CN107771285A

CN107771285A - 方法

Info

Publication number: CN107771285A
Application number: CN201680033479.6A
Authority: CN
Inventors: D·N·米勒-琼斯; J·施托克利; C·尼伯格
Original assignee: Arquer Diagnostics Ltd
Current assignee: Arquer Diagnostics Ltd
Priority date: 2015-06-08
Filing date: 2016-06-01
Publication date: 2018-03-06
Also published as: WO2016198833A2; JP6854246B2; WO2016198833A3; JP2018523110A; EP3304082B1; US20230184773A1; US20180203012A1; ES2806498T3; EP3304082A2; US11519916B2

Abstract

本发明涉及用于分析来自受试者的尿液样品的方法，包括将尿液样品暴露于裂解缓冲剂，所述裂解缓冲剂能够从尿液样品中的细胞释放至少一种生物标志物。本发明还涉及可以在这些方法中使用的试剂盒、设备和装置。最后，本发明涉及用于检测受试者中泌尿系统癌症的存在的方法，包括对来自受试者的样品进行测定以确定Mcm蛋白的浓度。

Description

方法

发明领域

本发明涉及用于分析尿液样品的方法，用于帮助诊断受试者中的泌尿系统癌症的方法，用于检测受试者中指示泌尿系统癌症的生物标志物的存在的方法以及用于从尿液样品中制备细胞的装置。

背景技术

泌尿系统癌症(偶尔被称为“泌尿系癌症”)是一个重大且日益增长的流行病学问题。两种最具经济重要性的泌尿系统癌症是膀胱癌和前列腺癌。

前列腺癌是排在非黑色素瘤皮肤癌之后的男性患者中第二大常见癌症，英国每年诊断的新病例超过35,000例；每年约有10,200人死于前列腺癌。欧洲每年新增病例约30万例，美国约19万例，全球约67万例。英国癌症研究机构(Cancer Research UK)报告说，在英国男性中诊断出的所有癌症新病例中有四分之一是前列腺癌，60％的新诊断是70岁以上的男性。这种疾病最常见的形式是腺癌。英国的5年生存率接近80％。没有已知的环境原因，但与前列腺癌或乳腺癌近亲的人更容易发生疾病。西非和非裔加勒比男性的前列腺癌风险增加。

前列腺癌的症状与前列腺良性肿大引起的症状类似，包括尿急，排尿困难或排尿疼痛，和罕见地尿或精液带血。然而，在许多男性中，直到疼痛的转移癌(主要是在骨骼中)形成为止，这种疾病保持没有症状。

治疗取决于肿瘤的阶段和等级以及患者的一般健康和年龄。选项包括主动监测，局部或根治性前列腺切除术，睾丸切除术，激素治疗和放疗，如近距离放疗。睾丸切除术和激素治疗减少或消除睾丸激素的生产，其是肿瘤生长所必需的。

前列腺癌的明确诊断需要多方面的方法。目前用于前列腺癌的金标准诊断试验是活检材料的组织学检查。活检的决定是基于年龄相关的血清PSA水平和/或异常的直肠指诊(DRE)。DRE(其中腺体被直接触诊以检查形态异常)也是非特异性的。不能检测到太小而不能改变腺体形态的肿瘤，并且非恶性疾病也会导致形态异常或肿大。这是本领域中的问题。前列腺的样品通常采用TRUS(经直肠超声)引导的穿刺活检。采取多个针芯，通常最多12个，以使采样的面积最大化。手术由泌尿科医生在局部麻醉下在护士或医疗助理的协助下在门诊部门进行。该手术存在缺点，包括对患者的一定痛苦，使患者暴露于败血症和/或出血的风险。在实验室中对组织核心进行显微检查以确定是否存在恶性细胞，这具有劳动密集型的问题，需要训练有素的细胞学家，并且容易出现人为错误。

可以理解的是，活检是侵入性和昂贵的。本领域需要一种用于诊断和/或监测泌尿肿瘤如前列腺癌的更具成本效益、可靠和/或非侵入性的工具。用于前列腺癌的已知的代替和/或较少侵入性的诊断程序涉及特定生物标志物(“生物标志物”)的分析。

前列腺癌的核酸生物标志物的实例是PCA3(前列腺癌基因3)测试。该尿测定鉴定来自在前列腺癌中过表达的PCA3基因的非编码mRNA(Hessels&Schalken，The use ofPCA3in the diagnosis of prostate cancer.Nat Rev Urol，6,255-61；2009)。PCA3测试(Gen-Probe，Inc)依赖于用于产生前列腺分泌物的确定形式的前列腺按摩后产生的第一次抓取尿液样品的分析，所述前列腺分泌物含有进入尿道的上皮细胞。作为前列腺癌的诊断，PCA3的ROC值为0.68(Chun等人，Prostate Cancer Gene 3(PCA3)：development andinternal validation of a novel biopsy nomogram.Eur Urol；2009vol 56p659-668)，其与对于下面讨论的PSA测试的ROC值相似。然而，PCA3测试是昂贵的并且不适合即时护理使用，这是现有技术的问题。

PSA(前列腺特异性抗原)是常用于指示前列腺癌存在的蛋白质生物标志物的一个例子。在初级护理中出现症状的患者通常给予血清PSA测试和DRE。然而，PSA并不特异于前列腺癌。PSA是组成性表达的组织特异性细胞内酶。具有健康前列腺的男性血清中存在低浓度的PSA。由于从前列腺的渗漏，血清中的PSA水平升高，并且是腺体相对大小的指示。升高的PSA可以发生在非恶性疾病，如良性前列腺增生和前列腺炎中，也可以发生在前列腺癌中。随着年龄的增长，腺体积增大，导致PSA水平在没有恶性疾病的情况下升高。在最近的研究中发现，60-70％的“阳性”PSA检测(血清PSA水平大于4ng/mL)与癌症无关(等人,False-positive screening results in the Finnish prostatecancer screening trial,British Journal of Cancer.102,469–474；2010)。假阳性结果的高比率导致许多不必要的活组织检查操作，并使测试不适合人群筛查。此外，PSA测试未能检测到大量的前列腺癌病例，特别是在年轻男性中。在ROC(接受者操作特征)分析中测量的PSA测试的准确性是0.678(Thompson等人,Operating characteristics of aprostate-specific antigen in men with an initial PSA level of 3.0ng/ml orlower.JAMA,294,66-70；2005)。在英国，PSA检测通常在医院实验室进行，尽管快速即时护理检测是可用的。

膀胱癌是男性中第四大常见癌症，在女性中是第九大常见癌症，并且导致显著的发病率和死亡率(Jemal等人CA Cancer J Clin.2007.57:43-66.)。大多数膀胱癌患者在出现明显或微观血尿或其他刺激性排尿症状如频率和排尿困难后，会接受诊断。在最初的诊断中，约70％的患者具有局限于上皮或上皮下结缔组织的膀胱癌。这些癌症可以通过内镜切除和膀胱内治疗进行管理。这些肿瘤的复发率在50％至70％的范围内，10％至15％的病例在5年期间进展为肌肉浸润(Shariat等人,2008.Rev Urol.10:120-135)。即使几年后，复发也可能在局部见到和更罕见地在上尿路见到，从而需要终身监测。其余30％的患者在初诊时有肌肉浸润性癌症。其中50％在2年内有远处转移，60％在治疗后5年内死亡。

膀胱癌的明确诊断需要结合手术。目前还没有方法可以准确、方便地鉴别早期膀胱癌的存在。目前使用尿液分析、膀胱镜检查和扫描程序如腹部超声、静脉尿路造影、计算机断层扫描或磁共振成像进行具有合适症状的泌尿科门诊患者的膀胱癌筛查。偶尔使用尿液细胞学，其中显微镜检查来自尿液样品的细胞。作为检测膀胱癌的主要手段，膀胱镜检查是一项相对较短，创伤最小的手术，采用局部尿道麻醉，几乎可以识别所有的乳头状和无蒂病变。然而，这仍然是侵入性的，并且是导致患者不舒服和痛苦。此外，由于膀胱粘膜出现严重异常，特别是在具有留置导管或活动性炎症的患者中，膀胱镜检查有时可能是不确定的，并且无法检测输尿管内的癌症。虽然考虑用于膀胱癌的诊断的金标准，因为它允许膀胱尿道上皮的直接可视化和活检，但膀胱镜具有是来自操作者的错误或来自“原位癌”的小区域(其可能难以检测)的明显的假阴性率。(van der Poel&Debruyne.Curr Opin Urol.2001；11:503-509；Herr.BJU Int.1999；84:1102-1103.)。

在膀胱癌的尿细胞学中，可以研究脱落细胞中特定细胞表面抗原的存在，细胞核形态，基因表达或其他生物学标志物。尿液细胞学对于高级别膀胱癌的检测具有高敏感性和特异性，但缺乏检测低级别肿瘤的敏感性(Wiener等人Acta Cytol.1993；37:163-169)。尿细胞学在预测膀胱癌复发方面的准确性可能差别很大，部分原因是因为在结果的解释中存在主观因素。因此，细胞学对膀胱癌的筛查和监测并不理想。

Mcm5是癌症的生物标志物(WO99021014)。在膀胱癌的非侵入性研究中，证明尿液中微小染色体维持复合物组分5(Mcm5)的免疫荧光检测结果与尿NMP22(核基质蛋白22)的ELISA检测结果相结合，几乎可以使所有的威胁生命的疾病得到鉴定(Kelly等人,BladderCancer Diagnosis and Identification of Clinically Significant Disease byCombined Urinary Detection of Mcm5and Nuclear Matrix Protein 22PlosONE.7,e40305；2012)。

尿沉积物中Mcm蛋白如Mcm5水平的升高与前列腺恶性变化相关。因此这些Mcm蛋白水平的升高可以用来检测前列腺癌。在双抗体测定中使用(解离增强的镧系元素荧光免疫测定法)和抗Mcm5单克隆抗体，Dudderidge等人(BJC,103,701–707；2010)研究了Mcm5作为前列腺癌检测的尿生物标志物的用途，并得出结论认为它似乎是用于鉴定前列腺癌患者的简单、准确和非侵入性的方法。与具有30％特异性的PSA测试相比，Mcm5的特异性估计为73％至93％。重要的是，良性前列腺增生没有产生假阳性结果，而这是PSA测试的缺点。Mcm5和其他Mcm蛋白质的评估目前需要一个专门的实验室，配备精密的仪器和高技能的操作人员，因此该测定不适合于病理学实验室或即时护理应用。

这通过制备用于生物标志物分析的样品的复杂方法而进一步复杂化。由于Mcm蛋白存在于细胞中，所以Mcm蛋白必须从样品诸如尿液样品中的细胞中释放。制备这种样品的方法公开于Dudderidge等人(BJC，103,701-707,2010)，其中描述了样品必须使用大量步骤进行处理，包括(1)在4℃1500g离心5分钟，(2)丢弃上清液，(3)用500μl PBS洗涤细胞沉淀三次，(3)将细胞沉淀重悬于250μl或500μl处理缓冲剂(PBS，0.4％十二烷基硫酸钠和0.02％叠氮化钠)中，(4)将重新悬浮的样品在95℃孵育45分钟，(5)使裂解物通过21号针剪切样品中的DNA，(6)在37℃下用核糖核酸酶I和核糖核酸酶A消化核酸2小时，和(7)在15000g下离心10分钟。这种方法也见于其他文献，如Stoeber等人2002(Journal of theNational Cancer Institute，94,1071-1079；2002)。这种尿液样品制备方法涉及使用多种试剂的多个步骤，并且非常耗时。通常这些方法至少需要两个小时。因此，需要一种制备尿液样品的方法和/或装置，其不太繁重。这样的方法将更适合于病理学实验室或即时护理应用。

目前用于检测Mcm蛋白质，特别是Mcm5的测定需要采用使用复杂且涉及昂贵的设备和试剂的DELFIA技术。因此，基于DELFIA的测定不适用于病理学实验室或即时护理应用，并且需要适用于这种应用的测定。

发明概述

本发明提供可用于早期检测泌尿系统癌症诸如前列腺癌而不需要有创手术程序的方法、组合物和试剂盒。该方法和组合物适用于临床实验室和/或即时护理应用。

本发明人已经证明，现有技术中描述的复杂的尿液样品制备方法不需要从样品例如尿液样品中的细胞中释放生物标志物，例如Mcm5。相反，只需要将样品暴露于能够从样品中的细胞释放生物标志物的裂解缓冲剂。这比现有技术方法简单得多。根据本发明，在一些实施方案中，样品(如尿液样品)中的细胞可以通过添加单一裂解缓冲剂来制备和裂解。类似地，本发明人已经设计出可用于容易地执行暴露于裂解缓冲剂的装置

本发明人还证明，不使用免疫荧光的Mcm蛋白质测定法能够准确地检测受试者是否患有泌尿系统癌症。这比使用铕标记和DELFIA检测的现有技术有利。这样的方法昂贵且复杂，因此不适用于病理学实验室或即时护理应用。

因此，在第一方面，提供了用于分析来自受试者的尿液样品的方法，包括

a.将尿液样品暴露于裂解缓冲剂中，其中裂解缓冲剂能够从尿液样品中的细胞释放至少一种生物标志物；和

b.进行测定以确定尿液样品中至少一种生物标志物的浓度。

在第二方面，提供了用于分析来自受试者的尿液样品的方法，包括将尿液样品暴露于裂解缓冲剂中的步骤，其中：

a.裂解缓冲剂不是含有0.4％脱氧胆酸钠和0.02％叠氮化钠的PBS；

b.该方法不包括在高于90℃的温度下孵育尿液样品大约45分钟；

c.该方法不包括使尿液样品通过21号针剪切核酸；

d.该方法不包括通过将尿液样品暴露于DNA酶I或RNA酶A来消化核酸；和/或

e.该方法不包括以15,000g离心样品十分钟；

并且其中所述方法进一步包括进行测定以确定所述尿液样品中的至少一种生物标志物的浓度的步骤。

在第三方面，提供了用于分析包含来自受试者的细胞的尿液样品的方法，其中所述尿液样品使用包括以下步骤的方法制备：

a.浓缩尿液样品中的细胞；和

b.将浓缩的细胞暴露于裂解缓冲剂；

在第四方面，提供了用于分析包含来自受试者的细胞的尿液样品的方法，其中所述尿液样品使用包括以下步骤的方法制备：

a.离心样品以提供样品沉淀；和

b.在裂解缓冲剂中重悬来自样品的沉淀的细胞；

第五方面，提供了试剂盒，其包含能够从尿液样品中的细胞中释放至少一种生物标志物的裂解缓冲剂，捕获抗体和检测抗体，其中捕获抗体和检测抗体结合Mcm5。

在第六方面，提供了用于从尿液样品制备细胞的装置，所述装置包括：

入口；

定位在入口下游并且与入口流体连通的第一阀布置；

用于从尿中捕获细胞的过滤器，所述过滤器布置在所述第一阀布置的下游并且与所述第一阀布置流体连通；

定位在过滤器下游并且与过滤器流体连通的第二阀布置；

布置在所述第二阀布置下游并与所述第二阀布置流体连通的出口；

用于容纳裂解缓冲剂的第一缓冲剂储存器，所述第一缓冲剂储存器与所述第一阀布置流体连通；

用于容纳裂解缓冲剂的第二缓冲剂储存器，所述第二缓冲剂储存器与所述第二阀布置流体连通；

其中第一和第二阀布置可以被构造成使得：

在第一和第二阀布置的第一构造中，第一缓冲剂储存器和过滤器之间的流体连通被阻断，第二缓冲剂储存器和过滤器之间的流体连通被阻断，并且入口、过滤器和出口之间的流体连通是打开的，使得尿液能够通过过滤器从入口流到出口；和

