がディスクの中心に最も近く、遠位端がディスクの中心から最も遠いように、光バイオディスク上に設置される。図６３に示すように、マイクロ流体カセット３２６は、緩衝液およびサンプルがロードされる注入ポート１２２を含んでいてもよい。矢印で示すように、サンプルは混合チャンバ１３４に流れ、混合チャンバ１３４でサンプルおよび緩衝液が混合され、次に流体回路１２８に流れてさらに混合される。次に、サンプルはサンプル精製領域３００に入り、サンプル精製領域３００において、不要な細胞などの不要な夾雑物が、図５９、図６０、図６１Ｂ、および図６１Ｃに関連して上述したように除去される。次に、精製された検体すなわちサンプルは、分析チャンバ１３０に送られる。マイクロ流体カセット３２６内の種々のフロー流路およびチャンバを通るサンプルの移動は、所定の速度および持続時間でディスクをスピンさせることにより、遠心力により制御することができる。
次に図６４を参照して、本発明の光バイオディスク１１０を用いたＣＤマーカ検定から収集されたデータの棒グラフ図が示される。この実験では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を、磁気ビーズを用いて精製し、光バイオディスク１１０を用いて試験した。この特定の実験で用いられる捕捉剤は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ４抗体、および抗ＣＤ８抗体であった。図６４の棒グラフは、各捕捉領域において捕捉された細胞の数を示す
。この実験に関する詳細は、実施例１０に関連して以下で説明する。
実験の詳細
本発明を図面を参照して詳細に説明してきたが、本発明の一定の例およびさらなる例示を以下に提供する。
図１７Ａは、サンプルの調製、バイオディスクの使用、および結果（図５２および図５３で、より詳細に示される）の提供を示す画像的フローチャートを示す。それぞれの処理ステップの時間分、回転速度や他の詳細等の、以下の実施例の詳細は、図１７Ａ、図５２および図５３を参照した上記のものより詳細である。それにも関わらず、本実施例の基本的なステップは上記のものと類似である。
Ａ．基板調製および化学堆積を含むディスク製造
この実施例において、反射型ディスクまたは透過型ディスク基板１２０（それぞれ、図２および図５）を、エアガンを用いて清浄にしてすべての塵粒を除去する。このディスクを、スピンコータを用いてイソプロパノールで２回洗い流す。２％ポリスチレンをディスク上にスピンコートし、全体を極めて厚くコーティングする。
その後、化学堆積を行う。一実施の形態は、以下の３ステップの堆積プロトコルを含む：ストレプトアビジンを３０分間インキュベート；ビオチン化した第１の抗体を６０分間インキュベート；および第２の捕捉抗体を３０分間インキュベート。第１の抗体は、第２の種（例えば、マウス）のイムノグロブリンのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）に対して、第１の種（例えば、羊）において作成することができる。第２の捕捉抗体は、特異的な細胞表面抗原（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８）に対して、第２の種において作成される。これらのステップは、恒湿チャンバ中において室温で、堆積の間の洗浄および乾燥ステップを用いて行われる。
リン酸緩衝生理食塩水中の１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン１μｌずつを各窓上に積層し、３０分間培養する。過剰のストレプトアビジンを蒸留水を用いて洗い流し、ディスクを乾燥させる。等容量のビオチン化抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ）および活性化デキストランアルデヒド（２００μｇ／ｍｌ）を混合する。デキストランアルデヒド（ＤＣＨＯ）−ビオチン化抗マウスＩｇＧを、各捕捉窓中のストレプトアビジン上に積層し、冷蔵庫中で６０分間または一晩培養する。過剰の試薬を洗い流し、ディスクをスピン乾燥する。
図４７に示すように、ヒトの細胞表面抗原に対するマウスＩｇＧ抗体を用いて、ＣＤ４（窓２）、ＣＤ８（窓３）、ＣＤ３（窓４）、ＣＤ４５（窓５）、およびネガティブコントロール（窓６）等の、様々な試験のための放射状に配向したいくつかの観察窓があり得る。調製した基板を、冷蔵庫中で３０分間または一晩培養する。
化学堆積のパターンを以下の表３に示す。
Figure 2005509882
Ｂ．ディスクアセンブリ
流体流路を作製するＵ型または「ｅ−ｒａｄ」流路等のスタンプアウト（stamped out）部分、および透明なキャップ１１６（図５、上部検出器を用いた透過型ディスクとの使用のため）または捕捉領域全体にある反射層１４２（図２、底部検出器を用いた反射型ディスクとの使用のため）を有するキャップ１１６を有する、例えば、２５、５０または１００ミクロン厚であり得る接着層（図２および図５の流路層１１８）を用いて、ディスクを組み立てる。
一実施の形態において、このディスクは、符号化情報層として３００ｎｍの金で被覆された、フォワードＷｏｂｂｌｅ Ｓｅｔ ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０ ＣＤ−Ｒディスクである。反射型ディスク上には、既知のリソグラフィー技術によって、２×１ｍｍの大きさの楕円の観察窓が反射層からエッチングされている。透過型ディスクの幾つかのデザインにおいては、分かれた観察窓はエッチングされておらず、ディスク全体を使用可能である。この特殊な例においては、流路層は、Ｆｒａｙｌｏｃｋ ａｄｈｅｓｉｖｅ ＤＢＬ２０１ Ｒｅｖ Ｃ ３Ｍ９４６６１から形成される。カバーは、半径２６ｍｍで等距離にある、直径０．０４０インチの４８個のサンプル注入口を有するクリアディスクである。ＣＤ４／ＣＤ８計数ソフトウェアを用いて、ソフトウェアを４倍速かつサンプル率２．６７ＭＨｚで、データディスクを走査して読み取る。
Ｃ．ディスク漏れチェック
血液を分析しているため、ディスクの漏れをチェックし、ｉｎ ｓｉｔｕでサンプルを有するディスクをスピンする間にチャンバ漏れがないことを初めに確認することが可能である。ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄおよびＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ等の遮断剤を、各流路に充填する。ブロックは少なくとも１時間である。ディスクを５０００ｒｐｍで５分間スピンさせて漏れ試験を行い、ディスクの安定性をチェックする。漏れをチェックした後、ディスクを真空チャンバに２４時間入れる。２４時間真空化後、ディスクを真空パウチに入れ、使用まで冷蔵庫中に保管する。
Ｄ．サンプルの回収、調製およびディスクへの塗布
以下の項は、概して図１７Ａに示されるサンプル処理ステップに関する。単核細胞（ＭＮＣ）を、例えばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＣＰＴ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒを用いて、密度勾配遠心法により精製する。血液（４〜８ｍｌ）を、４または８ｍｌのＥＤＴＡ含有ＣＰＴ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ中に直接回収する。水平ローターおよび回転バケツを有するバイオハザード遠心機中で、１５００〜１８００×ｇで２５分間、室温で管を遠心分離する。血液は、回収の２時間以内に使用されることが好ましい。遠心分離後、ＭＮＣ層上の約２ｍｍの血漿は残し、単核細胞画分上の血漿を除去する。ＭＮＣを回収し、
