CN101738469A - 一种基于可视化蛋白芯片的食物过敏原检测方法 - Google Patents

一种基于可视化蛋白芯片的食物过敏原检测方法 Download PDF

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林洪
李小燕
李振兴
张轶群
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Abstract

本发明公开了一种蛋白芯片的检测方法。本发明所提供的蛋白芯片检测方法，包括如下步骤：1)以手动点样仪点制所需的抗体芯片；2)以辣根过氧化物酶标记待测蛋白的抗体，与芯片进行杂交；3)加入沉淀型TMB显色液进行反应，扫描并分析样点的灰度值。本发明方法重复性好，特异性强，敏感性高，操作简便，可以实现对多种待测蛋白的同时检测，所需样本极微量，结果形象、直观，无需昂贵的检测设备，成本低廉。

Description

一种基于可视化蛋白芯片的食物过敏原检测方法
技术领域
本发明涉及一种可视化蛋白芯片的检测方法，特别是涉及食品过敏原的快速及通量化检测。
背景技术
食物过敏原通常是一些水溶性或盐溶性糖蛋白，倾向于耐热、耐酸、耐酶解(果蔬过敏原例外)，在简单的加工或消化过程中不会被破坏掉，仍会引发过敏症，其症状轻则出现皮肤骚痒、腹泻等问题，重则发生休克死亡，故而食物过敏原的检测有着重大的意义。目前，食物过敏原的常用检测方法主要有如下几种：
1、皮肤试验法，主要指划痕试验、点刺试验、皮内注射实验，该法虽快捷，但结果的特异性和敏感性差，给患者造成痛苦，不安全和不易定量等问题，常造成假阳性和假阴性结果。
2、双盲实验，准确度较高，但是由于体内实验不确定性因素较多，而且给患者造成较大的不便和痛苦。
3、基因法，该法虽然检测限比较低，方法灵敏，但假阳性率相对较高，且操作麻烦。
4、免疫法，主要有放射过敏原吸附抑制试验，、免疫杂交电泳、酶联免疫等。其中放射性的危险限制了放射过敏原吸附抑制试验的广泛应用，免疫杂交电泳存在定量难的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏、快速、简便、通量化、特异性好的应用于食品过敏原的可视化蛋白芯片检测方法，所需样本极微量，检测成本低。
本发明所提供的可视化蛋白芯片检测方法，包括如下步骤：
1)以手动式点样仪将捕获抗体点至琼脂糖三维基片上；
2)待测抗原与预制好的蛋白芯片进行杂交，加入以辣根过氧化物酶(HRP)标记的待测蛋白的检测抗体；
3)加入沉淀型TMB与蛋白芯片进行杂交，然后以H2SO4或水洗终止反应，检测样品点处的色素沉积。
其中，HRP标记的待测蛋白检测抗体的方法参照文献(PAUL K.NAKANE ANDAKIRA KAWAOI，THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY ANDCYTOCHEMISTRY，1974，22(12)：1084-1091)制备，HRP标记抗体的使用浓度为0.5-5ug/ml，H2SO4浓度为2mol/L。
本发明方法能应用于食物过敏原的快速可视检测，能检测到待检蛋白的蛋白芯片含有食物过敏原的兔多克隆抗体。
辣根过氧化物酶(HRP)一种含亚铁血红素的蛋白质，具有来源广泛，标记操作简便，标记效率高等特点。本发明利用辣根过氧化物酶作为待测蛋白检测抗体的标记物，加入的沉淀型TMB(3，3’5，5——四甲基联苯胺)在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和待测蛋白的量呈正相关。本方法操作简单，能同时实现对多个待检样本的检测，其检测限可达到10ng/ml以下，与荧光检测的灵敏度相当，并且具有设备简易，成本低廉的优点。
附图说明
图1蛤蜊过敏原浓度与灰度值间的关系图
图2海鱼过敏原浓度与灰度值间的关系图
图3芯片重复性实验结果
具体实施方式
实施例1、蛤蜊及海鱼鱼过敏原的检测
1、制备抗体蛋白芯片
蛋白芯片的制备方法参见文献(金世辉、刘必成，张春秀等，中国生物工程杂志，2005，25(2)：57-60)，所用的蛤蜊、海鱼抗原及其捕获抗体均为实验室自制。
2、辣根过氧化物酶(HRP)标记检测抗体
将抗蛤蜊及海鱼抗原的鼠单克隆抗体参照文献(PAUL K.NAKANE ANDAKIRA KAWAOI，THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY ANDCYTOCHEMISTRY，1974，22(12)：1084-1091)中所述的方法进行标记。
3、芯片杂交
