KR101343035B1 - 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 고체 기판을포함하는 표적물질을 분석하기 위한 물품 및 그 용도 - Google Patents

제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 고체 기판을포함하는 표적물질을 분석하기 위한 물품 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

하나 이상의 예시적 구체예는 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 고체 기판을 포함하는 표적물질을 분석하기 위한 물품, 그를 제조하는 방법 및 그를 이용한 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다.
제2수용체, 건조

Description

제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 고체 기판을 포함하는 표적물질을 분석하기 위한 물품 및 그 용도{Product for analyzing a target material comprising a solid substrate immobilized with first receptor, blocking material and second target material and use thereof}
하나 이상의 예시적 구체예는 표적물질을 분석하기 위한 물품을 제조하는 방법, 표적물질을 분석하기 위한 물품 및 시료 중의 표적물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
다양한 표적물질 분석방법이 알려져 있다. 예를 들면, 비경쟁적 표적물질 분석 방법이 알려져 있다. 비경쟁적 표적물질 분석 방법은 고체 기판 상에 표적물질에 특이적으로 결합하는 제1성분이 결합되어 있고, 여기에 표적물질을 포함하는 시료를 첨가하여 반응시키고, 다음으로써, 상기 제1성분 및 표적물질의 복합체에 상기 표적물질에 특이적으로 결합하는 제2성분을 결합시키고, 상기 제1성분, 표적물질 및 제2성분으로 이루어진 복합체로부터 신호를 검출함으로써 시료 중의 표적물질을 검출하는 것일 수 있다. 상기 신호 검출은 상기 제2성분에 표지된 형광물질과 같은 직접적으로 검출가능한 표지로부터 나오거나 상기 제2성분에 표지된 호스래디 쉬 퍼옥시다제 (HRP) 또는 알칼라인 포스파타제 (AP)와 같은 효소와 그의 발색 기질의 반응에 의하여 간접적으로 나오는 신호일 수 있다. 상기 분석 방법은 면역분석 방법일 수 있다.
또한, 표적물질 분석방법은 경쟁적 분석 방법일 수 있다. 경쟁적 표적물질 분석 방법은 고체 기판 상에 표적물질에 특이적으로 결합하는 제1성분이 결합되어 있고, 여기에 표지된 표적물질 또는 그의 유사체의 존재하에서, 표적물질을 포함하는 시료를 첨가하여 반응시키고, 상기 제1성분과 상기 표지된 표적물질로부터 신호를 검출함으로써 시료 중의 표적물질을 검출하는 것일 수 있다. 상기 표적물질의 양은 알려진 농도의 표적물질을 포함하는 표준 용액으로부터 얻어지는 신호와 비교함으로써 확인할 수 있다.
이러한 종래 기술에 있어서, 상기 제2성분 및 표지된 표적물질은 용액 중에 포함되어 있으며, 분석 반응 중에 반응 혼합물 중에 도입되어 사용되는 것이었다.
일 구체예는 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 기판을 포함하는 표적물질을 분석하기 위한 물품을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 일 구체예는 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 기판을 포함하는 표적물질을 분석하기 위한 물품을 제공한다.
다른 일 구체예는 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 기판을 포함하는 표적물질을 분석하기 위한 물품을 이용하여 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다.