在第一和第二阀布置的第二构造中，第一缓冲剂储存器和过滤器之间的流体连通是打开的，第二缓冲剂储存器和过滤器之间的流体连通是打开的并且通过入口和出口的流动被阻断，裂解缓冲剂能够经由过滤器在第一缓冲剂储存器与第二缓冲剂储存器之间流动。

在第七方面，提供了从尿液样品制备细胞的方法，所述方法包括：

使尿液样品通过用于捕获细胞的过滤器，使得细胞被捕获在过滤器中；

使裂解缓冲剂通过过滤器，使得捕获的细胞暴露于裂解缓冲剂；

将过滤器孵育一段时间，使得裂解缓冲剂使细胞释放至少一种生物标志物。

在第八方面中，提供了用于检测指示受试者中的泌尿系统癌症的生物标志物的存在的方法，所述方法包括：

a.对来自受试者的样品进行测定以确定Mcm蛋白质的浓度；

b.将步骤a中确定的Mcm蛋白的浓度与参考值进行比较；

其中该测定不是免疫荧光测定。

在第九方面中，提供了适用于实施本发明的方法的试剂盒。

第十方面，提供了用于诊断泌尿系统癌症的试剂盒，其包含捕获抗体和检测抗体，其中(a)捕获抗体和检测抗体与Mcm5特异性结合，(b)捕获抗体与固体支持物结合，和(c)检测抗体与辣根过氧化物酶缀合。

在第十一方面中，提供了用于分析来自受试者的尿液样品的设备，所述设备包括：

本发明的装置；和

能够确定尿液样品中的至少一种生物标志物的浓度的测定设备。

在第十二方面中，提供了本发明的裂解缓冲剂用于从尿液样品中的细胞释放至少一种生物标志物的用途。

附图的简要说明

图1是序列表。

图2显示了描述不同浓度的Mcm5在450nm处的吸光度的图。

图3显示了描述如何稀释贮液校准溶液的图表。

图4显示了比较暴露于4种不同的裂解缓冲剂(Uro LB“0.08％脱氧胆酸钠，0.08％CHAPS，2mM EDTA，150mM Trizma pH 7.6)、Cytobuster TM、Glolysis TM和0.1％SDS 50mMTrizma pH 7.6,150mM NaC，1mM EDTA后从泌尿道上皮癌细胞释放的Mcm5的量。

图5显示了比较在修改之前的CytoBuster、RIPA缓冲剂和TBS-T缓冲剂的图。

图6显示冻融裂解前和裂解后，比较基于TBST缓冲剂并包含来自RIPA缓冲剂的元素的缓冲剂的图。

图7显示冻融裂解前和裂解后，比较基于RIPA缓冲剂的缓冲剂但移除了一些RIPA缓冲剂元素的缓冲剂的图。

图8显示使用新鲜裂解物，比较具有不同浓度的Tris和Triton X-100的缓冲剂的图。

图9显示使用新鲜裂解物，比较不同缓冲剂基础制剂(TBS，PBS，碳酸氢盐，MOPS和HEPES)的图。

图10显示使用新鲜裂解物，比较具有不同浓度的Tris(100mM-350mM)的缓冲剂的图。

图11显示使用冻融裂解物，比较基于TBS-T和RIPA缓冲剂但具有改变的离子强度的缓冲剂的图。

图12显示使用冻融裂解物，比较具有改变的NaCl强度的TBS-T缓冲剂的图。

图13A和13B显示比较进一步包含各种稳定剂的TBS-T缓冲剂的图。

图14显示比较储存6天后包含不同浓度的稳定剂的TBST缓冲剂的图。

图15A，15B和15C显示评估各种细胞系中TBST缓冲剂+/-2.5％BSA的功效的图。

图16显示比较具有或不具有ProClin950的TBST+2.5％BSA缓冲剂的图。

图17显示比较具有或不具有叠氮化钠(NaN 3)的TBST+2.5％BSA缓冲剂的图。

图18描述了用于从尿液样品制备细胞的装置。

详细说明

定义

术语“包括”(含有，包含)应当被理解为具有其在本领域中的通常含义，即包括所陈述的特征或特征组，但是该术语不排除存在任何其他陈述的特征或特征组。

术语“由...组成”还应该被理解为具有其在本领域中的通常含义，即包括所陈述的特征或特征组，以排除其它特征。例如，由去污剂组成的裂解缓冲剂含有去污剂并且不含其它组分。另一方面，包含由聚山梨醇酯80组成的去污剂的裂解缓冲剂可包含除去污剂以外的组分，但裂解缓冲剂中唯一的去污剂是聚山梨醇酯80。

对于使用“包括”或“包含”的每个实施方案，我们预期使用其中使用“由......构成”或“由......组成”的另一实施方案。因此，“包含”的每一个公开应该被认为是“由...组成”的公开。

尿液样品制备方法

本发明涉及分析尿液样品的方法，包括将尿液样品暴露于裂解缓冲剂。这些方法比现有技术方法简单得多，成本效益更高。

术语“将尿液样品暴露于裂解缓冲剂”可以被认为是指以这样的方式操纵尿液样品，以使得尿液样品中的细胞(或者这些细胞的大部分)与裂解缓冲剂接触。合适地，将尿液样品离心以提供样品沉淀物，弃去上清液，将样品沉淀物重新悬浮在裂解缓冲剂中。或者，例如，将浓缩的缓冲剂组分加入到液体尿液样品中以形成包含暴露于裂解缓冲剂的尿液样品的溶液。

在一个实施方案中，尿液样品使用包含以下步骤的方法制备：

a.浓缩尿液样品中的细胞；和

b.将浓缩的细胞暴露于裂解缓冲剂。

适当地，浓缩尿液样品中的细胞的步骤a是通过过滤尿液样品以捕获细胞来进行的。适当地，将细胞浓缩在裂解缓冲剂中的步骤a以及将浓缩细胞暴露于裂解缓冲剂的步骤b使用本发明的装置或设备或使用本发明的从尿液样品制备细胞的方法进行。

在进一步优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：在将尿液样品暴露于裂解缓冲剂的步骤之前浓缩尿液样品中的细胞，将浓缩的细胞暴露于裂解缓冲剂或将样品中的沉淀的细胞重新悬浮于裂解缓冲剂。

在一个实施方案中，使用包括以下步骤的方法制备包含细胞的尿液样品：a.离心样品以提供样品颗粒；和b.在裂解缓冲剂中重新悬浮样品中的沉淀细胞。

合适地，将样品在500g至5000g离心1分钟至30分钟，在750g至2500g离心1分钟至20分钟，在750g至2000g离心3分钟至10分钟，或者在1500g离心约5分钟。

合适地，使用带有一次性吸头的可调节移液管将沉淀物重新悬浮。

在一个实施方案中，该方法不包括在大于90℃的温度下孵育尿液样品大约45分钟。任选地，该方法不包括在高温下孵育尿液样品。在一个实施方案中，高温是高于50℃，高于60℃，高于70℃，高于80℃，高于90℃，50℃至120℃，高于60℃110℃，70℃至100℃，或80℃至100℃。任选地，该方法不包括在高温下孵育尿液样品超过30分钟，超过35分钟，超过40分钟，超过45分钟，30分钟至2小时，35分钟至2小时，或40分钟至2小时。

在另一个实施方案中，该方法不包括通过使尿液样品通过21号针来剪切核酸。在另一个实施方案中，该方法不包括将尿液样品暴露于机械剪切。

在另一个实施方案中，该方法不包括通过将尿液样品暴露于DNA酶I或RNA酶A来消化核酸。

任选地，该方法不包括在高于90℃的温度下孵育尿液样品超过45分钟，通过使尿液样品通过21号针来剪切尿液样品中的核酸，通过暴露尿液样品转移至DNA酶I或RNA酶A，以15,000g离心样品10分钟，其中裂解缓冲剂不是含有0.4％脱氧胆酸钠和0.02％叠氮化钠的PBS。

短语“不包括通过将尿液样品暴露于DNA酶I或RNA酶A来消化核酸”是指样品不应暴露于能有效引起样品中核酸的显著消化的浓度的DNA酶I或RNA酶A。优选地，样品不暴露于超过20U/ml DNA酶I或超过1μg/mL RNA酶A。适当地，样品不暴露于超过1U/ml，超过5U/ml，超过10U/ml，超过15U/ml，1U/ml至500U/ml，5U/ml至250U/ml，10U/ml至100U/mL或15U/ml至100U/ml的DNA酶I。适当地，样品不暴露于超过0.1μg/mL，超过0.2μg/mL，超过0.5μg/mL，超过0.7μg/mL，0.1μg/ml至100μg/ml，0.5μg/mL至50μg/mL或0.5μg/mL至25μg/mL的RNA酶A。

在另一个实施方案中，该方法不包括以15,000g离心样品十分钟。在另一个实施方案中，该方法不包括离心样品。在另一个实施方案中，该方法不包括将样品以超过10,000g，超过12,000g，超过14,000g或超过14,500g离心。在另一个实施方案中，该方法不包括将样品离心超过2分钟，超过5分钟，超过7分钟或超过8分钟。

在优选的实施方案中，所述方法是用于从尿液样品中的细胞释放至少一种生物标志物如Mcm5并确定从细胞释放的至少一种生物标志物的浓度的方法。

在一个实施方案中，用于分析本发明的尿液样品的方法是帮助诊断受试者中的泌尿学癌症的更大方法的一部分。

本发明的裂解缓冲剂

裂解缓冲剂通常是用于裂解细胞的目的的缓冲剂。除了从细胞释放一种或多种生物标志物之外，裂解缓冲剂必须与用于随后分析的方法相容。例如，在分析方法是双抗体夹心ELISA的情况下，裂解缓冲剂不能降解结合到微量滴定板表面的捕获抗体。裂解缓冲剂通常但不排他地包含一种或多种去污剂(也称为表面活性剂)，一种或多种盐和缓冲剂。这些组分的浓度影响裂解缓冲剂的功效。

在本发明的优选实施方案中，裂解缓冲剂能够从样品中的细胞释放生物标志物，例如Mcm5。如果释放的生物标志物(例如Mcm5)的量大于当使用含有0.08％脱氧胆酸钠，0.08％CHAPS，2mM EDTA，150mM Trizma pH 7.6的缓冲剂时释放的量的40％，50％，60％，70％，或80％，则裂解缓冲剂将被认为是“能够从样品中的细胞释放生物标志物如Mcm5”。在一个实施方案中，如果释放的生物标志物例如Mcm5的量大于当使用含有10mM Tris(pH7.6)，200mM NaCl，2.5％BSA，0.1％Triton X100和0.09％叠氮化钠的缓冲剂时释放的量的40％，50％，60％，70％或80％，则裂解缓冲剂将被认为是“能够从样品中的细胞释放生物标志物，例如Mcm5”。使用裂解缓冲剂释放的生物标志物例如Mcm5的量可以通过测定暴露于裂解缓冲剂后存在的量并将其与参考样品(优选与第一个样品基本上相同或同一的样品样品，其已经暴露于含有0.08％脱氧胆酸钠，0.08％CHAPS，2mM EDTA，150mM Trizma pH7.6的缓冲剂)比较来确定。在一个实施方案中，使用裂解缓冲剂释放的生物标志物例如Mcm5的量可以通过测定暴露于裂解缓冲剂后存在的量并将其与参考样品(优选与第一个样品基本上相同或同一的样品样品，其已经暴露于含有10mM Tris(pH 7.6),200mM NaCl,2.5％BSA,0.1％Triton X100和0.09％叠氮化钠的缓冲剂)比较来确定，释放的生物标志物(例如Mcm5)的量可以使用夹心ELISA测定法(例如实施例1中所述的测定法)来测量。用于夹心测定法的抗体应是与生物标志物例如Mcm5结合的抗体，例如根据本发明的第一单克隆抗体或第二单克隆抗体。优选使用12A7和4B4抗体。

在本发明的甚至更优选的实施方案中，裂解缓冲剂能够从尿液样品中的细胞中释放Mcm5，并且基本上不降解Mcm5蛋白质。如果在样品暴露于裂解缓冲剂之后存在的完整Mcm5的量大于在暴露于含有0.08％脱氧胆酸钠，0.08％CHAPS，2mM EDTA，150mM TrizmapH7.6的缓冲剂后的完整Mcm5蛋白的量的40％，50％，60％，70％或80％，则认为缓冲剂不会实质性降解Mcm5蛋白。如果存在与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2结合的抗体(例如第一单克隆抗体和第二单克隆抗体或抗体12A7和4B4)的结合位点，则认为Mcm5蛋白是完整的。确定样品中Mcm5有多少被降解是在技术人员的能力范围内的。应该测试样品以查看样品中的Mcm5是否可以结合本发明的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体。这可以使用如实施例1中所述的夹心ELISA测定来测量。夹心测定中使用的抗体应是结合Mcm5的抗体，例如本发明的第一单克隆抗体或第二单克隆抗体。优选使用12A7和4B4抗体。

如果暴露于裂解缓冲剂后抗体的活性是暴露于裂解缓冲剂之前抗体活性的40％，50％，60％，70％或80％，则可以认为裂解缓冲剂不使抗体变性。抗体的活性可以使用例如实施例1中所述的ELISA测定来测试。

在一个实施方案中，裂解缓冲剂能够从新鲜样品中的细胞释放Mcm5。术语“新鲜样品”是指未被冷冻的样品。优选地，在用于本发明的方法之前少于10天，少于5天，少于2天或少于1天从患者获得“新鲜样品”。在一个实施方案中，将细胞暴露于裂解缓冲剂，然后冷冻，然后进一步处理。例如，可以通过离心浓缩尿液样品，然后丢弃上清液，然后可以将裂解缓冲剂添加到浓缩的细胞中。优选地，在进行测定以确定尿液样品中的至少一种生物标志物的浓度的步骤之前，将冷冻样品解冻。优选地，在进行测定以确定尿液样品中至少一种生物标志物的浓度的步骤之前，将样品冷冻至少1小时，至少1天，至少5天或至少10天。优选地，在进行测定以确定尿液样品中的至少一种生物标志物的浓度的步骤之前，将样品冷冻1小时至1年，1小时至6个月，1天至3个月或约1周。

