CN108411001A - 一种用于快速检测肉源食品的多重pcr检测试剂盒 - Google Patents
一种用于快速检测肉源食品的多重pcr检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108411001A CN108411001A CN201810482987.3A CN201810482987A CN108411001A CN 108411001 A CN108411001 A CN 108411001A CN 201810482987 A CN201810482987 A CN 201810482987A CN 108411001 A CN108411001 A CN 108411001A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- specific
- reverse
- specific primer
- donkey
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒，具体为由“公共引物”介导的可以鉴别狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔的高通量多重PCR检测试剂盒及PCR鉴定方法，该引物体系可一次性检测多达8个动物物种，达到对常见动物物种基本覆盖的目的，且本发明引物均仅对各自物种目标片段进行特异性扩增，不会与其他物种起反应，因此也能适用于一次PCR反应中导入两种及以上引物对的多重PCR反应，从能有效缩短实验时间，此外本试剂盒具有较高的敏感度、可重复性、操作简单而且成本比较低，适用性广，快速高效且特异性高，可用于混合肉制品肉源的筛选和鉴定检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，尤其涉及狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔的多重 PCR 鉴定用引物体系及 PCR鉴定方法，适用于上述八种动物肉制品的快速检测及鉴定，尤其适用于掺假肉制品的快速防伪鉴定。
技术背景
肉制品是人体蛋白质和微量元素的重要来源。我国是肉制品的生产和消费大国，肉制品在居民食品消费中占有很大比例。目前全球的肉制品的安全状况令人担忧，比如欧洲的马肉风波，我国江苏地区羊肉掺假事件等，都暴露了严重的食品安全问题。由于肉制品的品种和价格差异，不法商贩以低价肉类代替高价肉类出售，不仅损害了消费者的利益，而且存在食品营养价值和食品安全等问题, 更直接影响消费者的健康, 尤其是对某些食物过敏的消费者。
目前，国内外报道的肉类鉴别的主要方法包括传统感官鉴别、免疫学方法、核酸检测方法，以及近年发展的如生物芯片、近红外光谱分析技术和质谱分析技术等。免疫学方法利用抗体对蛋白的识别来区别肉类品种，与传统鉴别技术相比，较灵敏可靠，但各种肉类特异性抗体难以制备，检测结果存在交叉反应，易出现假阳性结果，特别是加工食品蛋白易受到破坏和分解，导致检查结果易出现假空白且方法的重复性差。近年发展的生物芯片、近红外光谱分析技术和质谱分析等技术存在一些暂时无法有效解决或客观存在的缺点，如成本高、频繁维护和改进模型等原因，该类检测技术短期内仍无法有效推广应用。因此，建立快速、准确、敏感的多重PCR肉源检测技术是严格监测市场上肉制品安全的基础和关键之一。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔的多重 PCR 引物体系及 PCR鉴定方法，适用于上述八种动物肉制品的快速检测及鉴定。
为实现上述目的，本发明选用种属间特异性差异明显的线粒体基因作为靶基因，同时，为了实现一次性鉴别出狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔8个物种的目的，首先确定各组物种的线粒体基因的高度保守区，然后创造性的设计出了公共引物和狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔各物种特异性引物对。本发明的引物对均可通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法进行 DNA合成技术来获得 。
本发明采用如下技术方案：
一种用于快速检测肉源食品的PCR检测用引物，包括公共引物，还包括狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对中的一种或几种。
引物对，所述引物对包括狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对中的一种或几种。
一种用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒，包括公共引物，还包括狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对中的一种或几种。以及所述用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒在检测肉源食品中狗成分、鸡成分、牛成分、猪成分、马成分、驴成分、狐狸成分、兔成分中的一种或几种中的应用。
用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤，将装有公共引物的试剂瓶、分别装有狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对的试剂瓶、装有常规PCR试剂的试剂瓶置入盒体中，得到用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒。
上述用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒还包括下述PCR常规试剂中的一种或多种：Taq 聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水、阳性对照引物对、Taq DNAMasterMix、阳性对照DNA 模板。
本发明还公开了检测肉源食品中肉源性成分的方法，包括以下步骤：
提取样品线粒体基因组DNA作为模板；然后在公共引物存在下，利用狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对中的一种或多种与模板进行PCR反应；最后对PCR反应的产物进行分析完成肉源食品中肉源性成分的检测。
上述技术方案中，PCR反应的程序为:95℃下预变性5min、95℃变性30s、先70℃退火10s、再61℃退火30s、72℃延伸30s，进行10次循环；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、72℃下延伸10min，进行24次循环，最后保持在4℃结束。