일 예시적 구체예는, 고체 기판 상에 표적물질에 결합하는 제1수용체를 고정화하는 단계; 상기 고체 기판 표면의 상기 제1수용체가 고정화되어 있지 않은 영역에 차단물질을 고정화하는 단계; 및 상기 제1수용체 및 차단물질이 고정화된 기판 상에 효소로 표지된 상기 표적물질에 결합하는 제2수용체의 용액을 첨가하고 건조시키는 단계;를 포함하는, 표적물질을 분석하기 위한 물품을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, 고체 기판 상에 표적물질에 결합하는 제1수용체를 고정화하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기판은 예를 들면, 플라스틱, 실리콘, 유리, 및 이들의 표면 개질된 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 고체 기판은, 평판, 웰, 챔버 또는 입자의 형태를 갖는 것일 수 있다. 상기 웰은 마이크로 웰 플레이트 상의 웰이거나 개별적 웰의 형태를 갖는 것으로서 미세유동장치 플랫폼에 결합될 수 있도록 되어 있는 카트리지인 것일 수 있다. 상기 플랫폼은 미세유동장치의 전부 또는 일부의 구성요소가 형성되어 있거나, 형성되어질 수 있는 물질 또는 공간을 제공하는 것이다. 상기 플랫폼은 상기 카트리지를 수용할 수 있도록 형성된 장착부를 포함할 수 있다. 상기 장착부는 상기 카트리지와 상보적인 요철구조를 가지고 있어 상기 카트리지가 상기 장착부에 끼어져 고정될 수 있도록 된 것일 수 있다. 상기 카트리지는 다양한 방법에 의하여 상기 미세유동장치의 장착부에 결합될 수 있다. 예를 들면, 맞물림 고정, 초음파 융착, 핫멜트 접합, 및 레이저 접합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 의하여 결합될 수 있다. 상기 고체 기판의 구체예는, 상업적으로 구입가능한 마이크로타이트레이션 스트립, 마이크로플레이트, 및 UV-흡수된 저형광 Maxisorb 스트립 (Nunc, Roskilde, Denmark)이 될 수 있다. //
상기 표적물질은 분석하고자 하는 분석 대상 (analyte)를 말한다. 상기 표적물질은, 항원, 항체, 효소, 및 효소 기질 등이 될 수 있다. 예를 들면, 상기 표적물질은, 단백질 (예, 전립선 특이항원 (prostate specific antigen: PSA), 갑상선 자극 호르몬 (thyroid stimulating hormone: TSH)), 티록신 (3,4,3',5'-테트라요도티로닌 : T4), 테스토스테론이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 제1수용체는 상기 표적물질에 특이적으로 결합하는 물질을 의미하는 것으로, 예를 들면, 항원에 대한 항체, 리간드에 대한 수용체, 기질에 대한 효소 또 는 효소 저해제에 대한 효소가 될 수 있다. 제1수용체 및 제2수용체는 상기 표적물질의 다른 부위에 결합하는 항체인 것일 수 있다. 상기 고정화에는 알려진 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 고정화는 공유결합 또는 비공유결합에 의하여 이루어질 수 있다. 공유결합에 의하는 경우, 상기 기판 상에 내재적으로 존재하는 아미노기와 같은 활성기 또는 외래적으로 도입된 아미노기와 같은 활성기에, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide: DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride:EDC] 및 N-히드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide: NHS)와 같은 물질에 의하여 활성화된 제1수용체를 반응시킴으로써, 이루어질 수 있다. 또한, 상기 고정화는 상기 기판 상에 흡착 또는 포집 등에 의하여 제1수용체를 고정화하는 비공유 결합에 의하는 것일 수 있다. 상기 기판의 활성화는 예를 들면, GAPTES (감마아미노트리에톡시실란)과 같은 아미노 실란을 기판상에 코팅함으로써 아미노기를 도입하는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 제1수용체의 고정화의 일 예는 소듐 비카보네이트 버퍼 중의 제1수용체를 기판에 코팅함으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 제1수용체는 또한 상기 기판에 간접적으로 고정화될 수 있다. 예를 들면, 상기 기판의 표면을 먼저 스트렙타비딘 (streptavidin)으로 코팅하고, 여기에 비오틴화된 제1수용체를 결합시킴으로써 고정화될 수 있다.