在本发明的一个实施方案中，裂解缓冲剂是Cytobuster ^TM蛋白质提取试剂。

在一个实施方案中，裂解缓冲剂不是含有0.4％脱氧胆酸钠和0.02％叠氮化钠的PBS。

在一个实施方案中，裂解缓冲剂包含去污剂(也称为表面活性剂)。通常，去污剂是已知破坏细胞壁的化合物。去污剂是具有疏水性和亲水性区域的两亲性物质。合适的去污剂是本领域技术人员所熟知的。适宜的去污剂是阴离子去污剂，阳离子去污剂，非离子去污剂或两性离子去污剂。合适的去污剂选自脱氧胆酸钠，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)，烷基苯磺酸盐，十二烷基苯磺酸钠，吐温去污剂(例如聚氧乙烯(2b)脱水山梨醇单油酸酯或吐温-20)和Triton去污剂(例如聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚或Triton X-100)。去污剂适宜地包含脱氧基酸钠。去污剂合适地包含CHAPS。去污剂合适地包含脱氧胆酸钠和CHAPS。合适地，裂解缓冲剂包含浓度为0.01％至0.15％，0.03％至0.10％，0.05％至0.09％或约0.08％的脱氧胆酸钠。合适地，裂解缓冲剂包含浓度为0.01％至0.15％，0.03％至0.10％，0.05％至0.09％或约0.08％的CHAPS。去污剂适宜地包含Triton X-100。优选去污剂包含浓度为0.01％至25％，0.01％至10％，0.05％至5％，0.05％至1％，0.05％至0.5％，0.075％至0.125％或约0.1％的Triton X-100。去污剂适宜地由triton X-100组成。优选去污剂由浓度为0.01％至25％，0.01％至10％，0.05％至5％，0.05％至1％，0.05％至0.5％，0.075％和0.125％或约0.1％Triton X-100组成。去污剂合适地包含聚山梨醇酯，优选聚山梨酸酯20(也称为吐温20)。合适地，去污剂包含浓度为0.01％至5％，0.02％至1％，0.03％至0.07％或约0.05％的聚山梨醇酯。去污剂适宜地包含脱氧胆酸钠或十二烷基硫酸钠。例如，去污剂可以包含0.1％至20％，0.5％至10％，0.5％至5％，0.75％至1.25％或约1％的浓度的脱氧胆酸钠或十二烷基硫酸钠。

在另一个实施方案中，裂解缓冲剂包含螯合剂。在另一个实施方案中，裂解缓冲剂不包含螯合剂。螯合剂是可配位金属离子的多基配体。螯合剂适宜的是EDTA(乙二胺四乙酸)。任选地，裂解缓冲剂包含浓度为0.5mM至10mM，1mM至5mM，1.5mM至3mM或约2mM的EDTA。

在另一个实施方案中，裂解缓冲剂包含缓冲剂组分。缓冲剂组分可以被认为是将裂解缓冲剂的pH保持在pH变化小于2.0pH单位，1.5pH单位或1.0pH单位的任何组分。适用于此目的的缓冲剂的实例是本领域技术人员所熟知的。在一个实施方案中，缓冲剂组分是选自以下的缓冲剂：TAPS(3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸)，Bicine(N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸)，Tris(三(羟甲基)甲胺)，Tricine(N-三(羟甲基(甲基甘氨酸)，TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸，HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)和MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)。合适的缓冲剂组分包括Tris，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，MOPS，碳酸氢盐或HEPES缓冲剂。适宜地，缓冲剂组分包含Tris，PBS，MOPS或碳酸氢盐缓冲剂。适宜地，缓冲剂组分包含Tris，PBS或碳酸氢盐缓冲剂。在一个实施方案中，缓冲剂组分是Tris或Trizma缓冲剂。在一个实施方案中，缓冲剂组分包含Tris或Trizma缓冲剂或由其组成。Trizma可以指 Pre-set crystals pH 7.6’(Sigma-Aldrich Cat.No.T7943)。在另一个实施方案中，缓冲剂组分将所述缓冲剂的pH保持在pH 4至pH 9，pH 5至pH 8，pH 6至pH 8，或者约pH 7.6。任选地，缓冲剂组分是Tris或Trizma缓冲剂，并且缓冲剂组分将裂解缓冲剂的pH保持在pH 4至pH 9，pH 5至pH 8，pH 6至pH 8，或者约pH 7.6。任选地，缓冲剂组分包含Tris或Trizma缓冲剂或由Tris或Trizma缓冲剂组成，并且缓冲剂组分将裂解缓冲剂的pH维持在pH 4至pH 9，pH 5至pH 8，pH 6至pH 8，或者约pH 7.6。

优选地，缓冲剂组分包含tris缓冲剂，例如浓度为大于5mM，5mM至350mM，200mM至300mM，225mM至275mM，10mM至25mM，8mM至12mM，约10mM或约250mM。优选地，缓冲剂组分由tris缓冲剂组成，例如浓度为大于5mM，5mM-350mM，200mM-300mM，225mM-275mM，10mM-25mM，8mM-12mM，约10mM或约250mM。合适地，缓冲剂组分包含磷酸盐缓冲盐水，例如浓度为5mM至250mM，50mM至250mM或约100mM。

在一个实施方案中，裂解缓冲剂包含浓度为0.01％至0.15％的脱氧胆酸钠，浓度为0.01％至0.15％的CHAPS，浓度为0.5mM至10mM的EDTA，以及Tris或Trizma缓冲剂，其中Tris或Trizma缓冲剂将裂解缓冲剂的pH保持在pH 4至pH 9。在另一个实施方案中，裂解缓冲剂包含浓度为0.05％至0.09％的脱氧胆酸钠，浓度为0.05％至0.09％的CHAPS，浓度为1.5mM至3mM的EDTA，和Tris或Trizma缓冲液，其中Tris或Trizma缓冲剂将裂解缓冲剂的pH保持在pH 6至pH 8。在另一个实施方案中，裂解缓冲剂包含浓度为约0.08％的脱氧胆酸钠，浓度为约0.08％的CHAPS，浓度为约2mM的EDTA，以及Tris或Trizma缓冲剂，其中Tris或Trizma缓冲剂将裂解缓冲剂的pH维持在约pH7.6。

在一个实施方案中，裂解缓冲剂包含选自以下的盐：氯化钠，氯化钾，氯化镁，硫酸钠，硫酸钾，硫酸镁，乙酸钠，乙酸钾，乙酸镁，磷酸钠，磷酸钾或磷酸镁。优选的盐是钠盐或钾盐。合适的盐是氯化钠或氯化钾。合适地，盐的浓度为20mM至300mM，150mM至300mM，100mM至200mM，150mM至250mM，175mM至275mM或约200mM。合适的盐包含氯化钠或氯化钾或由氯化钠或氯化钾组成。合适地，盐的浓度为20mM至300mM，150mM至300mM，100mM至200mM，150mM至250mM，175mM至275mM或约200mM。优选地，盐是氯化钠，例如浓度为20mM至300mM，在150mM至300mM，在100mM至200mM或者约200mM。优选地，盐包含氯化钠或由氯化钠组成，例如浓度为20mM-300mM，150mM-300mM，100mM-200mM或约200mM。

在一个实施方案中，裂解缓冲剂具有1mM至500mM，50mM至450mM，100mM至250mM，100mM至175mM或125mM至175mM的离子强度。缓冲剂的各种组分可能促成这种离子强度。例如，裂解缓冲剂可以包含缓冲剂组分(例如Tris)和额外的盐组分(例如氯化钠)，并且这两种组分都可以促成裂解缓冲剂的离子强度。

在一个实施方案中，裂解缓冲剂包含稳定剂。“稳定剂”是减少蛋白质分解的成分。例如，稳定剂减少Mcm5的分解。可以使用夹心ELISA测定法(例如实施例1中所述的测定法)测试缓冲剂组分是否稳定Mcm5。例如，可以将样品暴露于包含潜在稳定剂的裂解缓冲剂，并且可以将对照样品暴露于缺乏潜在的稳定剂的裂解缓冲剂。使用夹心ELISA测定暴露后可检测的Mcm5的水平。如果具有包含潜在稳定剂的缓冲剂的样品中的Mcm5水平大于具有不包含潜在稳定剂的缓冲剂的样品中的Mcm5水平，则潜在稳定剂是根据本发明的稳定剂。本发明的稳定剂可防止Mcm5的分解，使得在包含稳定剂的缓冲剂中储存1天，3天，5天，1周或2周后存在1％，2％，5％，10％，20％或25％更多的Mcm5(与不包含稳定剂的缓冲剂相比)。

稳定剂可以是选自牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FBS)和蛋白酶抑制剂的稳定剂。例如，蛋白酶抑制剂包括4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(Petrabloc SC或AEBSF)，蛋白酶抑制剂混合物(如Sigma P8340)，其包含AEBSF、抑肽酶、贝他汀盐酸盐、N-(反式-环氧琥珀酰)-L亮氨酸4-胍丁酰胺(E-64)、亮抑酶肽半焦硫酸盐和胃蛋白酶抑制剂A，以及Roche完全蛋白酶抑制剂。优选地，稳定剂是BSA，例如浓度为0.1％至20％，0.1％至10％，0.1％至5％，1％至3％，2.2％至2.7％或约2.5％。优选地，稳定剂包含BSA或由BSA组成，例如浓度为0.1％至20％，0.1％至10％，0.1％至5％，1％至3％，2.2％至2.7％或约2.5％。

裂解缓冲剂可以包含抗微生物剂。如果组分减少微生物(例如细菌，病毒或真菌)的复制，则组分是“抗微生物剂”。在一个实施方案中，抗微生物剂是叠氮化钠或异噻唑酮。在一个实施方案中，抗微生物剂包含叠氮化钠或异噻唑酮或由叠氮化钠或异噻唑酮组成。异噻唑酮可以是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和/或5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。优选地，抗微生物剂包含叠氮化钠，例如浓度为0.01％至5％，0.02％至1.5％，0.07％至0.12％或约0.09％。优选地，抗微生物剂由叠氮化钠组成，例如浓度为0.01％至5％，0.02％至1.5％，0.07％至0.12％或约0.09％。

裂解缓冲剂可以包含：

(i)1mM至500mM Tris；

(ii)5mM至500mM氯化钠；

(iii)0.1％至20％的BSA；

(iv)0.001％至10％Triton X-100；和

(v)0.001％至1％叠氮化钠。

裂解缓冲剂可以由以下组成：

(i)1mM至500mM Tris；

(ii)5mM至500mM氯化钠；

(iii)0.1％至20％的BSA；

(iv)0.001％至10％Triton X-100；和

(v)0.001％至1％叠氮化钠。

或者，裂解缓冲剂可以包含：

(i)1mM至150mM Tris；

(ii)50mM至400mM氯化钠；

(iii)0.5％至10％的BSA；

(iv)0.01％至5％的Triton X-100；和

(v)0.01％至0.5％的叠氮化钠。

或者，裂解缓冲剂可以由以下组成：

(i)1mM至150mM Tris；

(ii)50mM至400mM氯化钠；

(iii)0.5％至10％的BSA；

(iv)0.01％至5％的Triton X-100；和

(v)0.01％至0.5％的叠氮化钠。

或者，裂解缓冲剂可以包含：

(i)1mM至100mM Tris；

(ii)100mM至300mM氯化钠；

(iii)1％至5％的BSA；

(iv)0.01％至1％的Triton X-100；和

(v)0.01％至0.1％叠氮化钠。

或者，裂解缓冲剂可以由以下组成：

(i)1mM至100mM Tris；

(ii)100mM至300mM氯化钠；

(iii)1％至5％的BSA；

(iv)0.01％至1％的Triton X-100；和

(v)0.01％至0.1％叠氮化钠。

裂解缓冲剂可以包含：

(i)约10mM Tris；

(ii)约200mM氯化钠；

(iii)大约2.5％的BSA；

(iv)约0.1％Triton X-100；和

(v)约0.09％叠氮化钠。

裂解缓冲剂可以由以下组成：

(i)约10mM Tris；

(ii)约200mM氯化钠；

(iii)约2.5％的BSA；

(iv)约0.1％Triton X-100；和

(v)约0.09％叠氮化钠。

裂解缓冲剂可以是RIPA缓冲剂。

在一个实施方案中，本发明的裂解缓冲剂用于从尿液样品中的细胞释放至少一种生物标志物。任选地，所述至少一种生物标志物是Mcm蛋白质，优选Mcm5。

试剂盒

在本发明的一个方面，提供了包含本发明的裂解缓冲剂，捕获抗体和检测抗体的试剂盒，其中捕获抗体和检测抗体结合Mcm5。试剂盒可以用作测定(例如ELISA测定)的一部分以确定样品中Mcm5的浓度。裂解缓冲剂可以从样品中的细胞释放Mcm5。捕获抗体和检测抗体可用于定量样品中Mcm5的浓度。

捕获抗体和检测抗体

“捕获抗体”是结合于固体支持物例如ELISA板(也称为微滴定板)的表面的抗体。“捕获抗体”能够结合Mcm5，从而将Mcm5结合到固体支持物上。在一个实施方案中，“捕获抗体”被固定在ELISA板上。

“检测抗体”是与靶标例如Mcm5结合的并且可用于检测靶标浓度的抗体。例如，可以通过可检测标记直接或间接标记抗体。或者，可以通过使检测抗体与对“检测抗体”的Fc区特异性的第三抗体接触来标记“检测抗体”，在这种情况下，第三抗体应带有标记。合适标记的实例包括酶(例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶)，放射性同位素(例如铕2+)，DNA报告分子，荧光报告分子或电化学发光标记。在一个优选的实施方案中，“检测抗体”通过缀合至辣根过氧化物酶来标记。

抗体

术语“抗体”可以指天然存在的形式或重组抗体，例如单链抗体，嵌合抗体或人源化抗体。术语“抗体”也可以被认为包括能够结合靶蛋白的抗体的片段，诸如像Mcm5的Mcm蛋白。这样的片段可以包括Fab’₂,F’(ab)₂，Fv，单链抗体或双抗体。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是天然存在的全长抗体(而不是片段)。在进一步优选的实施方案中，抗体不是人源化抗体。

通常，抗体由两条重链和两条轻链形成。每条重链由重链恒定区(CH)和重链可变区(VH)组成。类似地，每条轻链由轻链恒定区(CL)和轻链可变区(VL)组成。VH和VL区包含互补决定区(CDR)。CDR主要负责与靶蛋白的特异性结合。

此外，本发明的抗体将结合Mcm5的表位(片段)。因此，术语“与Mcm5结合的抗体”是指仅与Mcm5的单个表位结合的抗体。任选地，结合Mcm5的抗体是“特异性结合”Mcm5的抗体。术语“特异性结合”是指与靶标例如Mcm5结合的抗体，其结合亲和力比其对非靶标分子的结合亲和力大至少2倍，10倍，50倍或100倍。

检测抗体可以与标记(例如铕²⁺或辣根过氧化物酶)缀合。标记可以直接附接或可以通过接头(例如己二酸二酰肼或ADH)附接。

标记可以通过化学缀合来附接。将标记缀合到抗体的方法是本领域已知的。例如，可以使用缀合的碳二亚胺(Bauminger&Wilchek(1980)Methods Enzymol.70,151-159)将标记缀合至抗体。也可以使用其他将标记缀合到抗体上的方法。例如，可以使用高碘酸钠氧化，随后还原烷基化或还原酰胺化适当的反应物，如可以使用戊二醛交联。然而，应该认识到，无论选择何种生产本发明缀合物的方法，都必须确定缀合的抗体保持其靶向能力，并且缀合的标记维持其功能。