上述技术方案中，所述PCR反应为25微升体系；所述公共引物的终浓度为0.083μM；当采用狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对同时与模板进行PCR反应时，引物的终浓度分别为：狗正向引物是0.067μM，驴正向引物是0.033μM，狐狸正向引物是0.099μM；鸡正向引物、牛正向引物、猪正向引物、马正向引物、兔正向引物都是0.05μM；狗反向引物、鸡反向引物、牛反向引物、猪反向引物、马反向引物、驴反向引物、狐狸反向引物、兔反向引物终浓度分别为0.067μM、0.00132μM、0.0165μM、0.00132μM、0.033μM、0.033μM、0.067μM、0.033μM。
本发明中，所公开的公共引物、狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对分别如下：
所述公共引物为5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'；
所述狗特异性引物对为：
正向引物 :5' -TGGCTCTAGCCGTTCGATTA-3'
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCAAGGCAACAGCAAATTCTAGG-3' ;
所述鸡特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3' ;
所述牛特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAAT-3' ;
所述猪特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCTGATAGTAGATTTGTGATGACCG-3' ;
所述马特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATTCACTCGACGAGGGT-3' ;
所述驴特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -CTCTTCCCCAGTTAATGTAGCTT-3 '
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTATCGTGTGGTCAGAGATATT-3' ;
所述狐狸特异性引物对为：
正向引物 :5' -AACTTAGACCGAACCATATTGCATC-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGGGTTTGAAGTTCATAAGTTTGG-3' ;
所述兔特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGAGGAGAAGAATGGCTACAAGGAA -3'。
本发明还公开了上述用于快速检测肉源食品的多重PCR检测用引物、上述引物对在检测肉源食品中狗成分、鸡成分、牛成分、猪成分、马成分、驴成分、狐狸成分、兔成分中的一种或几种中的应用。
本发明所述快速检测肉源食品的多重PCR检测方法中，进行琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果，判定依据为所述狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对分别扩増出的 DNA片段大小。比如：
狗物种的引物对 I扩増出的 DNA片段大小为181bp；
鸡物种的引物对 II扩增出的 DNA片段大小为229bp；
牛物种的引物对III扩増出的 DNA片段大小为287bp；
猪物种的引物对IV扩增出的 DNA片段大小412bp；
马物种的引物对V扩増出的 DNA片段大小为451bp；
驴羊物种的引物对VI扩增出的 DNA片段大小为510bp；
狐狸物种的引物对V]l扩増出的 DNA片段大小为570bp；
兔物种的引物对Vl]I扩增出的 DNA片段大小678bp。
将本发明所述引物对以及相关常规PCR试剂组装成试剂盒，以方使使用。其中所述相关试剂可以为本发明中所述的特定 PCR反应体系中除了线粒体DNA模板以外的其他试剂，也可以为其他适用的除样品线粒体DNA模板外的试剂，如用于PCR反应的一些常规试剂，或常规试剂的组合物等；此外本发明试剂盒中还包括有实施PCR所需的基本用具。本发明试剂盒盒体可以是由多个隔断所形成，用以容纳固定一个或多个如管或小瓶类的容器（试剂瓶），这些容器中可以分别装有本发明中各物种的引物对，也可以将各物种的引物对按照一定比例混合成引物对混合物后装于其中，根据实际需要各物种的引物对或引物对混合物可以是冻干形式或者溶于前述相关试剂中的状态。
本发明所述试剂盒用于単物种线粒体DNA模板进行狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸和兔的物种鉴定，也用于多物种混合线粒体DNA模板进行狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸和兔的物种鉴定，尤其适用于肉类产品的真伪及掺假判定。
本发明的有益技术效果是:通过使用本发明的由“公共引物”介导的高通量多重PCR引物体系可以一次性检测多达八个动物物种，达到对常见动物物种基本覆盖的目的，并且本发明的引物均仅对各白物种的目标片段进行特异性扩增，不会扩增到其它区域且不会与其他物种起反应，因此也能适用于一次PCR反应中导入两种或两种以上引物对的多重PCR反应，从而能有效的缩短实验时间；此外在进行PCR反应时，使用优化的特定PCR反应体系及反应程序，釆用统一的PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的鉴定方式；本试剂盒具有较高的敏感度、可重复性、操作简单而且成本比较低，适用性广，可用于混合肉制品肉源的筛选和鉴定检测。此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能,其应用前景极好。
附图说明
图1是8种引物对特异性检测电泳图；
图2是8种引物对特异性检测电泳图；
图3是多重体系特异性检测电泳图；
图4是多重体系特异性检测电泳图；
图5是多重体系特异性检测电泳图；
图6是多重体系特异性检测电泳图；
图7是多重体系敏感性检测电泳图；
图8是多重体系敏感性检测电泳图；
图9是多重体系敏感性检测电泳图；
图10是多重体系敏感性检测电泳图。
具体实施方式
各物种特异性引物的设计:
为了实现一次性鉴别出狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔8个物种的目的，本发明设计了公共引物和狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔各物种特异性引物对。本发明的引物对均可通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法进行 DNA合成技术来获得。