ＰＢＳで洗浄する。３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離することにより、細胞をペレット化する。上清を除去し、管をそっと軽く叩くことによりＭＮＣを含有するペレットをＰＢＳに再懸濁する。３００×ｇで各１０分間、室温でもう一度洗浄を行い、血小板を除去する。最終的なペレットを、１０，０００細胞／μｌの細胞数に再懸濁する。１８μｌ容量のＭＮＣを、１以上の分析チャンバまたは流路へ導入し、ディスクを固定して１５分間室温で培養する。流路を密閉する。その後、ディスクドライブを用いて３０００ｒｐｍで３〜４分間ディスクをスピンさせる。４倍速かつサンプル率２．６７ＭＨｚでソフトウェアを用い、ディスクを走査して読み取ることが好ましい。
血液サンプルを直ちに処理できない場合、ＣＰＴ管を数回穏やかに反転させることによって最初の遠心分離後の単核細胞を血漿に再懸濁し、室温で２４時間まで保管することができる。２４時間以内に、上記のように血漿中の細胞を回収し、洗浄することができる。
Ｅ．ＣＤ４／ＣＤ８検定フォーマット
この実施例における検定は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球集団の絶対数および血液サンプル中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球の比を迅速に測定するための一般的な均質固相細胞捕捉検定法である。この試験はＣＤ−ＲＯＭに組み込まれた小さなチャンバ内で実施されるが、全血液から単離された単核細胞（ＭＮＣ）７μｌ中の、捕捉領域上の特異的な抗体によって捕捉される、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋およびＣＤ４５＋細胞の数を測定する。この試験は、ディスク上の特異的な位置の局在細胞を捕捉するという原理に基づく。特定の血液細胞表面抗原に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に基づく捕捉化学物質を局在塗布することにより、幾つかの特異的な細胞捕捉領域をディスク上に作製する。チャンバをＭＮＣ血液（３０，０００細胞／μｌ）で溢れさせると、抗原ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ４５を発現する細胞は、ディスク上の捕捉領域で捕捉される。また、画定されたネガティブコントロール領域もバーコードに組み込まれる。
Ｆ．オンディスク分析
上記ステップＤで調製されたＭＮＣ細胞（ＰＢＳ中、１８μｌ）をディスクチャンバに注入し、チャンバの注入ポートおよび排出ポートを密閉する。ディスクを１５分間室温で培養した後、上部検出器を有する光学ドライブ中で７８０ｎｍのレーザを用いて走査し、上記のように捕捉領域を画像化する。
ソフトウェアをディスク上に符号化して、ドライブに以下の動作を自動的に行うように指示を与える：（ａ）１以上の段階でディスクを遠心分離し、過剰の非結合細胞をスピン除去する、（ｂ）特異的な捕捉窓を画像化する、および（ｃ）それぞれの捕捉領域中の特異的に捕捉された細胞を計数すること、およびＣＤ４／ＣＤ８の比（または比がプログラムされ、測定される）を得ることを含み、データを処理する。
処理ステップの間、ソフトウェアによってそれぞれの捕捉領域画像全体を読み込み、細胞に接近すると細胞に印を付ける。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の数の評価に続いて、ソフトウェアによってＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の比を算出し、全血液１μｌ当たりの、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋およびＣＤ４５＋捕捉領域中の細胞の絶対数、およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋比の双方を示す。光学ドライブへディスクを挿入してから数および比を得るまでの全処理は、約１２分かかる。
Ｇ．使用試薬
ストレプトアビジン（Sigma, cat.＃ S-4762）：脱イオン水を添加して５ｍｇ／ｍｌ溶液とし、等分して−３０℃で保管する。使用の際は、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにＴｒｉｓ緩衝液を添加する。
ポジティブコントロール：ＣＤ４５（Sigma, Lot ＃ 038H4892, cat ＃ C7556）。２〜８℃で保管する。
二次捕捉抗体：ビオチン化抗マウスＩｇＧ（ヒツジ由来、Vector laboratories, lot ＃ L0602, Catalog ＃ BA-9200）。保存溶液（１．５ｍｇ／ｍｌ）は蒸留水で作製される。使用ｂ−ＩｇＧ溶液：０．１ＭのＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ。２〜８℃で保管する。長期保管の場合は−３０℃で保持してもよい。
アルデヒド活性化デキストラン（Pierce, lot ＃ 97111761, cat ＃ 1856167）。保存溶液：ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌ、２〜８℃で保管する。
一次捕捉抗体：ＣＤ４（DAKO, cat ＃ M0716）、ＣＤ８（DAKO, cat ＃ M0707）、ＣＤ２（DAKO, cat ＃ M720）、ＣＤ４５（DAKO, cat ＃ M0701）、ＣＤ１４（DAKO, cat ＃ M825）、およびＣＤ３（DAKO, cat ＃ M7193）。２〜８℃で保管する。
ネガティブコントロール：マウスＩｇＧ１（DAKO, cat ＃ X0931）。２〜８℃で保管する。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Life Technologies/GIBCO BRL, cat. ＃ 10010-023）または等価物。室温で保管する。
イソプロピルアルコール、９０〜１００％。
Ｈ．ＲＢＣ溶解プロトコル
塩化アンモニウム溶解緩衝液
塩化アンモニウム溶解緩衝液の１ｘストックは、２〜８℃で保管されるべきである。０．１５５ＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムを含有する；ｐＨ７．３〜７．４、２〜８℃で保管する。使用前に室温に戻す。
手順
１．各１００μｌの血液に対して２ｍｌの溶解緩衝液を添加する（この手順はバイオハザードフード中で行うのが好ましい）。
２．ボルテックスして室温で１５分間培養する。
３．バイオハザードフード中の遠心機を用いて、５００×ｇで５分間、室温で血液を遠心分離する。
４．上清を除去し、ＰＢＳ中の２％ＦＣＳまたはＦＢＳで細胞を洗浄する。細胞を遠心分離する。
５．ＷＢＣの全量を算出し、サンプル注入のためにＷＢＣの最終濃度を１０，０００細胞／μｌとする。
単核細胞分離手順
クエン酸ナトリウムを有するＢｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ（BD catalog ＃ 362760（４ｍｌの場合）、＃ 362761（８ｍｌの場合））細胞調製管を使用する。手順は、すべてのバイオハザード注意に従い、バイオハザードフード中で行う。ステップ：