在一个优选的实施方案中，检测抗体通过缀合至铕来标记。这可以使用EG&GWallac DELFIA^(R)标记试剂盒并遵循制造商的方案来实现。

开发结合Mcm5的抗体完全在本领域技术人员的能力范围内。这可以通过用Mcm5免疫哺乳动物如小鼠、兔或豚鼠来进行。包括佐剂如弗氏完全佐剂可能是有益的。移出免疫的哺乳动物的脾脏细胞，并与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞系，其在适当的条件下永生化并分泌抗体。将杂交瘤分成单个克隆，评估每个克隆分泌的抗体与Mcm5蛋白的结合能力。

其他试剂盒组件

在一个实施方案中，试剂盒包括校准物。“校准物”是一个或多个已知浓度的Mcm5制剂。

在一个实施方案中，试剂盒包含底物试剂。底物试剂可用于检测检测抗体。例如，当“检测抗体”与辣根过氧化物酶缀合时，底物试剂可以包含TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，DAB(3,3'-二氨基联苯胺)或ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))。在一个优选的实施方案中，底物试剂包含TMB。在更优选的实施方案中，底物试剂是过氧化物和TMB。

在一个实施方案中，试剂盒还包含洗涤溶液和/或终止溶液。

在一个实施方案中，该试剂盒适用于进行夹心ELISA。

用于检测受试者中泌尿系统癌症的存在的方法

本发明还提供了用于检测受试者中泌尿系统癌症的存在的方法。这样的方法优选是体外方法。这样的方法包括“进行测定以确定至少一种生物标志物的浓度”的步骤。

进行测定以确定生物标志物(例如Mcm蛋白质)的浓度，

在本发明的一个实施方案中，术语“检测生物标志物的存在”可被认为可用术语“进行测定以确定生物标志物的浓度”来替代。在这样的实施方案中，生物标志物的存在可以被认为是被检测到的，其中其浓度高于限定的截断水平。

生物学标志物或生物标志物是在血液或其他体液或组织中发现的分子，其有助于指示生物学状态、过程、事件、状况或疾病。本领域技术人员将清楚，生物标志物可以由但不限于DNA、RNA、染色体异常、蛋白质及其衍生物或代谢物组成。一般而言，生物标志物可被视为过程、事件或状况的独特生物学或生物衍生指标。换句话说，生物标志物指示某种生物状态，例如癌性组织的存在。在一些情况下，不同形式的生物标志物可以指示某些疾病状态。或者，仅在体液例如血液和/或尿液中存在升高(或降低)的本发明生物标志物水平是泌尿系统癌症的指示。在一些实施方案中，生物标志物可以是特定的蛋白质或肽，其在生物流体例如尿液(包括尿沉积物)、血液、唾液或精液中存在、过度表达或低表达可以反映泌尿系统癌症如前列腺癌的存在、进展、对治疗的反应或严重程度。

因此，术语“生物标志物”包括所鉴定的蛋白质或核酸的所有生物相关形式，包括翻译后修饰的多肽。例如，当生物标志物是多肽时，标志物蛋白质可以以糖基化，磷酸化，多聚体或前体形式存在于样品中。

没有特别要求对例如全长多肽(或核酸)的浓度进行评分。实际上，检测可以通过测定存在的感兴趣的多肽的特定片段来进行，这些片段因此被用来指示样品中总体生物标志物多肽的存在。如果例如通过质谱分析样品，这是尤其如此的。因此，本发明包括检测多肽(或核酸)生物标志物的片段。而且，本发明的试剂盒和肽可以包含多肽的片段，并且不需要包含本文例举的全长序列。合适地，片段足够长以能够实现其通过免疫学或质谱方法的独特鉴定。

因此，对于多肽，片段合适地为至少6个氨基酸的长度，合适地至少7个氨基酸的长度，合适地至少8个氨基酸的长度，合适地至少9个氨基酸的长度，合适地至少10个氨基酸的长度，合适地至少15个氨基酸，合适地至少25个氨基酸，合适地至少50个氨基酸，合适地至少100个氨基酸，或合适地为感兴趣的生物标志物多肽的大部分。合适地，片段包含感兴趣的生物标志物多肽的小片段，同时足够长以保留可鉴定的氨基酸序列或质量。

相同的考虑适用于核酸核苷酸序列。对于核酸序列，合适地，片段的长度为至少15个核苷酸，合适地为至少30个核苷酸，合适地为至少50个核苷酸，合适地为至少80个核苷酸，合适地为至少100个核苷酸，合适地为至少200个核苷酸，或合适地为感兴趣的序列大部分。

序列同源性/同一性

虽然序列同源性也可以根据功能相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，但在本文中，优选在序列同一性方面表达同源性。序列比较可以通过眼睛进行，或者更常见的是借助容易获得的序列比较程序进行。这些公开和市售的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的百分比同源性(例如同一性百分比)。

可以在连续序列上计算百分比同一性，即一个序列与另一个序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的相应氨基酸直接比较，一次比较一个残基。这被称为“无间隙”比对。通常，这种无间隙比对仅在相对较短数量的残基(例如少于50个连续氨基酸)上进行。为了在较长序列上进行比较，使用间隙评分来产生最佳比对，以准确反映具有相对于彼此的插入或缺失的相关序列中的同一性水平。进行这种比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University of Wisconsin,U.S.A；Devereux等人,1984,Nucleic Acids Research 12:387)。可以执行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包，FASTA(Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410)和GENEWORKS比较工具套装。

在本文中，同源氨基酸序列被认为包括至少40、50、60、70、80或90％相同的氨基酸序列。最合适地，与感兴趣的生物标志物具有至少90％序列同一性的多肽将被视为指示该生物标志物的存在；更合适地，在氨基酸水平上95％或更合适地98％相同的多肽将被用来指示该生物标志物的存在。适当地，所述比较至少在待测定以确定感兴趣的生物标志物的存在或不存在的多肽或片段的长度上进行。最合适的是在感兴趣的多肽的全长上进行比较。

特异性生物标志物可以通过以下来检测和/或定量：与配体的相互作用，基于1-D或2-D凝胶的分析系统，液相色谱，组合液相色谱和包括MSMS、ICAT(R)或iTRAQ(R)的任何质谱技术，凝集测试，薄层色谱，NMR光谱，夹心免疫测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RAI)，酶免疫测定(EIA)，横向流动/免疫层析试纸条测试，蛋白质印迹，免疫沉淀，包括使用金、银或胶乳颗粒和磁性颗粒或Q-点的基于颗粒的免疫测定，或本领域已知的任何其他合适的技术。

生物标志物如Mcm5的浓度通过以下来检测和/或定量：与配体的相互作用，基于1-D或2-D凝胶的分析系统，液相色谱，组合液相色谱和包括MSMS、ICAT(R)或iTRAQ(R)的任何质谱技术，凝集测试，薄层色谱，NMR光谱，夹心免疫测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RAI)，酶免疫测定(EIA)，横向流动/免疫层析试纸条测试，蛋白质印迹，免疫沉淀，包括使用金、银或胶乳颗粒和磁性颗粒或Q-点的基于颗粒的免疫测定，或本领域已知的任何其他合适的技术。

在本发明的某些方面或实施方式中，确定生物标志物浓度的测定不是免疫荧光测定。在这样的实施方案中，测定优选是ELISA测定。在另一个实施方案中，ELISA测定是夹心ELISA测定。夹心ELISA测定包括使用已经与板结合的“捕获抗体”捕获待测定的生物标志物(例如Mcm蛋白质)，并使用“检测抗体”检测捕获了多少抗原的步骤。检测抗体已经与诸如酶HRP(辣根过氧化物酶)的标记预缀合。然后洗涤带有标记的检测抗体的ELISA板以除去任何过量的未结合的检测抗体。然后将洗过的板暴露于其性质以可测量的方式被标签改变的试剂。然后可以确定检测抗体的浓度。例如，如果检测抗体与辣根过氧化物酶缀合(用辣根过氧化物酶标记)，则ELISA板可以暴露于TMB底物。检测抗体的浓度以及因此原始样品中Mcm5的浓度可以通过定量与TMB转化为有色产物相对应的颜色变化来确定。

本发明包括进行测定以确定尿液样品中至少一种生物标志物浓度的步骤。在一个优选的实施方案中，所述至少一种生物标志物包含Mcm蛋白质，任选Mcm5。在另一个实施方案中，Mcm5浓度的异常值表示受试者泌尿系统癌症的可能性增加。

泌尿系统癌症

本发明还提供了用于检测泌尿系统癌症的方法。这样的方法提供了显著的优点，因为它们将检测与被测患者的泌尿系统(即肾，输尿管，膀胱和尿道)中的流动或尿液紧密接触的任何肿瘤。

泌尿系统癌症包括可能在泌尿系统中出现的所有类型的移行细胞癌。移行细胞癌的一个例子是膀胱癌。然而，在整个泌尿系统(包括肾盂衬里，将尿液从肾脏传导到膀胱和尿道的输尿管以及膀胱本身的壁)中存在移行细胞。移行细胞癌可能在任何这些地方出现。

应该指出的是，膀胱癌存在一系列不同的亚型，即存在除了移行细胞癌之外的膀胱癌类型，尽管这(移行细胞癌)是最常见的膀胱癌类型。

本发明的一个优点是，还可以检测到其他原发性癌症，例如阴茎癌，例如如果它们在其穿过阴茎时撞击尿道。

此外，某些泌尿系统肿瘤可能会被检测到，即使它们可能不直接接触尿流。一个例子是通常不与尿流接触的前列腺肿瘤，但是细胞从其中脱落并渗入尿道。

本发明还提供了能够检测转移性癌症的优点，例如在泌尿系统中已经发生转移的不同原发性癌症的转移。在该实施方案中，本发明能够检测任何生长到泌尿系统的癌症(例如，可能已经局部侵入的结肠癌)或已通过转移侵袭的任何癌症(例如远程原发性癌症，其在受试者的泌尿系统内产生一个或多个转移性肿瘤)。

在一个实施方案中，本发明有利地用于检测前列腺癌。

在一个实施方案中，本发明有利地用于检测膀胱癌。

在一个实施方案中，本发明应用于检测前列腺癌和膀胱癌。

微染色体维持蛋白(Mcm)

以前曾用微染色体维持(MCM)蛋白作为宫颈癌的诊断性生物标志物。根据本发明优选的生物标志物是Mcm蛋白质。最合适的Mcm蛋白是Mcm5。

微核蛋白维持复合物(MCM)家族蛋白如核蛋白Mcm5的水平升高可用于检测尿沉积物中的膀胱癌细胞以及前列腺癌。Mcm5的评估通常在具有精密仪器和高技能操作人员的专门实验室中进行(Stoeber等人，JNCI.2002：94：1071-1079)，并且这种分析方式在病理学实验室或即时护理应用中可能是昂贵的或不切实际的。然而，有利的是本申请的发明人利用一对适合于病理学实验室和即时护理应用的特异性单克隆抗体成功地开发了修改的双抗体夹心ELISA形式，以准确地测量尿沉积物中的Mcm5水平。然而，这种优选类型的测定法不将Mcm5的分析限制于这种模式，根据本发明，可以根据本领域已知的任何合适的方法测定Mcm5。

MCM蛋白2-7包含复制前复合物的一部分，其在染色质上形成，并且是后续DNA复制的基本先决条件或许可因子。MCM蛋白复合物充当复制性解旋酶，因此是DNA复制机器的核心组分。MCM在细胞周期从G0至G1/S期的过渡中上调，并积极参与细胞周期调控。MCM蛋白在染色质周围形成环状结构。

人Mcm5基因定位于22q13.1，成熟Mcm5蛋白由734个氨基酸组成(SEQ ID NO：1；图1：UNIPROT P33992：人DNA复制许可因子MCM5)。术语“Mcm5”是指SEQ ID NO：1的多肽，与SEQID NO：1具有85％，90％，95％，98％或100％同一性的多肽。

本发明有用地提供了适用于一般临床实验室使用和即时护理应用的Mcm5的新测定方法。

Mcm5被记录为尿中的浓度。当浓度超过截断点时，泌尿系统癌症的可能性增加。截断点可以以许多不同的方式设置。例如，可以将其设置为健康患者尿液的数值的平均值加上健康人群的数值的标准偏差的倍数，通常是两倍或三倍倍数。任选地，可以将截断点设定为由已知浓度的表达Mcm5的分裂细胞产生的值，以Stoeber等人(2002)例示的，他们采用从每个板孔包含1500个复制细胞的样品产生的DELFIA中的计数的数量作为截断点。

因此，根据本发明，大于健康患者尿液中浓度的平均值加两个标准偏差的Mcm5的存在，或大于从每个板孔包含1500个复制细胞的样品产生的DELFIA中的计数数量的计数的Mcm5的存在，表明泌尿系统癌症的可能性增加。

在一个实施方案中，Mcm蛋白质存在的异常值指示受试者中泌尿系统癌症的可能性增加。在另一个实施方案中，本发明的方法包括这样的步骤：在通过进行测定确定的Mcm蛋白质的浓度高于来自健康患者的平均值加上由来自健康受试者的值显示的标准偏差的倍数的情况下，将患者诊断为患有泌尿系统癌症。

抗体

许多适用于本发明的抗Mcm5抗体可商购获得。示例如下所示：

样品

本发明的方法可以包括“提供来自受试者的样品”的步骤。优选地，该步骤是非侵入性的(非手术的)，例如收集尿液。

样品可以包括任何生物流体，例如血液，血清，唾液，精液，尿液或尿沉积物，或由这些流体之一制备的提取物。

样品适当地是尿液。

通常在尿液中存在的细胞的核中发现Mcm5。因此，适当地，样品包含尿液内的细胞。更合适的是，那些细胞可以通过本领域常用的任何已知技术进行浓缩，例如过滤或更合适地从尿液中离心收集细胞。从尿液中富集细胞可以增加信号，并且可以促进检测。

当测试前列腺癌时，最合适地样品是第一次捕集尿液，例如可以在按摩前列腺(当受试者是男性时)之后获得。

更合适的是，样品可以包含最初几毫升的第一次捕集尿液。

换句话说，适当地，样品可以包括第一次通过尿液，合适地是在按摩前列腺之后产生的第一次通过尿液。

更合适地，样品可以包括尿沉积物，例如从尿液中收集的沉积细胞(例如来自总尿液，或者来自如上所述的第一次捕集尿液)。

分析形式

在本发明的一个方面，提供测定系统以通过在夹心ELISA或双位点ELISA中检测生物标志物和特异性抗体之间的结合来确定生物标志物的存在和/或浓度。可以分开确定生物标志物(例如，在物理上分开的测定中，适当地对相同样品的级分进行测定)。在本实施方案中，在每个测定中，将样品与单一配体例如对待测试的生物标志物特异性的抗体接触。例如，可以将样品加入到微量滴定板的不同孔中，其中每个孔含有不同的抗体。

测定适宜地在水溶液中进行。样品和/或配体(例如抗体)可以存在于溶液中。在一些实施方案中，抗体或样品可以固定在固体支持物上。典型地，这样的支持物可以包括在其中进行测定的容器的表面，例如微量滴定板的孔的表面。在其它实施方案中，载体可以是膜(例如硝酸纤维素膜或尼龙膜)或珠(例如胶乳或金)或阵列的表面。

