CN113215273A - 肉类品种鉴定相关的miRNA特异性标志物及其应用 - Google Patents

肉类品种鉴定相关的miRNA特异性标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了肉类品种鉴定相关的miRNA特异性标志物，涉及生物技术领域。所述miRNA特异性标志物的序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示。本发明筛选得到了由种属特异性DNA转录来的种属特异性miRNA，将其作为肉类鉴别标志物，可以实现肉类品种或肉类掺假的现场快速检测。

Description

肉类品种鉴定相关的miRNA特异性标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及肉类品种鉴定相关的miRNA特异性标志物及其应用。
背景技术
食品掺假(特别是肉类掺假)已经成为当前国内外食品安全领域的重点问题之一。特别地，羊肉串掺假的现象屡见不鲜，街边摊贩羊肉串掺假尤为严重，这其中用鸭肉冒充羊肉是目前羊肉串掺假的主要手段。肉类掺假不仅损害了消费者的权益，还有可能因为消费者对掺假肉过敏造成潜在的健康威胁。因此亟需开展对市场羊肉类食品的执法监管和掺假鉴别。
现有肉类掺假鉴别技术主要是以蛋白多肽为基础的质谱分析技术和DNA扩增为基础的核酸扩增技术。前者需要在专业实验室分析，一般需要2-3天出结果。后者虽然时间大为缩短，但仍需要几个小时的时间。对于羊肉卷、羊肉串等具有鲜活或短时间变质的食品，从市场主动执法检查角度考虑，需要在当场30分钟甚至更短的时间内给出检测结果，只有这样才不会影响真实食品的正常经营。因此，目前上述两项技术都不符合市场主动监管的需求。目前的监管处于被动监管的局面，也即出现举报才进行执法检查，缺乏主动监管的技术手段。
有关羊肉掺假检测方面的发明专利，主要涉及基于理化分析的核磁共振波谱法(CN202010053345.9)、气相离子迁移色谱法(CN201910082642.3)、近红外光谱鉴别法(CN201510549243.5)和基于分子生物学分析的普通PCR法(CN201610596514.7，CN201310576876.6，CN201010237540.3)、高分辨率熔解曲线法(CN201510309901.3)、逆转录-实时荧光PCR法(CN201410592070.0)、多重PCR法(CN201310123666.1)以及限制性片段长度多态性聚合酶链反应方法(CN201010226683.4)。
基于色谱和质谱的理化鉴定技术分辨率高，灵敏度高，且鉴定结果重现性好。但上述技术主要是依据羊物种中的特异性化合物进行样品真实属性的表征，而各类化学成分易受生命体生存环境和捕捞季节等因素影响，造成鉴定结果的不准确性。此外，加工制品的各类化合物的结构和化学组成会有一定程度的改变，各类食品添加剂的加入也会进一步影响各类化学组分的分离纯化和鉴定。基于DNA的分子生物学技术在灵敏度、准确性和特异性方面具有较大优势。但目前现有发明中涉及的相关方法均相对耗时较长，且检测成本较高。在有关羊肉产品的快速检测领域，目前仅检索到一篇关于应用荧光法试纸条快速鉴别羊肉掺假方法的发明专利(CN201810533879.4)，该专利以DNA为靶标设计羊物种特异性引物，实现了羊肉产品的快速检测，且检测成本低。但该方法在检测前需预先对靶标基因进行等温扩增，操作相对繁琐，且扩增后易造成气溶胶污染而产生假阳性结果。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供肉类品种鉴定相关的miRNA特异性标志物及其应用。现有技术中，标志物蛋白多肽等加热容易变性，DNA不经过扩增无法通过试纸条等方法直接检测，而其他标志物如mRNA片段较长且易降解，小分子代谢物等不具有种属特异性。本发明筛选得到了由种属特异性DNA转录来的种属特异性miRNA，将其作为肉类鉴别标志物，可以实现肉类品种或肉类掺假的现场快速检测。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了一种肉类品种鉴定相关的miRNA特异性标志物，所述miRNA特异性标志物的序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示。
本发明首次提出以种属特异性DNA转录来的miRNA作为标志物进行肉类食物品种的鉴定。SEQ ID No.1所示序列为羊肉种属特异性miRNA。SEQ ID No.2所示序列为鸭肉种属特异性miRNA。