상기 방법은, 또한, 상기 고체 기판 표면의 상기 제1수용체가 고정화되어 있지 않은 영역에 차단물질을 고정화하는 단계를 포함한다. 상기 차단물질은 상기 고체 기판 표면의 상기 제1수용체가 고정화되어 있지 않은 영역에 고정화되는 경우 상기 표적물질과 기판 사이에 비특이적 결합이 일어나는 것을 방지 또는 감소시킬 수 있는 물질을 말한다. 상기 차단물질은 표적물질과 결합하지 않는 것일 수 있다. 상기 차단물질은 예를 들면, 소혈청 알부민 (BSA) 또는 카제인인 것일 수 있다. 상기 차단물질의 고정화하는 차단물질의 종류, 예를 들면, 단백질, 당, 또는 지질 여부에 따라 알려진 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 고정화는 PBS (phosphate buffered saline) 중의 차단물질을 상기 제1수용체가 고정화되어 있는 기판의 표면에 첨가하고 배양하는 것에 의하여 이루어질 수 있다.
상기 방법은 또한, 상기 제1수용체 및 차단물질이 고정화된 기판 상에 효소로 표지된 상기 표적물질에 결합하는 제2수용체의 용액을 첨가하고 건조시키는 단계를 포함한다. 상기 제2수용체는 상기 표적물질에 특이적으로 결합하는 물질을 의미하는 것으로, 예를 들면, 항원에 대한 항체, 리간드에 대한 수용체, 기질에 대한 효소 또는 효소 저해제에 대한 항체가 될 수 있다. 제1수용체 및 제2수용체는 상기 표적물질의 다른 부위에 결합하는 것으로서, 예를 들면 항체인 것일 수 있다. 상기 제2수용체가 포함되는 용액은 예를 들면, MOPS 또는 Tris 버퍼일 수 있다. 상기 건조는 동결건조, 자연 또는 송풍 건조일 수 있다. 상기 효소는 기질을 검출가능한 신호를 내는 산물로 전환시키는 반응을 촉매하는 것이다. 예를 들면, 상기 효소는 기질을 검출가능한 광 신호를 내는 산물로 전환시키는 반응을 촉매하는 것이다. 상 기 광 신호는 흡광, 화학발광, 및 형광 등의 광 신호를 포함한다. 예를 들면, 상기 효소는 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 또는 알칼라인 포스파타제 (AP)인 것일 수 있다. "효소로 표지된 제2수용체"란 효소가 공유 또는 비공유 결합에 의하여 제2수용체에 결합되어, 분석 반응 중의 세척 등의 과정에서 서로 분리되지 않고 유지되는 것을 의미한다. 상기 제2수용체는 상기 제2수용체와 상기 제1수용체 또는 상기 차단물질 층 사이에 다른 물질의 매개 없이 상기 제1수용체 또는 상기 차단물질 상에 코팅되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 다른 물질은 단백질 및/또는 탄수화물과 같은 물질이 될 수 있다. 상기 방법에 의하면, 다른 물질의 매개 없이도 제2수용체가 상기 표적물질이 아닌 물질과 비특이적인 결합을 하지 않고, 그에 따라 상기 비특이적인 결합이 시료 중의 표적물질의 분석 결과에 영향을 미치지 않는다.
상기 제2수용체는 건조에 의하여 상기 제1수용체 및 차단물질 상에 코팅되어 있고, 표적물질을 포함하는 액체 시료와 접촉하는 경우, 액체 시료 중에서 표적물질과 결합할 수 있는 것이다.