１．血液を、４または８ｍｌのＥＤＴＡ含有ＣＰＴ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ中に直接回収する。血液が既に抗凝固物質中にある場合、初めにＥＤＴＡをＶａｃｕｔａｉｎｅｒへ添加した後、血液サンプル６〜８ｍｌをＣＰＴ管へ添加する。
２．水平ローターおよび回転バケツを有するバイオハザード遠心機中で、１５００〜１８００×ｇ、２５分間室温で管を遠心分離する。最も良い結果のために、回収の２時間以内に血液を遠心分離すべきである。しかしながら、２時間より古い血液を遠心分離すると、ＭＮＣ数が減少し、かつＲＢＣ汚染が増加し得る。
３．遠心分離後、ＭＮＣ層上の約２ｍｍの血漿を残し、血漿を除去する。白色の単核層を１５ｍｌの円錐形遠心分離管へ回収し、移す。
４．ＭＮＣ層へ１０〜１５ｍｌのＰＢＳを添加し、遠心分離管を数回反転させることに
よって細胞を穏やかに混合する。
５．バイオハザード遠心機中で２００×ｇで１０分間、室温で遠心分離することによって細胞を洗浄する。
６．上清を除去する。管をそっと軽く叩くことによって細胞を再懸濁する。
７．１０ｍｌのＰＢＳ中でもう一度洗浄する。２００〜３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離して血小板を除去する。
８．上清を除去して５０μｌのＰＢＳにペレットを再懸濁する。
９．サンプル中の細胞数を評価する。ＣＢＣを実施する、または２μｌの細胞を１８μｌのトリパンブルーに希釈し、穏やかに混合して細胞を血球計算器で計数する。分析のために、サンプルを最終細胞数１０，０００細胞／μｌとする。
１０．細胞を直ちに処理することができない場合、最初の遠心分離(上記ステップ２)の後にＣＰＴ管を数回穏やかに反転させることによって、分離された血漿中へ単核細胞を再懸濁し、室温で２４時間までの間保管する。２４時間以内に血漿中の細胞を回収し、上記のような洗浄を続ける。
１μｌ当たりの全細胞数＝２５個の小さな四角の中の細胞数×（倍）１００。
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を用いた全血液からのＭＮＣの単離
１ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を１５ｍｌの遠心分離管に入れ、１ｍｌの全血液をその上に穏やかに積層した。その後、４００×ｇで３０分間、室温で遠心分離した。混合物をパスツールピペットで慎重に吸引し、不透明な界面を遠心分離した管へ移した。その後、１０ｍｌのＰＢＳを遠心分離管へ添加した。その後、溶液を２５０×ｇで１０分間遠心分離した。上清を静かに移し、細胞ペレットを１０．０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、２５０×ｇで１０分間スピンさせた。その後、ペレットを１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、２５０×ｇでスピンさせることによって、細胞をもう一度洗浄した。最終的な細胞ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。
Ｄｙｎａｌビーズを用いたＣＤ４＋細胞の単離
Ａ．材料
１．冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳ、ｐＨ７．４
２．ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．４
３．ＣＤ４陽性Ｄｙｎａｌ単離キット
４．ＤｙｎａｌＭＰＣ、Ｄｙｎａｌ混合機、遠心機、ポリプロピレン管
Ｂ．手順
ＣＢＣを実施し、必要な細胞ごとのビーズの数を決定する（４〜１０ビーズ／細胞）。１ｍｌの冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳを、所望量のビーズ（１×１０７ビーズ／７２μｌ）に添加し、再懸濁する。管をＤｙｎａｌＭＰＣ中に３０秒間置き、上清をピペットで除去する。洗浄したビーズを最初の容量に再懸濁する。所望量のビーズを細胞に添加する。１１に設定したＤｙｎａｌ混合機にて２〜８℃で２０分間培養する。ロゼット形成細胞をＤｙｎａｌ ＭＰＣ中で２分間単離する。上清をピペットで除去する。ロゼット形成細胞を４×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄する。ロゼットを２００〜４００μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁する。１００μｌ細胞懸濁液あたり１０μｌのＤｅｔａｃｈ−ａ−Ｂｅａｄを添加する。１１に設定したＤｙｎａｌ混合機にて室温で６０分間培養する。ビーズをＤｙａｎａｌ ＭＰＣ中で２分間単離する。上清を移して保存する。ビーズを５００μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳ中で２〜３回洗浄し、細胞残渣を得る。回収した細胞を４００μｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄する。
ＣＢＣを実施し、単離した細胞濃度を求める。
ディスク調製および化学堆積（ストレプトアビジンによる）
Ａ．基板調製および化学堆積を含むディスク製造
この実施例では、透過ディスク基板をエアガンで清浄にして塵粒を除去した。その後、このディスクをスピンコータに載せ、イソプロパノールの一定流で２回洗い流した。次いで、３１０ｍｌのトルエンおよび６５ｍｌのイソプロパノールに溶解させた２％ポリスチレンを有するポリスチレン溶液を、ディスク上に均一にコーティングした。
ストレプトアビジン堆積のために、ストレプトアビジン保存溶液をＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。手動のピン堆積を用いて、約１μｌのストレプトアビジンをディスク上のそれぞれの捕捉領域に堆積させた。ディスクを恒湿チャンバ中で３０分間培養した。その後、過剰の非結合ストレプトアビジンを脱イオン水で洗い流して捕捉領域から除去し、ディスクをスピン乾燥した。
二次抗体堆積のために、活性化デキストランアルデヒドの新たな溶液（ＰＢＳ中に２００μｇ／ｍｌ）を、等容量のＶｅｃｔｏｒ ＩｇＧ（ＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ）と混合した。手動のピン堆積を用いて、ディスク上のそれぞれの捕捉領域に、約１μｌのＩｇＧ＋ＤＣＨＯ複合体を堆積（ストレプトアビジン層の上に積層）した。ディスクを恒湿チャンバ中で６０分間培養した。過剰の抗体は脱イオン水で洗い流して除去し、ディスクをスピン乾燥した。
一次抗体のために、ＤＡＫＯ ＣＤ４を希釈してＰＢＳ中に５０μｇ／ｍｌとし、ＤＡＫＯ ＣＤ８を希釈してＰＢＳ中に２５μｇ／ｍｌとし、ＤＡＫＯ ＣＤ４５を希釈してＰＢＳ中に１４５μｇ／ｍｌとした。手動のピンアプリケーターを用いて、約１μｌの各一次抗体を、結合させた二次抗体の上に堆積させた。その後、ディスクを恒湿チャンバ中で３０分間培養した。捕捉領域をＰＢＳで洗浄することにより過剰の非結合抗体を除去し、ディスクをスピン乾燥した。
Ｂ．ディスクアセンブリ
使用したカバーディスクは、Ｆｒａｙｌｏｃｋ接着流路層が取り付けられた透明のディスクであった。流体回路を作製する４つのＵ型流路を接着剤へ刻印した。カバーを透過ディスク基板上に置いて、流体流路が捕捉領域全体にわたるようにした。次いで、ディスクを共に固定するために、ディスクプレスを８回通過させた。