各引物如下所述:
（1）对狗的ATPase 6 基因进行扩増生成兔特异性扩増片段( 长度181bp)的引物对 I:
公共引物 : 5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'
正向引物 :5' -TGGCTCTAGCCGTTCGATTA-3'
特异性反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCAAGGCAACAGCAAATTCTAGG-3' ;
（2）对鸡cytb基因进行扩增生成鸡特异性扩增片段( 长度239bp)的引物对II:
公共引物 : 5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
特异性反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3' ;
(3)对牛cytb基因进行扩増生成鸭特异性扩増片段( 长度287bp)的引物对m:
公共引物 : 5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
特异性反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAAT-3' ;
(4)对猪 cytb基因进行扩增生成鹅特异性扩增片段( 长度412bp)的引物对IV:
公共引物 : 5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
特异性反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCTGATAGTAGATTTGTGATGACCG-3' ;
(5) 对马 Cytb基因进行扩増生成牛特异性扩増片段( 长度451bp)的引物对 V :
公共引物 : 5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
特异性反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATTCACTCGACGAGGGT-3' ;
(6)对驴 cytb基因进行扩增生成山羊特异性扩增片段( 长度510bp)的引物对VI:
公共引物 : 5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'
正向引物 :5 ' -CTCTTCCCCAGTTAATGTAGCTT-3 '
特异性反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTATCGTGTGGTCAGAGATATT-3' ;
(7)对狐狸16S rRNA基因进行扩増生成驴特异性扩増片段( 长度570bp)的引物对VII:
公共引物 : 5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'
正向引物 :5' -AACTTAGACCGAACCATATTGCATC-3'
特异性反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGGGTTTGAAGTTCATAAGTTTGG-3' ;
(8)对兔cytb基因进行扩增生成马特异性扩增片段( 长度678bp)的引物VIII:
公共引物 : 5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
特异性反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGAGGAGAAGAATGGCTACAAGGAA -3' ;
各物种组织线粒体DNA的提取
（1） 采集狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔样品1g，于-20℃下保存备用；
（2） DNA 模板制备
DNA 模板制备分别用柱式动物线粒体DNA提取试剂盒PCR级（北京百奥莱博）或者公认的、具有相同效力的其他提取方法；纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2 .0之间，浓度稀释为20ng/μL。
单引物对PCR反应体系见表1；多重引物对PCR反应体系见表2，PCR反应程序见表3；Taq masterMix 购自Thermo Fisher Scientific 公司。
表1 单引物对PCR反应体系
表2 多重PCR反应体系
表3 PCR反应程序
多重 PCR体系中引物配制，引物的终浓度分别为公共引物是0.083μM，狗正向引物是0.067μM，驴的正向引物是0.033μM，狐狸的正向引物是0.099μM；鸡，牛，猪，马，兔的正向引物是0.05μM；狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔的特异性反向引物终浓度分别为： 0.067μM、0.00132μM、0.0165μM、0.00132μM、0.033μM、0.033μM、0.067μM、0.033μM。
对PCR 扩增产物进行检测和结果判定
PCR扩增反应结束后，将扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。结果判定方法是：当PCR 反应产物与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中检测出一种或多种源性成分；当PCR 反应无扩增产物或产物与阳性对照扩增产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出成分；如果阳性样品未检测预期片段，说明试剂失效或操作失误；若空白对照与阳性样品均检出，说明试剂污染或操作失误。
实施例一 狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔引物对的特异性检测
（1）单引物单模板方法
在PCR 反应管中依次加入反应试剂( 如表1 所示)，引物分别为狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔引物对，及其相应的模板。进行PCR 反应，程序为表3；反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图1为特异性检测结果，其中第1泳道空白对照，第2泳道到第9泳道分别是狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔，目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