상기 제2수용체는 사용되는 농도보다 약 10 내지 40배 농축된 농도로 상기 용액 중에 포함되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 제2수용체는 17㎍/ml 내지 68㎍/ml의 농도의 항체일 수 있다. 여기서, "사용되는 농도"란 제2수용체가 시료 중의 표적물질을 분석하기 위하여 분석 반응에서 사용되는 농도를 말한다. 상기 분석 반응에서 통상적으로 제2수용체는 고도로 (예를 들면, 1000배 내지 10,000배) 희석되어 사용되므로, 용액 중에서 안정하지 않은 경향이 있다. 상기 고농도의 제2수용체의 사용 및 건조는 상기 제2수용체의 안정성을 높일 수 있다. 상기 안정성은 시 간, 온도, 압력 및 화학물질 등에 대하여 표적물질에 대한 결합 활성을 유지하는 정도를 말한다. 상기 제2수용체의 용액의 부피는 2.5 ㎕ 내지 10 ㎕일 수 있으며, 10분 내지 30분 동안 건조되는 것일 수 있다. 또한, 상기 제2수용체 용액 중에는 BSA, 수크로스, 트레할로즈, 젤라틴 및 카제인와 같은 상기 제2수용체의 안정화제가 포함될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 고체 기판은 웰의 형태를 갖는 것으로서 미세유동장치 플랫폼에 결합될 수 있도록 되어 있는 카트리지인 것일 수 있다. 상기 플랫폼은 미세유동장치의 전부 또는 일부의 구성요소가 형성되어 있거나, 형성되어질 수 있는 물질 또는 공간을 제공하는 것이다. 상기 플랫폼은 상기 카트리지를 수용할 수 있도록 형성된 장착부를 포함할 수 있다. 상기 장착부는 상기 카트리지와 상보적인 요철구조를 가지고 있어 상기 카트리지가 상기 장착부에 끼어져 고정될 수 있도록 된 것일 수 있다. 또한, 상기 방법은, 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 웰의 표면을 갖는 상기 카트리지를 상기 플랫폼의 장착부에 결합시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. "미세유동장치"란 출구 및/또는 입구가 마이크로채널 및/또는 챔버에 의하여 연결되어 있는 장치로서, 하나 이상의 단면, 즉 직경, 높이, 넓이 또는 깊이 등이 1 nm 내지 1000 mm의 차원을 갖는 것을 의미한다. 상기 플랫폼은 회전 중심을 중심으로 회전될 수 있도록 되어 있고, 상기 회전 중심으로부터 방사상으로 채널 및/또는 챔버가 구비되어 있는 것일 수 있다. 상기 카트리지와 상기 플랫폼의 결합은 맞물림 고정, 초음파 융착, 핫멜트 접합, 및 레이저 접합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 카트리지를 상기 플랫폼의 장착부에 끼워 고정하여 맞물림 고정하거나, 맞물림 고정된 상기 카트리지와 상기 플랫폼의 장착부를 초음파 융착, 핫멜트 접합, 및 레이저 접합에 의하여 접합시키는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 미세유동장치는 랩온어칩, 또는 랩온어디스크로 사용될 수 있다. 상기 방법은, 평판과 같은 지지체에 형성된 복수 개의 고정부에 고정된 복수 개의 상기 카트리지의 웰에 대하여 수행되고, 그 결과 상기 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 웰의 표면을 갖는 복수 개의 상기 카트리지를 형성하고, 형성된 복수 개의 상기 카트리지를 상기 플랫폼의 장착부에 결합시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 방법은, 평판과 같은 지지체에 형성된 복수 개의 고정부에 고정된 복수 개의 상기 카트리지의 웰에 대하여 동시에 수행되고, 상기 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 웰의 표면을 갖는 복수 개의 상기 카트리지를 형성하고, 형성된 복수 개의 상기 카트리지를 상기 플랫폼의 장착부에 동시에 결합시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 복수 개의 플랫폼의 장착부는 상기 지지체의 고정부에 대응되게 정렬하고 상기 카트리지를 상기 장착부에 끼워 고정함으로써 상기 복수 개의 카트리지를 해당하는 위치에 결합시킬 수 있다. 상기 카트리지는 월에 형성되어 있는 면의 반대면인 배면이 상기 장착부에 결합되는 것 일수 있다.
