CN108728554A - 荧光法试纸条及使用该荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法 - Google Patents

荧光法试纸条及使用该荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测技术领域，尤其是荧光法试纸条及使用该荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法。该试纸条包括吸收垫、反应膜、吸水垫和底板，吸收垫、反应膜、吸水垫均固定在底板上，反应膜位于吸收垫和吸水垫之间，反应膜上设有由链霉亲和素包被在反应膜上形成的检测区和生物素修饰的正向引物互补链连接亲和素包被在反应膜上形成的质控区。本发明通过重组酶聚合酶技术配合试纸条，来对羊肉进行是否掺假的检测，该方法灵敏度高、操作简单快速，成本低，同时检测只需一台荧光检测仪即可，便于携带。

Description

荧光法试纸条及使用该荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假 方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其是荧光法试纸条及使用该荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法。
背景技术
近年来，随着社会的发展，经济水平的提高，人们饮食结构发生了重大的 改变，肉及肉制品逐渐成为人们生活餐桌上的主角，其产量也是逐渐递增的。 目前食品欺诈问题日益突出，肉制品掺假现象尤为严重。主要表现为将廉价肉 放入高价肉中谋取不法利润，这些问题的出现严重干扰了畜产品产业的发展， 不仅损害消费者的权益，还涉及到经济、食品安全、人民健康。普通消费者难 以通过感官分辨掺假肉，因此急需开发新的检测方法和手段，从而快速、方 便、准确的判别肉品掺假等问题，这些对保障肉及肉制品安全，维护消费者权 益，都有重要的现实意义。
目前针对肉及肉制品掺假问题，各国已经制备了相应的行业标准与控制手段，同时建立了基于不同检测平台的定性定量检测技术，其中主要的检测技术为基于蛋白质检测平台的免疫学技术与色谱质谱技术,基于代谢物检测平台的红外光谱、电子鼻与电子舌技术，以及基于核酸检测平台的PCR技术。基于形态学的检测技术与检测人员有较大关系，具有一定的主观性。基于代谢物的光谱技术主要为红外光谱技术，此技术可对样品进行快速、简单、可重复、无损伤的定性定量分析，但是红外光谱的缺点是模型需要大量已知的样品实验，模型通用性不强，仪器状态和样品发生改变，模型也会随之发生变化，从而限制了它的使用。基于蛋白质的检测技术的免疫学方法操作简单方便，使用范围广泛、成本低，灵敏度较高，可以同时检测大量样品，但是该方法对抗原要求较高，只有少数动物品种找到了耐热蛋白并制备出了抗体，另外由于蛋白抗原的变化,对于加工后样品成分的鉴定准确度会降低，因此常常需要其他方法辅助检测。而基于蛋白质的色谱质谱技术，虽然是一种可靠、快速的鉴别方法，但是，由于样品中的蛋白质结构不可逆而导致溶解性降低，蛋白质含量变化广、干扰因素多，因此技术灵敏度较低。核酸探针检测技术的最大优点是特异性强，但探针检测技术成本较高，检测一种成分就要制备一种探针。PCR方法可快速、灵敏鉴别羊源性成分，但是PCR反应进行需要热循环仪，很难在基层得到推广。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为了解决现有的检测技术难以推广的不足，本发明提供了一种荧光法试纸条及使用该荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法，通过重组酶聚合酶技术配合试纸条，来对羊肉进行是否掺假的检测，该方法灵敏度高、操作简单快速，成本低，同时检测只需一台荧光检测仪即可，便于携带。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种荧光法试纸条，包括吸收垫、反应膜、吸水垫和底板，吸收垫、反应膜、吸水垫均固定在底板上，反应膜位于吸收垫和吸水垫之间，反应膜上设有由链霉亲和素包被在反应膜上形成的检测区和生物素修饰的正向引物互补链连接亲和素包被在反应膜上形成的质控区。
具体地，所述链霉亲和素的包被浓度为10mg/ml。
具体地，所述生物素修饰的正向引物互补链包被浓度为252ug/ml。
一种使用荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法，包括以下步骤：
(1)获得引物，引物序列为：
序列(5'-3')，上游引物Cy5’-GTATCTGTTACTTTATCTCTTCCTCTCCA，下游引物Biotin-TCTTCTAGGATACTTCTAGGATGCTTCTG；