在另一方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂为用于检测前述miRNA特异性标志物的存在的试剂。
在另一个方面，本发明提供了所述miRNA特异性标志物或所述检测试剂在肉类掺假鉴别中的应用。
本发明提供了所述miRNA特异性标志物或所述检测试剂在制备鉴定肉类品种的产品中的应用。
在一个实施方案中，本发明提供了所述羊肉种属特异性miRNA和鸭肉种属特异性miRNA的组合在在肉类掺假鉴别中的应用以及在肉类品种鉴定中的应用。
在一个实施方案中，所述产品包括通过使用miRNA检测技术来检测所述miRNA特异性标志物以鉴定肉类品种的产品；所述miRNA检测技术包括PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、酶联免疫、侧流层析、基因芯片或测序。
基于本发明提供的miRNA分子标记物而制备的产品或工具，例如试剂盒、试纸条、芯片等具有高特异性和灵敏度。例如生物芯片、酶联免疫分析试剂盒、试纸条或其他类似的检测工具。
在一个实施方案中，所述肉类品种包括羊肉和/或鸭肉；优选地，所述羊肉为生羊肉样品和/或熟羊肉样品；所述鸭肉为生鸭肉样品和/或熟鸭肉样品。
在一个实施方案中，所述应用为采用酶联免疫分析进行检测。
在一个实施方案中，提取不同肉类及其熟食制品的miRNAs，将所述miRNA与DNA形成杂交复合物，然后加入已经包被有S9.6抗体的酶标板，洗涤后再加入HRP标记的S9.6抗体进行酶联免疫分析，洗涤后再加入酶反应底物，并利用酶标仪测定吸光度。
在一个实施方案中，提取不同肉类及其熟食制品的miRNAs，加入到已经固定好设计的单链DNA的酶联板中，形成DNA-miRNA杂交复合物，洗涤后再加入HRP标记的S9.6抗体进行酶联免疫分析，洗涤后再加入酶反应底物，通过酶标仪进行结果检测分析。
在一个实施方案中，以肉类miRNA作为标志物，利用特异性识别DNA-miRNA复合物的S9.6抗体，进行羊肉、鸭肉的侧流层析现场快速鉴定。
有益效果：
本发明首次提出以具有种属特异性DNA转录来的miRNA作为标志物，所述miRNA是经大量的实验筛选或得，可以进行羊肉、鸭肉的侧流层析现场快速鉴定，突破目前食品物种掺假缺乏现场快速鉴别技术的瓶颈，为食品真实性鉴别提供新的方法。
本发明筛选得到的miRNA不仅特异性好，而且稳定存在，不易降解，使得其更加方便地用于肉类产品的快速检测，为肉类品种鉴定和掺假检测提供了新的方向。本发明提供的miRNA标志物具有重要的应用价值。
本发明筛选得到的miRNA可以实现灵敏地检测对应的肉类品种，检测限可低至1ng。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为侧流层析核酸试纸条方法检测原理示意图；
图2为侧流层析核酸试纸条检测羊肉的miRNA灵敏度的相关性分析；
图3为侧流层析核酸试纸条检测鸭肉的特异性(其中1：鸭，2：羊，3：鸡，4：猪，5：鲤鱼，6：平菇，7：NTC)；
图4为侧流层析核酸试纸条检测鸭肉的稳定性(其中，1：生鲜鸭肉，2：自制水煮鸭肉，3：自制烤制鸭肉，4：鸭肉罐头，5：鸭肉松，6：鸭肉干，7：NTC)；
图5为侧流层析核酸试纸条检测鸭肉的miRNA灵敏度分析(1：10μg；2：1μg；3：0.1μg；4：0.01μg；5：1ng；6：0.1ng；7：NTC)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.1高丰度、稳定且种属特异的羊肉miRNA筛选
采集我国常见品种的羊肉样品以及烤熟的羊肉制品，利用深度Small RNA测序技术，研究不同样品miRNA表达谱。
筛选在生鲜熟制以及不同部位等的不同样品中均持续高丰度表达的miRNA序列。同时利用生物信息学等手段，在miRBase、miRecords、CoGeMiR、TargetScan等miRNA数据库中进行比对分析，并利用Blast等软件进行种属特异性确认，最终筛选出羊肉高丰度稳定性且种属特异性miRNA序列：5’-CACAAGUUAGGGUCUCAGGGA-3’(SEQ ID No.1)。
1.2 S9.6抗体-DNA-miRNA酶联免疫分析验证
提取不同肉类及其熟食制品的miRNAs，加入设计的互补单链DNA，形成DNA-miRNA杂交复合物，然后加入已经包被有S9.6抗体的酶标板，洗涤后再加入HRP标记的S9.6抗体进行酶联免疫分析，洗涤后再加入酶反应底物，并利用酶标仪测定吸光度，研究不同miRNA-DNA杂交复合物对检测灵敏度、稳定性的影响，筛选高灵敏度且稳定性好的miRNA。