상기 방법은, 또한, 상기 카트리지가 결합된 플랫폼에 상판을 결합시켜, 상기 카트리지의 웰과 상기 상판에 의하여 반응 챔버를 형성시키는 단계는 더 포함하 고, 상기 물품은 미세유동장치인 것일 수 있다. 상기 상판은 상기 카트리지의 웰이 노출되어 있는 방향의 상기 고체 기판의 면과 결합된다. 상기 고체 기판의 면과 상판을 결합시키는 것은 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, UV 접착 방법에 의하여 결합될 수 있다. 상기 미세유동장치는 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 상기 반응 챔버 외에 제2수용체를 포함하는 별도의 챔버를 포함하지 않는 것일 수 있다.
다른 예시적 구체예에는, 고체 기판의 표면에 고정화되어 있고, 표적물질에 결합하는 제1수용체;
상기 고체 기판 표면의 상기 제1수용체가 고정화되어 있지 않은 영역에 고정화된 차단물질; 및
상기 제1수용체 및 차단물질이 고정화된 기판 상에 고정화되어 있고, 효소로 표지된 상기 표적물질에 결합하는 제2수용체;를 포함하는, 표적물질을 분석하기 위한 물품을 제공한다.
상기 물품은 상기한 예시적 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다. 상기 고체 기판은 평판, 웰, 챔버 및 입자로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 물품은 미세유동장치일 수 있다. 이 경우, 상기 제1수용체, 차단물질 및 효소로 표지된 제2수용체가 고정화되는 상기 고체 기판은 미세유동장치 중의 반응 챔버의 일면, 예를 들면, 바닥 면일 수 있다. 상기 반응 챔버의 형성과정은 예를 들면, 상기한 예시적 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다.
다른 예시적 구체예에는, 상기한 물품의 상기 고체 기판의 표면에 표적물질을 포함하는 액체 시료를 접촉시키는 단계;
상기 고체 기판의 표면을 세척하는 단계;
상기 세척된 고체 기판의 표면을 상기 효소의 기질과 액체 매질 중에서 접촉시키는 단계; 및
상기 액체 매질 중의 상기 기질의 효소 반응 산물로부터 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다.
상기 검출 방법은, 상기한 물품의 상기 고체 기판의 표면에 표적물질을 포함하는 액체 시료를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 물품에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 시료는 표적물질을 포함하는 것이면 어느 것이나 될 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는 혈액, 타액, 조직, 세포 및 생검 시료와 같은 생물학적 시료일 수 있다. 상기 시료는, 물 또는 PBS 버퍼와 같은 적절한 버퍼 중에 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 접촉 조건은 선택되는 제1수용체 및 제2수용체와 표적물질 사이의 결합 반응을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 접촉은 0℃ 내지 40℃, pH 3 내지 8의 범위에서 수행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 제1수용체 및 제2수용체는 항체이고, 상기 접촉은 0℃ 내지 40℃, pH 3 내지 8의 범위에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 접촉에 의하여 시료 중의 표적물질을 상기 제1수용체 및 제2수용체와 결합시킨다. 상기 접촉 결과, 제1수용체와 제2수용체가 표적물질을 매개로 하여 결합되어 있는 복합체, 즉 제1수용체-표적물질-제2수용체의 순서로 결합된 복합체가 형성될 수 있다.
상기 검출 방법은, 또한, 상기 고체 기판의 표면을 세척하는 단계를 포함한다. 상기 세척에 의하여 시료 중의 물질 중 제1수용체 및/또는 제2수용체와 결합되지 않은 물질 또는 비특이적으로 결합된 물질을 제거할 수 있다. 세척 용액은 표적물질 분석 방법, 예를 들면, 면역분석 방법에 알려진 세척 용액이 사용될 수 있다. 예를 들면, PBS와 같은 버퍼가 사용될 수 있다. 또한, 세척 회수와 같은 세척 조건도 선택된 제1수용체, 표적물질, 및 제2수용체를 고려하여, 당업자가 적절하게 설정할 수 있다. 상기 세척 조건은 제1수용체-표적물질-제2수용체의 복합체를 상기 고체 기판으로부터 분리시키지 않으면서, 결합되어 있지 않은 반응물 또는 비특이적으로 결합된 산물을 제거하는 것일 수 있다.
