CN110907442B - 一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒及检测方法。一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒，包括：能够特异性识别牛奶酪蛋白的第一抗体、能够特异性识别牛奶酪蛋白且与第一抗体结合位点不同的第二抗体、牛奶酪蛋白、纳米金溶液、AgNO3溶液、对苯二酚溶液和TMB溶液即3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液。该方法具有高特异性、高灵敏度、成本低廉、易于保存等优点，其制成的牛奶致敏原检测试剂盒，可用于定量检测牛奶致敏原酪蛋白。

Description

一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及致敏原检测领域，具体涉及一种牛奶致敏原的比色检测方法及试剂盒。
背景技术
食物过敏是人类最为常见的健康问题。牛奶富含蛋白质及多种矿物质，是婴幼儿早期接触的第一个也是最常见的食物致敏原，在儿童中发病率大约为0.3％～7.5％。目前，美国、欧盟和新西兰等国家均要求对致敏食品进行致敏原标示，以提醒消费者，避免误食。因此，致敏原含量的检测是进行过敏食品的生产、评估和标示工作的基础和首要任务。酪蛋白是引发牛奶过敏的主要致敏原之一。目前，牛奶致敏原的检测方法主要有ELISA、RT-PCR、LC-MS等技术。这些方法都需要高端仪器设备及专业人员操作，检测时间较长，操作较为复杂。由此，牛奶致敏原的检测方法有待改进。
酶是催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体,其催化效率高、选择性强,被广泛应用于疾病诊断、临床治疗、生物传感和环境保护等领域。但是天然酶在极端条件下如强酸、强碱、高温等易失活且提取成本高,产量低,难以被用于大规模工业生产。纳米酶泛指具有酶活性的纳米材料，基于无机纳米材料的新型纳米酶具有制备简单、稳定性高、成本低廉、易于保存运输、环境耐受性高等优点，可代替传统酶应用于酶检测法，为致敏原分析领域提供一项方便快捷、稳定性好、灵敏性高且特异性强的快速检测方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测方法。该方法具有高特异性、高灵敏度、成本低廉、易于保存等优点，其制成的牛奶致敏原检测试剂盒，可用于定量检测牛奶致敏原酪蛋白。
一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒，包括：能够特异性识别牛奶酪蛋白的第一抗体、能够特异性识别牛奶酪蛋白且与第一抗体结合位点不同的第二抗体、牛奶酪蛋白、纳米金溶液、AgNO3溶液、对苯二酚溶液和TMB溶液即3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；所述第一抗体浓度为0.1～0.5μg/mL；第二抗体浓度为0.1～0.5μg/mL；牛奶酪蛋白浓度为100μg/mL；AgNO3溶液浓度为1mM；对苯二酚溶液浓度为1mM，TMB溶液浓度为40mmol/L；纳米金溶液浓度为75mg/mL，纳米金的粒径为15～20nm。
一种牛奶致敏原的比色检测方法，包括以下步骤：
a、制备纳米金-第二抗体探针：于量筒中量取48.75mL去离子水于洁净的锥形瓶中，温和搅拌下加入1.25mL 4g/LHAuCl4储备液；280℃下高温搅拌至溶液沸腾，保持沸腾2-3min后加入2.0mL 10mg/mL柠檬酸钠溶液，并增加磁力搅拌转速；待溶液颜色稳定后停止加热，并将反应完成的纳米金溶液置于磁力搅拌器上继续搅拌冷却至室温，即可制得15nm纳米金粒子溶液；将获得的纳米金溶液于室温1000rpm条件下离心10min，过滤去除部分聚集沉降的金粒子，将过滤获得的纳米金粒子溶液储存于4℃待用；吸取1mL纳米金粒子溶液于2mL离心管内，加入0.1mol/mL K2CO3溶液条件体系pH至8.5；将pH为8.6，10mmol/L的第二抗体用PBS缓冲液稀释至0.3μg/mL，加入10μL第二抗体，所述第二抗体为牛奶致敏原特异性单抗，室温下孵育60min，使得第二抗体吸附在纳米金颗粒上；加入10μL 500μg/mL BSA即牛清蛋白，室温下孵育60min，以封闭纳米金的非特异性结合位点，于4℃下10000g离心10min，小心移去上清液；用含有0.5％BSA的pH为7.4的0.5×PBS缓冲液将沉淀复溶，即得到纳米金-第二抗体探针；