（2） 单引物多模板
在PCR 反应管中依次加入反应试剂( 如表1 所示)，引物分别为狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔的引物对，模板为混合模板（狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔模板分别按1：1混合）；进行PCR 反应，程序为表3；反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图2为特异性检测结果，其中第1泳道空白对照，第2泳道到第9泳道分别是狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔.目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
实施例二 多重PCR体系的特异性检测
（1）多引物单模板的方法：反应体系如表2，反应程序如表3.反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图3为检测结果其中第1泳道空白对照，第2泳道到第9泳道分别是狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔，目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
（2） 多引物二模板的方法：反应体系如表2，反应程序如表3，.反应结束后取出PCR管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图4为检测结果，其中第0泳道空白对照，第1泳道到第7泳道分别是狗和鸡、狗和牛、狗和猪、狗和马、狗和驴、狗和狐狸，狗和兔。第8泳道到第13泳道分别是鸡和牛、鸡和猪、鸡和马、鸡和驴、鸡和狐狸，鸡和兔。第14泳道到第18泳道分别是牛和猪、牛和马、牛和驴、牛和狐狸，牛鸡和兔。第19泳道到第22泳道分别是猪和马、猪和驴、猪和狐狸，猪和兔。图5也为检测结果，其中第0泳道空白对照，第1泳道到第6泳道分别是马和驴、马和狐狸，马和兔，驴和狐狸，驴和兔，狐狸和兔。2条目的条带清晰明亮，结果表明本发明的引物具有高特异性。（3） 多引物八模板的方法：反应体系如表2，反应程序如表3，.反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。图6为检测结果，其中第0泳道空白对照，第1泳道到第4泳道的8条条带是狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔。每个泳道8条目的条带清晰明亮，均未出现杂带，结果表明本发明的引物具有高特异性。
实施例三多重体系的敏感性检测
体系敏感性检测采用多引物单模板的方法，将试剂盒内引物按比例混合。反应体系如表2，反应程序如表3. 反应结束后取出PCR 管，对PCR 反应产物进行电泳检测。体系敏感性的检测结果，图7分别是狗和鸡两个模板浓度在2ng/ul, 0.5ng/ul, 0.25ng/ul, 0.1ng/ul, 0.05ng/ul模板浓度下多引物单模板的电泳图，图8分别是牛和猪两个模板浓度在2ng/ul, 0.5ng/ul, 0.25ng/ul, 0.1ng/ul, 0.05ng/ul 模板浓度下多引物单模板的电泳图；图9分别是马和驴两个模板浓度在2ng/ul, 0.5ng/ul, 0.25ng/ul, 0.1ng/ul, 0.05ng/ul模板浓度下多引物单模板的电泳图；图10左图和右图分别是狐狸和兔子两个模板浓度在2ng/ul, 0.5ng/ul, 0.25ng/ul, 0.1ng/ul, 0.05ng/ul 模板浓度下多引物单模板的电泳图，第1泳道空白对照，第2泳道到第5泳道这 4个泳道均能跑出清晰可辨目的条带；鸡，牛，驴，狐狸，兔检测敏感性达到0.1ng/ul模板浓度，狗，猪，马检测敏感性甚至达到0.05ng/ul模板浓度。0.1ng/ul 的模板浓度都有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。
本发明以自主研发的基于“公共引物”介导的多重PCR分子检测技术为基础，针对引物间的相互作用和检测通量低，多重PCR发展和应用的主要技术瓶颈，建立系统的、由“公共引物”介导的高通量多重PCR技术体系，同时，以狗、鸡、牛、猪、马、驴、狐狸、兔这八种肉源作为检测靶标，研发能在一个反应管内一次检出这8种肉源的多重PCR检测试剂盒，特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性以及高特异性。
序列表
<110> 苏州大学张家港工业技术研究院
苏州大学
<120> 一种用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccttccttcc ttcccccc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggctctagc cgttcgatta 20
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttccttcc ttccccccaa ggcaacagca aattctagg 39
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacctcccag ctccatcaaa catctcatct tgatgaaa 38
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccttccttcc ttccccccca gatgaagaag aatgaggcg 39
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacctcccag ctccatcaaa catctcatct tgatgaaa 38
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccttccttcc ttccccccct agaaaagtgt aagacccgta at 42
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacctcccag ctccatcaaa catctcatct tgatgaaa 38
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccttccttcc ttcccccctg atagtagatt tgtgatgacc g 41
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacctcccag ctccatcaaa catctcatct tgatgaaa 38