1.3侧流层析检测方法
向提取的miRNA中加入单链DNA，孵育形成复合物后，加入到样品垫上，在层析作用下与结合垫上的荧光素标记S9.6抗体结合进一步形成S9.6-DNA-miRNA复合物，再在层析作用下继续上行，与T线处包被的S9.6抗体形成标记S9.6-DNA-miRNA-捕获S9.6抗体双夹心复合物，出现荧光信号，剩余荧光素标记的S9.6抗体继续层析到试纸条C线处被抗小鼠IgG抗体捕获出现荧光信号(图1)。通过荧光读数仪读取T线和C线荧光信号值进行计算结果。
实施例2
2.1高丰度、稳定且种属特异的鸭肉miRNA筛选
采集我国常见品种的鸭肉样品以及烤熟的鸭肉制品，利用深度Small RNA测序技术，研究不同样品miRNA表达谱。筛选在不同样品中均持续高丰度表达的miRNA序列。同时利用生物信息学等手段，在miRBase、miRecords、CoGeMiR、TargetScan等miRNA数据库中进行比对分析，并利用Blast等软件进行种属特异性确认，最终筛选出鸭肉高丰度稳定性且种属特异性miRNA序列(5’-UUCUCUAGUGUAGUGGUUAUCACGUUC-3’)(SEQ ID No.2)。
2.2 S9.6抗体-DNA-miRNA酶联免疫分析验证
提取不同肉类及其熟食制品的miRNAs，加入到已经固定好设计的单链DNA的酶联板中，形成DNA-miRNA杂交复合物，洗涤后再加入HRP标记的S9.6抗体进行酶联免疫分析，洗涤后再加入酶反应底物，通过酶标仪进行结果检测分析。研究不同miRNA-DNA杂交复合物对检测灵敏度、稳定性的影响，筛选高灵敏度且稳定性好的miRNA。
2.3侧流层析检测方法
向提取的miRNA中加入单链DNA，孵育形成复合物后，加入到样品垫上，在层析作用下与结合垫上的胶体金标记S9.6抗体结合进一步形成S9.6-DNA-miRNA复合物，再在层析作用下继续上行，与T线处包被的S9.6抗体形成标记S9.6-DNA-miRNA-捕获S9.6抗体双夹心方式复合物，出现红色条带，剩余胶体金标记的S9.6抗体继续层析到试纸条C线处被抗小鼠IgG抗体捕获出现红色条带。然后直接通过肉眼观察检测线T线颜色变化判断结果。
实验结果：
1.羊肉miRNA特异性验证
通过跨物种实验验证所筛选的羊miRNA的特异性。选择猪、鸭、鸡、鱼以及蘑菇、豆制品等常见烧烤以及潜在沾染的产品，用本发明建立的侧流层析核酸试纸条法进行检测，通过荧光扫描仪扫描荧光信号。
结果显示，对于羊的miRNA，只对目标物种在检测线具有荧光信号，对其余阴性和空白对照样品只在质控线处具有荧光信号，miRNA特异性良好(表1)。
表1.侧流层析核酸试纸条检测羊肉的特异性
检测样品 检测区的荧光信号中位值(A) 质控区的荧光信号中位值(B)
羊肉 18925.3 15332.4
鸭肉 1990.2 12048.6
鸡肉 1984.2 15918.6
猪肉 1997.9 13852.2
鲤鱼 2012.3 15445.4
平菇 2002.1 15372.4
NTC 1999.1 15351.6
NTC:阴性对照。
2.加工食品中羊肉miRNA稳定性验证
生鲜羊肉及制品在以整块肉的形式出售，保留有原始形态的情况下，通常掺假行为较少。羊肉深加工制品，如烤羊肉串、羊肉干、羊肉罐头等，这些制品经过各种加工过程，已丧失其原有形态，在经济利益的驱动下，存在以次充好、以假乱真等掺杂掺假现象。
为保证本发明方法在加工食品中同样受用，对miRNA的稳定性进行了评估。分别在自制的水煮和油炸羊肉，以及市售的羊肉干、烤羊肉串和羊肉罐头中进行羊肉miRNA稳定性验证。结果显示，所有羊肉加工制品的miRNA在检测线和质控线均有荧光信号检出，而空白对照只在质控线检出荧光信号，表明筛选的miRNA具有足够的稳定性，可用于市售制品的检测中(表2)。
表2.侧流层析核酸试纸条检测羊肉的稳定性
检测样品 检测区的荧光信号中位值(A) 质控区的荧光信号中位值(B)
生鲜羊肉 19123.4 15547.4
自制水煮羊肉 14235.4 12384.7
自制油炸羊肉 12462.1 14273.4
羊肉干 14562.6 15337.5
烤羊肉串 13642.6 15437.3
羊肉罐头 12373.8 15527.3
NTC 2087.2 15447.4
NTC:阴性对照。
3.羊肉miRNA灵敏度分析
为评估侧流层析核酸试纸条方法的检测限，对提取的羊肉miRNA分别从10μg至0.1ng进行10倍系列稀释。如表3和图2所示，随着羊肉miRNA浓度的降低，检测线荧光信号值逐渐下降，最后0.1ng的miRNA荧光信号值接近空白对照，说明该方法能够检测到低至1ng的miRNA，计算回归方程为：y＝1785.3x+13472，R2＝0.9715。