b、依次将第一抗体、系列浓度牛奶酪蛋白和纳米金-第二抗体探针结合在酶标板上；第一抗体的浓度为0.1～0.15μg/mL，第一抗体也为牛奶致敏原特异性单抗且与第二抗体结合位点不同；
c、依次往b步骤上的酶标板上加入AgNO3溶液和对苯二酚溶液，孵育，以形成@Ag/Au结构；AgNO3溶液浓度为1mM；对苯二酚溶液浓度为1mM；
d、依次往c步骤上的酶标板上加入H2O2溶液和TMB溶液，显色后，加入H2SO4终止反应，肉眼观察进行定性检测，在450nm处测定吸光度，进行定量检测；H2O2溶液为100μL/well的9M H2O2溶液；TMB溶液浓度为40mmol/L。
所述a步骤中第二抗体的浓度为0.1μg/mL。
所述a步骤中中纳米金的粒径为15～20nm。
所述b步骤中中第一抗体的浓度为0.1μg/mL。
所述c步骤中中孵育时间为10～15min。
所述d步骤中中反应时间为1～2min。
本发明的有益效果是：根据本发明的试剂盒，通过上述纳米酶比色检测法，相对于传统的ELISA具有稳定性强、灵敏性强、特异性强等优点，使得该试剂盒可特异性识别酪蛋白，且灵敏性高、特异性强、不易出现假阳性、成本低、设备要求低且检测周期短，可广泛适用于牛奶致敏原的现场快速检测。
本发明的方法中，设计@Ag/Au作为过氧化氢纳米酶，标记在第二抗体上，采用第一抗体捕获样品中的酪蛋白，@Ag/Au标记第二抗体特异性识别酪蛋白。在@Ag/Au的催化作用下，H2O2与TMB反应呈现蓝色，加入H2SO4终止反应后呈现黄色。随着酪蛋白浓度的增加，溶液颜色越深，通过肉眼观察进行酪蛋白的定性检测，实现酪蛋白的快速检测，根据酪蛋白浓度-吸光值变化曲线换算待测样品中牛奶致敏原中酪蛋白的浓度，达到定量检测的水平。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例酪蛋白标准曲线拟合结果图。
图2为本发明所述的浓度-颜色变化图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1：
纳米金-第二抗体探针的制备：
(1)于量筒中量取48.75mL去离子水于洁净的锥形瓶中，温和搅拌下加入1.25mL4g/L HAuCl4储备液；
(2)280℃下高温搅拌至溶液沸腾，保持沸腾2-3min后加入2.0mL 10mg/mL柠檬酸钠溶液，并增加磁力搅拌转速；
(3)待溶液颜色稳定后停止加热，并将反应完成的纳米金溶液置于磁力搅拌器上继续搅拌冷却至室温，即可制得15nm纳米金粒子溶液；
(4)将获得的纳米金溶液于室温1000rpm条件下离心10min，过滤去除部分聚集沉降的金粒子，将过滤获得的纳米金粒子溶液储存于4℃待用；
(5)吸取1mL纳米金粒子溶液于2mL离心管内，加入0.1mol/mL K2CO3溶液条件体系pH至8.5；
(6)将第二抗体用PBS缓冲液(pH 8.6，10mmol/L)稀释至0.3μg/mL，加入10μL第二抗体，室温下孵育60min，使得第二抗体吸附在纳米金颗粒上；
(7)加入10μL 500μg/mL BSA即牛清蛋白，室温下孵育60min，以封闭纳米金的非特异性结合位点，于4℃下10000g离心10min，小心移去上清液；
(8)用含有0.5％BSA的0.5×PBS缓冲液(pH7.4)将沉淀复溶，即得到纳米金-第二抗体探针。
实施例2：
牛奶致敏原的比色检测试剂盒的制备：