상기 검출 방법은, 또한, 상기 세척된 고체 기판의 표면을 상기 효소의 기질과 액체 매질 중에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, 상기 효소는 호스래디쉬퍼옥시다제 (HRP), 베타-갈락토시다제, 글루쿠로니다제 및 알칼라인 포스파타제 (AP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 기질은 발색기질 (예, 3,3-디아미노벤지딘(diaminobenzidin:DAB), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine:TMB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린)-6-술폰산[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulphonic acid:ABTS], 파라-니트로페닐포스페이트(para-Nitrophenylphosphate: pNPP), 5-브로모-4-클로로-3-인 돌릴 포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate:BCIP) 및 X-gal) 또는 화학발광 기질 (예, 루미놀 및 아크리단)이 될 수 있다. 상기 액체 매질은 선택되는 효소 반응에 적합한 것으로, 선택되는 효소에 따라 적절하게 당업자에 의하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 액체 매질은 PBS 또는 Tris 버퍼일 수 있다. 상기 접촉 조건은 또한, 선택되는 효소에 따라 적절하게 당업자에 의하여 선택될 수 있다.
상기 검출 방법은, 또한, 상기 액체 매질 중의 상기 기질의 효소 반응 산물로부터 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 신호는 시료 중의 표적물질의 측도이다. 상기 신호는 예를 들면, 분광기와 같은 광 신호 측정기에 의하여 측정될 수 있다. 측정되는 광 신호의 파장은 선택되는 효소 및 기질에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 상기 파장은 405 nm, 450 nm, 및 630 nm가 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
일 예시적 구체예에 따른 표적물질을 분석하기 위한 물품을 제조하는 방법에 의하면, 상기 물품을 효율적으로 제조할 수 있다.
또한, 다른 예시적 구체예에 따른 표적물질을 분석하기 위한 물품에 의하면, 제조가 용이하며 표적물질을 효율적으로 분석하는데 사용될 수 있다.
또한, 다른 예시적 구체예에 따른 시료 중의 표적물질을 검출하는 방법에 의하면, 시료 중의 표적물질을 간단하고 효율적으로 검출할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 하나 이상의 구체예를 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 상기 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 : 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 기판의 제조 및 그를 이용한 표적물질의 검출
(1) 제1수용체의 고정화
제1수용체를 고체 기판에 물리적 흡착을 통하여 고정화하였다. 제1수용체로서 생쥐 항-PSA IgG 항체 (Fujirebio Diagnostics, Malvern, USA)를 폴리스티렌 재질의 랩온어디스크 (LOD) 용 웰에 코팅하였다. 코팅은 PBS 버퍼 (pH 7.4) 중의 생쥐 항-PSA IgG 항체를 웰 당 830 ng으로 첨가하고 4℃에서 밤샘 배양하여 이루어졌다.
다음으로, PBS (pH 7.4) 중의 BSA 1%농도 용액 300㎕를 상기 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 25℃에서 30분 동안 건조하였다.
(2) 효소로 표지된 제2수용체의 고정화
제2수용체를 포함하는 용액을 웰에 첨가하고 건조시켰다. 제2수용체로는 생쥐 항-PSA IgG-HRP (Fujirebio Diagnostics, Malvern, USA)를 사용하였다. 상기 제 2수용체는 상기 제1수용체와는 다른 부위에서 PSA에 결합한다.
(1)에서 제작된 제1수용체 및 차단물질이 고정화된 웰에 MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid) 버퍼 (pH6.5) 중에 생쥐 항-PSA IgG-HRP 170 ng 및 안정제로서 BSA를 포함하는 용액을 각각 2.5 ㎕, 5 ㎕ 및 10 ㎕의 양으로 첨가하고 건조하였다. 건조는 실온의 데시케이터에서 1 시간 동안 방치함으로써 이루어졌다.