确定抗体是否结合(检测)样品中的生物标志物可以通过本领域已知的用于检测两个部分之间的结合的任何方法进行。可以通过测量结合发生时改变的抗体或生物标志物(例如蛋白质)中的特征(例如光谱变化)来确定结合。

在一个优选的实施方案中，使用抗体作为配体进行测定，该抗体固定在固体支持物上。当样品与抗体接触时，样品中的生物标志物分子(如蛋白质分子)与抗体结合。

任选地，固体载体的表面然后被洗涤以从样品中除去未结合抗体的任何生物标志物(例如蛋白质)。然后可以确定与固体支持物结合的生物标志物的存在(通过与抗体的结合)，表明蛋白质与抗体结合。这可以例如通过使固体支持物(其可能具有或可能不具有与其结合的生物标志物)与特异性结合蛋白质的试剂接触来完成。该试剂可以直接标记或通过可检测标签间接标记。典型地，所述试剂是第二抗体，其能够在生物标志物与第一固定化抗体结合的同时以特异性方式结合生物标志物。可以通过与特异于第二抗体的Fc区的第三抗体接触来间接标记该第二抗体，其中第三抗体携带可检测标记。

可用于确定生物标志物蛋白质和抗体之间的结合的另一个系统是竞争性结合系统。这种系统的一个实施方案确定样品中的生物标志物是否能够抑制抗体与能够结合抗体的参照化合物的结合。如果样品中的生物标志物蛋白质能够抑制抗体与参照化合物之间的结合，则这表明这样的样品包含由抗体识别的生物标志物。

参照标准

参照标准通常是指来自健康个体即没有患有泌尿系统癌症的个体的样品。

参照标准可以是并行分析的实际样品。或者，参照标准可以是先前从比较样品(例如，来自健康受试者的样品)中获得的一个或多个值。在这样的实施方案中，可以通过将针对来自受试者的样品确定的值与先前分析的参照样品的数值进行比较来进行纯粹的数值比较。这样做的优点是不必通过每次分析来自受试者的样品时并行确定个体参照样品中的浓度来重复分析。

适当地，参照标准与被分析的受试者相匹配，例如按性别，例如按年龄，例如根据种族背景或本领域众所周知的其他这样的标准来进行。参照标准可以是数字诸如由一个或多个先前研究确定的绝对浓度。

参照标准可适当地与特定患者亚组(例如老年受试者或曾经有过相关病史的受试者，如泌尿系统癌症的易感受试者)相匹配。

适当地，参照标准与被分析的样品类型相匹配。例如，待测定的生物标志物多肽的浓度可以根据样品的类型或性质(例如，常规尿液样品相对在前列腺按摩之后的第一次捕集样品)而变化。对于本领域技术人员而言显而易见的是，参照标准的浓度值应该是针对与本发明的方法中所测试的浓度值相同或相当的样品的。例如，如果被分析的样品是第一次捕集尿液，那么参照标准值应该是针对第一次捕集尿液的，以确保它能够进行有意义的交叉比较。尤其是，如果尝试通过比较针对感兴趣的受试者确定的浓度和在参照标准中确定的浓度(其中样品的性质在两者之间不相同)进行推论，则必须格外小心。参照标准的样品类型和感兴趣的受试者的样品类型是相同的。

应该注意的是，对于本发明的一些实施方案，所测定的蛋白质浓度可以与来自相同受试者的先前样品比较。这可以有利于监测受试者复发的可能性。这对监测受试者治疗的过程和/或有效性可能是有益的。在此实施方式中，该方法可以包括以下步骤：将针对感兴趣样品确定的值与针对来自不同样品(例如在不同时间点对同一受试者采集的样品)的相同生物标志物确定的一个或多个值进行比较。通过进行这样的比较，可以收集关于在特定受试者中特定标志物是增加还是减少的信息。这个信息可以用于诊断或预测随着时间推移的变化，或者由特定的治疗或治疗方案抑制或刺激的变化，或任何其他感兴趣的变量。

以这种方式，本发明可用于确定例如在用药物或候选药物或者通过肿瘤切除治疗患者之后，疾病是否进展，或者疾病进展的速度是否已经改变。结果可以告知进一步治疗的途径。

配体/抗体

确定本文讨论的生物标志物的存在和/或浓度的优选模式利用了与选择的生物标志物特异性结合的合适的抗原结合分子或配体。适当地，配体可以是抗体，或抗体衍生物，如scFv或Fab.

从尿液样品制备细胞的方法

本发明提供了从尿液样品制备细胞的方法。

在一个实施方案中，来自尿液样品的尿液通过用于捕获细胞的过滤器，使得尿液样品中的细胞被捕获在过滤器中。通过过滤器的尿液量优选为1ml至100ml，更优选为30ml至70ml，甚至更优选为约50ml。

然后将裂解缓冲剂(任选的本发明的裂解缓冲剂)通过过滤器，使得细胞暴露于裂解缓冲剂。裂解缓冲剂可以能够从细胞释放至少一种生物标志物。使裂解缓冲剂至少一次通过过滤器以将细胞暴露于裂解缓冲剂，使得从细胞释放至少一种生物标志物。在其它实施方案中，可能有必要使裂解缓冲剂多次通过过滤器，例如至少两次，至少三次或至少四次。这有助于用裂解缓冲剂使过滤器完全饱和，使得至少一种生物标志物更有效地从捕获的细胞中释放。在裂解缓冲剂多次通过过滤器的情况下，裂解缓冲剂优选交替地通过过滤器的上游和下游(即以相反的方向)以帮助用裂解缓冲剂使过滤器完全饱和。裂解缓冲剂的体积(即一次通过过滤器的裂解缓冲剂的体积)优选为250μl至1000μl，更优选300μl至500μl，甚至更优选约500μl。

在将捕获的细胞暴露于裂解缓冲剂之后，将过滤器孵育一段时间，使得裂解缓冲剂从细胞释放至少一种生物标志物，产生包含从细胞释放的至少一种生物标志物的裂解缓冲剂(裂解物)。过滤器的孵育时间优选为5分钟至1小时，更优选为20分钟至30分钟，进一步优选为10分钟左右。合适地“孵育过滤器”包括将裂解缓冲剂与过滤器保持接触一段时间。合适地，将过滤器在相对恒定的温度下孵育(在孵育期间变化小于5℃)。任选地，温度为15℃至30℃，优选在室温左右。任选地，在已经孵育过滤器之后，裂解缓冲剂再次通过过滤器至少一次。

用于从尿液样品制备细胞的装置

本发明还提供了用于从尿液样品制备细胞的装置。在下面的装置的描述中，术语“上游”和“下游”相对于通过装置的尿液流动方向来定义，即从入口到出口的流动是在下游方向上的流动。被描述为彼此“流体连通”的装置的组件意味着流体能够在这些组件之间流动，尽管它可能不能够进一步流动(例如，在关闭的阀的情况下)。这些组件可以通过本领域已知的方式连接，例如，管子或管道。装置的每个组件可以可移除地连接到其他组件。装置的一些或全部组件可以整体形成。

图18示出了装置100的一个实施方案。装置100包括入口101，来自尿液样品的尿液在使用时能够通过入口101进入该装置(从左边，如图所示)。入口101任选地包括单向阀(未示出)以防止流体从装置中返回(即，入口的上游)。

第一阀102布置在入口101的下游并且与入口101流体连通。第一阀102不限于特定的阀类型，只要其可以被构造为根据需要打开或阻止装置的不同部分之间的流体连通。这种构造将在下面进一步详细解释。第一阀102任选地是鲁尔阀。第一阀102任选地是三通阀或四通阀。

过滤器103布置在第一阀102的下游并且与第一阀102流体连通。当尿液流过过滤器时，过滤器103适于捕获来自尿液的细胞。过滤器103优选防止直径大于15μm，10μm或5μm的球形颗粒通过，同时允许较小的颗粒通过。对于非球形颗粒，过滤器103优选地防止直径大于15μm，10μm或5μm的等效球形颗粒通过，等效球形颗粒具有与非球形颗粒相同的体积。这样的等效球形颗粒的直径d_v由等式给出，其中V是非球形颗粒的体积。过滤器103任选地具有孔径(孔直径)为约15μm、约10μm或约5μm的孔结构。过滤器103优选具有孔径(孔直径)为1至6μm，更优选4至6μm，甚至更优选约5μm的孔结构。然而，过滤器的类型不受限制，只要适合在尿液流过过滤器时从尿液中捕获细胞。例如，过滤器103可以任选地具有网状结构而不是孔结构。

第二阀104布置在过滤器103的下游并且与过滤器103流体连通。第二阀104不限于特定的阀类型，只要其可以构造成根据需要打开或阻止装置的不同部分之间的流体连通。这种构造将在下面进一步详细解释。第二阀104任选地是鲁尔阀。第二阀104任选地是三通阀或四通阀。

在装置使用期间能够通过其流出尿液的出口105设置在第二阀104的下游并且与第二阀104流体连通。出口105任选地包括阀(未示出)以在需要时阻断流体通过出口105流出。

提供了用于容纳裂解缓冲剂的第一缓冲剂储存器106。第一缓冲剂储存器106与第一阀102流体连通。第一缓冲剂储存器106的尺寸优选为容纳至少500μl的裂解缓冲剂，更优选至少1ml的裂解缓冲剂，甚至更优选至少5ml的裂解缓冲剂。第一缓冲剂储存器106任选地尺寸为容纳最多50ml裂解缓冲剂，更优选最多25ml裂解缓冲剂，甚至更优选最多10ml裂解缓冲剂。第一缓冲剂储存器106任选地是注射器，但是可以使用适于容纳裂解缓冲剂的任何容器。

还提供了用于保存裂解缓冲剂的第二缓冲剂储存器107。第二缓冲剂储存器107与第二阀104流体连通。第二缓冲剂储存器107的尺寸优选为容纳至少500μl的裂解缓冲剂，更优选至少1ml的裂解缓冲剂，甚至更优选至少5ml的裂解缓冲剂。第二缓冲剂储存器107的尺寸可选择为容纳最多50ml裂解缓冲剂，更优选最多25ml裂解缓冲剂，甚至更优选最多10ml裂解缓冲剂。第二缓冲剂储存器107任选地是注射器，但是可以使用适于容纳裂解缓冲剂的任何容器。

现在将描述第一阀102和第二阀104的构造。

在第一阀102和第二阀104的第一构造中，第一缓冲剂储存器106与过滤器103之间的流体连通被阻断，第二缓冲剂储存器107与过滤器103之间的流体连通被阻断，并且入口101、过滤器103和出口105之间的流体连通被打开。在该第一构造中，当装置在使用中时，尿液能够经由过滤器103从入口101流到出口105。在第一构造中，优选地，尿液不能从入口101或出口105流到第一和/或第二缓冲剂储存器106、107。在第一构造中，优选地，裂解缓冲剂不能从第一缓冲剂储存器106流到入口101或出口105。在第一构造中，优选地，裂解缓冲剂不能从第二缓冲剂储存器107流到入口101或出口105。

在第一和第二阀102、104的第二构造中，第一缓冲剂储存器106和过滤器103之间的流体连通是打开的，第二缓冲剂储存器107和过滤器103之间的流体连通是打开的并且通过入口101和出口105的流动被阻断。在该第二构造中，当装置在使用中时，裂解缓冲剂能够经由过滤器103在第一缓冲剂储存器106与第二缓冲剂储存器107之间流动。在第二构造中，优选地，裂解缓冲剂不能从第一缓冲剂储存器106流动到入口101或出口105。在第二构造中，优选地，裂解缓冲剂不能从第二缓冲剂储存器107到出口105或入口101。在第二构造中，优选地，尿液不能在入口101和出口105之间流动。

在第二构造中，优选地在第一缓冲剂储存器106、过滤器103和第二缓冲剂储存器107之间形成封闭系统。因此，当一定体积的裂解缓冲剂流出第一缓冲剂储存器106时，等体积的裂解缓冲剂优选地流入第二缓冲剂储存器107中，反之亦然。因此，在装置使用时的给定时间点，在第一缓冲剂储存器106和第二缓冲剂储存器107中的一个或两个中提供裂解缓冲剂。换句话说，在装置使用时的给定时间点，(i)裂解缓冲剂存在于第一缓冲剂储存器106中，但不存在于第二缓冲剂储存器107中；(ii)裂解缓冲剂存在于第二缓冲剂储存器107中但不存在于第一缓冲剂储存器106中；或(iii)裂解缓冲剂存在于第一和第二缓冲剂储存器106、107中。

装置100任选地包括用于容纳尿液的尿液储存器108。尿液储存器108被布置在出口105的下游并且与出口105流体连通。优选地，尿液储存器108的尺寸设定为容纳至少10ml的尿液，更优选至少25ml的尿液，并且甚至更优选容纳至少50ml尿液。尿液储存器108的尺寸可选择为容纳最多1000ml尿液，更优选最多500ml尿液，甚至更优选最多250ml尿液。在第一阀102和第二阀104的第一构造中，尿液能够从入口101经由过滤器103和出口105流动到尿液储存器108。因此，尿液储存器108被构造成容纳在装置使用时已经通过过滤器103过滤的尿液。出口105可以使用阀或密封装置(未示出)可逆地阻断，以防止尿液从尿液存储器108回流通过出口105(即，以上游方向)。尿液储存器可以可移除地连接到出口105。

装置100任选地包括用于提供尿流的装置110。这种装置可以是例如泵或注射器的一部分。当使用注射器时，注射器可提供尿液储存器108和用于提供尿液流动的装置110。在这种情况下，可以通过拉动尿液存储器108的注射器来提供尿液流动，使得尿液从入口101流入到尿液存储器108中。在另一个实施方案中，可以例如使用与入口101流体连通的注射器通过从入口101“推动”尿液样品通过装置来提供尿液的流动。

装置100任选地包括用于提供裂解缓冲剂流的装置109。这种装置可以是例如泵或注射器的一部分。当使用注射器时，注射器可以提供第一缓冲剂储存器和用于提供裂解缓冲剂流的装置109。类似地，如果第二缓冲剂储存器107是注射器的一部分，则第二缓冲剂储存器可以充当用于提供裂解缓冲剂流的装置109。如果第一缓冲剂储存器106和第二缓冲剂储存器107都由注射器提供，则两者都可以充当用于提供裂解缓冲剂流的装置109。

本发明还提供了用于分析来自受试者的尿液样品的装置。该装置包括上述装置100和能够确定尿液样品中至少一种生物标志物浓度的测定设备。测定设备优选包含固定的第一抗体，和第二检测抗体。该设备优选地被设置为使得裂解物可以流过固定的抗体(例如通过横向流动)，并且生物标志物可以结合固定的抗体。结合的生物标志物的量可以使用检测抗体来检测。测定设备可以作为单独的组件提供，不连接到装置100，或者可以是整体的或可连接到装置100以与装置100流体连通。测定设备优选地被构造为接收来自装置100的裂解物。在测定设备与装置100流体连通的情况下，第一和第二阀可构造成第三构造，使得裂解物能够从第一缓冲剂储存器106或第二缓冲剂储存器107流动到测定设备。