将第一抗体、第二抗体、牛奶酪蛋白、纳米金溶液、AgNO3溶液、对苯二酚溶液和TMB溶液即3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，获得检测试剂盒。其中，第一抗体浓度为1mg/mL；第二抗体浓度为1mg/mL；牛奶酪蛋白浓度为100μg/mL；AgNO3溶液浓度为1mM；对苯二酚溶液浓度为1mM；TMB溶液浓度40mmol/L。纳米金溶液浓度为75mg/mL，纳米金的粒径为15～20nm。
该检测试剂盒使用时，首先制备纳米金-第二抗体探针，然后将第一抗体用PBS缓冲液(pH 7.0,10mmol/L)稀释至0.1μg/mL，100μL/well加入96孔板中，4℃过夜；充分洗涤后，将1％BSA(w/v)200μL/well加入96孔板中，25℃放置1h，以封闭非特异性结合位点；充分洗涤后，将待测样品100μL/well加入96孔板中，25℃放置1h；充分洗涤后，将纳米金-第二抗体探针100μL/well加入96孔板中，25℃放置1h；充分洗涤后，100μL/well AgNO3溶液和对苯二酚溶液(1:1v/v)加入96孔板中，25℃放置10min；充分洗涤后，100μL/well的9M的H2O2溶液和40mmol/L的TMB溶液(9:1v/v)加入96孔板中，25℃反应1min后50μL/well加入10％H2SO4溶液，肉眼观察进行定性检测，在450nm下测定吸光值，进行定量检测。
实施例3：
酪蛋白的标准曲线：
采用pH为7.0，浓度为10mmol/L的PBS缓冲液精密配制酪蛋白为不同浓度如1、5、10、20、30、50ng/mL，采用本发明所述试剂盒检测酪蛋白，以酪蛋白浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。结果如图1所示，标准曲线为y＝0.0539x+0.7529，R2＝0.9928。随着酪蛋白浓度的增大，反应液颜色逐渐加深，结果如图2所示。
实施例4：
奶粉中酪蛋白的检测：
(1)称取0.1g奶粉，与1mL pH为7.0，浓度为10mmol/L PBS缓冲液混合，60℃下搅拌1小时，使奶粉充分溶解，然后以10000r/min，4℃离心15min，取上清液，分装保存于-80℃，应避免反复冻融。
(2)将提取的牛奶蛋白浸液通过ANX Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用0.1～0.4M NaCl溶液进行线性洗脱，收集洗脱产物，PBS透析后得到牛奶的杂蛋白混合液。
(3)取1mL牛奶的杂蛋白混合液，分别加入不同量的酪蛋白，使其浓度为5、10、20、50ng/mL，每个浓度6个平行样，进行样品检测和回收率测定。检测结果如表1所示，在5～50ng/mL浓度添加范围内，回收率在92％～102％，表明该方法可以用于实际样品中酪蛋白的检测。
表1 人工添加样品检测结果(n＝6)
实际浓度(ng/mL) 样品检出值(ng/mL) 回收率％
5 4.6±0.15 92
10 9.8±0.2 98
20 20.4±0.18 102
50 47.5±0.2 95
综上，本发明通过设计@Ag/Au作为过氧化氢纳米酶，标记在第二抗体上，采用第一抗体捕获样品中的酪蛋白，@Ag/Au标记第二抗体特异性识别酪蛋白。在@Ag/Au的催化作用下，H2O2与TMB反应呈现蓝色，加入H2SO4终止反应后呈现黄色。通过肉眼观察进行酪蛋白的定性检测，实现酪蛋白的快速检测，根据酪蛋白浓度-吸光值变化曲线换算待测样品中牛奶致敏原中酪蛋白的浓度，达到定量检测的水平。
利用本发明所得试剂盒检测的方法操作简便，实验室人员稍加培训即可操作，检测灵敏度高，结果判定不受主观因素影响，储存简单，可以定量、定性确定食品中牛奶致敏原酪蛋白的含量，具备极高的推广价值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒，其特征在于：包括：能够特异性识别牛奶酪蛋白的第一抗体、能够特异性识别牛奶酪蛋白且与第一抗体结合位点不同的第二抗体、牛奶酪蛋白、纳米金溶液、AgNO3溶液、对苯二酚溶液和TMB溶液即3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；所述第一抗体浓度为0.1~0.5 μg/mL；第二抗体浓度为0.1~0.5 μg/mL；牛奶酪蛋白浓度为100 μg/mL；AgNO3溶液浓度为1mM；对苯二酚溶液浓度为1 mM，TMB溶液浓度为40 mmol/L；纳米金溶液浓度为75 mg/mL，纳米金的粒径为15~20 nm；