(2)DNA模板的制备，在20mg羊肉组织中提取100ul的核酸提取液；
(3)进行RPA反应，用羊源性成分基因组DNA，用RPA试剂盒进行扩增并用电泳检测扩增产物，RPA反应体系为：29.5ul的反应缓冲液、13.2ul的无菌去离子水、2.4ul的上游引物与2.4ul的下游引物、2.5ul的DNA模板、2ul的醋酸镁启动反应，在37℃下反应4min，再取出后利用离心机混匀后，再在37 ℃下反应16min；
(4)目的片段的纯化，使用柱式纯化试剂盒进行产物纯化目的片段；
(5)将试纸条平放，取2ul的扩增产物、98ul展开液，混匀滴加到试纸条的检测孔中，放在读卡仪中读取结果。
具体地，所述获得引物的方法为，通过生物学信息手段寻找羊源性成分的特异性基因，并通过BLAST进行比对及筛选，进行在线BLAST分析重新确认而获得。
具体地，所述上游引物的5'端修饰有荧光素，包括但不限于Cy5。
具体地，所述下游引物的5'端修饰有生物素。
具体地，所述展开液为含0.5％蔗糖的磷酸盐溶液。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种荧光法试纸条及使用该荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法，通过重组酶聚合酶技术配合试纸条，来对羊肉进行是否掺假的检测，该方法灵敏度高、操作简单快速，成本低，同时检测只需一台荧光检测仪即可，便于携带。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明的结构示意图；
图2是试纸条荧光扫描阳性结果图；
图3是试纸条荧光扫描阴性结果图；
图中1.吸收垫，2.反应膜，3.吸水垫，4.底板，21.检测区，22.质控区。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
图1是本发明的结构示意图，图2是试纸条荧光扫描阳性结果图，图3是试纸条荧光扫描阴性结果图。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品的制备
本研究所使用的样品均取自养殖场，所有样品放在-20℃下保存使用。
1.1.2试纸条的制备
将链霉亲和素按照包被浓度10mg/ml包被在反应膜上形成检测区21；将生物素修饰的正向引物互补链连接亲和素按照包被浓度252ug/ml包被在反应膜上做为质控区22，得到包被检测区与质控区的反应膜2。试纸条由样品吸收垫1(上海杰一生物技术有限公司，JY-BX111)、上述制备的包被检测区21和质控区22的反应膜2、吸水垫3依次按照顺序黏贴在底板4上。
1.1.3主要试剂和仪器
RPA Basic试剂盒购自北京新时代众合科技有限公司；引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。羊肉组织核酸提取试剂盒购自北京长峰科远科技发展有限公司；电泳仪购自Bio-Rad公司；凝胶成像系统(Alphalmager EP)购自美国UVP公司；紫外分光光度计购自Thermo有限生物公司；微量离心机购自Thermo Fisher Scientific公司。
1.1.4引物设计
通过生物学信息手段寻找羊源性成分的特异性基因，并通过BLAST进行比对及筛选，进行在线BLAST分析重新确认而获得，该基因为核基因[Genbank登录号为NC_019468.1]，其上游引物的5'端修饰有荧光素Cy5，下游引物的5'端修饰有生物素。引物设计使用Primer Premier 5.0软件，引物序列如表1所示。
表1：引物序列
1.2 DNA模板的制备
取20mg的羊肉组织，按照组织样品核酸提取试剂盒说明书进行提取，最终得到100ul的提取液。
1.3 RPA反应
用羊源性成分基因组DNA，用RPA试剂盒进行扩增并用电泳检测扩增产物。RPA反应体系为：29.5ul的反应缓冲液、13.2ul的无菌去离子水、2.4ul的上游引物与2.4ul的下游引物、2.5ul的DNA模板、2ul的醋酸镁启动反应。反应过程：37℃ 4min，拿出混匀离心，37℃16min。
1.4试纸条的检测方法及定性判读
将试纸条平放，取2ul的扩增产物、98ul展开液(PB+0.5％的蔗糖)，混匀滴加到试纸条的检测孔中，放在读卡仪中读取结果。
2实验结果
2.1检测原理