Ｃ．ディスク漏れチェック、ブロッキング
各流体流路にＳｔａｂｌｅＧｕａｒｄを充填し、１時間培養した。培養の間、ディスクをスピンコータ中で５分間５０００ｒｐｍでスピンさせた。スピン後、ディスク流路の漏れをチェックした。次いで、ＳｔａｂｌｅＧｕａｒｄを流路から吸引し、ディスクを真空チャンバ中、真空下で一晩置いた。翌朝、ディスクを真空パウチに入れ、４℃で保管した。
光バイオディスクによるＣＤ４／ＣＤ８の比とＦＡＣＳによるＣＤ４／ＣＤ８の比との比較
Ａ．ＣＰＴ管を用いた臨床血液サンプルの調製
３ｍｌの臨床ＥＤＴＡ血液サンプル（番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５）を、クエン酸ナトリウムを除去した個別のＣＰＴ管に添加した。管を１５００×ｇで室温にて、２５分間遠心分離した。遠心分離後、０．５ｃｍの不透明ＭＮＣ層内の上
部血漿を吸引により除去した。残りの不透明ＭＮＣ層を清浄な１５ｍｌ管に移し、１２ｍｌのＰＢＳをそれぞれの管に添加した。
洗浄
続いて、細胞懸濁液を２５０×ｇで１０分間遠心分離した。続いて、上清を吸引により除去し、細胞を１４ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。懸濁液を、２５０×ｇで１０分間、再び遠心分離した。上清を吸引により除去し、各細胞ペレットを２００〜１７５μｌのＰＢＳを用いて再懸濁した。各サンプルの細胞濃度を、血球計算機で細胞を計数することにより求めた。最終細胞濃度を各サンプルにつき３０，０００細胞／μｌに調整した。
Ｂ．光バイオディスクＣＤ４／ＣＤ８の比とＦＡＣＳによるＣＤ４／ＣＤ８の比との比較
ディスク（番号２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ、２７ｆ、および２８）を、２５μｍの接着流路を用いて、実施例５と同様に調製した。
各サンプルを、以下の表４に示すように対応する各ディスクに注入した。３０分後、ディスクを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。続いて、化学領域で捕捉された細胞の光顕微鏡写真を撮影し、細胞を計数した。各臨床サンプルに対して、ＦＡＣＳ分析も行った。この実験の結果を以下の表４に示す。
Figure 2005509882
ディスク調製および化学堆積
Ａ．基板調製および化学堆積を含むディスク製造
この実施例では、透過ディスク基板をエアガンで清浄にして塵粒を除去した。その後、このディスクをスピンコータに載せ、イソプロパノールの一定流で２回洗い流した。次いで、３１０ｍｌのトルエンおよび６５ｍｌのイソプロパノールに溶解させた２％ポリスチレンを有するポリスチレン溶液を、ディスク上に均一にコーティングした。
二次抗体堆積のために、活性化デキストランアルデヒドの新たな溶液（ＰＢＳ中に２００μｇ／ｍｌ）を、等容量のＶｅｃｔｏｒ ＩｇＧ（ＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ）と混合した。手動のピン堆積を用いて、ディスク上のそれぞれの捕捉領域に、約１μｌのＩｇＧ＋ＤＣＨＯ複合体を堆積した。ディスクを恒湿チャンバ中で６０分間培養した。過剰の抗体は脱イオン水で洗い流して除去し、ディスクをスピン乾燥した。
一次抗体のために、ＤＡＫＯ ＣＤ４を希釈してＰＢＳ中に５０μｇ／ｍｌとし、ＤＡ
ＫＯ ＣＤ８を希釈してＰＢＳ中に２５μｇ／ｍｌとし、ＤＡＫＯ ＣＤ４５を希釈してＰＢＳ中に１４５μｇ／ｍｌとした。手動のピンアプリケーターを用いて、約１μｌの各一次抗体を、結合させた二次抗体の上に堆積させた。恒湿チャンバ中で３０分間培養した。過剰の非結合抗体をＰＢＳで洗い流して除去し、ディスクをスピン乾燥した。
Ｂ．ディスクアセンブリ
使用したカバーディスクは、透明で、Ｆｒａｙｌｏｃｋ接着流路層が取り付けられていた。流体回路を作製する４つのＵ型流路を接着剤へ刻印した。カバーを透過ディスク基板上に置いて、流体流路が抗体領域全体にわたるようにした。次いで、ディスクを共に固定するために、ディスクプレスを８回通過させた。
Ｃ．ディスク漏れチェック、ブロッキング
各流体流路にＳｔａｂｌｅＧｕａｒｄを充填し、１時間培養した。培養の間、ディスクをスピンコータ中で５分間５０００ｒｐｍでスピンさせた。スピン後、ディスク流路の漏れをチェックした。次いで、ＳｔａｂｌｅＧｕａｒｄを流路から吸引し、ディスクを真空チャンバ中、真空下で一晩置いた。翌朝、ディスクを真空パウチに入れ、４℃で保管した。
血液サンプルのＣＤマーカ試験
Ａ．Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７を用いた臨床血液サンプルの調製
１２ｍｌの血液（サンプル番号１７６）を、午前１０時にＥＤＴＡ管に引き入れた。午後１２時に、３ｍｌの血液を４×１５ｍｌ管中の３ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７上に重ねた。管を、４００×ｇで室温にて、３０分間遠心分離した。遠心分離後、０．５ｃｍの不透明ＭＮＣ層内の上部血漿を吸引により除去した。残りの不透明ＭＮＣ層を清浄な１５ｍｌ管に移し、１２ｍｌのＰＢＳを添加した。これを残りの３つの管についても繰り返した。
洗浄
続いて、細胞懸濁液を２５０×ｇで１０分間遠心分離した。続いて、上清を吸引により除去し、細胞を１４ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。懸濁液を、２５０×ｇで１０分間、再び遠心分離した。上清を吸引により除去し、各細胞ペレットを１７５μｌのＰＢＳを用いて再懸濁した。続いて、４つの懸濁液すべてを混合し、Ｃｅｌｌ Ｄｙｎｅ１６００細胞計数器を用いてＣＢＣを実施することにより細胞濃度を求めた。最終容量は、６５０μｌで、濃度が２３．５Ｋ細胞／μｌであった。続いて、６回の連続希釈を行い、最終的に、以下の表５に示す、１０００細胞／μｌ〜１００，０００細胞／μｌの範囲の濃度にした。
Ｂ．ＤＡＫＯおよびＳｅｒｏｔｅｃ ＣＤ４抗体の比較
それぞれ６つの流路を有する２つのディスク（＃３３８および３３９）を、１００μｍ接着層を用いて、実施例７に従って作成した。Serotecの別の一次ＣＤ４抗体（５０μｇ／ｍｌ、ｃａｔ＃ ＬＮ１２９８）もこの試験で用いた。
ディスク３３８の各流路に、サンプル１７６の１つの連続希釈液を注入した。１５分後、ディスクを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。化学領域で捕捉された細胞の光顕微鏡写真を撮影し、細胞計数ソフトウェア（Metamorph）を用いて細胞を計数した。別法として、捕捉された細胞の数は、光ディスク読み取り装置および付属のソフトウェアを用いて評価してもよい。この方法はディスク３３９に用いた。ＤＡＫＯ ＣＤ４化学領域で捕捉された細胞の数を、Ｓｅｒｏｔｅｃ ＣＤ４化学領域で捕捉された細胞の数と比較した。この実験から収集されたデータを表５に示す。
Figure 2005509882
ＡＣＤ管に引き入れた溶解血液を用いたディスクの試験
Ａ．アンモニウム溶解緩衝液を用いた臨床サンプルの調製
４ｍｌの１×塩化アンモニウムを、２００μｌの各ＡＣＤ血液サンプル（番号２５１、
２５２、２５３、２５４、２５５、および２５６）に添加した。サンプルをボルテックスし、室温で１５分間培養した。次に、サンプルを５００×ｇで室温にて５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞をＰＢＳ中２％のＦＢＳ３ｍｌで洗浄した。再び遠心分離した。上清を除去し、細胞をＰＢＳ中２％のＦＢＳ１００μｌに再懸濁した。最終濃度は１０，０００〜５，５００細胞／μｌであった。