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccttccttcc ttccccccca gattcactcg acgagggt 38
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcttcccca gttaatgtag ctt 23
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccttccttcc ttccccccct atcgtgtggt cagagatatt 40
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacttagacc gaaccatatt gcatc 25
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccttccttcc ttccccccgg ggtttgaagt tcataagttt gg 42
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gacctcccag ctccatcaaa catctcatct tgatgaaa 38
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccttccttcc ttccccccga ggagaagaat ggctacaagg aa 42
Claims (10)
1.一种用于快速检测肉源食品的PCR检测用引物，包括公共引物，还包括狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对中的一种或几种，其特征在于：
所述公共引物为5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'；
所述狗特异性引物对为：
正向引物 :5' -TGGCTCTAGCCGTTCGATTA-3'
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCAAGGCAACAGCAAATTCTAGG-3' ;
所述鸡特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3' ;
所述牛特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAAT-3' ;
所述猪特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCTGATAGTAGATTTGTGATGACCG-3' ;
所述马特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATTCACTCGACGAGGGT-3' ;
所述驴特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -CTCTTCCCCAGTTAATGTAGCTT-3 '
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTATCGTGTGGTCAGAGATATT-3' ;
所述狐狸特异性引物对为：
正向引物 :5' -AACTTAGACCGAACCATATTGCATC-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGGGTTTGAAGTTCATAAGTTTGG-3' ;
所述兔特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGAGGAGAAGAATGGCTACAAGGAA -3'。
2.引物对，所述引物对包括狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对中的一种或几种，其特征在于：
所述狗特异性引物对为：
正向引物 :5' -TGGCTCTAGCCGTTCGATTA-3'
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCAAGGCAACAGCAAATTCTAGG-3' ;
所述鸡特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3' ;
所述牛特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAAT-3' ;
所述猪特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCTGATAGTAGATTTGTGATGACCG-3' ;
所述马特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATTCACTCGACGAGGGT-3' ;
所述驴特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -CTCTTCCCCAGTTAATGTAGCTT-3 '
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTATCGTGTGGTCAGAGATATT-3' ;
所述狐狸特异性引物对为：
正向引物 :5' -AACTTAGACCGAACCATATTGCATC-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGGGTTTGAAGTTCATAAGTTTGG-3' ;
所述兔特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGAGGAGAAGAATGGCTACAAGGAA -3'。
3.用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒，包括公共引物，还包括狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对中的一种或几种，其特征在于：
所述公共引物为5'-CCTTCCTTCCTTCCCCCC-3'；
所述狗特异性引物对为：
正向引物 :5' -TGGCTCTAGCCGTTCGATTA-3'
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCAAGGCAACAGCAAATTCTAGG-3' ;
所述鸡特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3' ;
所述牛特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAAT-3' ;