核酸试纸条检测羊肉成分的原理如附图1所示。使用一对特异性引物(上游标记Cy5,下游标记生物素)扩增从羊肉组织中提取得到的基因组，将无需纯化的扩增产物与展开液混合滴加在样品吸收垫1上，混合液通过层析作用向前流动。当有扩增产物存在时，扩增产物一端修饰的生物素被固定在检测区21的链霉亲和素捕获，就使被Cy5标记的产物停留在检测线处，产生荧光信号。多余的游离的单链引物继续层析，最终标记有Cy5的正向引物序列被此序列的互补序列捕获，使质控线产生荧光信号。产物越多，携带的荧光素物质就越多，检测区 21的荧光信号越高，剩余游离的荧光素标记的序列就越少，质控区22的荧光信号就越低。当扩增产物不存在时，标记有Cy5的序列无法停留在检测线处，而被质控线上的互补链捕获，所以质控线的荧光信号可以用来对试纸条进行质控。
本发明的检测羊源性成分的试纸具有灵敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间的优点。由于以荧光代替了胶体金作为标记物，很少的荧光信号既可以通过仪器检测出来，因此大大提高了检测的灵敏度。同时采用互补链法进行检测，可以降低购买抗体的成本。通过设置质控带(点)作为数据归一化方法，降低了不同纸条间不同操作人员乃至不同仪器扫描的实验误差，由于采用了特异性引物，与其他的动物物种没有交叉，因此避免了其他动物源性成分的干扰。采用本方法，从扩增到结果检测，30min内即可获得实验结果，可以大大提高检测效率。
2.1特异性实验
根据确立的反应体系进行特异性实验，使用本研究设计的引物对不同种属的DNA模板进行实验，检测结果显示除了羊源性DNA外，其他几个物种均没有扩增，从而证明试验方法的特异性良好。如附图2所示，左侧峰为C线对照线荧光强度，右侧峰为T线检测线荧光强度，显示为阳性。如附图3所示，左侧峰为C线对照线荧光强度，右侧T线处无荧光峰出现，显示为阴性样品(不含羊肉成分)。
本申请方法灵敏度高、操作简单快速，成本低，同时检测只需一台荧光检测仪即可，便于携带，本方法的建立为羊肉掺假鉴别奠定了一定的基础。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (8)

1.一种荧光法试纸条，其特征是，包括吸收垫（1）、反应膜（2）、
吸水垫（3）和底板（4），吸收垫（1）、反应膜（2）、吸水垫（3）均固定在底板（4）上，反应膜（2）位于吸收垫（1）和吸水垫（3）之间，反应膜（2）上设有由链霉亲和素包被在反应膜（2）上形成的检测区（21）和生物素修饰的正向引物互补链连接亲和素包被在反应膜（2）上形成的质控区（22）。
2.根据权利要求1所述的荧光法试纸条的制备方法，其特征在于：所述链霉亲和素的包被浓度为10mg/ml。
3.根据权利要求1所述的荧光法试纸条的制备方法，其特征在于：所述生物素修饰的正向引物互补链包被浓度为252ug/ml。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的使用荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）获得引物，引物序列为：
序列（5'-3'），上游引物Cy5’- GTATCTGTTACTTTATCTCTTCCTCTCCA，下游引物Biotin-TCTTCTAGGATACTTCTAGGATGCTTCTG；
（2）DNA模板的制备，在20mg羊肉组织中提取100ul的核酸提取液；
（3）进行RPA反应，用羊源性成分基因组DNA，用RPA试剂盒进行扩增并用电泳检测扩增产物，RPA反应体系为：29.5ul的反应缓冲液、13.2ul的无菌去离子水、2.4ul的上游引物与2.4ul的下游引物、2.5ul的DNA模板、2ul的醋酸镁启动反应，在37℃下反应4min，再取出后利用离心机混匀后，再在37℃下反应16min；
（4）目的片段的纯化，使用柱式纯化试剂盒进行产物纯化目的片段；
（5）将试纸条平放，取2ul的扩增产物、98ul展开液，混匀滴加到试纸条的检测孔中，放在读卡仪中读取结果。
5.根据权利要求4所述的使用荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法，其特征在于：所述获得引物的方法为，通过生物学信息手段寻找羊源性成分的特异性基因，并通过BLAST进行比对及筛选，进行在线BLAST分析重新确认而获得。
6.根据权利要求4所述的使用荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法，其特征在于：所述上游引物的5'端修饰有荧光素，包括但不限于Cy5。
7.根据权利要求4所述的使用荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法，其特征在于：所述下游引物的5'端修饰有生物素。
8.根据权利要求4所述的使用荧光法试纸条的快速鉴别羊肉掺假方法，其特征在于：所述展开液为含0.5%蔗糖的磷酸盐溶液。
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