Ｂ．ＡＣＤ管に引き入れた溶解血液を用いたディスクの試験
それぞれ６つのＢ−Ｒａｄ流路を有する６つのディスク（＃４９９、５００、５０１、５０２、５０３、および５０４）を、１００μｍ接着層を用いて実施例７に従って作成した。
ディスク４９９の３つの流路にサンプル２５１を注入した。１５分後、ディスクを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。化学領域で捕捉された細胞の光顕微鏡写真を撮影し、細胞計数ソフトウェア（Metamorph）を用いて細胞を計数した。結果を以下の表６に示す。別法として、捕捉された細胞の数は、光ディスク読み取り装置および付随のソフトウェアを用いて評価してもよい。残りの５つのディスクおよび５つのサンプルのそれぞれについて、この手順を繰り返した。
Figure 2005509882
ＣＤ４およびＣＤ８単離細胞集団を用いたディスクの試験
Ａ．ＣＤ４およびＣＤ８単離細胞集団の調製
実施例８におけるように、４×１５ｍｌ管中、３ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７上に３ｍｌの血液を重ねることにより、１２ｍｌの血液（サンプル＃２６９）を調製した。ＣＢＣを実施し、単離ＭＮＣ濃度は２５，０００細胞／μｌであったと判断する。１００μｌのＭＮＣをディスク用に取っておいた。残りの５００μｌのＭＮＣを等容量に分割した。１ｍｌの冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳを、２００μｌのＣＤ４ビーズおよび２００μｌのＣＤ８ビーズに添加し、ビーズを再懸濁した。管をＤｙｎａｌ ＭＰＣに３０秒間置き、上清をピペットで除去した。洗浄したビーズを最初の容量に再懸濁した。２００μｌのＣＤ４ビーズおよびＣＤ８ビーズを対応するそれぞれの細胞の管に添加した。１１に設定したＤｙｎａｌ混合機にて２〜８℃で２０分間培養した。ロゼット形成細胞をＤｙｎａｌ ＭＰＣ中で２分間単離した。上清をピペットで除去した。ロゼット形成ＣＤ４およびＣＤ８細胞を４×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄した。各セットの細胞ロゼットを２００〜４００μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液あたり１５μｌのＤｅｔａｃｈ−ａ−Ｂｅａｄを添加した。１１に設定したＤｙｎａｌ混合機にて室温で６０分間培養した。ＣＤ４ビーズおよびＣＤ８ビーズをＤｙｎａｌ ＭＰＣで２分間培養した。上清を移して保存した。ＣＤ４ビーズおよびＣＤ８ビーズを５００μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳ中で２〜
３回洗浄し、細胞残渣を得た。回収した細胞を４００μｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄した。ＣＢＣを実施し、単離細胞濃度を求めた。３６０μｌのＣＤ４細胞を５０００細胞／μｌで、２１５μｌのＣＤ８細胞を５０００細胞／μｌで回収した。
Ｂ．ＣＤ４およびＣＤ８単離細胞集団を用いたディスクの試験
６つのＢ−Ｒａｄ流路を有する１つのディスク（＃５３８）を、１００μｍ接着層を用いて実施例７に従って作成した。
ディスク５３８の１つの流路それぞれに、サンプル２６９からの単離したＭＮＣ、ＣＤ４細胞、およびＣＤ８細胞を注入した。１５分後、ディスクを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。化学領域で捕捉された細胞の光顕微鏡写真を撮影し、細胞計数ソフトウェア（Metamorph）を用いて細胞を計数した。この実施の結果を、表７および図６４に示す。別法として、捕捉された細胞の数は、光ディスク読み取り装置および付属のソフトウェアを用いて評価してもよい。
Figure 2005509882
結言
本明細書に開示した装置、方法、およびプロセスに関する本発明の態様は、以下の出願にも提供されている。すなわち、２００１年９月２０日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents」と題する米国仮出願第６０／３２３，６８２号、２００１年９月２４日に出願された「Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs」と題する米国仮出願第６０／３２４，３３６号、２００１年１０月３日に出願された「Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies」と題する米国仮出願第６０／３２６，８００号、２００１年１０月１０日に出願された「Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３２８，２４６号、２００１年１０月１９日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３８６，０７２号、２００１年１０月１９日に出願された「Methods for Quantitative
and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells Including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」と題する米国仮出願第６０／３８６，０７３号、２００１年１０月２６日に出願された「Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc Including Same」と題
する米国仮出願第６０／３８６，０７１号、２００１年１１月７日に出願された「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」と題する米国仮出願第６０／３４４，９７７号、および２００１年１１月９日に出願された「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin, Plasma, or Poly-Lysine」と題する米国仮出願第６０／３４９，９７５号に提供されている。これらの出願のすべては、参照により本明細書に援用される。
この明細書で言及したすべての特許、仮出願、特許出願、およびそれ以外の出版物は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
一定の好ましい実施の形態を参照して、本発明を詳細に説明してきたが、本発明は、それらの正確な実施の形態に限定されるものでないことが理解されるべきである。逆に、本発明を実践する現在のベストモードを説明する本光バイオディスクを考慮すると、当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、多くの変更および変形が思い浮かぶであろう。したがって、本発明の範囲は、上記説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意味するものおよび均等物の範囲内に入るすべての改変、変更、および変形は、特許請求の範囲の範囲内にあるとみなされる。