(3) 표적물질의 검출
(2)에서 제작된 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 웰에 표적물질인 PSA를 포함하는 시료를 첨가하고, HRP 기질을 첨가하고 반응 결과를 흡광도를 측정하여 확인하였다.
혈청에 아는 농도의 PSA를 첨가하여 농도를 아는 PSA 함유 혈청을 제조하였다 (표준 시료). 이 다양한 농도의 PSA를 함유하는 혈청 46 ㎕를 상기 (2)에서 제작된 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 웰에 첨가하고, 37℃에서 9분 동안 배양하였다. 반응 혼합물을 세척 버퍼 (PBS, Tween-20) 300 ㎕로 1회 세척하였다. TMB 용액 100 ㎕를 상기 웰에 첨가하고 37℃에서 6분 동안 배양하였다. 다음으로, 1M H2SO4 50 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다. Molecular Device 사의 VERSAmax 기기를 사용하여 450 nm에서 상기 반응 혼합물의 흡광도를 측정하였다.
대조군으로서, 종래 방법에 의하여 PSA의 농도를 측정하였다. 종래 방법은 먼저 (1)에 기재된 방법과 동일한 방법으로 제1수용체를 상기 기판에 고정화하고, (2)에 따른 제2수용체 고정화 과정을 거치지 않는 대신에, 제2수용체는 분석 반응 중에 직접 첨가하였다. 구체적으로, (1)에서 제작된 상기 제1수용체 및 차단물질이 고정화된 기판에, PSA를 함유하는 상기 시료 46 ㎕를 첨가한 다음, 곧바로 MOPS 버퍼 (pH6.5) 중에 생쥐 항-PSA IgG-HRP 170 ng 및 안정제로서 BSA를 포함하는 용액100 ㎕를 첨가하여, 상기에서 기재된 표적물질 검출과정을 동일하게 수행하였다.
그 결과는 아래 표 1에 나타낸 바와 같다.
표 1.
PSA 농도(ng/ml)
 대조군
 실험군
2.5 ㎕ 5 ㎕ 10 ㎕
0 0.044 0.050 0.049 0.047
0.8 0.120 0.089 0.091 0.105
2.5 0.214 0.142 0.131 0.137
5 0.311 0.228 0.188 0.242
15 0.753 0.522 0.535 0.660
50
 1.666 1.318 1.179 1.390
R2 0.9998 1 0.9988 0.9987
표 1은 PSA 농도에 따른 측정된 450 nm에서의 흡광도 및 농도와 흡광도의 상관관계를 나타낸 것이다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예1에 기재된 기판을 이용하여 PSA를 측정한 결과는 상관도가 대조군과 유사한 것으로 관찰되어, 상관도가 높았다. 표 1에서, R2은 회귀방정식의 상관도를 나타내는 계수이다. 도 1은 PSA 농도에 따른 측정된 450 nm에서의 흡광도를 나타내는 도면이다.
이상의 실시예의 결과로부터 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 기판을 이용하여 표적물질을 정확하게 검출할 수 있다는 것이 확인하였다. 이상의 결과에 의하면, 제2수용체는 별도의 챔버에 포함될 필요 없이, 하나의 챔버 중의 표면에 제1수용체와 함께 고정화될 수 있으므로, 분석반응에 사용되는 물품을 단순화할 수 있다. 특히, 상기 물품이 미세유동장치인 경우, 상기 제2수용체를 포함하는 별도의 챔버가 필요 없으며, 상기 챔버 내 또는 밖으로 상기 제2수용체의 이송을 제어하는 밸브가 없어도 되며, 사용되지 않아도 되는 밸브의 수는 3개 이상 즉, 상기 제2수용체 챔버로의 유입 및 그로부터의 유출을 제어하는 밸브, 및 상기 반응 챔버로의 유입을 제어하는 밸브일 수 있다.
도 1은 PSA 농도에 따른 측정된 450 nm에서의 흡광도를 나타내는 도면이다.