例如，在一个实施方案中，第一阀102构造成允许从第一缓冲剂储存器106流动到测定设备。在这种情况下，优选地，第一缓冲剂储存器106与第二缓冲剂储存器107之间的流体连通被阻断。在另一个实施方案中，第二阀104构造成允许从第二缓冲剂储存器107流动到测定设备。在这种情况下，优选地，第一缓冲剂储存器106与第二缓冲剂储存器107之间的流体连通被阻断。

第一阀102是第一阀布置的示例，第二阀104是第二阀布置的示例，其使得流体通过装置的路径能够根据上述第一和第二(以及任选第三)构造进行控制。然而，第一阀布置不限于一个阀。第一阀布置可以包括多个阀。例如，在第一阀布置包括两个阀的情况下，可以布置一个阀以打开和阻断入口101和过滤器103之间的流体连通，并且另一个阀可以布置成打开和阻断第一缓冲剂储存器106和过滤器103之间的流体连通。类似地，第二阀布置不限于一个阀。第二阀布置可以包括多个阀。例如，在第二阀布置包括两个阀的情况下，可以布置一个阀以打开和阻断过滤器103和出口105之间的流体连通，并且另一个阀可以布置成打开和阻断第二缓冲剂储存器107和过滤器103之间的流体连通。

使用该装置的方法

本发明还提供了使用装置100的方法。如前所述，术语“上游”和“下游”相对于通过装置的尿液的流动方向来定义，即，从入口到出口的流动是以下游方向的流动。

在构造成第一构造的第一阀布置(例如第一阀102)和第二阀布置(例如第二阀104)的情况下，来自尿液样品的尿液通过过滤器103从入口101流到出口105。这导致尿液中的细胞被捕获在过滤器103中，而过滤后的尿液流出出口105并任选地进入尿液储存器108中。尿液的流动任选地由用于提供尿液流动的装置110提供。

然后惰性气体(例如空气)优选地通过入口101流到出口105以除去装置中的任何残余量的尿液。这可以使用用于提供尿液流动的装置108来实现，例如，通过使惰性气体从入口流到出口。或者，可以提供用于提供惰性气体流的单独装置。

然后优选地将出口105封闭或密封，以防止尿液沿上游方向通过出口回流。

然后，将第一和第二阀102、104构造成第二构造，从而在第一缓冲剂储存器106、过滤器103(包含细胞)和第二缓冲剂储存器107之间形成封闭系统。然后包含在第一缓冲剂储存器106中的裂解缓冲剂经由过滤器103被传送到第二缓冲剂储存器107，反之亦然。使裂解缓冲剂至少一次通过过滤器103以将细胞暴露于裂解缓冲剂，使得从细胞释放至少一种生物标志物。在其它实施方案中，可能需要使裂解缓冲剂多次通过过滤器103，例如至少两次，至少三次或至少四次。这有助于用裂解缓冲剂使过滤器完全饱和，使得至少一种生物标志物更有效地从捕获的细胞中释放。在裂解缓冲剂多次通过过滤器的情况下，裂解缓冲剂优选交替地通过过滤器的上游和下游(即以相反的方向)以帮助用裂解缓冲剂使过滤器完全饱和。

然后将过滤器103孵育一段时间，使得裂解缓冲剂导致至少一种生物标志物从细胞释放。孵育优选进行10秒至5小时，更优选30秒至1小时，甚至更优选约10分钟的时间。合适地“孵育过滤器”包括将裂解缓冲剂与过滤器保持接触一段时间。合适的是将过滤器在相对恒定的温度(变化小于5℃)下孵育。任选地，温度为15℃至30℃，优选在室温左右。随后将含有从细胞释放的至少一种生物标志物的裂解缓冲剂(裂解物)任选地返回到第一和第二缓冲剂储存器106、107之一中。

在用于分析来自受试者的尿液样品的包括装置100和测定设备的装置的情况下，含有至少一种生物标志物的裂解缓冲剂然后可以被传递到测定设备。在测定设备与装置100流体连通的情况下，这可以通过将第一阀102和第二阀104构造成第三构造，然后将含有至少一种生物标志物的裂解物传递到测定设备中来实现。在测定设备不与装置100流体连通的情况下，裂解物可以从装置100外部传递到测定设备。

现在通过实施例来描述本发明，这些实施例本质上是说明性的而不是限制性的。

实施例

除非另有说明，所有化学品均购自Sigma-Aldrich。

实施例1

材料

从Heatherwood医院(Heatherwood and Wexham Park Hospitals NHSFoundation Trust)的血尿门诊就诊的患者获得了单废弃尿液样本，这获得了当地研究伦理委员会的道德批准。使用Multistix 10 SG试纸条(Siemens)对新鲜样品进行尿液分析，将剩余的尿液分配到1ml或15ml的Falcon管中，将其置于干冰中运送到实验室。

Mcm5

本发明的一个实施方案是针对Mcm5的简单的ELISA测试，其有效地替代了专门的和复杂的Mcm5DELFIA测试(参见Stoeber等人2002(Journal of the National CancerInstitute，94,1071-1079；2002)，因此测试可以在一个典型的临床化学实验室进行。该试验是一种直接的双重单克隆抗体夹心酶联免疫分析法，两种抗体对Mcm5抗原具有高亲和性和特异性，被测样品中的任何Mcm5都被特定的单克隆抗体结合到微量滴定板的表面上，然后加入检测抗体，其与抗原上的不同位点结合并与辣根过氧化物酶(HRP)相连接。保留在板孔中的HRP的存在和量通过测量加入作为HRP的显色底物的四甲基联苯胺(TMB)后产生的颜色的强度来评估。在确定的极限内光密度与样品中的Mcm5浓度成比例。通过测试一系列Mcm5浓度，可以产生剂量反应曲线，从中可以确定未知的抗原浓度(见图2和3)。

在测定中使用两种单克隆抗体(mAb)，12A7和4B4。该抗体根据与申请人的非排他性许可协议从Cancer Research Technology Ltd(CRT)获得。对于ELISA测试，将mAb 12A7用于平板包被，并将mAb 4B4用于检测。

样本收集和制备：可以在人尿液上进行测试。将样品收集在例如150mL带螺帽的塑料瓶中，该瓶应是干净的，但不一定是无菌的。收集瓶不应该包含任何防腐剂，理想情况下应该是大于100mL的体积。使用前，样品可以在2-8℃下保存4小时。为了制备用于测定的尿液样品，将30mL样品转移到50mL带螺旋盖的塑料离心管中。1500g离心5分钟后，根据当地的H&S指南小心地倾倒上清液并作为废物处理。将管倒置在吸水纸上，允许过量的液体排出。向沉淀中加入250μl裂解/样品缓冲剂；使用带有一次性吸头的可调移液管重新悬浮沉淀。

试剂：试剂组分在此以试剂盒的形式描述(参见表1)。每个试剂盒包含足够的材料用于一个96孔微孔板，或者如果一次使用整个板，则在一式两份的孔中进行80个测定。

表1：

除了表1中列出的成分之外，以下附加材料是有用的，并且可以任选地提供在本发明的试剂盒中。这些材料被认为是单独公开的，因此可以单独添加到本发明的试剂盒中。移液器能够提供50μl和100μl体积，精度优于1.5％；分配器重复运送100μl和300μl体积，精度优于1.5％；微孔板洗涤器或挤压瓶(可选)；具有450nm和620nm波长吸收能力的酶标仪，用于印迹微孔板孔的吸收纸和用于孵育步骤的保鲜膜或微孔板盖以及定时器。

测试程序：在进行测定之前，应使所有试剂达到室温(20-27℃)30分钟。未使用的试剂在使用后储存在2-8℃。对于每个待测试的样品，取出足够的微孔板孔条，包括系列稀释的校准品和质量对照样品，一式两份进行测定。将100μL合适的校准品或样品吸移到指定的孔中，在旋转的微量滴定板摇床上以700rpm在室温(20-27℃)孵育三十(30)分钟。弃去内容物，用300μl洗涤缓冲剂洗涤孔6次。然后将100μl抗Mcm5 HRP抗体试剂/缀合物加入到每个孔中。混合后，将孔在室温(20-27℃)下静置培养30分钟。然后通过滗析或抽吸丢弃微板的内容物。如果倾析，请用吸水纸轻拍并吸干纸板，然后按上述方法清洗。然后将100ul底物试剂加入到所有孔中，并在室温(20-27℃)下孵育30分钟。通过向每个孔添加100uL终止溶液来终止反应。在微孔板读数器中，在450nm处读取每个孔的吸光度(使用620-630nm的参照波长以最小化孔的机械误差)。在添加终止溶液的30分钟内应读取结果。

提供校准品样品。在分析时使用系列稀释液制备，使用后丢弃(见图3)。

为了解释结果，使用剂量-反应曲线来确定未知样本中Mcm5的浓度。这可以手动或使用计算机程序自动构建。对于手动计算，记录从酶标仪的打印输出中获得的吸光度。在线性方格纸上绘制每个重复稀释度的吸光度相对相应Mcm5浓度(ng/mL)的关系曲线，然后通过绘制点画出最佳拟合曲线。为了确定未知浓度的Mcm5，在图的纵轴上找出每个未知物重复物的平均吸光度，在曲线上找到相交点，从图表的横轴读取浓度(ng/ml)。

表2说明了典型实验的结果。

表2

Mcm5程序的分析检测限<7pg/ml。

实施例2-正在就膀胱癌进行研究的116名受试者中的Mcm5的临床研究。

尿液样本来自116例患者，其中大多数随后通过灵活的膀胱镜检查和CT或超声扫描。如果获得异常结果，则将患者转移进行活组织检查。在可获得的情况下，收集这些调查的结果并将其添加到数据集中。使用上述ELISA技术(实施例1)在每个受试者中测量Mcm5的水平。临床上证实了8例膀胱癌，其中5例在Mcm5检测中被评为阳性。

表：在表中，“+”表示Mcm5测定结果超过已知阴性的平均值+3SD(阴性平均OD0.05，SD 0.0593)。因此，截断点人为地设定在OD 0.23。

在没有确诊的恶性肿瘤的情况下，也有4例发生阳性ELISA结果：患者13(在膀胱中观察到乳头状病变；没有记录活检结果，前列腺闭塞)；患者30(没有其他病理记录)；患者65(肾切除术记录)；患者101(前列腺肥大伴钙化)。已知由于材料对表皮基底层的磨蚀作用导致MCM+细胞释放，所以结石的存在可能导致假阳性结果，但这种情况的发生率太小而不能影响本发明的测定。

分析统计

计算Mcm5测定数据的标准测定统计。尽管研究中所有患者都不可获得真正的临床终点，但技术熟练的人员将会意识到，这一适度小组已经取得了令人信服的结果。特别是该研究提供了96％的特异性的现实估计(104/108)。

实施例3-各种缓冲剂的比较

已知数目的T24泌尿道上皮癌细胞在每种缓冲剂中裂解，在ELISA中测试裂解物中的Mcm5。结果显示在该测定中裂解效率显著不同。含有SDS的缓冲剂是文献中描述的那些缓冲剂，但是与Cytobuster或“Urosens LB”(0.08％脱氧胆酸钠，0.08％CHAPS，2mM EDTA，150mM Trizma pH 7.6)相比效率明显较低。结果如图4所示。

实施例4

将细胞在CytoBuster中的裂解与TBS Triton缓冲剂(TBST)和RIPA缓冲剂中的细胞进行比较，在DMEM(细胞培养基)中重构的细胞沉淀作为对照。结果如图5所示。

在将缓冲剂应用于细胞之后测试Mcm5在裂解样品中的效力。一些样品在暴露于缓冲剂之后并在测试之前被冷冻。理想情况下，将在两种情况下使用的通用缓冲剂将是有用的。

对照结果证明，当新鲜样品进行测试时，当不添加裂解剂时细胞保持完整，但是在冷冻-解冻(FT)后，细胞通过机械分解细胞膜而破裂，由此释放Mcm5。该实验显示，当使用新鲜的裂解物时，TBST缓冲剂大致相当于CytoBuster。但是，样品冷冻后，CytoBuster裂解物会严重丧失效力，而TBST不会受到严重的影响。尽管在从新鲜样品中得到时较低，但RIPA裂解缓冲剂在FT后保留了所有效力。

实施例5

额外的组分被添加到TBT以尝试改善TBST裂解物的稳定性。将缓冲剂应用于新鲜和冷冻的细胞后，测试裂解样品中Mcm5的效力。这个实验的结果如图6所示

这些数据(在图6中描述)表明，RIPA缓冲剂的稳定组分是脱氧胆酸钠(SDC)和十二烷基硫酸钠(SDS)，但不幸的是，将这些元素掺入更简单的TBST缓冲剂中导致信号显著丢失。进行补充测试以逐个去除RIPA缓冲剂中的元素，以查看是否去除任何元素能够将RIPA信号改善至与TBST相同的水平，同时保持稳定性。结果如图7所示。

实施例6

比较了包含不同浓度的Tris和Triton x-100的各种缓冲剂。将缓冲剂应用于新鲜和冷冻的细胞后，测试裂解样品中Mcm5的效力。结果如图8所示。

数据显示增加Tris浓度导致细胞裂解物Mcm5水平的改善，尽管提高Triton X-100浓度没有效果。

为了确保在进一步进行之前使用裂解缓冲剂的最佳基础，在不同pH范围和缓冲剂类型下测试了几种化合物。这些缓冲剂中的几个得到了很好的结果，但是TBS显示具有最高的信号。这些数据在图9中描述。

实施例7

进行Tris的进一步滴定以观察如果使用更高的缓冲剂浓度，信号是否仍会增加，并且看到改善的稳定程度。结果如图10所示。

Mcm5的水平在225mM Tris时开始平稳，只有250mM Tris更高，然后信号稳定到325mM，然后降低。为了避免制造和变异带来的潜在问题，在平台稳定区域的浓度将是最佳的选择，如300mM。

实施例8

据推测，由于离子强度增加，改变Tris浓度可能是有效的。由于这可以通过加入NaCl同样实现，所以测试具有不同浓度的NaCl的组合物。结果如图11所示。

数据显示，提高的TBST(TBS+吐温20)缓冲剂中的NaCl浓度以及降低的Tris水平提高了信号，但是不管Tris浓度如何，在RIPA缓冲剂中都没有看到相同的效果。即使补偿降低NaCl水平，提高Tris浓度对于标准RIPA缓冲剂(25mM Tris和150mM NaCl)信号似乎也没有任何实质性改善。10mM Tris 150mM NaCl TBST具有在数据组中获得的最高信号(大约是CytoBuster的两倍)，因此该缓冲剂在NaCl浓度方面进行了优化并分别评估了稳定组分。

实施例9

实施例8中提供的数据表明，具有约10mM tris的缓冲剂是最有效的，因此研究了具有10mM tris和不同NaCl浓度的缓冲剂。结果如图12所示。

NaCl的滴定显示最佳的候选者是具有200mM NaCl的10mM Tris。数据也似乎表明，当离子强度达到某一点时，精度受损。从这一点开始选择的缓冲剂制剂是10mM Tris，200mMNaCl和0.1％Triton X-100，然后向其中加入稳定化合物以找到合适的最终制剂。