さらに、当業者は、定型的に実験にすぎないものを使用するだけで、本明細書で説明した本発明の特定の実施の形態に対する多くの均等物を認識するか、または、把握することができる。このような均等物も、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
本発明によるバイオディスクシステムのイラスト表現である。 本発明と共に利用される反射型バイオディスクの分解斜視図である。 図２に示すディスクの平面図である。 切り取り部分がディスクのさまざまな層を示す、図２に示すディスクの斜視図である。 本発明と共に使用される透過型バイオディスクの分解斜視図である。 切り取り部分がディスクの半反射層の機能的態様を示す、図５に示すディスクを表す斜視図である。 薄い金薄膜の厚さと透過との関係を示すグラフ表示である。 図５に示すディスクの平面図である。 切り取り部分が、図６に示す半反射層のタイプを含むディスクのさまざまな層を示す、図５に示すディスクの斜視図である。 図１のシステムをより詳細に示すブロック斜視図表現である。 図２、図３、および図４に示す反射型光バイオディスクに形成されたフロー流路を示す、当該反射型光バイオディスクの半径に対して垂直な部分断面図である。 図５、図８、および図９に示す透過型光バイオディスクに形成されたフロー流路および上部検出器を示す、当該透過型光バイオディスクの半径に対して垂直な部分断面図である。 図２、図３、および図４に示す反射型光バイオディスクに形成されたウォブル溝を示す当該反射型光バイオディスクの縦方向の部分断面図である。 図５、図８、および図９に示す透過型光バイオディスクに形成されたウォブル溝および上部検出器を示す当該透過型光バイオディスクの縦方向の部分断面図である。 反射型ディスクの全層と、反射型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１１と同様の図である。 透過型ディスクの全層と、透過型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１２と同様の図である。 本発明の方法を使用する血液サンプルの分析を示す、イラストで表したフローチャートである。 図１７Ａに示すディスクと共に使用する白血球への抗体の付着を示すイラスト詳細図である。 Ａはストレプトアビジンのイラスト表現である。 Ｂはビオチンのイラスト表現である。 Ｃはストレプトアビジンおよびビオチンからなるクロスリンクシステムのイラスト表現である。 Ｄは二次抗体のイラスト表現である。 Ｅはビオチン化二次抗体のイラスト表現である。 Ｆは一次抗体のイラスト表現である。 Ｇはビオチン化一次抗体のイラスト表現である。 Ｈは４つのＣＤ４表面抗原を示すＣＤ４＋細胞のイラスト表現である。 Ｉは４つのＣＤ８表面抗原を示すＣＤ８＋細胞のイラスト表現である。 Ｊはアルデヒド活性化デキストランに結合した二次抗体を示すイラスト表現である。 Ｋは図１８Ｊの断面のイラスト表現である。 ＡおよびＢは、本発明の第１の実施態様におけるクロスリンクシステムにより基板に結合する一次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。 ＣおよびＤは、本発明の第１の実施態様における基板に直接結合する一次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。 本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 本発明によるクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第１の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 図２０Ａ〜図２０Ｉに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。 透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図２０Ａ〜図２０Ｉに利用される捕捉化学反応を示す図である。 ＡおよびＢは、本発明の第２の実施態様におけるクロスリンクシステムによって基板に結合する、二次抗体に結合した一次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。 ＣおよびＤは、本発明の第２の実施態様における基板に直接結合する、二次抗体に結合した一次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。 本発明による一次捕捉抗体および二次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して、反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 本発明による一次捕捉抗体および二次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 本発明による一次捕捉抗体および二次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 本発明による一次捕捉抗体および二次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 図２４Ａ〜図２４Ｌに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。 透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図２４Ａ〜図２４Ｌに利用される捕捉化学反応を示す図である。 ＡおよびＢは、本発明の第２の実施態様におけるＤＣＨＯのストランドによって基板に結合する、二次抗体に結合した一次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。 ＣおよびＤは、本発明の第２の実施態様におけるＤＣＨＯのストランドによって基板に直接結合する一次抗体による細胞捕捉を示すイラスト表現である。 抗体ＤＣＨＯ複合体の調製を示すイラストによる流れ図である。 一次抗体および二次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 一次抗体および二次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 一次抗体および二次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第２の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 図２８Ｂ〜図２８Ｊに示す反射型ディスクの、二次抗体を使用しない別の実施の形態である。 透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図２８Ｂ〜図２８Ｊに利用される捕捉化学反応を示す図である。 各流体回路が、特異的細胞表面マーカ用の幾つかの捕捉領域とネガティブコントロール領域とを有する４つの流体回路を示す光バイオディスクの平面図である。 ＢおよびＣは、本発明の第３の実施態様におけるクロスリンクシステムによって基板に結合する二次抗体による一次抗体細胞複合体の捕捉を示すイラスト表現である。 ＤおよびＥは、本発明の第３の実施態様における基板に直接結合する二次抗体による一次抗体細胞複合体の捕捉を示すイラスト表現である。 クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 クロスリンクシステムを使用して反射型バイオディスクの捕捉領域上に捕捉剤を堆積させる方法の第３の実施態様の実施の形態を示す側断面図である。 