表3.侧流层析核酸试纸条检测羊肉的miRNA灵敏度分析
Figure BDA0003058013800000091
NTC:阴性对照。
4.鸭肉miRNA特异性
通过跨物种实验验证所筛选的miRNA的特异性。选择羊、猪、鸡、鱼以及蘑菇、豆制品等常见烧烤以及潜在沾染的产品，用本发明建立的侧流层析核酸试纸条法进行检测。结果显示，只有鸭物种的miRNA在检测线显示红色，表明结果为阳性；其余物种均只在质控线处显示红色，检测限保持原样不变，miRNA特异性良好(图3)。
5.鸭肉miRNA稳定性
生鲜羊肉及制品以整块肉的形式出售，保留有原始形态，通常掺假行为较少。羊肉深加工制品，如烤羊肉串、羊肉干、羊肉罐头等，这些制品经过各种加工过程，已丧失其原有形态，在经济利益的驱动下，存在以次充好、以假乱真等掺杂掺假现象。为保证对掺假羊肉制品中鸭肉的检出，同时模拟了水煮和烤制鸭肉，以及对市售鸭肉罐头、鸭肉松和鸭肉干进行鸭肉miRNA稳定性验证。结果显示，所有鸭肉加工制品的miRNA均产生两条清晰的红色条带，而空白对照只有质控线的一条红色条带，表明筛选的miRNA具有足够的稳定性，可用于市售制品的检测中(图4)。
6.鸭肉miRNA灵敏度
为评估侧流层析核酸试纸条方法的检测限，对提取的鸭肉miRNA分别从10μg至0.1ng进行10倍系列稀释。如图5所示，随着鸭肉miRNA浓度的降低，检测线红色条带颜色逐渐变浅，最后0.1ng的miRNA检测线颜色模糊不清，接近空白对照，说明该方法能够检测到低至1ng的miRNA。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> 肉类品种鉴定相关的miRNA特异性标志物及其应用
<130> PA21009043
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 羊肉特异性miRNA
<400> 1
cacaaguuag ggucucaggg a 21
<210> 2
<211> 27
<212> RNA
<213> 鸭肉特异性miRNA
<400> 2
uucucuagug uagugguuau cacguuc 27

Claims (10)

1.肉类品种鉴定相关的miRNA特异性标志物，其特征在于，所述miRNA特异性标志物的序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的miRNA特异性标志物，其特征在于，SEQ ID No.1所示序列为羊肉种属特异性miRNA。
3.根据权利要求1所述的miRNA特异性标志物，其特征在于，SEQ ID No.2所示序列为鸭肉种属特异性miRNA。
4.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂为用于检测权利要求1-3任一项所述的miRNA特异性标志物存在的试剂。
5.根据权利要求1-3任一项所述的miRNA特异性标志物或权利要求4所述的检测试剂在制备鉴定肉类品种的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过使用miRNA检测技术来检测所述miRNA特异性标志物以鉴定肉类品种的产品；所述miRNA检测技术包括PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、酶联免疫、侧流层析、基因芯片或测序。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试纸条或试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肉类品种包括羊肉和/或鸭肉；优选地，所述羊肉为生羊肉样品和/或熟羊肉样品；所述鸭肉为生鸭肉样品和/或熟鸭肉样品。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为采用酶联免疫分析进行检测。
10.根据权利要求9所述的应用，将所述miRNA与DNA形成杂交复合物，然后加入已经包被有S9.6抗体的酶标板；或者，将所述miRNA加入到已经固定好设计的单链DNA的酶联板中，形成DNA-miRNA杂交复合物；
洗涤后再加入HRP标记的S9.6抗体进行酶联免疫分析，洗涤后再加入酶反应底物，并利用酶标仪测定吸光度。
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