将抗体蛋白芯片放入芯片反应盒内，加入不同浓度待测的蛤蜊及海鱼抗原样品，25ul/区域，蛤蜊及海鱼抗原浓度为10，50，100，500ng/ml，1，5，10ug/ml，孵育1小时后，加入2ug/ml的HRP标记的抗蛤蜊的鼠单克隆抗体，15ul/区域，孵育1小时，加入TMB显色液，避光作用20min，后以2mol/L硫酸终止使其变成褐色的可目视检测的样点。
4、实验结果检测
以平板扫描仪扫描获得检测图像，数据采用软件处理获得各点的灰度值。
各检测点的灰度与过敏原的浓度关系如图1和图2所示。图1为蛤蜊过敏原浓度与灰度值的关系图，图2为海鱼过敏原浓度与灰度值的关系图。由图1和图2可见，利用HRP标记鼠单克隆抗体，采用双抗夹心式杂交方法，具有较高的检测灵敏度，对10ng/ml的蛤蜊及海鱼抗原均能较好地检出。
实施例2、芯片的重复性
1、制备抗体蛋白芯片
蛋白芯片的制备方法参见文献(金世辉、刘必成，张春秀等，中国生物工程杂志，2005，25(2)：57-60)，采用兔抗蛤蜊制备抗体芯片。
2、辣根过氧化物酶(HRP)标记检测抗体
将抗蛤蜊抗原的鼠单克隆抗体参照文献(PAUL K.NAKANE AND AKIRAKAWAOI，THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY ANDCYTOCHEMISTRY，1974，22(12)：1084-1091)中所述的方法进行标记。
3、芯片杂交
将抗体蛋白芯片放入芯片反应盒内，加入三个不同浓度待测的蛤蜊抗原样品，25ul/区域，蛤蜊抗原浓度分别为5，10，15ng/ml。设三个平行的芯片，每个芯片上每个浓度重复两个区域，每个区域设9个点样点，与芯片反应1小时后，加入HRP标记的抗蛤蜊的鼠单克隆抗体，15ul/区域，孵育1小时，加入TMB显色液，避光作用20min，后以2mol/L的硫酸终止使其变成褐色的可目视检测的样点。
4、实验结果检测
以平板扫描仪扫描获得检测图像，数据采用软件处理可获得各点的灰度值。
由图3可见，该检测方法的重复性较好。
实施例3芯片的特异性检测
1、制备抗体蛋白芯片
蛋白芯片的制备方法参见文献(金世辉、刘必成，张春秀等，中国生物工程杂志，2005，25(2)：57-60)，采用兔抗蛤蜊制备抗体芯片。
2、检测的抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记
将抗蛤蜊抗原的鼠单克隆抗体参照文献(PAUL K.NAKANE AND AKIRAKAWAOI，THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY，1974，22(12)：1084-1091)中所述的方法进行标记。
3、芯片杂交
将抗体蛋白芯片放入芯片反应盒内，分别加入10ng/ml的牛奶、南美白对虾、海鱼及蛤蜊过敏原，25ul/区域，设三个平行的芯片，每个芯片上每种过敏原重复两个区域，每个区域设9个点样点，与芯片反应1小时后，加入HRP标记的抗蛤蜊的鼠单克隆抗体，15ul/区域，孵育1小时，加入TMB显色液，避光作用20min，后以2mol/L的硫酸终止，使其变成褐色的可目视检测的样点。
4、实验结果检测
以平板扫描仪扫描获得检测图像，数据采用软件处理可获得各点的灰度值。
实验结果表明，该法特异性较强。

Claims (6)

1.一种基于可视化蛋白芯片的食物过敏原检测方法，包括如下的步骤：
1)以手动式点样仪在基片上点制3×3的矩阵。
2)待测抗原与预制好的蛋白芯片进行杂交，加入以辣根过氧化物酶(HRP)标记的待测蛋白的检测抗体；
3)加入沉淀型TMB(3，3’5，5-四甲基联苯胺)与蛋白芯片进行杂交，然后以H2SO4或水洗终止反应，检测样品点处的色素沉积。
2.根据权利要求1所述步骤1中的基片为表面铺有琼脂糖的玻片。
3.根据权利要求1所述步骤1中的点阵，水平方向点距为1250μm，竖直方向点间间距为750μm，点的大小为500-1000μm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述HRP标记抗体方法参照文献(PAUL K.NAKANE AND AKIRA KAWAOI，THEJOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY，1974，22(12)：1084-1091)，HRP标记抗体的使用浓度为0.5-5ug/ml。
5.根据权利要求1所述的步骤3中的H2SO4浓度为2mol/L。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述待测蛋白为食物过敏原，所述能检测到待检蛋白的蛋白芯片含有该待检蛋白的抗体(兔抗)。
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