図３２Ａ〜図３２Ｉに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。 透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図３２Ａ〜図３２Ｉに利用される捕捉化学反応を示す図である。 各流体回路が、異なる細胞表面マーカ用の幾つかの捕捉領域とネガティブコントロール領域とを有する４つの流体回路を示す光バイオディスクの平面図である。 クロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第１の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。 図３５Ｂ、図３５Ｃ、および図３５Ｄに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。 透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図３５Ｂ、図３５Ｃ、および図３５Ｄに利用される捕捉化学反応を示す図である。 一次捕捉抗体および二次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第２の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。 図３８Ａ、図３８Ｂ、および図３８Ｃに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。 透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図３８Ａ、図３８Ｂ、および図３８Ｃに利用される捕捉化学反応を示す図である。 一次抗体および二次抗体ならびにＤＣＨＯのストランドを使用する血液サンプル分析方法の第３の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。 図４１Ａ、図４１Ｂ、および図４１Ｃに示す反射型ディスクの、二次抗体を使用しない別の実施の形態の図である。 透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図４１Ａ、図４１Ｂ、および図４１Ｃに利用される捕捉化学反応を示す図である。 一次抗体細胞複合体の調製を示すイラストによる流れ図である。 一次捕捉抗体および二次捕捉抗体ならびにクロスリンクシステムを使用する血液サンプル分析方法の第４の実施態様の実施の形態を示す反射型光バイオディスクの側断面図である。 図４４Ｂ、図４４Ｃ、および図４４Ｄに示す反射型ディスクの、クロスリンクシステムを使用しない別の実施の形態の図である。 透過型ディスクフォーマットで実施される場合の図４４Ｂ、図４４Ｃ、および図４４Ｄに利用される捕捉化学反応を示す図である。 本発明の一実施の形態によるバーコード技法を示すチャンバを有する光ディスクのイラスト図である。 本発明の一実施の形態によるバーコードフォーマットを使用する検定から得られた結果図である。 ＣＤ４領域、ＣＤ８領域、および制御領域の対応する顕微鏡画像およびディスク画像を示す図である。 本発明の方法および装置から得ることができる結果を示す、対応する顕微鏡画像およびディスク画像の拡大図を示す図である。 本発明の一実施の形態による画像認識の使用を示す図である。 本発明の一実施の形態による画像認識の使用を示す図である。 本発明の一実施の形態によるバーコードからの予想出力のスクリーンショットを示す図である。 本発明の一実施の形態による捕捉された細胞から使用可能な出力への変換方法を示す図である。 サンプリングされたアナログ信号の、一次元配列として記憶される対応するデジタル信号への変換のイラストによるグラフ表示である。 指定部分の拡大詳細図が、入射ビームと相互作用した後の信号を含むビームを発生するバイオディスクのトラックを基準にして位置する捕捉された白血球を示す、光ディスクの斜視図である。 Ａは、本発明による光バイオディスクのトラックを基準にして位置する白血球のグラフ表示である。 Ｂは、本発明による図５６Ａの白血球から得られた一連のシグネチャトレースである。 共に取り込まれると、一次元配列として記憶されて、データ入力用の二次元配列に結合されるデジタル信号への、図５６Ｂのシグネチャトレースの変換のイラストによるグラフ表示である。 共に取り込まれると、一次元配列として記憶されて、データ入力用の二次元配列に結合されるデジタル信号への、図５６Ｂのシグネチャトレースの変換のイラストによるグラフ表示である。 共に取り込まれると、一次元配列として記憶されて、データ入力用の二次元配列に結合されるデジタル信号への、図５６Ｂのシグネチャトレースの変換のイラストによるグラフ表示である。 共に取り込まれると、一次元配列として記憶されて、データ入力用の二次元配列に結合されるデジタル信号への、図５６Ｂのシグネチャトレースの変換のイラストによるグラフ表示である。 図５７Ａ、図５７Ｂ，図５７Ｃ、および図５７Ｄの間の関係を示すグラフ表示である。 本発明に関する処理方法および計算アルゴリズムによるデータ評価の主要なステップを示す論理フローチャートである。 全血またはＭＮＣサンプルからのＴ細胞の単離に用いる流体回路の平面図を示す。 ＲＢＣ溶解および白血球精製ステップを含むＴ細胞の精製および分析のための流体回路の別の実施の形態を示す。 全血サンプルからのＴ細胞を精製するために実施される流体回路のさらに別の実施の形態を有する光バイオディスクの図である。 図６１Ａに示す流体回路の実施の形態の図である。 図６１Ａに示す流体回路の実施の形態の図である。 Ａは、マイクロ流体カセットを示す、中心を通るように切断した光バイオディスクの断面図である。 Ｂは、マイクロ流体カセットが取り付けられた光バイオディスクの外面図（top, side view）である。 Ｃは、マイクロ流体カセットが取り付けられた光バイオディスクの外面図である。 マイクロ流体カセットの拡大斜視図である。 本発明の光バイオディスクを用いるＣＤマーカ検定からの結果の棒グラフ図である。

Claims (27)

  1. 細胞検定を行うための光バイオディスクであって、
    回転可能な基板と、
    該基板に関連したキャップ部、および
    前記基板と前記キャップ部の間に形成された流体回路であって、
    注入ポートを含む混合チャンバ、
    該混合チャンバと流体連通している精製チャンバ、
    該精製チャンバに関連したフィルタ手段、
    前記精製チャンバと流体連通しており、捕捉領域を含む分析チャンバ、および
    該分析チャンバに関連した排出ポート
    を備える流体回路
    を備える、細胞検定を行うための光バイオディスク。
  2. 前記フィルタ手段は、微小球および細胞ふるいからなる群から選択される、請求項１に記載の光バイオディスク。
  3. 前記微小球は精製剤で被覆される、請求項２に記載の光バイオディスク。
  4. 前記精製剤は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、オリゴヌクレオチド、リガンド、受容体、および結合剤を含む群から選択される、請求項３に記載の光バイオディスク。
  5. 前記モノクローナル抗体は、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ９、抗ＣＤ３１、抗ＣＤ４１、抗ＣＤ１３、抗ＣＤ３１、および抗ＣＤ４３を含む群から選択される、請求項４に記載の光バイオディスク。