实施例10

当与TBS-T组合时，测试了各种稳定剂的稳定Mcm5样品的有效性。

就潜在候选物而言，将1％FBS(胎牛血清)，2.5％BSA(牛血清白蛋白)，0.25mMPefabloc SC，0.1mM Pefabloc SC，0.5％Sigma P8340蛋白酶抑制剂混合物和0.25x RochecOmplete蛋白酶抑制剂混合物与没有稳定添加剂的缓冲剂相比都具有令人鼓舞的数据而不损害背景或阳性样品信号。这些数据显示在图13A和13B中。

这些化合物在6天后用各种储存温度进行测试，以查看它们与不含添加剂的TBST和CytoBuster的比较。这些数据如图14所示。

所有的稳定剂都能有效地稳定组合物。商业生产的蛋白酶抑制剂混合物(Pefabloc，Sigma P3840和Roche cOmplete)是稳定的，但降低了Mcm5信号。在-20℃，2.5％BSA比1％FBS表现更好。1％FBS和2.5％BSA在4℃和新鲜条件下的性能相当，两者似乎都提高了与标准TBST缓冲剂的信号对比。由于BSA在-20℃有损失，使用另外的细胞系进行重复实验以证实对稳定性的改善。

实施例11

将TBSTr+2.5％BSA组合物与TBSTr和CytoBuster进行比较。结果显示在图15A，15B和15C中。

对于所有的细胞系，TBST+2.5％BSA已经被证明是稳定的(浓度为新鲜裂解物的10％以内)，并且在1个FT循环后具有比CytoBuster和TBST两者最高的信号。一般来说，CytoBuster似乎对新鲜的裂解物产生了非常不同的结果，但是当进行冻融时总是有明显的效力丧失。

实施例12

由于含有BSA的缓冲剂倾向于微生物生长，所以使用TBST+2.5％BSA制剂测试了两种抗微生物剂ProClin950和叠氮化钠(NaN3)。结果显示在图16和17中。

0.09％的叠氮化钠是抗微生物剂的最佳候选者，因为与参照缓冲剂的偏差小于10％。

上述说明书中提到的所有出版物都通过引用并入本文。对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明的范围的情况下，本发明所描述的方面和实施方案的各种修改和变化将是明显的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应该不适当地限于这些具体实施方案。实际上，对于本领域技术人员来说明显的用于实施本发明的所描述的模式的各种修改意在落入以下权利要求的范围内。

序列表

<110> Arquer Diagnostics Ltd

<120> 方法

<130> N403138WO

<140> tbc

<141> tbc

<150> tbc

<151> tbc

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 734

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> Mcm5 (多肽)

<400> 1

Met Ser Gly Phe Asp Asp Pro Gly Ile Phe Tyr Ser Asp Ser Phe Gly

1 5 10 15

Gly Asp Ala Gln Ala Asp Glu Gly Gln Ala Arg Lys Ser Gln Leu Gln

20 25 30

Arg Arg Phe Lys Glu Phe Leu Arg Gln Tyr Arg Val Gly Thr Asp Arg

35 40 45

Thr Gly Phe Thr Phe Lys Tyr Arg Asp Glu Leu Lys Arg His Tyr Asn

50 55 60

Leu Gly Glu Tyr Trp Ile Glu Val Glu Met Glu Asp Leu Ala Ser Phe

65 70 75 80

Asp Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Tyr Lys Gln Pro Ala Glu His Leu

85 90 95

Gln Leu Leu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Val Ala Asp Glu Val Thr Arg

100 105 110

Pro Arg Pro Ser Gly Glu Glu Val Leu Gln Asp Ile Gln Val Met Leu

115 120 125

Lys Ser Asp Ala Ser Pro Ser Ser Ile Arg Ser Leu Lys Ser Asp Met

130 135 140

Met Ser His Leu Val Lys Ile Pro Gly Ile Ile Ile Ala Ala Ser Ala

145 150 155 160

Val Arg Ala Lys Ala Thr Arg Ile Ser Ile Gln Cys Arg Ser Cys Arg

165 170 175

Asn Thr Leu Thr Asn Ile Ala Met Arg Pro Gly Leu Glu Gly Tyr Ala

180 185 190

Leu Pro Arg Lys Cys Asn Thr Asp Gln Ala Gly Arg Pro Lys Cys Pro

195 200 205

Leu Asp Pro Tyr Phe Ile Met Pro Asp Lys Cys Lys Cys Val Asp Phe

210 215 220

Gln Thr Leu Lys Leu Gln Glu Leu Pro Asp Ala Val Pro His Gly Glu

225 230 235 240

Met Pro Arg His Met Gln Leu Tyr Cys Asp Arg Tyr Leu Cys Asp Lys

245 250 255

Val Val Pro Gly Asn Arg Val Thr Ile Met Gly Ile Tyr Ser Ile Lys

260 265 270

Lys Phe Gly Leu Thr Thr Ser Arg Gly Arg Asp Arg Val Gly Val Gly

275 280 285

Ile Arg Ser Ser Tyr Ile Arg Val Leu Gly Ile Gln Val Asp Thr Asp

290 295 300

Gly Ser Gly Arg Ser Phe Ala Gly Ala Val Ser Pro Gln Glu Glu Glu

305 310 315 320

Glu Phe Arg Arg Leu Ala Ala Leu Pro Asn Val Tyr Glu Val Ile Ser

325 330 335

Lys Ser Ile Ala Pro Ser Ile Phe Gly Gly Thr Asp Met Lys Lys Ala

340 345 350

Ile Ala Cys Leu Leu Phe Gly Gly Ser Arg Lys Arg Leu Pro Asp Gly

355 360 365

Leu Thr Arg Arg Gly Asp Ile Asn Leu Leu Met Leu Gly Asp Pro Gly

370 375 380

Thr Ala Lys Ser Gln Leu Leu Lys Phe Val Glu Lys Cys Ser Pro Ile

385 390 395 400

Gly Val Tyr Thr Ser Gly Lys Gly Ser Ser Ala Ala Gly Leu Thr Ala

405 410 415

Ser Val Met Arg Asp Pro Ser Ser Arg Asn Phe Ile Met Glu Gly Gly

420 425 430

Ala Met Val Leu Ala Asp Gly Gly Val Val Cys Ile Asp Glu Phe Asp

435 440 445

Lys Met Arg Glu Asp Asp Arg Val Ala Ile His Glu Ala Met Glu Gln

450 455 460

Gln Thr Ile Ser Ile Ala Lys Ala Gly Ile Thr Thr Thr Leu Asn Ser

465 470 475 480

Arg Cys Ser Val Leu Ala Ala Ala Asn Ser Val Phe Gly Arg Trp Asp

485 490 495

Glu Thr Lys Gly Glu Asp Asn Ile Asp Phe Met Pro Thr Ile Leu Ser

500 505 510

Arg Phe Asp Met Ile Phe Ile Val Lys Asp Glu His Asn Glu Glu Arg

515 520 525

Asp Val Met Leu Ala Lys His Val Ile Thr Leu His Val Ser Ala Leu

530 535 540

Thr Gln Thr Gln Ala Val Glu Gly Glu Ile Asp Leu Ala Lys Leu Lys

545 550 555 560

Lys Phe Ile Ala Tyr Cys Arg Val Lys Cys Gly Pro Arg Leu Ser Ala

565 570 575

Glu Ala Ala Glu Lys Leu Lys Asn Arg Tyr Ile Ile Met Arg Ser Gly

580 585 590

Ala Arg Gln His Glu Arg Asp Ser Asp Arg Arg Ser Ser Ile Pro Ile

595 600 605

Thr Val Arg Gln Leu Glu Ala Ile Val Arg Ile Ala Glu Ala Leu Ser

610 615 620

Lys Met Lys Leu Gln Pro Phe Ala Thr Glu Ala Asp Val Glu Glu Ala

625 630 635 640

Leu Arg Leu Phe Gln Val Ser Thr Leu Asp Ala Ala Leu Ser Gly Thr

645 650 655

Leu Ser Gly Val Glu Gly Phe Thr Ser Gln Glu Asp Gln Glu Met Leu

660 665 670

Ser Arg Ile Glu Lys Gln Leu Lys Arg Arg Phe Ala Ile Gly Ser Gln

675 680 685

Val Ser Glu His Ser Ile Ile Lys Asp Phe Thr Lys Gln Lys Tyr Pro

690 695 700

Glu His Ala Ile His Lys Val Leu Gln Leu Met Leu Arg Arg Gly Glu

705 710 715 720

Ile Gln His Arg Met Gln Arg Lys Val Leu Tyr Arg Leu Lys

725 730

<210> 2

<211> 2534

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> Mcm5 (mRNA)

<400> 2

ggaaaaccag aggcgcagtc atgtcgggat tcgacgatcc tggcattttc tacagcgaca 60

gcttcggggg cgacgcccag gccgacgagg ggcaggcccg caaatcgcag ctgcagaggc 120

gcttcaagga gttcctgcgg cggtaccgag tgggcaccga ccgcacgggc ttcaccttca 180

aatacaggga tgaactcaag cggcattaca acctggggga gtactggatt gaggtggaga 240

tggaggatct ggccagcttt gatgaggacc tggccgacta cttgtacaag cagccagccg 300

agcacctgca gctgctggag gaagctgcca aggaggtagc tgatgaggtg acccggcccc 360

ggccttctgg ggaggaggtg ctccaggaca tccaggtcat gctcaagtcg gacgccagcc 420

cttccagcat tcgtagcctg aagtcggaca tgatgtcaca cctggtgaag atccctggca 480

tcatcatcgc ggcctctgcg gtccgtgcca aggccacccg catctctatc cagtgccgca 540

gctgccgcaa caccctcacc aacattgcca tgcgccctgg cctcgagggc tatgccctgc 600

ccaggaagtg caacacagat caggctgggc gccccaaatg cccattggac ccgtacttca 660

tcatgcccga caaatgcaaa tgcgtggact tccagaccct gaagctgcag gagctgcctg 720

atgcagtccc ccacggggag atgcccagac acatgcagct ctactgcgac aggtacctgt 780

gtgacaaggt cgtccctggg aacagggtta ccatcatggg catctactcc atcaagaagt 840

ttggcctgac taccagcagg ggccgtgaca gggtgggcgt gggcatccga agctcctaca 900

tccgtgtcct gggcatccag gtggacacag atggctctgg ccgcagcttt gctggggccg 960

tgagccccca ggaggaggag gagttccgtc gcctggctgc cctcccaaat gtctatgagg 1020

tcatctccaa gagcatcgcc ccctccatct ttgggggcac agacatgaag aaggccattg 1080

cctgcctgct ctttgggggc tcccgaaaga ggctccctga tggacttact cgccgaggag 1140

acatcaacct gctgatgcta ggggaccctg ggacagccaa gtcccagctt ctgaagtttg 1200

tggagaagtg ttctcccatt ggggtataca cgtctgggaa aggcagcagc gcagctggac 1260

tgacagcctc ggtgatgagg gacccttcgt cccggaattt catcatggag ggcggagcca 1320

tggtcctggc cgatggtggg gtcgtctgta ttgacgagtt tgacaagatg cgagaagatg 1380

accgtgtggc aatccacgaa gccatggagc agcagaccat ctctatcgcc aaggctggga 1440

tcaccaccac cctgaactcc cgctgctccg tcctggctgc tgccaactca gtgttcggcc 1500

gctgggatga gacgaagggg gaggacaaca ttgacttcat gcccaccatc ttgtcgcgct 1560

tcgacatgat cttcatcgtc aaggatgagc acaatgagga gagggatgtg atgctggcca 1620

agcatgtcat cactctgcac gtgagcgcac tgacacagac acaggctgtg gagggcgaga 1680

ttgacctggc caagctgaag aagtttattg cctactgccg agtgaagtgt ggcccccggc 1740

tgtcagcaga ggctgcagag aaactgaaga accgctacat catcatgcgg agcggggccc 1800

gtcagcacga gagggacagt gaccgccgct ccagcatccc catcactgtg cggcagctgg 1860

aggccattgt gcgcatcgcg gaagccctca gcaagatgaa gctgcagccc ttcgccacag 1920

aggcagatgt ggaggaggcc ctgcggctct tccaagtgtc cacgttggat gctgccttgt 1980

ccggtaccct gtcaggggtg gagggcttca ccagccagga ggaccaggag atgctgagcc 2040

gcatcgagaa gcagctcaag cgccgctttg ccattggctc ccaggtgtct gagcacagca 2100

tcatcaagga cttcaccaag cagaaatacc cggagcacgc catccacaag gtgctgcagc 2160

tcatgctgcg gcgcggcgag atccagcatc gcatgcagcg caaggttctc taccgcctca 2220

agtgagtcgc gccgcctcac tggactcatg gactcgccca cgcctcgccc ctcctgccgc 2280

tgcctgccat tgacaatgtt gctgggacct ctgcctcccc actgcagccc tcgaacttcc 2340

caggcaccct cctttctgcc ccagaggaag gagctgtagt gtcctgctgc ctctgggcgc 2400

ccgcctctag cgcggttctg ggaagtgtgc ttttggcatc cgttaataat aaagccacgg 2460

tgtgttcagg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520

aaaaaaaaaa aaaa 2534

Claims

1.一种用于分析来自受试者的尿液样品的方法，包括

b.进行测定以确定尿液样品中至少一种生物标志物的浓度。

2.权利要求1的方法，其中，

b.所述方法不包括在大于90℃的温度下孵育尿液样品超过45分钟；

c.所述方法不包括将尿液样品通过21号针来剪切尿液样品中的核酸；

d.所述方法不包括通过将尿液样品暴露于DNA酶I或RNA酶A来消化核酸；和/或

e.所述方法不包括以15,000g离心样品10分钟。

3.一种用于分析来自受试者的尿液样品的方法，包括将所述尿液样品暴露于裂解缓冲剂的步骤，其中：

b.所述方法不包括在高于95℃的温度下孵育尿液样品约45分钟；

c.所述方法不包括使尿液样品通过21号针来剪切核酸；

e.所述方法不包括以15,000g离心样品10分钟；

4.一种用于分析包含来自受试者的细胞的尿液样品的方法，其中所述尿液样品使用包括以下步骤的方法制备：

a.浓缩尿液样品中的细胞；和

b.将浓缩的细胞暴露于裂解缓冲剂；

5.一种用于分析包含来自受试者的细胞的尿液样品的方法，其中所述尿液样品使用包括以下步骤的方法制备：

a.离心样品以提供样品沉淀；和

b.在裂解缓冲剂中重悬来自样品的沉淀的细胞；

6.一种试剂盒，其包含能够从尿液样品中的细胞释放至少一种生物标志物的裂解缓冲剂，捕获抗体和检测抗体，其中捕获抗体和检测抗体结合Mcm5。

7.一种用于从尿液样品制备细胞的装置，所述装置包括：

入口；

定位在入口下游并且与入口流体连通的第一阀布置；

定位在过滤器下游并且与过滤器流体连通的第二阀布置；

其中第一和第二阀布置可以被构造成使得：

在第一和第二阀布置的第二构造中，第一缓冲剂储存器和过滤器之间的流体连通是打开的，第二缓冲剂储存器和过滤器之间的流体连通是打开的，并且通过入口和出口的流动被阻断，使得裂解缓冲剂能够经由过滤器在第一缓冲剂储存器与第二缓冲剂储存器之间流动。