Claims (19)

  1. 고체 기판 상에 표적물질에 결합하는 제1수용체를 고정화하는 단계;
    상기 고체 기판 표면의 상기 제1수용체가 고정화되어 있지 않은 영역에 상기 표적 물질과 상기 고체 기판 사이에 비특이적 결합이 일어나는 것을 방지 또는 감소시키는 차단물질을 고정화하는 단계; 및
    상기 제1수용체 및 차단물질이 고정화된 기판 상에 효소로 표지된 상기 표적물질에 결합하는 제2수용체의 용액을 첨가하고 건조시키는 단계;를 포함하는, 표적물질을 분석하기 위한 미세유동장치를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1수용체 및 제2수용체는 상기 표적물질의 다른 부위에 결합하는 항체인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1수용체의 고정화는 PBS 또는 소듐 비카보네이트 버퍼 중의 제1수용체를 기판에 코팅함으로써 수행되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 차단물질은 소혈청 알부민 (BSA) 또는 카제인인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 차단물질의 고정화는 PBS 중의 차단물질을 상기 제1수용체가 고정화되어 있는 기판의 표면에 첨가하고 배양하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 효소는 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼라인 포스파타제인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 고체 기판은, 평판, 웰 또는 입자의 형태를 갖는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제2수용체는 상기 제1수용체 또는 상기 차단물질 상에 다른 물질의 매개 없이 직접적으로 코팅되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제2수용체는 사용되는 농도보다 10 내지 40배 농축된 농도인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 고체 기판은 웰의 형태를 갖는 것으로서 상기 미세유동장치 플랫폼에 결합될 수 있도록 되어 있는 카트리지인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 제1수용체, 차단물질 및 제2수용체가 고정화된 웰의 표면을 갖는 상기 카트리지를 상기 플랫폼의 장착부에 결합시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 플랫폼은 회전 중심을 중심으로 회전될 수 있도록 되어 있고, 상기 회전 중심으로부터 방사상으로 채널 및 챔버가 구비되어 있는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 카트리지와 상기 플랫폼의 결합은 초음파 융착, 핫멜트 접합, 및 레이저 접합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에 의하여 이루어지는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 카트리지가 결합된 플랫폼에 상판을 결합시켜, 상기 카트리지의 웰과 상기 상판에 의하여 반응 챔버를 형성시키는 단계는 더 포함하는 방법.
  15. 고체 기판의 표면에 고정화되어 있고, 표적물질에 결합하는 제1수용체;
    상기 고체 기판 표면의 상기 제1수용체가 고정화되어 있지 않은 영역에 고정화되어 상기 표적 물질과 상기 고체 기판 사이에 비특이적 결합이 일어나는 것을 방지 또는 감소시키는 차단물질; 및
    상기 제1수용체 및 차단물질이 고정화된 기판 상에 고정화되어 있고, 효소로 표지된 상기 표적물질에 결합하는 제2수용체;를 포함하는, 표적물질을 분석하기 위한 미세유동장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 고체 기판은 평판, 웰, 챔버 및 입자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 형태를 갖는 것인 미세유동장치.
  17. 제15항 또는 제16항에 따른 미세유동장치의 상기 고체 기판의 표면에 표적물질을 포함하는 액체 시료를 접촉시키는 단계;
    상기 고체 기판의 표면을 세척하는 단계;
    상기 세척된 고체 기판의 표면을 상기 효소의 기질과 액체 매질 중에서 접촉시키는 단계; 및
    상기 액체 매질 중의 상기 기질의 효소 반응 산물로부터 신호를 측정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 표적물질을 검출하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 효소는 호스래디쉬퍼옥시다제 또는 알칼라인 포스파타제인 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 기질은 3,3-디아미노벤지딘(diaminobenzidin:DAB), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine:TMB),2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린)-6-술폰산(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulphonic acid:ABTS), 파라-니트로페닐포스페이트(para-Nitrophenylphosphate: pNPP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate:BCIP), 루미놀 또는 아크리단인 것인 방법.
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