  6. 前記捕捉領域は捕捉剤で被覆される、請求項１に記載の光バイオディスク。
  7. 前記捕捉剤は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、オリゴヌクレオチド、リガンド、受容体、および結合剤を含む群から選択される、請求項６に記載の光バイオディスク。
  8. 前記モノクローナル抗体は、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、および抗ＣＤ２を含む群から選択される、請求項７に記載の光バイオディスク。
  9. 溶解緩衝液槽と、該溶解緩衝液槽を前記混合チャンバに接続する溶解流路、および、該溶解流路内にある溶解緩衝液弁をさらに備え、前記溶解緩衝液槽には溶解緩衝液が予め充填される、請求項１に記載の光バイオディスク。
  10. 分析緩衝液槽と、該分析緩衝液槽を前記精製チャンバに接続する緩衝液流路、および、該緩衝液流路内にある分析緩衝液弁とをさらに備え、前記分析緩衝液槽には分析緩衝液が予め充填される、請求項９に記載の光バイオディスク。
  11. 前記分析チャンバおよび前記排出ポートと流体連通している廃液チャンバをさらに備える、請求項１０に記載の光バイオディスク。
  12. 前記混合チャンバと前記精製チャンバとを接続する前記流体回路内にあるサンプル混合弁をさらに備える、請求項１１に記載の光バイオディスク。
  13. 前記混合チャンバと前記精製チャンバとを接続するＲＢＣ捕捉領域であって、サンプルが前記混合チャンバにロードされると、前記サンプルは前記精製チャンバに入る前に該ＲＢＣ捕捉領域を通って流れるようになっている、ＲＢＣ捕捉領域をさらに備える、請求項１、２、３、４、５、６、７、または８のいずれか１項に記載の光バイオディスク。
  14. 前記ＲＢＣ捕捉領域は、該ＲＢＣ捕捉領域全体に分布する支柱を含む、請求項１３に記載の光バイオディスク。
  15. 前記ＲＢＣ捕捉領域はＲＢＣ捕捉剤で被覆されている、請求項１４に記載の光バイオディスク。
  16. 前記ＲＢＣ捕捉剤はレクチンである、請求項１５に記載の光バイオディスク。
  17. 細胞検定を行うために請求項１２に記載の光バイオディスクを用いる方法であって、
    全血サンプルを前記注入ポートを通して前記混合チャンバにロードし、
    前記バイオディスクを光読み取り装置にロードし、
    前記溶解緩衝液弁を開いて、血液サンプルを含む前記混合チャンバに前記溶解緩衝液を放出するのに十分な第１の速度で前記バイオディスクを回転させ、
    前記サンプル中の赤血球が溶解されるのに十分な時間、前記溶解緩衝液中で前記サンプルを培養し、
    前記サンプル混合弁を開いて、前記サンプルを、不要な細胞が捕捉される前記精製チャンバを通して、特定の細胞が捕捉領域で捕捉される前記分析チャンバに移動させるのに十分な第２の速度でバイオディスクを回転させ、
    電磁放射入射ビームを前記捕捉領域に照射し、
    前記捕捉領域において前記ディスクと相互作用した後に形成される前記電磁放射ビームを検出し、
    前記検出したビームを出力信号に変換し、そして
    前記出力信号を分析するステップであって、それにより、前記捕捉領域において捕捉された細胞の数に関する情報を前記出力信号から抽出する、ステップ
    を含む、方法。
  18. 細胞検定のために請求項１６に記載の光バイオディスクを用いる方法であって、
    全血サンプルを前記注入ポートを通して前記混合チャンバにロードし、
    前記バイオディスクを光読み取り装置にロードし、
    前記サンプルを、該サンプル中の赤血球が捕捉される前記ＲＢＣ捕捉領域を通して、前記サンプル中の不要な細胞が捕捉される前記精製領域を通して、そして特定の細胞が前記捕捉領域で捕捉される前記分析チャンバを通して移動させるのに十分な速度で十分な時間の間、、前記バイオディスクを回転させ、
    電磁放射入射ビームを前記捕捉領域に照射し、
    前記捕捉領域において前記ディスクと相互作用した後に形成される電磁放射ビームを検出し、
    前記検出されたビームを出力信号に変換し、そして
    前記出力信号を分析し、それにより、前記捕捉領域において捕捉された細胞の数に関する情報を前記出力信号から抽出する、ステップ
    を含む、方法。
  19. 細胞検定を行うための光バイオディスクであって、
    回転可能な基板と、
    該基板に取り付けられたマイクロ流体カセット、そして
    該マイクロ流体カセット内に形成された流体回路
    を備える、細胞検定を行うための光バイオディスク。
  20. 前記マイクロ流体カセットは、組み立てられて前記マイクロ流体カセットを形成した時に、注入ポート、混合チャンバ、フロー流路、および精製チャンバを含む前記流体回路の種々の構成要素を形成する、種々の切取部分を有する板から形成される、請求項１９に記載の光バイオディスク。
  21. 前記精製チャンバにはフィルタ手段が充填される、請求項２０に記載の光バイオディスク。
  22. 前記基板に関連したキャップ部、および
    前記キャップ部と前記基板の間に形成された捕捉領域を有し、前記精製チャンバと流体連通している分析チャンバ
    をさらに備える、請求項２１に記載の光バイオディスク。
  23. サンプルを収容する光ディスクおよびドライブシステムであって、
    該システムは、
    基板、
    該基板、混合チャンバ、精製チャンバ、および前記混合チャンバと前記精製チャンバの間に画定され、捕捉領域を有する分析チャンバに平行な、キャップ、および
    前記捕捉領域において前記基板上に重ねられた捕捉層であって、第１の捕捉領域が第１の細胞捕捉剤を有し、第２の捕捉領域が第２の細胞捕捉剤を有する、捕捉層、
    を備えるバイオディスクと、

    前記ディスクの前記捕捉領域に光を送る光源、
    前記捕捉領域において前記ディスクから反射した光または該ディスクを透過した光を検出して、信号を供給する検出器、および
    前記信号を用いて捕捉分子に結合した前記サンプル中のアイテムを計数するプロセッサ、
    を備える光ディスクドライブ、
    を備える、システム。
  24. 細胞検定で用いるための光バイオディスクを作成する方法であって、
    回転可能な光ディスク基板を形成し、
    該基板と同様の寸法を有するカバーディスクを形成し、
    流体回路を形成する切取部分を有する流路層を形成し、前記流体回路は、注入ポート、混合チャンバ、精製チャンバ、分析チャンバ、および排出ポートを含み、前記分析チャンバは捕捉領域を含み、
    捕捉プローブを前記捕捉領域に結合させ、
    前記基板に前記流路層を取り付け、
    フィルタ手段を前記精製チャンバにロードし、
    前記流路層に前記カバーディスクを取り付け、それにより前記光バイオディスクを形成する、ステップ
    を含む、方法。
  25. 前記取り付けるステップは、接着剤およびプラスチック溶接を含む群から選択される技法により行われる、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記フィルタ手段は、微小球および細胞ふるいからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記フィルタ手段は精製剤で被覆される、請求項２６に記載の方法。
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