8.权利要求7的装置，还包括裂解缓冲剂。

9.一种从尿液样品制备细胞的方法，所述方法包括：

10.权利要求3-5或7-9中任一项的方法或装置，其中所述裂解缓冲剂能够从所述尿液样品中的细胞释放至少一种生物标志物。

11.权利要求1-10中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂能够从所述尿液样品中的细胞中释放Mcm5，并且基本上不使所述Mcm5蛋白质变性。

12.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述方法是用于从所述尿液样品中的细胞释放至少一种生物标志物并确定从所述细胞释放的所述至少一种生物标志物的浓度的方法。

13.权利要求1-5或12中任一项的方法，其中所述方法包括以下步骤：在将所述尿液样品暴露于裂解缓冲剂的步骤之前浓缩所述尿液样品中的细胞，将所述浓缩的细胞暴露于裂解缓冲剂或在裂解缓冲剂中重悬来自样品的沉淀细胞。

14.权利要求1-5或7-13中任一项的方法或权利要求6的试剂盒，其中所述裂解缓冲剂不使抗体变性。

15.权利要求1-14中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含去污剂。

16.权利要求15的方法、装置或试剂盒，其中所述去污剂包含triton X-100或由tritonX-100组成。

17.权利要求16的方法、装置或试剂盒，其中所述去污剂包含浓度为0.01％至25％，0.01％至10％，0.05％至5％，0.05％至1％，0.05％至0.5％或者约0.1％的triton X-100。

18.权利要求15至17中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述去污剂包含聚山梨醇酯。

19.权利要求18的方法、装置或试剂盒，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。

20.权利要求18或19的方法、装置或试剂盒，其中所述去污剂包含浓度为0.01％至5％，0.02％至1％或约0.05％的聚山梨醇酯。

21.权利要求15-20中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述去污剂包含脱氧胆酸钠或十二烷基硫酸钠。

22.权利要求21的方法、装置或试剂盒，其中所述去污剂包含浓度为0.1％至20％，0.5％至10％，0.5％至5％或约1％的脱氧胆酸钠或十二烷基硫酸钠。

23.权利要求15至22中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述去污剂包含3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)。

24.权利要求1-23中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含浓度为0.01％至0.15％，0.03％至0.10％，0.05％至0.09％或约0.08％的脱氧胆酸钠。

25.权利要求1-24中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含浓度为0.01％至0.15％，0.03％至0.10％，0.05％至0.09％或约0.08％的CHAPS。

26.权利要求1-25中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含螯合剂。

27.权利要求1-25中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂不包含螯合剂。

28.权利要求26的方法、装置或试剂盒，其中所述螯合剂是或包含EDTA。

29.权利要求1-28中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含浓度为0.5mM至10mM，1mM至5mM，1.5mM至3mM或约2mM的EDTA。

30.权利要求1-29中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含缓冲剂组分。

31.权利要求30的方法、装置或试剂盒，其中所述缓冲剂组分是Tris或Trizma缓冲剂，包含Tris或Trizma缓冲剂，或由Tris或Trizma缓冲剂组成。

32.权利要求31的方法、装置或试剂盒，其中所述缓冲剂组分包含浓度为大于5mM，5mM至350mM，200mM至300mM，10mM至25mM，约10mM或约250mM的Tris缓冲剂或由其组成。

33.权利要求30-32中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述缓冲剂组分包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)，MOPS，碳酸氢盐或HEPES缓冲剂。

34.权利要求30-33中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述缓冲剂组分包含浓度为5mM至250mM，50mM至250mM或约100mM的磷酸盐缓冲盐水。

35.权利要求30-34中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述缓冲剂组分将所述缓冲剂的pH维持在pH 4至pH 9，pH 5至pH 8，pH6至pH 8或约pH 7.6。

36.权利要求1-35中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含选自以下的盐：氯化钠，氯化钾，氯化镁，硫酸钠，硫酸钾，硫酸镁，乙酸钠，乙酸钾，乙酸镁，磷酸钠，磷酸钾和磷酸镁。

37.权利要求36的方法、装置或试剂盒，其中所述盐的浓度为20mM至300mM，150mM至300mM，100mM至200mM或约200mM。

38.权利要求36或37的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂或盐包含浓度为20mM至300mM，150mM至300mM，100mM至200mM或约200mM的氯化钠或由其组成。

39.权利要求1至38中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂具有1mM至500mM，50mM至450mM，100mM至250mM，或100mM至175mM的离子强度。

40.权利要求1-39中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含稳定剂。

41.权利要求40的方法、装置或试剂盒，其中所述稳定剂包含选自牛血清白蛋白(BSA)，胎牛血清(FBS)和蛋白酶抑制剂的稳定剂或由其组成。

42.权利要求41的方法、装置或试剂盒，其中所述蛋白酶抑制剂选自4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(如Petrabloc SC或AEBSF)，Roche完全蛋白酶抑制剂，和蛋白酶抑制剂混合物(如Sigma P8340)，其包含AEBSF，抑肽酶，贝他汀盐酸盐，N-(反式环氧琥珀酰)-L-亮氨酸4-胍丁基酰胺(E-64)，亮抑酶肽半焦硫酸盐和胃蛋白酶抑制剂A。

43.权利要求40或41的方法、装置或试剂盒，其中所述稳定剂包含浓度为0.1％至20％，0.1％至10％，0.1％至5％，1％至3％或约2.5％的BSA。

44.权利要求1-43中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含抗微生物剂。

45.权利要求44的方法、装置或试剂盒，其中所述抗微生物剂包含叠氮化钠或异噻唑酮，或由其组成。

46.权利要求45的方法、装置或试剂盒，其中所述抗微生物剂包含2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和/或5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(Proclin950)。

47.权利要求44-45中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述抗微生物剂包含浓度为0.01％至5％，0.02％至1.5％或约0.09％的叠氮化钠或由其组成。

48.权利要求1-47中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含以下或由以下组成：

(i)1mM至100mM的Tris；

(ii)100mM至300mM的氯化钠；

(iii)1％至5％的BSA；

(iv)0.01％至1％的Triton X-100；和

(v)0.01％至0.1％叠氮化钠。

49.权利要求48的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含以下或由以下组成：

(i)约10mM的Tris；

(ii)约200mM的氯化钠；

(iii)约2.5％的BSA；

(iv)约0.1％的Triton X-100；和

(v)约0.09％的叠氮化钠。

50.权利要求1-49中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂包含RIPA缓冲剂。

51.权利要求1-50中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述裂解缓冲剂是Cytobuster蛋白质提取试剂。

52.权利要求1-5或9-51中任一项的方法，其中所述方法不包括在高温下孵育所述尿液样品。

53.权利要求52的方法，其中所述高温是高于50℃，高于60℃，高于70℃，高于80℃，在50℃至120℃之间，在60℃和110℃之间，在70℃和100℃之间，或在80℃和100℃之间。

54.权利要求52或53的方法，其中所述方法不包括在高温下孵育所述尿液样品超过30分钟，超过35分钟，超过40分钟，超过45分钟，30分钟至2小时，35分钟至2小时，或40分钟至2小时。

55.权利要求1-5或9-54中任一项的方法，其中所述方法不包括通过机械剪切剪切所述尿液样品中的核酸。

56.权利要求1-5或9-55中任一项的方法，其中所述方法不包括将所述尿液样品暴露于消化核酸的酶。

57.权利要求1-5或9-56中任一项的方法，其中所述方法不包括以15,000g离心样品10分钟。

58.权利要求1-6或9-57中任一项的方法或试剂盒，其中所述至少一种生物标志物是Mcm蛋白质。

59.权利要求58的方法，其中所述Mcm蛋白是Mcm5。

60.权利要求59的方法，其中Mcm 5浓度的异常值表示所述受试者中泌尿系统癌症的可能性增加。

61.权利要求1-5或9-60中任一项的方法，其中所述方法是用于检测受试者中泌尿系统癌症的存在的方法。

62.权利要求61的方法，其中所述泌尿系统癌症是前列腺癌和/或膀胱癌。

63.权利要求6的试剂盒，还包括校准物。

64.权利要求63的试剂盒，其中所述校准物是已知浓度的Mcm5的溶液。

65.权利要求6或63-64中任一项的试剂盒，还包含至少一种可用于检测所述检测抗体的浓度的底物试剂。

66.权利要求65的试剂盒，其中所述至少一种底物试剂是过氧化物和TMB。

67.权利要求6或63-66中任一项的试剂盒，还包含洗涤溶液和/或终止溶液。

68.一种用于检测受试者中泌尿系统癌症的存在的方法，所述方法包括：

a.对来自受试者的样品进行测定以确定Mcm蛋白质的浓度；

b.将步骤a中确定的Mcm蛋白的浓度与参照值进行比较；

其中所述测定不是免疫荧光测定法。

69.权利要求67的方法，其中Mcm的存在的异常值指示所述受试者中泌尿系统癌症的可能性增加。

70.权利要求或1-5或9-62中任一项的方法，其中确定至少一种生物标志物或Mcm蛋白质的浓度的测定是ELISA测定。

71.权利要求70的方法，其中确定至少一种生物标志物或Mcm蛋白质的浓度的测定是夹心ELISA测定法。

72.权利要求71的方法，其中确定至少一种生物标志物或Mcm蛋白质的浓度的测定包括使用捕获抗体捕获所述样品中的所述至少一种生物标志物或Mcm蛋白质，并使用检测抗体检测Mcm蛋白质的浓度，其中所述捕获抗体和所述检测抗体特异性结合所述至少一种生物标志物或Mcm蛋白质。

73.权利要求72的方法或权利要求6的试剂盒，其中所述捕获抗体固定在ELISA板上。

74.权利要求72或73的方法或权利要求6的试剂盒，其中所述检测抗体与辣根过氧化物酶缀合。

75.权利要求68至74中任一项的方法，还包括：当步骤(b)中确定的所述至少一种生物标志物或Mcm蛋白质的浓度高于来自健康患者的平均值加上由健康受试者得出的值显示的标准偏差的倍数时诊断患者为具有泌尿系统癌症。

76.权利要求68-75中任一项的方法，其中所述样品包含尿液。

77.前述权利要求中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述样品或所述尿液样品包括尿沉积物。

78.前述权利要求中任一项的方法、装置或试剂盒，其中所述样品或尿液样品包括从前列腺按摩之后收集的第一次捕集尿液获得的尿沉积物。

79.权利要求68-78中任一项的方法，其中所述方法是体外方法。

80.权利要求68-79中任一项的方法，还包括权利要求1-5或8-79的步骤。

81.权利要求68-80中任一项的方法，其中所述Mcm蛋白是Mcm5。

82.一种适用于执行权利要求68-81中任一项的方法的试剂盒。

83.一种用于诊断泌尿系统癌症的试剂盒，其包含捕获抗体和检测抗体，其中(a)所述捕获抗体和所述检测抗体与Mcm5特异性结合，(b)所述捕获抗体与固体支持物结合，和(c)所述检测抗体与辣根过氧化物缀合。

84.权利要求7或8的装置，其中所述裂解缓冲剂提供于所述第一和第二缓冲剂储存器中的之一或两者中。

85.权利要求7、8或84中任一项的装置，还包括用于提供裂解缓冲剂流的装置。

86.权利要求85的装置，其中所述用于提供裂解缓冲剂流的装置是泵或注射器的一部分。

87.权利要求7、8或84-86中任一项的装置，其中所述第一缓冲剂储存器和所述第二缓冲剂储存器中的至少一个是注射器的一部分。

88.权利要求7、8或84-87中任一项的装置，还包括用于容纳过滤的尿液的尿液储存器，所述尿液储存器布置在所述出口的下游并且与所述出口流体连通。

89.权利要求88的装置，其中所述尿液储存器是注射器的一部分。

90.权利要求7、8或84-89中任一项的装置，还包括用于提供尿液流的装置。

91.权利要求90的装置，其中所述用于提供尿液流的装置是泵或注射器的一部分。

92.权利要求7、8或84-91中任一项的装置，其中所述尿液储存器构造成容纳至少10ml过滤的尿液，优选至少约50ml。

93.权利要求7、8或84-91中任一项的装置，其中所述第一缓冲剂储存器和所述第二缓冲剂储存器各自构造成容纳至少500μl裂解缓冲剂，优选至少约5ml。

94.权利要求7、8或84-93中任一项的装置，其中所述过滤器阻止直径大于5μm的颗粒通过。

95.权利要求7、8或84-94中任一项的装置，其中所述第一阀布置和所述第二阀布置中的至少一个包括鲁尔阀。

96.一种用于分析来自受试者的尿液样品的装置，所述装置包括：

权利要求7、8或84-95中任一项的装置；和

97.权利要求96的装置，其中：

测定设备与装置流体连通；

在第一和第二阀布置的第一和第二构造中，从装置流向测定设备的流动被阻断；和

第一和第二阀布置可以进一步构造为使得在第一和第二阀布置的第三构造中，裂解产物能够从第一缓冲剂储存器或第二缓冲剂储存器流向测定设备。

98.权利要求96或97的装置，其中所述测定设备包含捕获抗体和检测抗体，其中(a)所述捕获抗体和所述检测抗体特异性结合Mcm5，(b)所述捕获抗体与固体支持物结合，和(c)所述检测抗体缀合至辣根过氧化物酶。

99.权利要求97或98的装置，其中所述测定设备被构造用于横向流动。

100.权利要求9的方法，其中使裂解缓冲剂通过所述过滤器的步骤包括使所述裂解缓冲剂相对于通过所述过滤器的尿液流以上游方向通过所述过滤器至少一次并且使所述裂解缓冲剂沿下游方向通过过滤器至少一次。

101.权利要求100的方法，其中所述裂解缓冲剂交替地通过所述过滤器的上游和下游。

102.权利要求9或100-101中任一项的方法，其中所述尿液样品的体积为1至100ml，优选约50ml。

103.权利要求9或100-102中任一项的方法，其中所述裂解缓冲剂的体积为250μl至1000μl，优选约500μl。

104.权利要求9或100-103中任一项的方法，其中使用注射器使所述尿液样品通过所述过滤器。

105.权利要求9或100-104中任一项的方法，其中使用注射器使所述裂解缓冲剂通过所述过滤器。

106.权利要求9或100-105中任一项的方法，其中所述裂解缓冲剂经由所述过滤器在两个注射器之间通过，所述两个注射器和所述过滤器形成用于通过所述裂解缓冲剂的步骤的封闭系统。

107.权利要求9或100-106中任一项的方法，其中孵育时间为30秒至1小时，优选约10分钟。

108.权利要求9或100-107中任一项的方法，其中所述至少一种生物标志物是Mcm5。

109.权利要求9或100-108中任一项的方法，其中所述方法使用权利要求7-8、10-50或84-99中任一项的装置或设备来执行。

110.权利要求1-5或9-62中任一项的方法，其中使用权利要求9或102-109中任一项的方法将所述尿液样品暴露于裂解缓冲剂。

111.权利要求10-51中任一项的裂解缓冲剂用于从尿液样品中的细胞释放至少一种生物标志物的用途。

112.权利要求111的用途，其中所述至少一种生物标志物是Mcm蛋白质。

113.权利要求112的用途，其中所述Mcm蛋白是Mcm5。