所述猪特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCTGATAGTAGATTTGTGATGACCG-3' ;
所述马特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3 '
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCAGATTCACTCGACGAGGGT-3' ;
所述驴特异性引物对为：
正向引物 :5 ' -CTCTTCCCCAGTTAATGTAGCTT-3 '
反向引物 :5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCCTATCGTGTGGTCAGAGATATT-3' ;
所述狐狸特异性引物对为：
正向引物 :5' -AACTTAGACCGAACCATATTGCATC-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGGGGTTTGAAGTTCATAAGTTTGG-3' ;
所述兔特异性引物对为：
正向引物 :5' -GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'
反向引物:5' -CCTTCCTTCCTTCCCCCCGAGGAGAAGAATGGCTACAAGGAA -3'。
4.根据权利要求3所述用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：Taq 聚合酶、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、去离子水、阳性对照引物对、Taq DNA MasterMix、阳性对照DNA 模板。
5.权利要求1所述用于快速检测肉源食品的多重PCR检测用引物或者权利要求2所述引物对在检测肉源食品中狗成分、鸡成分、牛成分、猪成分、马成分、驴成分、狐狸成分、兔成分中的一种或几种中的应用。
6.检测肉源食品中肉源性成分的方法，包括以下步骤：
提取样品线粒体基因组DNA作为模板；然后在公共引物存在下，利用狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对中的一种或多种与模板进行PCR反应；最后对PCR反应的产物进行分析完成肉源食品中肉源性成分的检测。
7.根据权利要求6所述检测肉源食品中肉源性成分的方法，其特征在于，PCR反应的程序为:95℃下预变性5min、95℃变性30s、先70℃退火10s、再61℃退火30s、72℃延伸30s，进行10次循环；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、72℃下延伸10min，进行24次循环，最后保持在4℃结束。
8.根据权利要求6所述检测肉源食品中肉源性成分的方法，其特征在于，所述PCR反应为25微升体系；所述公共引物的终浓度为0.083μM；当采用狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对同时与模板进行PCR反应时，引物的终浓度分别为：狗正向引物是0.067μM，驴正向引物是0.033μM，狐狸正向引物是0.099μM；鸡正向引物、牛正向引物、猪正向引物、马正向引物、兔正向引物都是0.05μM；狗反向引物、鸡反向引物、牛反向引物、猪反向引物、马反向引物、驴反向引物、狐狸反向引物、兔反向引物终浓度分别为0.067μM、0.00132μM、0.0165μM、0.00132μM、0.033μM、0.033μM、0.067μM、0.033μM。
9.权利要求3所述用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒在检测肉源食品中狗成分、鸡成分、牛成分、猪成分、马成分、驴成分、狐狸成分、兔成分中的一种或几种中的应用。
10.用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤，将装有公共引物的试剂瓶、分别装有狗特异性引物对、鸡特异性引物对、牛特异性引物对、猪特异性引物对、马特异性引物对、驴特异性引物对、狐狸特异性引物对、兔特异性引物对的试剂瓶、装有常规PCR试剂的试剂瓶置入盒体中，得到用于快速检测肉源食品的多重PCR检测试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810482987.3A CN108411001A (zh) | 2018-05-18 | 2018-05-18 | 一种用于快速检测肉源食品的多重pcr检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810482987.3A CN108411001A (zh) | 2018-05-18 | 2018-05-18 | 一种用于快速检测肉源食品的多重pcr检测试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108411001A true CN108411001A (zh) | 2018-08-17 |
Family
ID=63140101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810482987.3A Pending CN108411001A (zh) | 2018-05-18 | 2018-05-18 | 一种用于快速检测肉源食品的多重pcr检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108411001A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110029172A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-07-19 | 华中农业大学 | 马、驴源性成分二重pcr检测试剂盒 |
| CN111334585A (zh) * | 2019-10-08 | 2020-06-26 | 齐鲁工业大学 | 同时检测8种动物成分的引物、试剂盒及检测方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105296647A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-02-03 | 华中农业大学 | 羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒 |
| CN107245518A (zh) * | 2017-04-07 | 2017-10-13 | 北京市食品安全监控和风险评估中心 | 一种同时检测26种动物源性成分的基因微流体芯片及其应用 |