纳米金溶液与第二抗体制备纳米金-第二抗体探针；将第一抗体、系列浓度牛奶酪蛋白和纳米金-第二抗体探针结合并加入AgNO3溶液和对苯二酚溶液，孵育，以形成@Ag/Au结构；
第一抗体捕获酪蛋白，@Ag/Au标记第二抗体特异性识别酪蛋白；在@Ag/Au的催化作用下，H2O2与TMB反应呈现蓝色，加入H2SO4终止反应后呈现黄色。
2.使用权利要求1中所述的一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、制备纳米金-第二抗体探针：于量筒中量取48.75 mL去离子水于洁净的锥形瓶中，温和搅拌下加入1.25 mL 4 g/L HAuCl4储备液；280 ℃下高温搅拌至溶液沸腾，保持沸腾2-3min后加入2.0 mL10 mg/mL柠檬酸钠溶液，并增加磁力搅拌转速；待溶液颜色稳定后停止加热，并将反应完成的纳米金溶液置于磁力搅拌器上继续搅拌冷却至室温，即可制得15 nm纳米金粒子溶液；将获得的纳米金溶液于室温1000 rpm条件下离心10 min，过滤去除部分聚集沉降的金粒子，将过滤获得的纳米金粒子溶液储存于4 ℃待用；吸取1 mL纳米金粒子溶液于2 mL离心管内，加入0.1 mol/mL K2CO3溶液条件体系pH至8.5；将pH 为8.6，10 mmol/L的第二抗体用PBS 缓冲液稀释至0.3 μg/mL，加入10 μL第二抗体，所述第二抗体为牛奶致敏原特异性单抗，室温下孵育60 min，使得第二抗体吸附在纳米金颗粒上；加入10 µL 500µg/mL BSA即牛清蛋白，室温下孵育60 min，以封闭纳米金的非特异性结合位点，于4℃下10000 g离心10 min，小心移去上清液；用含有0.5% BSA的pH为7.4的0.5× PBS缓冲液将沉淀复溶，即得到纳米金-第二抗体探针；
b、依次将第一抗体、系列浓度牛奶酪蛋白和纳米金-第二抗体探针结合在酶标板上；第一抗体的浓度为0.1~0.15μg/mL，第一抗体也为牛奶致敏原特异性单抗且与第二抗体结合位点不同；
c、依次往b步骤上的酶标板上加入AgNO3溶液和对苯二酚溶液，孵育，以形成@Ag/Au结构；AgNO3溶液浓度为1 mM；对苯二酚溶液浓度为1 mM；
d、依次往c步骤上的酶标板上加入H2O2溶液和TMB溶液，显色后，加入H2SO4终止反应，肉眼观察进行定性检测，在450 nm处测定吸光度，进行定量检测；H2O2溶液为100 µL/well的9 M H2O2溶液；TMB溶液浓度为40 mmol/L。
3.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述a步骤中第二抗体的浓度为0.1 μg/mL。
4.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述a步骤中纳米金的粒径为15~20 nm。
5.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述b步骤中第一抗体的浓度为0.1μg/mL。
6.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述c步骤中孵育时间为10~15 min。
7.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述d步骤中反应时间为1~2 min。
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