-
2018
- 2018-05-18 CN CN201810482987.3A patent/CN108411001A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105296647A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-02-03 | 华中农业大学 | 羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒 |
| CN107245518A (zh) * | 2017-04-07 | 2017-10-13 | 北京市食品安全监控和风险评估中心 | 一种同时检测26种动物源性成分的基因微流体芯片及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| UMMI KALTHUM HANAPI等: "A higher sensitivity and efficiency of common primer multiplex PCR assay in identification of meat origin using NADH dehydrogenase subunit 4 gene", 《J FOOD SCI TECHNOL》 * |
| WEIBIN BAI等: "A novel common primer multiplex PCR (CP-M-PCR) method for the simultaneous detection of meat species", 《FOOD CONTROL》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110029172A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-07-19 | 华中农业大学 | 马、驴源性成分二重pcr检测试剂盒 |
| CN110029172B (zh) * | 2018-12-28 | 2021-07-09 | 华中农业大学 | 马、驴源性成分二重pcr检测试剂盒 |
| CN111334585A (zh) * | 2019-10-08 | 2020-06-26 | 齐鲁工业大学 | 同时检测8种动物成分的引物、试剂盒及检测方法和应用 |
| CN111334585B (zh) * | 2019-10-08 | 2022-06-28 | 齐鲁工业大学 | 同时检测8种动物成分的引物、试剂盒及检测方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105177150B (zh) | 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法 | |
| CN105734160A (zh) | 畜禽肉猪牛羊源性成分pcr鉴定用引物体系及pcr鉴定方法与试剂盒 | |
| CN109609695A (zh) | 检测猪流行性腹泻病毒的rpa-led可视化试剂盒 | |
| CN107012229A (zh) | 食品中猪源性成分快速检测方法及试剂盒 | |
| CN108588277A (zh) | 一种犬瘟热病毒可视化核酸检测方法 | |
| CN106148502A (zh) | 一种直接检测食源致病菌的高通量方法 | |
| CN108411001A (zh) | 一种用于快速检测肉源食品的多重pcr检测试剂盒 | |
| CN102864226A (zh) | 快速检测金黄色葡萄球菌的lamp试剂盒 | |
| CN104263838A (zh) | 单增李斯特菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN104263839A (zh) | 布鲁氏杆菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法 | |
| Zhang et al. | Identification for meat adulteration (pork, beef, sheep and duck) in foodstuff by microfluidic chip-based real-time fluorescent LAMP | |
| CN104789692B (zh) | 一种鉴别牛羊猪源性成分的引物组及试剂盒 | |
| CN104962650B (zh) | 一种同步鉴别动物源性成分的pcr方法及试剂盒 | |
| CN105256013B (zh) | 一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴pcr引物体系及检测方法 | |
| CN106086209A (zh) | 一种快速鉴定鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的pcr检测试剂盒 | |
| CN106244690A (zh) | 一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重pcr检测试剂盒 | |
| CN109852705A (zh) | 一种食品中马源成分快速检测方法及试剂盒 | |
| CN110055339A (zh) | 一种食品中鸭源成分快速检测试剂盒及其应用 | |
| CN106191279B (zh) | 一种鉴别羊肉中掺杂鸭肉的方法 | |
| CN108251534A (zh) | 一种快速检测肉源食品用多重pcr检测试剂盒 | |
| CN113755618A (zh) | 一种高灵敏度检测动物布鲁氏菌病的方法 | |
| Wang et al. | Label-free cross-priming amplification coupled with endonuclease restriction and nanoparticles-based biosensor for simultaneous detection of nucleic acids and prevention of carryover contamination | |
| CN105803086A (zh) | 一种阿胶胶液半成品或成品中驴、猪源性成分的定量检测方法、组合物及试剂盒 | |
| CN110055336A (zh) | 一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒 | |
| CN109825613A (zh) | 一种食品中鸭源成分快速检测方法及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |