WO2018127386A1 - Nukleinsäurebasierter lateral flow-assay für schnelle fleischspeziesbestimmung - Google Patents

Nukleinsäurebasierter lateral flow-assay für schnelle fleischspeziesbestimmung Download PDF

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WO2018127386A1
WO2018127386A1 PCT/EP2017/083085 EP2017083085W WO2018127386A1 WO 2018127386 A1 WO2018127386 A1 WO 2018127386A1 EP 2017083085 W EP2017083085 W EP 2017083085W WO 2018127386 A1 WO2018127386 A1 WO 2018127386A1
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WO
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nucleic acid
sample
region
acid molecule
strip
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PCT/EP2017/083085
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Lay Kuan TEH
Chi Zhang
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Robert Bosch Gmbh
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid-based lateral flow assay (LFNA) strip for detection of an analyte nucleic acid molecule in a sample, wherein the detection of the analyte is based on the detection of a marker after migration of an analyte-conjugate-marker complex, which is formed in a conjugation region of the strip, and after the immobilization of this complex in a test zone via the binding of the complex to a capture molecule, whereby a detectable signal is generated by the marker.
  • the present invention further relates to the use of such a test strip and a method for detecting an analyte-nucleic acid molecule in a sample.
  • lateral flow assays There are commercially available rapid tests for the end user, all of which are lateral flow assays (LFA).
  • LFA lateral flow assay
  • Bio-Check's FlowThrough TM Rapid Test Strip has a different design. Instead of submerging the test strip in the sample solution, users must pour the sample solution onto the test strip. It is only used for raw meat.
  • the differences of the above-mentioned LFA are mainly in their analytes.
  • the analytes are different proteins derived from swine.
  • a solution for storing the conjugate is provided, and when the analyte is present, binds to the conjugate in the solution.
  • the background of this design could be that the binding of the analyte to the conjugate in a solution is more thorough than on a solid surface and the sensitivity of the assay is increased to some extent.
  • proteins are used as analytes.
  • they are susceptible to denaturation under heat and pressure. Therefore, when testing cooked foods, the sensitivity of the test is significantly impaired.
  • the disadvantages associated with proteins have a direct impact on the results of the immuno-LFA.
  • Nucleic acid lateral flow tests are relatively new and on the rise.
  • the analyte in LFNA is a nucleic acid that is more robust than proteins.
  • Nucleic acids are of central importance for the molecular diagnosis of various diseases, such as genetic and infectious diseases, for drug discovery, biological protection (biodefense), forensics and many other applications (Landegren, U. et al., Science, 1988, 242, 229 -237). So far, molecular diagnostics are highly dependent on polymerase chain reaction (PCR) and microarray technology. Both are tedious, expensive and require trained professionals to carry out. There has been a constant search for a tool for an accurate, inexpensive, and easy-to-use molecular rapid detection method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LFNA LFNA are good candidates for meeting these requirements.
  • Wang et al. reported an LFNA to detect more than 97% hepatitis C virus core antigen Accuracy (Wang, C. et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2013, 32, 59-68).
  • LFNA has been used for the pathogen and microbial detection for food safety testing after amplification of samples by PCR (Blazkova, M. et al., Eur. Food Res. Technol., 2009, 229, 867-874).
  • DNA as analyte is very stable, robust and can withstand heat and pressure. Since both heat and pressure usually come into play during food preparation, DNA detection can even be performed on processed foods.
  • Synthetic DNA oligonucleotides are readily available from all major bioreagent manufacturers, such as Sigma-Aldrich, Thermo Fisher or Integrated DNA Technologies. Usually, the cost of DNA oligonucleotides is significantly lower than that of proteins (more than ten times lower). They therefore do not cause logistical problems.
  • the inventors of the present invention have developed a test strip and method wherein an analyte nucleic acid molecule having a specific nucleotide sequence is recognized by a specifically designed complementary conjugate capture molecule system.
  • the analyte comprises or consists of a DNA sequence which is a fragment of the mitochondrial cytochrome B gene (Cyt B) of porcine consisting of about 30 base pairs (bp).
  • the conjugation and capture oligonucleotides are specifically designed to be complementary to the analyte, enabling detection of pork content in both raw and processed foods.
  • the present invention thus relates to a nucleic acid-based lateral flow assay (LFNA) strip for detection of an analyte-nucleic acid molecule in a sample (100) comprising from the proximal to the distal end of the strip:
  • LFNA nucleic acid-based lateral flow assay
  • conjugation region (2) adhered to the sample contacting region (1) with the distal end of the sample contacting region (1) attached to the proximal end of the conjugation region (2) and the conjugate immobilized on its surface and wherein the conjugate comprises or consists of: (i) a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleotide sequence (204) complementary to a first nucleotide sequence of the analyte (202) and (ii) a detectable label (203) exists, and
  • the test zone (4) has immobilized on its surface a capture molecule (205), wherein the capture molecule (205) comprises or consists of a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleotide sequence complementary to a second nucleotide sequence of the analyte (202);
  • sample (100) is a food sample and the detection of the analyte (202) is on detection of the label (203) in the test zone (4) of the detection region (3) after migration of an analyte conjugate formed in the conjugation region (2) Complex to the detection region (3) and the immobilization of this complex via the binding of the complex to the capture molecule in the test zone (4) based.
  • the present invention relates to the use of the nucleic acid-based lateral flow assay (LFNA) strip as described herein for the detection of an analyte nucleic acid molecule in a sample (100).
  • LFNA nucleic acid-based lateral flow assay
  • the present invention relates to a method of detecting an analyte nucleic acid molecule in a sample (100), wherein the sample (100) is a food sample, the method comprising the steps of:
  • the generation of a signal (207) in the test zone (4) indicates the presence of the analyte nucleic acid molecule in the sample (100) and the absence of a signal (207) in the test zone (4) indicates the absence of the analyte nucleic acid molecule in the sample (100) indicates.
  • Figure 1 shows the structure and the basic operating principle of a nucleic acid lateral flow test strip according to the present invention.
  • FIG. 2 shows the functional principle of a nucleic acid lateral flow assay according to the present invention.
  • the sample contacting region (1) is not shown in this illustration.
  • Figure 3 shows the introduction of a marker enzyme for signal amplification in a nucleic acid lateral flow assay according to the present invention.
  • the sample contacting region is not shown in this illustration.
  • One or more refers to at least one and includes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more of the species mentioned.
  • analyte nucleic acid molecule refers to a nucleic acid molecule containing a polynucleotide sequence of interest whose capture, immobilization and detection are desired.
  • nucleic acid refers to a polynucleotide linkage which includes oligonucleotides comprising nucleosides or nucleoside analogs having nitrogen-containing heterocyclic bases or base analogs covalently linked by standard phosphodiester bonds or other linkages.
  • Nucleic acids include RNA, DNA, chimeric DNA-RNA polymers or analogs thereof.
  • the backbone may consist of a variety of compounds, including one or more sugar phosphodiester linkages, peptide-nucleic acid (PNA) linkages, phosphorothioate linkages, methyl phosphonate linkages, or combinations thereof.
  • PNA peptide-nucleic acid
  • Sugar moieties in a nucleic acid may include ribose, deoxyribose or similar compounds with substitutions, e.g. 2'-methoxy and 2'-halide (e.g., 2'-F) substitutions.
  • Nitrogen-containing bases can include conventional bases (A, G, C, T, U), non-natural nucleotides such as isocytosine and isoguanine, their analogs (eg, inosine, The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al. (eds., 1 1 ed., 1992), derivatives of purine or pyrimidine bases z. B.
  • Nucleic acids may contain "abasic" positions where the backbone does not contain a nitrogenous base at one or more sites, e.g. For example, one or more abasic positions can form a linker region that links separate oligonucleotide sequences.
  • a nucleic acid may comprise only conventional sugars, bases, and linkages found in conventional RNA and DNA, or may include conventional components and substitutions (e.g., conventional bases linked by a 2'-methoxy backbone) Polymer containing a mixture of conventional bases and one or more analogs).
  • LNA locked (fixed) nucleic acids
  • oligonucleotide i.e., a sequence of nucleotides, such as an oligonucleotide primer or a target nucleic acid
  • sequence "5'-A-GTC-3 '" is complementary to the sequence "3'-TCAG-5"
  • Nucleic acids are included; These include, but are not limited to nucleosides, nucleotides and nucleic acids with modified bases and sugars such as inosine, isocytosine and isoguanine.
  • the complementarity does not have to be perfect; stable duplexes may contain mismatched base pairs, degenerate or unpaired nucleotides.
  • One skilled in the art of nucleic acid technology may empirically determine duplex stability considering a number of variables including, for example, the length of the oligonucleotide, base composition and sequence of the oligonucleotide, frequency of unpaired base pairs, ionic strength, other hybridization buffer components and conditions.
  • the complementarity may be partial with only some of the nucleotide bases of two nucleic acid strands mated according to the base pairing rules.
  • the complementarity may be complete or total, with all nucleotide bases of two nucleic acid strands being paired according to the base pairing rules.
  • Complementarity may be absent if none of the nucleotide bases of two nucleic acid strands are paired according to the base pairing rules.
  • the degree of complementarity between nucleic acid strands has a significant impact on the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands.
  • hybridization refers to conventional hybridization conditions, preferably to hybridization conditions, among which the Tm value is between Tm 20 ° C to Tm 70 ° C, more preferably between Tm 25 ° C to 65 ° C is. Most preferably, the term “hybridization” refers to stringent hybridization conditions.
  • sample refers essentially to any sample (100) containing the desired analyte nucleic acid molecule, including foods, cosmetics, pharmaceuticals, bioprocessed materials (finished product and intermediate materials) and the like, but is not limited thereto.
  • the sample (100) is a food sample.
  • the sample (100) is a sample which contains one or more liquid constituents, for example water.
  • a sample (100) containing one or more liquid components is referred to as a liquid sample, although it may not be "liquid" in conventional wisdom.
  • a sample of prepared dish may be a liquid sample, such as a sample of a stew, a soup, and the like.
  • a sample (100) may be liquefied, for example by adding one or more liquids, such as water. Preferably, after the addition of the one or more liquids, the one or more liquids and the sample (100) are thoroughly mixed.
  • the species determination of a food sample can be performed by detection of specific analyte nucleic acid molecules contained in the sample (100).
  • positive detection of specific analyte nucleic acid molecules in a sample is an indication of the presence of biological material derived from a specific animal, e.g. B. from pig comes in the sample.
  • biological material derived from a specific animal e.g. B. from pig comes in the sample.
  • the present invention relates to a nucleic acid-based lateral flow assay (LFNA) strip for the detection of an analyte-nucleic acid molecule in a sample (100).
  • a strip as disclosed herein essentially comprises at least three distinct zones, each serving a specific purpose, and which, in combination, allow rapid and easy detection of specific analyte nucleic acid molecules in a sample (100).
  • LFNA lateral flow assay
  • the first component of the strip is the first component to which a sample (100) to be tested is brought into contact, hence it is referred to as the sample contacting region (1).
  • the sample contacting region (1) may comprise or consist of any type of material which is chemically inert with respect to biological material-containing samples, such as food samples, and which is absorptive, such that thorough and sufficient contact of the strip with the corresponding sample (FIG. 100) and the components that it contains can be ensured.
  • the test strip according to the present invention is preferably for single use in the field, ie everyday use by laymen, it is further preferred that the material of the sample contacting region (1) as well as the other components of the strip according to the present invention are inexpensive and yet functional materials.
  • the material of the sample contacting region (1) is not particularly limited, and may be selected from, for example, various types of paper such as filter paper and chromatography paper.
  • various types of paper such as filter paper and chromatography paper.
  • hydrophilic polymers such as cellulose, agarose, gelatin, caragings, alginates, alginic acid, xanthan gums, guar gums and like polymers and any combination of the above may be enumerated as suitable materials for the sample contacting region (1) of the strip according to the present invention.
  • the sample contacting region (1) comprises or consists of cellulose fibers. The dimension and position of the sample contacting region (1) is limited to a certain area of the strip.
  • the sample contacting region (1) is located at only one end of the strip, as described herein, so that a sample with which the strip is contacted is pulled toward only one end of the test strip.
  • the strip according to the present invention will be described from a proximal end of the strip to a distal end of the strip.
  • the sample contacting region (1) is located at the proximal end of the strip or forms this end.
  • the sample contacting region (1) may be shaped in the form of a pad. After contacting the sample contacting region (1) with a sample, the sample contacting region (1) absorbs the volume of the sample and any soluble sample components contained therein, which then migrate toward and over the other test strip components described below.
  • the test strip according to the present invention further comprises a conjugation region (2).
  • the conjugation region (2) is connected to the sample contacting region (1) such that the distal end of the sample contacting region (1) is attached to the proximal end of the conjugation region (2).
  • the attachment of the above-mentioned components (1, 2) can be carried out by attaching one component partially on the other, so that a joint (21) can be formed.
  • the sample contacting region (1) overlay a portion at the proximal end of the conjugation region (2) to ensure sufficient flow of the liquid sample from the proximal end of the test strip to the distal end of the test strip.
  • connection of the components (1, 2) may be performed by, for example, adhering the distal end of the sample contacting region (1) to the proximal end of the conjugation region (2). you However, care should be taken not to interfere with sample migration across the junction. For example, sample migration could be disturbed due to excessive adhesive overflowing onto the adjacent regions of components (1, 2) of the test strip.
  • the components (1, 2) of the test strip according to the present invention may be mounted on top of a backing / backing component and adhered using an adhesive, for example a pressure sensitive adhesive such that the distal end of the sample contacting region (1) in FIG is in direct close contact with the proximal end of the conjugation region (2). Again, preferably, excessive adhesive should interfere with sample flow across the test strip. As a rule, fluid communication of the sample contacting region (1) and the conjugation region (2) must be ensured.
  • the conjugation region (2) in a proximal portion thereof partially overlaps the sample contacting region (1).
  • the overlapping region is characterized in that the distal end of the sample contacting region overlaps a proximal part of the conjugation region (2), thereby forming a junction (21).
  • the dimension of this overlapping region should be selected so that sufficient transfer of the sample components from the sample contacting region (1) to the conjugation region (2) can be ensured.
  • the conjugation region for contact with the sample contacting region may be in another way, i. H. not by overlapping, be designed.
  • the proximal tip of the conjugation region (2) is adhered to the distal tip of the sample contacting region (2) with the aid of an adhesive.
  • the fixation of both strip components (1, 2) by applying said components on top of a backing component, for. As a Kunststoffläläge with dimensions that are tailored to the dimensions of the test strip components, as described here performed.
  • the conjugation region can be made of any type of material that allows the migration of liquid and soluble ingredients of the sample across the surface of the conjugation region (2).
  • the conjugation region (2) consists of non-absorbent (m / n) material (s).
  • Suitable materials may include, for example and without limitation, polyester or fiberglass mats and the like. Of course, suitable materials may be used alone or in combination.
  • the conjugation region (2) of the strip according to the present invention comprises a conjugate immobilized on its surface.
  • the conjugate comprises or consists of (i) a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleotide sequence (204) complementary to a first nucleotide sequence of the analyte (202), and (ii) a detectable marker (203).
  • the detectable marker (203) is coupled to the conjugate nucleic acid molecule (204).
  • the immobilization of the conjugate on the surface of the conjugation region may be accomplished by applying the conjugate to the surface of the conjugation region, for example by spraying a solution of the conjugate onto the surface of the conjugation region (2) and then evaporating the solvent (s), be performed.
  • the present invention is not limited to particular types of immobilization methods, and any method known in the art can be used to advantage.
  • the conjugation region (2) is wetted.
  • the analyte nucleic acid molecule When the soluble contents of the sample migrate via the joint (21) from the sample contacting region (1) to the conjugation region (2), the conjugation region (2) is wetted.
  • the analyte nucleic acid molecule When the analyte nucleic acid molecule is present among the soluble contents of the sample, the analyte (202) forms a complex with the conjugate nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleotide sequence (204) complementary to a first nucleotide sequence of the analyte (202) the previously immobilized conjugate is remobilized.
  • the analyte-conjugate complex thus formed is entrained along with the flow of liquid sample and is able to reach the next functional portion of the strip according to the present invention.
  • detection region (3) This next functional section is referred to herein as detection region (3).
  • the detection region (3) is attached to the conjugation region (2) such that the distal end of the conjugation region (2) is attached to the proximal end of the detection region (3).
  • the compound of the above-mentioned components (2, 3) can be performed so that a joint (22) can be formed. Suitable methods are those described above with respect to the junction (21) that forms the link between the distal end of the sample contacting region (1) and the proximal end of the conjugation region (2).
  • proximal component in this case the conjugation region (2)
  • the detection region (3) are particularly preferred.
  • liquid communication must be ensured between the conjugation region (2) and the detection region (3).
  • junction structures (21, 22) are shown in Figure 1, wherein the junction (21) is characterized in that a part of the distal end of the sample contacting region (1) overlaps a part of the proximal end of the conjugation region, and wherein the junction ( 22) characterized in that a part of the distal end of the conjugation region (2) overlaps a part of the proximal end of the detection region (3).
  • the detection region (3) partially overlaps at its proximal end the distal end of the conjugation region (2).
  • the dimension of this overlapping region should be chosen so that sufficient transfer of the sample components from the conjugation region (2) to the detection region (3) can be ensured.
  • the detection region (3) may be designed for contact with the conjugation region (2) in another way, ie not by overlapping.
  • the proximal tip of the detection region (3) is attached to the distal tip of the conjugation region (2) by means of an adhesive.
  • the fixation of both strip components (2, 3) is performed by applying said components on top of a backing component, such as a plastic backing, having dimensions that are matched to the dimensions of the test strip components as described herein.
  • the detection region may be made of any type of material that allows the migration of liquid and soluble contents contained in the sample over the surface of the conjugation region (2).
  • the material should allow immobilization of a capture molecule (205) on the surface of the detection region (3).
  • Suitable materials may include, for example and without limitation, cellulose papers, nitrocellulose membranes, polyvinylidene fluoride, charge-modified nylon, polyethersulfone, porous polyethylene plates, glass fiber mats and the like. Of course, suitable materials may be used alone or in combination.
  • the detection region is in the form of a nitrocellulose membrane.
  • the detection region (3) may be in the form of a pad, for example a nitrocellulose membrane pad.
  • the detection region (3) of the strip according to the present invention comprises at least one test zone (4).
  • the test zone (4) is located at a part of the detection region (3) distal to the part of the detection region (3), namely the junction (22), attached to the conjugation region (2).
  • the test zone (4) can have any desired shape. For example, a simple line may be appropriate, although other shapes, such as a plus sign (+), may also be acceptable.
  • the test zone (4) is further characterized in that a capture molecule (205) is immobilized on the surface of this zone.
  • the capture molecule (205) comprises or consists of a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleotide sequence complementary to a second nucleotide sequence of the analyte nucleic acid molecule.
  • the capture molecule (205) is immobilized on the surface of the test zone (4). Because the capture molecule (205) according to the present invention comprises or consists of a nucleotide sequence, well-known technologies and methods for the immobilization of nucleic acid molecules on solid surfaces can be used in the art. In general, immobilization of the molecule can be accomplished by use of anchoring groups such as poly-dT20 or hapten-carrier complex systems.
  • immobilization of the capture molecule (205) can be accomplished by spray application of streptavidin onto the surface of a nitrocellulose membrane and biotinylation of the capture molecule (205), which can then be bound to the streptavidin-modified nitrocellulose membrane.
  • Other methods of immobilizing nucleic acid molecules on solid surfaces are known in the art Since the present invention is not limited in this respect, they can also be used to advantage.
  • the capture molecule (205) immobilized on the surface of the test zone (4) of the detection region (3) comprises or consists of a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleotide sequence complementary to a second nucleotide sequence of the analyte nucleic acid molecule, capture allowing the analyte-conjugation complex to migrate across the test strip, resulting in the immobilization of the analyte-conjugate complex in the test zone (4) to form an immobilized capture molecule-analyte-conjugate complex.
  • capture as used in connection with the present invention refers to a bond by hybridization as defined above.
  • the first nucleotide sequence of the analyte (202) that is complementary to a nucleotide sequence of the conjugate nucleic acid molecule (204) should not match the second nucleotide sequence of the analyte (202), which is complementary to a nucleotide sequence of the capturing nucleic acid molecule, overlap.
  • the first nucleotide sequence of the analyte (202) that is complementary to a nucleotide sequence of the conjugate nucleic acid molecule (204) should not be part of the second nucleotide sequence of the analyte (202) that is complementary to a nucleotide sequence of the capture nucleic acid molecule ,
  • the first nucleotide sequence of the analyte (202) is complementary to the conjugate nucleotide sequence (204) and the second nucleotide sequence of the analyte (202) is complementary to the capture molecule (205) nucleotide sequence , different and preferably not overlapping.
  • the conjugate nucleic acid molecule and the capture nucleic acid molecule are not sufficiently complementary to one another to hybridize (make Watson-Crick base pairs) under assay conditions. As a result, false-negative test results can be avoided since the formation of capture molecule-conjugate complexes in the test zone (4) is excluded.
  • any nucleic acid molecule may serve as the analyte (202), provided that it has a known nucleotide sequence, so that both the conjugate nucleic acid molecule and the capture nucleic acid molecule can be designed in a purposeful manner in that they are complementary to a first nucleotide sequence of the analyte (202) or a second nucleotide sequence of the analyte (202).
  • the analyte nucleic acid molecule comprises or consists of DNA, preferably ssDNA (single-stranded DNA).
  • the capture nucleic acid molecule and / or the conjugate nucleic acid molecule comprises or consists of DNA, preferably ssDNA.
  • the analyte nucleic acid molecule is a fragment of the porcine mitochondrial cytochrome B gene, preferably having a chain length of from about 10 to about 200 nucleotides, more preferably from about 20 to about 100 nucleotides.
  • the conjugate of the test strip comprises or consists of a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleotide sequence (204) complementary to a first nucleotide sequence of the mitochondrial porcine cytochrome B gene fragment analyte
  • the capture molecule (205) of the test strip comprises A nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleotide sequence complementary to a second nucleotide sequence of the mitochondrial cytochrome B gene fragment analyte of porcine.
  • the first nucleic acid sequence complementary to the conjugate nucleotide sequence of the porcine mitochondrial cytochrome B gene fragment analyte and the second nucleic acid sequence of the mitochondrial porcine cytochrome B gene fragment analyte complementary to the capture molecule nucleotide sequence are different and preferably non-overlapping. More preferably, the conjugate nucleic acid molecule and the capture nucleic acid molecule are not sufficiently complementary to one another to hybridize under assay conditions (base pairs to Watson-Crick).
  • the analyte nucleic acid molecule has a sequence as shown in SEQ ID NO: 1
  • the nucleic acid molecule of the conjugate has a sequence as shown in SEQ ID NO: 2
  • the capture nucleic acid molecule has a sequence as shown in SEQ ID NO : 3 shown.
  • the analyte nucleic acid molecule has a sequence as shown in SEQ ID NO: 4
  • the nucleic acid molecule of the conjugate has a sequence as shown in SEQ ID NO: 5
  • the capture nucleic acid molecule has a sequence as shown in SEQ ID NO : 6 shown.
  • the analyte nucleic acid molecule has a sequence as shown in SEQ ID NO: 7
  • the nucleic acid molecule of the conjugate has a sequence as shown in SEQ ID NO: 8
  • the capture nucleic acid molecule has a sequence as shown in SEQ ID NO : 9 shown.
  • detectable marker is detected by the detectable marker (203) coupled to the conjugate nucleic acid molecule ) generated.
  • detectable marker refers to a marker (203) capable of producing a signal (207) that can be optically detected by an observer. Examples of detectable markers include, without limitation, colloidal gold, such as gold nanoparticles, or colored latex particles.
  • a signal (207) to be detected by an observer is a change in color in the test zone (4) that occurs after the population and accumulation of marker-labeled analyte-conjugate complexes that are isolated from the capture molecule immobilized in the zone (205 ).
  • a detectable signal can also be produced in the course of or in response to an enzymatic reaction which occurs after the population and accumulation of marker-labeled analyte-conjugate complexes derived from the capture molecule immobilized in the zone (FIG. 205).
  • a signal (207) to be detected by an observer may be a change in color, such as a chemochromic change, or the generation of a fluorescence signal in the test zone (4) promoted by an enzymatic reaction.
  • enzymes (301) as markers which generate a detectable signal is particularly advantageous in the context of the present invention, since even the smallest contents of analyte in a sample can be visualized and recognized accordingly.
  • substrate (s) (300) and optionally cofactor (s) must be present and made available to the enzyme (301). Both the amount and the type of substrate (300) and cofactor depend on the particular enzyme (301) used.
  • the label is an enzyme (301) and the strip further comprises one or more substrates (300) and / or cofactors for the enzyme (301) and the detection is optionally based on one by the catalytic activity of the enzyme (301) generated signal (207).
  • the substrate (s) (300) and optionally the cofactor (s) should only be in the test zone (4).
  • nucleic acid molecules with markers such as enzymes (301) are known in the art, and thus the present invention is not particularly limited in this regard as long as sufficient functionality of the marker-labeled conjugate nucleic acid molecule, as described here, is taken care of.
  • test strip of the present invention further comprises at least one pH indicator.
  • the at least one pH indicator is only in the test zone (4).
  • the marker comprises or consists of a urease and the strip further comprises urea and at least one pH indicator.
  • the label comprises or consists of a horseradish peroxidase and the strip further comprises a chromogenic and / or a chemiluminescent substrate and hydrogen peroxide.
  • the marker comprises or consists of an alkaline phosphatase and the strip further comprises at least one substrate which may undergo dephosphorylation.
  • the marker comprises or consists of a luciferase, and the strip further comprises luciferin and adenosine triphosphate (ATP).
  • the basic operating principle of the nucleic acid-based lateral flow assay (LFNA) strip according to the present invention is shown in FIG.
  • a sample (100) containing the analyte-nucleic acid molecule not shown in Figure 2
  • the analyte comes into contact with the conjugate labeled with the label ("complementary strand") (203, 204) attached to the surface of the conjugation region (Fig. 2) is immobilized.
  • the complementarity between a part of the analyte nucleotide sequence and the conjugate a complex is formed which reaches in the capillary flow (206) of the sample over the test strip the capture molecule (205) (205) present in the test zone (4).
  • the detection region (3) is immobilized.
  • FIG. 3 shows the basic operating principle of the enzyme-based signal generation, wherein a substrate (300) is converted into a detectable signal (207).
  • the detection region (3) may further comprise at least one control zone (5).
  • a control zone (5) is located between the test zone (4) and the distal end of the detection region (3), ie, opposite its proximal end, which is attached to the conjugation region (2) ( Figure 1).
  • the control zone (5) is further characterized by comprising a substance that undergoes a visual change upon contact with a liquid.
  • optical change refers to a visible change in the optical properties of a corresponding substance or a corresponding material.
  • a chemochromic change may be referred to as an optical change.
  • Non-limiting examples of substances or materials that undergo optical change upon contact with liquids include superhydrophobic coatings, wet-visible particles, and liquid-activated paint.
  • a liquid-activated color change ink and method for its use are disclosed.
  • the present invention is not particularly limited in this respect to a kind of the specific material or the specific substance which undergoes a color change on contact with a liquid.
  • the control zone (5) may have any desired shape. Again, for example, a simple line may be appropriate, although other shapes may also be acceptable.
  • control zone (5) By observing the occurrence of an optical change in the control zone (5), the validity of the particular test carried out can be determined since the wetting of the control zone (5) indicates that all of the sample components had the opportunity to pass through the test zone (4) and optionally to react with the conjugate molecule and the capture molecule (205).
  • a positive signal, ie an optical change, in the control zone (5) should not be confused with a positive signal, ie a change in color, in the test zone (4) as described above. Therefore, it may be favorable if the control zone (5) has a different shape than the test zone (4) in order to avoid confusion.
  • test zone (4) it may be favorable, although the color change in the test zone (4) is slightly different from the optical change in the control zone (5) in the case of generating a positive signal in both zones (4,5).
  • predetermined markings indicate areas in which a positive signal for the test zone (4) or the control zone (5) is to be expected.
  • the test strip according to the present invention further comprises at least one excess liquid absorption region (6) located at the distal end of the detection region (3), i. H. opposite to the proximal end attached to the conjugation region.
  • the excess fluid absorption region (6) serves the purpose of absorbing excess fluid reaching the distalmost end of the strip according to the present invention.
  • the absorption of fluid at the distal end of the test strip as a whole promotes fluid flow from the sample contacting region (1) across the test strip.
  • the excess liquid absorption region (6) may be any type of absorbent material, which may be selected, for example, from various types of paper, such as filter paper and chromatography paper.
  • hydrophilic polymers such as cellulose, agarose, gelatin, carageen, alginate, alginic acid, xanthan gums, guar gums and like polymers, as well as any combination of the foregoing may be cited as suitable materials in this regard.
  • the test strip according to the present invention may optionally comprise additional components which may further enhance the analytical properties of the test strip and / or improve the overall stability and / or processability of the test strip.
  • the test strip may comprise a backing / backing component to which the above-described functional components of the test strip may be applied such that a relatively rigid and resilient base / base structure may be provided. Suitable materials in this regard may be selected without limitation from plastics, paperboard, glass, etc.
  • the test strip a housing and / or one or more cover layers, for. B. plastic topcoats to protect the conjugation region (2) and / or the detection region (3) and / or the absorption region (6) for excess liquid against possible external influences and damage.
  • the sample contacting region (1) should not, at least not completely, be covered by a housing and / or one or more cover layers.
  • all materials used in the design of the test strip of the present invention are inexpensive yet functional, as the lateral flow test strip of the present invention is preferably for disposable use.
  • the present invention further relates to the use of the nucleic acid-based lateral flow assay (LFNA) strip as described herein for detecting an analyte nucleic acid molecule in a sample (100).
  • the sample (100) is a food sample.
  • the present invention relates to a method for detecting an analyte nucleic acid molecule in a sample (100).
  • the sample is a food sample and the method comprises the following steps:
  • a first step (200) the sample is contacted with the (LFNA) strip as described herein.
  • the sample (100) is brought into contact with the sample contacting region (1) of the strip. Since the sample contacting region (1) consists of absorbing material (s), thorough absorption of liquid and soluble components of the sample (100) can be ensured.
  • the sample contacting region (1) consists of absorbing material (s)
  • thorough absorption of liquid and soluble components of the sample (100) can be ensured.
  • contacting when contacting the strip with the sample to be analyzed (100), only the portion of the test strip where the sample contacting region (1) is located is brought into contact with the sample (100). For example, contacting may be accomplished by placing one or more drops of the sample, i. H. liquid sample, as defined above, on the sample contacting region (1) of the strip.
  • contacting the test strip with the sample (100) may also include dipping the one end of the test strip on which the sample contacting region (1) is located in the sample (100).
  • a next step (201) after a time sufficient for liquid components of the sample to migrate across the strip, the detection region (3) is checked for the presence or absence of a marker (203) in the test zone (4) ) signal (207) as described above.
  • the generation of a signal (207) in the test zone (4) is an indication of the presence of the analyte nucleic acid molecule in the sample (100) and the absence of a signal (207) in the test zone (4) is an indication on the absence of the analyte nucleic acid molecule in the sample (100).
  • the method of the present invention may further comprise the step of examining the detection region (3) for the presence or absence of an optical Include change in the control zone (5).
  • an optical change in the control zone (5) is an indication of a valid test and the absence of an optical change in the control zone (5) is an indication of an invalid test.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen nukleinsäurebasierten Lateral Flow-Assay (LFNA)-Streifen für den Nachweis eines Analyt-Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100), wobei der Nachweis des Analyten auf dem Nachweis eines Markers (203) nach der Wanderung eines Analyt-Konjugat-Marker-Komplexes, der in einer Konjugationsregion (2) des Streifens gebildet wird, und nach der Immobilisierung dieses Komplexes in einer Testzone (4) über die Bindung des Komplexes an ein Einfangmolekül (205), wobei ein nachweisbares Signal (207) durch den Marker (203) erzeugt wird, basiert. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines solchen Teststreifens und ein Verfahren zum Nachweis eines Analyt-Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100).

Description

NUKLEINSÄUREBASIERTER LATERAL FLOW-ASSAY FÜR SCHNELLE
FLEISCHSPEZIESBESTIMMUNG
TECHNOLOGIEGEBIET
[001 ] Die vorliegende Erfindung betrifft einen nukleinsäurebasierten Lateral Flow-Assay(LFNA)- Streifen zum Nachweis eines Analyt-Nukleinsäuremoleküls in einer Probe, wobei der Nachweis des Analyten auf dem Nachweis eines Markers nach der Wanderung eines Analyt-Konjugat-Marker- Komplexes, der in einer Konjugationsregion des Streifens gebildet wird, und nach der Immobilisierung dieses Komplexes in einer Testzone über die Bindung des Komplexes an ein Einfangmolekül, wobei ein nachweisbares Signal durch den Marker erzeugt wird, basiert. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines solchen Teststreifens und ein Verfahren zum Nachweis eines Analyt- Nukleinsäuremoleküls in einer Probe.
STAND DER TECHNIK
[002] Heute konzentriert sich ein hauptsächlicher Teil der Lebensmittelanalyse auf die Speziesbestimmung von Lebensmitteln, was bedeutet, den tierischen Ursprung eines bestimmten Typs von Lebensmitteln herauszufinden. Zum Beispiel wurde billigeres Fleisch als Ersatz für teureres Fleisch verwendet. Mit voranschreitender Globalisierung und zunehmender Mobilität der Menschen reisen immer mehr Verbraucher weg von ihren Heimatländern in Regionen mit einer anderen Esskultur. Daher wird die Identifizierung von Tierspezies, insbesondere Schweinefleisch, in Lebensmittelprodukten für Verbraucher zu einem immer wichtigeren Problem.
[003] Zur Durchführung der Speziesbestimmung von Lebensmitteln können verschiedene Verfahren eingesetzt werden, wie DNA-Nachweis (US 20100216136 A1), Proteinnachweis (US 6288215 B1) und Aminosäureprofilerstellung (Raraswati, M.A. et al., J. Food Pharm. Sei. , 2013, 2, 1 -6). Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist in der Regel das Werkzeug für die Aminosäureprofilerstellung. Sämtliche vorstehend genannten Tests werden mit spezieller Laborausrüstung von gut ausgebildeten Fachleuten durchgeführt und sind in der Regel zeit- und kostenaufwendig. Aus diesem Grund ist es wichtig, preiswerte und leicht anzuwendende Lebensmittelschnelltests zu entwickeln, die auf dem Gebiet verwendet werden können.
[004] Es gibt im Handel erhältliche Schnelltests für den Endverbraucher, bei denen es sich sämtlich um Lateral Flow-Assays (LFA) handelt. Ein Lateral Flow-Assay (oder Teststäbchen-Assay) ist für die
Durchführung einer schnellen Diagnose im Feld ausgezeichnet geeignet (Posthuma-Trumpie, G.A. et al., Anal. Bioanal. Chem. , 2009, 393, 569-582). In der Regel handelt es sich um einen immunchromatographischen Assay, der auf dem Prinzip der Antigen-Antikörper-Bindung basiert. Verschiedene Formen von Lateral Flow-Teststreifen werden von Firmen, wie PerkinElmer, Capital Biotech, Bio-Check und Alpha Diagnostic International usw. geliefert, deren Prinzipien ähnlich sind. Daher weisen die handelsüblichen Lebensmittelanalyse-Lateral Flow-Assays sämtlich Proteine als ihre Analyten nach. Der Halal-Test® von Capital Biotech, das Porcine Detection Kit® von PerkinElmer und TruStrip® von Alpha Diagnostic sind sämtlich herkömmliche Lateral Flow-Teststreifen, wobei Benutzer den Teststreifen in Probenlösung eintauchen und auf die Entwicklung eines Signals warten. Sie können für rohes und verarbeitetes Fleisch verwendet werden, wobei die Empfindlichkeit für verarbeitetes Fleisch niedrig ist. Der FlowThrough™-Schnellteststreifen von Bio-Check hat einen anderen Aufbau. Anstatt den Teststreifen in die Probenlösung einzutauchen, müssen Benutzer die Probenlösung auf den Teststreifen gießen. Er wird nur für rohes Fleisch verwendet. Die Unterschiede der vorstehend genannten LFA liegen vor allem in ihren Analyten. Die Analyten sind verschiedene aus Schweinen stammende Proteine. Für den FlowThrough™-Teststreifen wird anstelle einer Vorimmobilisierung des Konjugats auf dem Streifen eine Lösung zum Aufbewahren des Konjugats bereitgestellt, und wenn der Analyt vorhanden ist, bindet er an das Konjugat in der Lösung. Der Hintergrund dieses Aufbaus könnte sein, dass die Bindung des Analyten an das Konjugat in einer Lösung gründlicher erfolgt als auf einer festen Oberfläche und die Empfindlichkeit des Tests bis zu einem gewissen Grad erhöht wird.
[005] Allerdings gibt es mehrere bekannte Nachteile, wenn Proteine als Analyten verwendet werden. Erstens sind sie anfällig für Denaturierung unter Hitze und Druck. Wenn gekochte Lebensmittel geprüft werden, wird daher die Empfindlichkeit des Tests erheblich beeinträchtigt. Zweitens werden zum Nachweis bestimmter Proteine deren entsprechende Antikörper als das Einfangmittel verwendet. Nicht alle Antikörper sind im Handel erhältlich und es ist normalerweise teuer, Antikörper zu kaufen. Drittens ist die Affinität zwischen Proteinen und deren Antikörpern entscheidend für den Erfolg bei der Entwicklung eines immunchromatographischen Assays. Die Affinität muss stark genug sein, damit falsch negative Ergebnisse minimiert werden. Daher muss einiger Aufwand in die Frage nach der Affinität zwischen einem Paar von Proteinen investiert werden. Die Nachteile in Zusammenhang mit Proteinen haben einen direkten Einfluss auf die Ergebnisse der Immuno-LFA.
[006] Nukleinsäure-Lateral Flow-Tests (LFNA) sind relativ neu und auf dem Vormarsch. Wie der Name bereits nahelegt, handelt es sich bei dem Analyten bei LFNA um Nukleinsäuren, die robuster als Proteine sind. Nukleinsäuren sind von zentraler Bedeutung für die molekulare Diagnostik verschiedener Krankheiten, wie genetischer und Infektionskrankheiten, für die Arzneimittelforschung, den biologischen Schutz (Biodefense), die Forensik und viele andere Anwendungen (Landegren, U. et al., Science, 1988, 242, 229-237). Bisher hängt die molekulare Diagnostik stark von der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) und der Mikroarray-Technologie ab. Beide sind langwierig, teuer und erfordern ausgebildete Fachkräfte für die Durchführung. Es wurde beharrlich nach einem Werkzeug für ein genaues, kostengünstiges und einfach anzuwendendes molekulares Schnellnachweisverfahren gesucht. LFNA sind gute Kandidaten für die Erfüllung dieser Anforderungen. Wang et al. berichteten über einen LFNA zum Nachweis von Hepatitis C-Virus-Core-Antigen mit mehr als 97%-iger Genauigkeit (Wang, C. et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2013, 32, 59-68). Vor kurzem hat man LFNA für den Pathogen- und Mikrobennachweis für die Lebensmittelsicherheitsprüfung nach einer Amplifikation von Proben mit PCR verwendet (Blazkova, M. et al., Eur. Food Res. Technol. , 2009, 229, 867-874).
[007] Bis heute hat man LFNA-Tests nicht zur Speziesbestimmung von Lebensmitteln eingesetzt. Im Hinblick auf die vorstehend genannten Nachteile in Zusammenhang mit dem Nachweis spezifischer Proteine in Lebensmittelproben lassen sich die folgenden Vorteile für den Einsatz von nukleinsäurebasierten Nachweisverfahren erkennen:
[008] DNA als Analyt ist sehr stabil, robust und kann Hitze und Druck widerstehen. Da sowohl Hitze als auch Druck in der Regel während der Lebensmittelzubereitung ins Spiel kommen, kann ein DNA- Nachweis sogar bei verarbeiteten Lebensmitteln durchgeführt werden.
[009] Synthetische DNA-Oligonukleotide (kurze DNA-Fragmente) sind leicht von allen größeren Bioreagenzherstellern, wie Sigma-Aldrich, Thermo Fisher oder Integrated DNA Technologies, erhältlich. Üblicherweise sind die Kosten für DNA-Oligonukleotide erheblich niedriger als diejenigen für Proteine (mehr als zehnmal niedriger). Sie bereiten daher keine logistischen Probleme.
[0010] Außerdem ist die Affinität und Spezifität zwischen zwei komplementären DNA-Strängen sehr hoch und somit werden die Nachweisergebnisse sehr genau sein.
[001 1 ] Folglich wurden von den Erfindern der vorliegenden Erfindung ein Teststreifen und ein Verfahren entwickelt, wobei ein Analyt-Nukleinsäuremolekül mit einer spezifischen Nukleotidsequenz von einem spezifisch dafür gestalteten, komplementären Konjugat-Einfangmolekül-System erkannt wird. In spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst der Analyt eine DNA- Sequenz oder besteht daraus, die ein Fragment des mitochondrialen Cytochrom B-Gens (Cyt B) aus Schwein ist, das aus etwa 30 Basenpaaren (bp) besteht. In diesen Ausführungsformen werden das Konjugations- und das Einfangoligonukleotid spezifisch dafür gestaltet, dass sie komplementär zu dem Analyten sind, was den Nachweis des Schweinefleischgehalts sowohl in rohen als auch in verarbeiteten Lebensmitteln ermöglicht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
[0012] Unter einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung somit einen nukleinsäurebasierten Lateral Flow-Assay(LFNA)-Streifen zum Nachweis von eines Analyt- Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100), umfassend vom proximalen zum distalen Ende des Streifens:
(a) mindestens eine Probenkontaktierungsregion (1), (b) mindestens eine Konjugationsregion (2), die dahingehend an die Probenkontaktierungsregion (1) angeheftet ist, dass das distale Ende der Probenkontaktierungsregion (1) an das proximale Ende der Konjugationsregion (2) angeheftet ist, und die ein auf ihrer Oberfläche immobilisiertes Konjugat umfasst, wobei das Konjugat Folgendes umfasst oder daraus besteht: (i) ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz (204), die komplementär zu einer ersten Nukleotidsequenz des Analyten (202) ist, und (ii) eine nachweisbare Markierung (203) umfasst oder daraus besteht, und
(c) mindestens eine Nachweisregion (3), die dahingehend an die Konjugationsregion (2) angeheftet ist, dass das distale Ende der Konjugationsregion (2) an das proximale Ende der Nachweisregion (3) angeheftet ist, und umfassend mindestens eine Testzone (4), wobei die Testzone (4) auf ihrer Oberfläche ein Einfangmolekül (205) immobilisiert hat, wobei das Einfangmolekül (205) ein Nukleinsäuremolekül umfasst oder daraus besteht, das eine zu einer zweiten Nukleotidsequenz des Analyten (202) komplementäre Nukleotidsequenz umfasst oder daraus besteht,
wobei die Probe (100) eine Lebensmittelprobe ist und der Nachweis des Analyten (202) auf dem Nachweis des Markers (203) in der Testzone (4) der Nachweisregion (3) nach der Wanderung eines in der Konjugationsregion (2) gebildeten Analyt-Konjugat-Komplexes zur Nachweisregion (3) und der Immobilisierung dieses Komplexes über die Bindung des Komplexes an das Einfangmolekül in der Testzone (4) basiert.
[0013] Unter einen zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des nukleinsäurebasierten Lateral Flow-Assay(LFNA)-Streifens, wie hier beschrieben, für den Nachweis eines Analyt-Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100).
[0014] Unter einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyt-Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100), wobei die Probe (100) eine Lebensmittelprobe ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(I) Inkontaktbringen der Probe (100) mit dem (LFNA-)Streifen, wie hier beschrieben, wobei die Probe (100) mit der Probenkontaktierungsregion (1) des Streifens in Kontakt gebracht wird;
(II) nach einer Zeit, die ausreicht, dass flüssige Bestandteile der Probe über den Streifen wandern, Untersuchen der Nachweisregion (3) auf die An- oder Abwesenheit eines Signals (207), das durch den Marker (203) in der Testzone (4) erzeugt wird,
wobei die Erzeugung eines Signals (207) in der Testzone (4) auf die Anwesenheit des Analyt- Nukleinsäuremoleküls in der Probe (100) hindeutet und die Abwesenheit eines Signals (207) in der Testzone (4) auf die Abwesenheit des Analyt-Nukleinsäuremoleküls in der Probe (100) hindeutet.
[0015] Weitere Ausführungsformen sind in der beigefügten Patentansprüchen definiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN [0016] Figur 1 zeigt den Aufbau und das grundlegende Funktionsprinzip eines Nukleinsäure-Lateral Flow-Teststreifens gemäß der vorliegenden Erfindung.
[0017] Figur 2 zeigt das Funktionsprinzip eines Nukleinsäure-Lateral Flow-Assays gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Probenkontaktierungsregion (1) ist in dieser Darstellung nicht gezeigt.
[0018] Figur 3 zeigt das Einbringen eines Marker-Enzyms zur Signalverstärkung in einen Nukleinsäure-Lateral Flow-Assay gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Probenkontaktierungsregion ist in dieser Darstellung nicht gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
[0019] Wie sie in dieser Beschreibung verwendet werden, beinhalten die Singularformen "ein", "einer", "eine" usw. und "der/die/das" usw. Pluralformen, es sei denn, aus dem Kontext geht eindeutig etwas andere hervor. So soll zum Beispiel der Begriff "ein Material" ein oder mehrere Materialien oder eine Kombination davon bedeuten.
[0020] "Ein oder mehrere", wie hier verwendet, bezieht sich auf mindestens eines und umfasst 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder mehr der genannten Spezies.
[0021 ] "Etwa", wie es im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, definiert einen Bereich von +/-10 %, vorzugsweise +/-5 %, des bestimmten angegebenen Wertes.
[0022] Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Analyt-Nukleinsäuremolekül" auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine Polynukleotidsequenz von Interesse enthält, deren Einfangen, Immobilisierung und Nachweis erwünscht sind.
[0023] Der Begriff "Nukleinsäure", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Polynukleotidverbindung, was Oligonukleotide einschließt, die Nukleoside oder Nukleosidanaloga umfasst, die stickstoffhaltige heterozyklische Basen oder Basenanaloga aufweisen, die kovalent durch Standard- Phosphodiesterbindungen oder andere Verknüpfungen verknüpft sind. Nukleinsäuren beinhalten RNA, DNA, Chimäre DNA-RNA-Polymere oder Analoga davon. In einer Nukleinsäure kann das Rückgrat aus einer Vielzahl von Verbindungen bestehen, einschließlich einer oder mehreren Zucker- Phosphodiester- Verknüpfungen, Peptid-Nukleinsäure(PNA)-Verknüpfungen, Phosphorthioat- Verknüpfungen, Methylphosphonat-Verknüpfungen oder Kombinationen davon. Zuckereinheiten in einer Nukleinsäure können Ribose, Desoxyribose oder ähnliche Verbindungen mit Substitutionen, z. B. 2'-Methoxy- und 2'-Halogenid (z. B. 2'-F)-Substitutionen, sein. Stickstoffhaltige Basen können herkömmliche Basen (A, G, C, T, U), nicht-natürliche Nukleotide, wie Isocytosin und Isoguanin, deren Analoga (z. B. Inosin; The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., Hrsg., 1 1 . Auflage, 1992), Derivate von Purin- oder Pyrimidinbasen (z. B. N4-Methyldesoxyguanosin, Deaza- oder Azapurine, Deaza- oder Azapyrimidine, Pyrimidine oder Purine mit veränderten oder Ersatz- Substituentengruppen an einer beliebigen von einer Vielzahl chemischer Positionen, z. B. 2-Amino-6- methylaminopurin, 06-Methylguanin, 4-Thiopyrimidine, 4-Aminopyrimidine, 4- Dimethylhydrazinpyrimidine und 04-Alkylpyrimidine, oder Pyrazoloverbindungen, wie z. B. unsubstituiertes oder 3-substituiertes Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, sein. Nukleinsäuren können "abasische" Positionen enthalten, an denen das Grundgerüst keine stickstoffhaltige Base an einer oder mehreren Stellen aufweist, z. B. können eine oder mehrere abasische Positionen eine Linkerregion bilden, die getrennte Oligonukleotidsequenzen miteinander verbindet. Eine Nukleinsäure kann nur herkömmliche Zucker, Basen und Verknüpfungen, wie man sie in herkömmlicher RNA und DNA findet, umfassen oder kann herkömmliche Komponenten und Substitutionen (z. B. herkömmliche Basen, die durch ein 2'-Methoxy-Grundgerüst verbunden sind, oder ein Polymer, das ein Gemisch aus herkömmlichen Basen und einem oder mehreren Analoga enthält) enthalten. Der Begriff beinhaltet "locked (fixierte) Nukleinsäuren" (LNA), die ein oder mehrere LNA-Nukleotidmonomere mit einer bizyklischen Furanoseeinheit, die in einer RNA nachahmenden Zuckerkonformation fixiert ist, enthalten, was die Hybridisierungsaffinität für komplementäre Sequenzen in ssRNA, ssDNA oder dsDNA verstärkt (Vester et al., Biochemistry, 2004, 43, 13233-13241).
[0024] Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "komplementär" in Zusammenhang mit einem Oligonukleotid (d. h. einer Sequenz von Nukleotiden, wie ein Oligonukleotid-Primer oder eine Ziel- Nukleinsäure) auf Standard-Watson/Crick-Basenpaarungsregeln. Zum Beispiel ist die Sequenz "5'-A- G-T-C-3'" komplementär zur Sequenz "3'-T-C-A-G-5\" Bestimmte Nukleotide, die man in natürlichen Nukleinsäuren üblicherweise nicht findet oder die chemisch synthetisiert sind, können in die hier beschriebenen Nukleinsäuren eingeschlossen werden; dazu gehören, sie sind aber nicht beschränkt auf Nukleoside, Nukleotide und Nukleinsäuren mit modifizierten Basen und Zuckern, wie Inosin, Isocytosin und Isoguanin. Die Komplementarität muss nicht perfekt sein; stabile Duplices können fehlgepaarte Basenpaare, degenierte oder ungepaarte Nukleotide enthalten. Der Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäuretechnologie kann die Duplexstabilität empirisch unter Berücksichtigung einer Reihe von Variablen, einschließlich zum Beispiel der Länge des Oligonukleotids, der Basenzusammensetzung und der Sequenz des Oligonukleotids, der Häufigkeit ungepaarter Basenpaare, der lonenstärke, anderer Hybridisierungspufferbestandteile und -bedingungen, bestimmen. Die Komplementarität kann partiell sein, wobei nur einige der Nukleotidbasen von zwei Nukleinsäuresträngen nach den Basenpaarungsregeln gepaart sind. Die Komplementarität kann vollständig oder total sein, wobei alle Nukleotidbasen von zwei Nukleinsäuresträngen nach den Basenpaarungsregeln gepaart sind. Komplementarität kann fehlen, wenn keine der Nukleotidbasen von zwei Nukleinsäuresträngen nach den Basenpaarungsregeln gepaart ist. Der Grad der Komplementarität zwischen Nukleinsäuresträngen hat erhebliche Auswirkungen auf die Effizienz und die Stärke einer Hybridisierung zwischen Nukleinsäuresträngen.
[0025] Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "Hybridisierung" auf herkömmliche Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen, unter denen der Tm-Wert zwischen Tm 20 °C bis Tm 70 °C, stärker bevorzugt zwischen Tm 25 °C bis 65 °C beträgt. Am stärksten bevorzugt bezieht sich der Begriff "Hybridisierung" auf stringente Hybrid isierungsbedingungen.
[0026] Der Begriff "Probe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich im Wesentlichen auf jede Probe (100), die das gewünschte Analyt-Nukleinsäuremolekül enthält, einschließlich Lebensmittel, Kosmetika, Arzneimittel/Pharmazeutika, mittels Bioprozessierung hergestellter Materialien (fertiges Produkt sowie Zwischenproduktmaterialien) und dergleichen, ist aber nicht darauf beschränkt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Probe (100) eine Lebensmittelprobe ist. Weiterhin ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass die Probe (100) eine Probe ist, die eine oder mehrere flüssige Bestandteile, zum Beispiel Wasser, enthält. In der Probe enthaltene flüssige Bestandteile ermöglichen ein leichtes Inkontaktbringen der Probe (100) mit der Probenkontaktierungsregion (1) des Teststreifens gemäß der vorliegenden Erfindung und ermöglichen die Wanderung des Analyten über den Teststreifen, so dass sie sowohl das Konjugat in der Konjugatregion (2) als auch das Einfangmolekül (205) in der Nachweisregion (3) erreichen kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine Probe (100), die eine oder mehrere flüssige Komponenten enthält, als flüssige Probe bezeichnet, obwohl sie eventuell gemäß herkömmlicher Auffassung nicht "flüssig" ist. Zum Beispiel kann eine Probe eines zubereiteten Gerichts eine flüssige Probe sein, wie eine Probe eines Eintopfs, einer Suppe und dergleichen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann eine Probe (100) verflüssigt werden, zum Beispiel durch Zugabe von einer oder mehreren Flüssigkeiten, wie Wasser. Vorzugsweise wird/werden nach Zugabe der einen oder mehreren Flüssigkeiten die eine oder mehreren Flüssigkeiten und die Probe (100) gründlich gemischt.
[0027] Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Speziesbestimmung einer Lebensmittelprobe durch Nachweis in der Probe (100) enthaltener spezifischer Analyt-Nukleinsäuremoleküle durchgeführt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein positiver Nachweis spezifischer Analyt-Nukleinsäuremoleküle in einer Probe, wie einer Lebensmittelprobe, ein Hinweis auf das Vorhandensein von biologischem Material, das aus einem spezifischen Tier, z. B. aus Schwein, stammt, in der Probe. Wie vorstehend erläutert, lassen sich mehrere technische sowie logistische Nachteile in Bezug auf proteinbasierte Speziesbestimmungstechniken identifizieren, die sämtlich mit nukleinsäurebasierten Prüftechniken, wie sie hier vorgeschlagen werden, überwunden werden können. So bezieht sich die vorliegende Erfindung in einer ersten Aufgabe auf einen nukleinsäurebasierten Lateral Flow-Assay(LFNA)-Streifen für den Nachweis eines Analyt- Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100). Ein Streifen, wie er hier offenbart ist, umfasst im Wesentlichen mindestens drei verschiedene Zonen, die jeweils einem spezifischen Zweck dienen und die in Kombination einen schnellen und einfachen Nachweis spezifischer Analyt- Nukleinsäuremoleküle in einer Probe (100) ermöglichen. Im Folgenden werden die grundlegende Struktur und die Funktionsweise eines Teststreifens gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben und im Detail erläutert. Die Struktur wird vom proximalen zum distalen Ende des Streifens beschrieben, was der Wanderungsrichtung einer Probe über den Streifen entspricht. [0028] Die erste Komponente des Streifens ist die erste Komponente, mit der eine zu prüfende Probe (100) in Kontakt gebracht wird, folglich wird sie als die Probenkontaktierungsregion (1) bezeichnet. Die Probenkontaktierungsregion (1) kann jede beliebige Art des Materials umfassen oder daraus bestehen, das im Hinblick auf biologisches Material enthaltende Proben, wie Lebensmittelproben, chemisch inert ist und das absorptionsfähig ist, so dass ein gründlicher und ausreichender Kontakt des Streifens mit der entsprechenden Probe (100) und den Komponenten, die sie enthält, sichergestellt werden kann. Da der Teststreifen gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt für eine einmalige Verwendung im Feld, d. h. die Verwendung durch Laien im Alltag, gedacht ist, es weiterhin bevorzugt, dass das Material der Probenkontaktierungsregion (1) sowie der anderen Komponenten des Streifens gemäß der vorliegenden Erfindung aus preiswerten und dennoch funktionellen Materialien besteht. Folglich ist das Material der Probenkontaktierungsregion (1) nicht besonders eingeschränkt und kann zum Beispiel aus verschiedenen Arten von Papier, wie Filterpapier und Chromatographiepapier, ausgewählt werden. Allgemein lassen sich hydrophile Polymere, wie Cellulose, Agarose, Gelatine, Carageen, Alginate, Alginsäure, Xanthangummen, Guargummen und ähnliche Polymere sowie beliebige Kombinationen der vorstehend Genannten als geeignete Materialien für die Probenkontaktierungsregion (1) des Streifens gemäß der vorliegenden Erfindung aufzählen. Gemäß bestimmten Ausführungsformen umfasst die Probenkontaktierungsregion (1) Cellulosefasern oder besteht daraus. Die Abmessung und die Position der Probenkontaktierungsregion (1) ist auf einen bestimmten Bereich des Streifens beschränkt. Gemäß der vorliegenden Erfindung befindet sich die Probenkontaktierungsregion (1) nur an einem Ende des Streifens, wie hier beschrieben, so dass eine Probe, mit der der Streifen in Kontakt gebracht wird, nur zu einem Ende des Teststreifens hin gezogen wird. Hier wird der Streifen gemäß der vorliegenden Erfindung von einem proximalen Ende des Streifens bis zu einem distalen Ende des Streifens beschrieben. Die Probenkontaktierungsregion (1) befindet sich am proximalen Ende des Streifens bzw. bildet dieses Ende. Die Probenkontaktierungsregion (1) kann in Form eines Kissens gestaltet werden. Nach dem Kontakt der Probenkontaktierungsregion (1) mit einer Probe absorbiert die Probenkontaktierungsregion (1) den Rauminhalt der Probe und sämtliche darin enthaltenen löslichen Probenkomponenten, die dann in Richtung der und über die anderen im Folgenden beschriebenen Teststreifenkomponenten wandern.
[0029] Der Teststreifen gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst weiterhin eine Konjugationsregion (2). Die Konjugationsregion (2) ist mit der Probenkontaktierungsregion (1 ) dahingehend verbunden, dass das distale Ende der Probenkontaktierungsregion (1) an das proximale Ende der Konjugationsregion (2) angeheftet ist. Die Anheftung der vorstehend genannten Komponenten (1 ,2) kann durchgeführt werden, indem man eine Komponente teilweise auf der anderen befestigt, so dass eine Verbindungsstelle (21) gebildet werden kann. In dieser Hinsicht ist bevorzugt, dass die Probenkontaktierungsregion (1) über einem Teil am proximalen Ende der Konjugationsregion (2) liegt, um ausreichenden Fluss der flüssigen Probe vom proximalen Ende des Teststreifens zum distalen Ende des Teststreifens zu gewährleisten. Alternativ kann die Verbindung der Komponenten (1 ,2) zum Beispiel dadurch durchgeführt werden, dass das distale End der Probenkontaktierungsregion (1) an das proximale Ende der Konjugationsregion (2) geklebt wird. Man sollte jedoch darauf achten, dass man die Probenwanderung über die Verbindungsstelle nicht stört. Zum Beispiel könnte die Probenwanderung aufgrund von übermäßigem Klebstoff, der auf die angrenzenden Bereiche der Komponenten (1 ,2) des Teststreifens überläuft, gestört werden. Als eine dritte Alternative können die Komponenten (1 ,2) des Teststreifens gemäß der vorliegenden Erfindung oben auf einer Unterlage-/Trägerkomponente befestigt und mithilfe eines Klebstoffs, zum Beispiel eines Haftklebstoffs, angeheftet werden, so dass das distale Ende der Probenkontaktierungsregion (1) in einem direkten engen Kontakt mit dem proximalen Ende der Konjugationsregion (2) steht. Wiederum sollte vorzugsweise kein übermäßiger Klebstoff den Probenfluss über den Teststreifen behindern. In der Regel muss eine Flüssigkeitskommunikation der Probenkontaktierungsregion (1) und der Konjugationsregion (2) sichergestellt sein.
[0030] In bestimmten Ausführungsformen überlappt die Konjugationsregion (2) in einem proximalen Teil derselben zum Teil die Probenkontaktierungsregion (1). Die überlappende Region ist dadurch gekennzeichnet, dass das distale Ende der Probenkontaktierungsregion einen proximalen Teil der Konjugationsregion (2) überlappt, wodurch eine Verbindungsstelle (21) gebildet wird. Die Abmessung dieser überlappenden Region sollte so gewählt werden, dass eine ausreichende Überführung der Probenbestandteile von der Probenkontaktierungsregion (1) auf die Konjugationsregion (2) sichergestellt werden kann. Es sollte jedoch natürlich selbstverständlich sein, dass nicht die gesamte Oberfläche der Konjugationsregion (2) durch die Probenkontaktierungsregion (1) abgedeckt sein sollte. In anderen Ausführungsformen kann die Konjugationsregion für einen Kontakt mit der Probenkontaktierungsregion auf eine andere Weise, d. h. nicht durch Überlappung, ausgelegt sein. Gemäß bestimmten Ausführungsformen ist die proximale Spitze der Konjugationsregion (2) an die distale Spitze der Probenkontaktierungsregion (2) mithilfe eines Klebstoffs angeheftet. Gemäß bestimmten Ausführungsformen wird die Fixierung beider Streifenkomponenten (1 ,2) durch Aufbringen der genannten Komponenten oben auf eine Unterlagekomponente, z. B. eine Kunststoff unterläge mit Abmessungen, die auf die Abmessungen der Teststreifenkomponenten, wie hier beschrieben, abgestimmt sind, durchgeführt.
[0031 ] Die Konjugationsregion kann aus jeder beliebigen Art des Materials bestehen, das die Wanderung von flüssigen und löslichen Inhaltsstoffen der Probe über die Oberfläche der Konjugationsregion (2) ermöglicht. Vorzugsweise besteht die Konjugationsregion (2) aus nicht absorbierende(m/n) Material(ien). Zu geeigneten Materialien können zum Beispiel und ohne Einschränkung Polyester oder Glasfasermatten usw. gehören. Natürlich können geeignete Materialien allein oder in Kombination verwendet werden.
[0032] Die Konjugationsregion (2) des Streifens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein auf ihrer Oberfläche immobilisiertes Konjugat. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Konjugat oder besteht aus (i) einem Nukleinsäuremolekül, das eine zu einer ersten Nukleotidsequenz des Analyten (202) komplementäre Nukleotidsequenz (204) umfasst oder daraus besteht, und (ii) einen nachweisbaren Marker (203). Gemäß bestimmten Ausführungsformen ist der nachweisbare Marker (203) an das Konjugat-Nukleinsäuremolekül (204) gekoppelt. [0033] Die Immobilisierung des Konjugats auf der Oberfläche der Konjugationsregion kann durch Aufbringen des Konjugats auf die Oberfläche der Konjugationsregion, zum Beispiel durch Sprühen einer Lösung des Konjugats auf die Oberfläche der Konjugationsregion (2) und anschließendes Verdunsten des/der Lösungsmittel(s), durchgeführt werden. In dieser Hinsicht ist die vorliegende Erfindung nicht auf bestimmte Typen der Immobilisierungsverfahren beschränkt und jedes beliebige im Stand der Technik bekannte Verfahren kann vorteilhaft eingesetzt werden.
[0034] Wenn die löslichen Inhalte der Probe über die Verbindungsstelle (21) von der Probenkontaktierungsregion (1) zur Konjugationsregion (2) wandern, wird die Konjugationsregion (2) benetzt. Wenn unter den löslichen Inhalten der Probe das Analyt-Nukleinsäuremolekül vorhanden ist, bildet der Analyt (202) einen Komplex mit dem Konjugat-Nukleinsäuremolekül, das eine zu einer ersten Nukleotidsequenz des Analyten (202) komplementäre Nukleotidsequenz (204) umfasst oder daraus besteht, wodurch das zuvor immobilisierte Konjugat remobilisiert wird. Während die flüssige Probe weiter über die Konjugationsregion (2) wandert, wird der so gebildete Analyt-Konjugat-Komplex zusammen mit der Strömung der flüssigen Probe mitgenommen und ist in der Lage, den nächsten funktionellen Abschnitt des Streifens gemäß der vorliegenden Erfindung zu erreichen.
[0035] Dieser nächste funktionelle Abschnitt wird hier als Nachweisregion (3) bezeichnet. Die Nachweisregion (3) ist an die Konjugationsregion (2) dahingehend angeheftet, dass das distale Ende der Konjugationsregion (2) an das proximale Ende der Nachweisregion (3) angeheftet ist. Die Verbindung der vorstehend genannten Komponenten (2,3) kann so durchgeführt werden, dass eine Verbindungsstelle (22) gebildet werden kann. Geeignete Verfahren sind diejenigen, wie sie vorstehend in Bezug auf die Verbindungsstelle (21), die die Verknüpfung zwischen dem distalen Ende der Probenkontaktierungsregion (1) und dem proximalen Ende der Konjugationsregion (2) bildet, beschrieben sind. Wiederum sind Gestaltungen, wobei die proximale Komponente, in diesem Fall die Konjugationsregion (2), über der distalen Komponente, in diesem Fall der Nachweisregion (3), liegt, besonders bevorzugt. Allgemein muss eine Flüssigkeitskommunikation zwischen der Konjugationsregion (2) und der Nachweisregion (3) sichergestellt sein. Veranschaulichende Beispiele für Verbindungsstellenstrukturen (21 ,22) sind in Figur 1 dargestellt, wobei die Verbindungsstelle (21) dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Teil des distalen Endes der Probenkontaktierungsregion (1) einen Teil des proximalen Endes der Konjugationsregion überlappt, und wobei die Verbindungsstelle (22) dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Teil des distalen Endes der Konjugationsregion (2) einen Teil des proximalen Endes der Nachweisregion (3) überlappt.
[0036] Gemäß bestimmten Ausführungsformen überlappt die Nachweisregion (3) an ihrem proximalen Ende zum Teil das distale Ende der Konjugationsregion (2). Auch hier sollte die Abmessung dieser überlappenden Region so gewählt werden, dass eine ausreichende Überführung der Probenbestandteile von der Konjugationsregion (2) auf die Nachweisregion (3) sichergestellt werden kann. Es sollte jedoch natürlich selbstverständlich sein, dass nicht die gesamte Oberfläche der Nachweisregion (3) von der Konjugationsregion (2) abgedeckt sein sollte. In anderen Ausführungsformen kann die Nachweisregion (3) für einen Kontakt mit der Konjugationsregion (2) auf eine andere Weise, d. h. nicht durch Überlappung, ausgelegt sein. Gemäß bestimmten Ausführungsformen ist die proximale Spitze der Nachweisregion (3) an die distale Spitze der Konjugationsregion (2) mithilfe eines Klebstoffs angeheftet. Gemäß bestimmten Ausführungsformen wird die Fixierung beider Streifenkomponenten (2,3) durch Aufbringen der genannten Komponenten oben auf eine Unterlagekomponente, wie eine Kunststoffunterlage, mit Abmessungen, die auf die Abmessungen der Teststreifenkomponenten, wie hier beschrieben, abgestimmt sind, durchgeführt.
[0037] Die Nachweisregion kann aus jeder beliebigen Art des Materials bestehen, das die Wanderung in der Probe enthaltener flüssiger und löslicher Inhalte über die Oberfläche der Konjugationsregion (2) ermöglicht. Darüber hinaus sollte das Material die Immobilisierung eines Einfangmoleküls (205) an der Oberfläche der Nachweisregion (3) ermöglichen. Zu geeigneten Materialien können zum Beispiel und ohne Einschränkung Cellulosepapiere, Nitrocellulosemembranen, Polyvinylidenfluorid, ladungsmodifiziertes Nylon, Polyethersulfon, poröse Polyethylenplatten, Glasfasermatten usw. gehören. Natürlich können geeignete Materialien allein oder in Kombination verwendet werden. Gemäß bestimmten Ausführungsformen hat die Nachweisregion die Form einer Nitrocellulosemembran. Gemäß weiteren Ausführungsformen kann die Nachweisregion (3) die Form eines Kissens, zum Beispiel eines Nitrocellulosemembran-Kissens, haben.
[0038] Die Nachweisregion (3) des Streifens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens eine Testzone (4). Gemäß bestimmten Ausführungsformen befindet sich die Testzone (4) an einem Teil der Nachweisregion (3), der distal von dem an die Konjugationsregion (2) angehefteten Teil der Nachweisregion (3), nämlich der Verbindungsstelle (22), liegt. Die Testzone (4) kann jede beliebige gewünschte Form haben. Eine einfache Linie kann zum Beispiel geeignet sein, obwohl andere Formen, wie ein Pluszeichen (+), ebenfalls akzeptabel sein können. Die Testzone (4) ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass ein Einfangmolekül (205) auf der Oberfläche dieser Zone immobilisiert ist.
[0039] Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Einfangmolekül (205) oder besteht aus einem Nukleinsäuremolekül, das eine zu einer zweiten Nukleotidsequenz des Analyt-Nukleinsäuremoleküls komplementäre Nukleotidsequenz umfasst oder daraus besteht. Das Einfangmolekül (205) ist auf der Oberfläche der Testzone (4) immobilisiert. Da das Einfangmolekül (205) gemäß der vorliegenden Erfindung eine Nukleotidsequenz umfasst oder daraus besteht, können im Stand der Technik allgemein bekannte Technologien und Verfahren für die Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen an festen Oberflächen verwendet werden. Im Allgemeinen kann die Immobilisierung des Moleküls durch Einsatz von Verankerungsgruppen, wie poly-dT20, oder Hapten-Träger-Komplex-Systemen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Immobilisierung des Einfangmoleküls (205) durch Sprühapplikation von Streptavidin auf die Oberfläche einer Nitrocellulosemembran und Biotinylierung des Einfangmoleküls (205), das anschließend an die mit Streptavidin modifizierte Nitrocellulosemembran gebunden werden kann, durchgeführt werden. Andere Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen auf festen Oberflächen sind im Stand der Technik bekannt und können, da die vorliegende Erfindung in dieser Hinsicht nicht eingeschränkt ist, auch vorteilhaft eingesetzt werden.
[0040] Da das auf der Oberfläche der Testzone (4) der Nachweisregion (3) immobilisierte Einfangmolekül (205) ein Nukleinsäuremolekül umfasst oder daraus besteht, das eine zu einer zweiten Nukleotidsequenz des Analyt-Nukleinsäuremoleküls komplementäre Nukleotidsequenz umfasst oder daraus besteht, wird das Einfangen des über den Teststreifen wandernden Analyt- Konjugationskomplexes ermöglicht, was zur Immobilisierung des Analyt-Konjugat-Komplexes in der Testzone (4) unter Bildung eines immobilisierten Einfangmolekül-Analyt-Konjugat-Komplexes führt. Der Begriff "einfangen", wie er in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf eine Bindung durch Hybridisierung, wie vorstehend definiert. Um eine ausreichende Bindung des Analyt-Konjugat-Komplexes durch das Einfangmolekül (205) zu gewährleisten, sollte die erste Nukleotidsequenz des Analyten (202), die komplementär zu einer Nukleotidsequenz des Konjugat-Nukleinsäuremoleküls (204) ist, nicht mit der zweiten Nukleotidsequenz des Analyten (202), die zu einer Nukleotidsequenz des einfangenden Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, überlappen. Anders gesagt, sollte die erste Nukleotidsequenz des Analyten (202), die komplementär zu einer Nukleotidsequenz des Konjugat-Nukleinsäuremoleküls (204) ist, kein Teil der zweiten Nukleotidsequenz des Analyten (202), die zu einer Nukleotidsequenz des Einfang- Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, sein.
[0041 ] Somit sind gemäß bestimmten Ausführungsformen die erste Nukleotidsequenz des Analyten (202), die komplementär zu der Konjugat-Nukleotidsequenz (204) ist, und die zweite Nukleotidsequenz des Analyten (202), die komplementär zu der Einfangmolekül(205)- Nukleotidsequenz ist, unterschiedlich und vorzugsweise nicht überlappend. In bestimmten Ausführungsformen sind das Konjugat-Nukleinsäuremolekül und das Einfang-Nukleinsäuremolekül nicht ausreichend komplementär zueinander, um unter Assay-Bedingungen zu hybridisieren (Watson- Crick Basenpaare zu bilden). Dadurch können falsch-negative Testergebnisse vermieden werden, da die Bildung von Einfangmolekül-Konjugat-Komplexen in der Testzone (4) ausgeschlossen ist.
[0042] Für den Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer Probe kann jedes beliebige Nukleinsäuremolekül als der Analyt (202) dienen, vorausgesetzt, dass es eine bekannte Nukleotidsequenz hat, so dass sowohl das Konjugat-Nukleinsäuremolekül als auch das Einfang- Nukleinsäuremolekül zweckbestimmt derart gestaltet werden können, dass sie komplementär zu einer ersten Nukleotidsequenz des Analyten (202) beziehungsweise einer zweiten Nukleotidsequenz des Analyten (202) sind. Gemäß bestimmten Ausführungsformen umfasst das Analyt-Nukleinsäuremolekül oder besteht aus DNA, vorzugsweise ssDNA (einzelsträngige DNA). Gemäß bestimmten Ausführungsformen umfasst das Einfang-Nukleinsäuremolekül und/oder das Konjugat- Nukleinsäuremolekül DNA, vorzugsweise ssDNA, oder besteht daraus.
[0043] Für den Nachweis von aus Schwein stammendem biologischen Material in einer Probe können vorzugsweise Fragmente des mitochondrialen Cytochrom B-Gens aus Schwein als Analyten dienen, da diese Fragmente reichlich in der Menge und gut untersucht sind. Darüber hinaus variiert das mitochondriale Cytochrom B-Gen stark zwischen verschiedenen Spezies. So ist gemäß bestimmten Ausführungsformen das Analyt-Nukleinsäuremolekül ein Fragment des mitochondrialen Cytochrom B-Gens aus Schwein, vorzugsweise mit einer Kettenlänge von etwa 10 bis etwa 200 Nukleotiden, stärker bevorzugt von etwa 20 bis etwa 100 Nukleotiden. Gemäß diesen Ausführungsformen umfasst das Konjugat des Teststreifens ein Nukleinsäuremolekül oder besteht daraus, das eine zu einer ersten Nukleotidsequenz des mitochondrialen Cytochrom B-Genfragment- Analyten aus Schwein komplementäre Nukleotidsequenz (204) umfasst oder daraus besteht, und das Einfangmolekül (205) des Teststreifens umfasst ein Nukleinsäuremolekül oder besteht daraus, das eine zu einer zweiten Nukleotidsequenz des mitochondrialen Cytochrom B-Genfragment-Analyten aus Schwein komplementäre Nukleotidsequenz umfasst oder daraus besteht. Vorzugsweise sind die erste zu der Konjugat-Nukleotidsequenz komplementäre Nukleinsäuresequenz des mitochondrialen Cytochrom B-Genfragment-Analyten aus Schwein und die zweite zu der Einfangmolekül- Nukleotidsequenz komplementäre Nukleinsäuresequenz des mitochondrialen Cytochrom B- Genfragment-Analyten aus Schwein unterschiedlich und vorzugsweise nicht überlappend. Besonders bevorzugt sind das Konjugat-Nukleinsäuremolekül und das Einfang-Nukleinsäuremolekül nicht ausreichend komplementär zueinander, um unter Assay-Bedingungen zu hybridisieren (Watson-Crick Basenpaare zu bilden).
[0044] Gemäß bestimmten Ausführungsformen hat das Analyt-Nukleinsäuremolekül eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt, das Nukleinsäuremolekül des Konjugats hat eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt und das Einfang-Nukleinsäuremolekül hat eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 3 dargestellt.
[0045] Gemäß anderen Ausführungsformen hat das Analyt-Nukleinsäuremolekül eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 4 dargestellt, das Nukleinsäuremolekül des Konjugats hat eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 5 dargestellt und das Einfang-Nukleinsäuremolekül hat eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 6 dargestellt.
[0046] Gemäß anderen Ausführungsformen hat das Analyt-Nukleinsäuremolekül eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 7 dargestellt, das Nukleinsäuremolekül des Konjugats hat eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 8 dargestellt und das Einfang-Nukleinsäuremolekül hat eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 9 dargestellt.
[0047] Nach der Immobilisierung des Analyt-Konjugat-Komplexes in der Testzone (4), d. h. nach der Bildung des Einfangmolekül-Analyt-Konjugat-Komplexes, wird ein Signal (207) durch den an das Konjugat-Nukleinsäuremolekül gekoppelten nachweisbaren Marker (203) erzeugt. Der Begriff "nachweisbar Marker", wie er in diesem Zusammenhang verwendet wird, bezieht sich auf einen Marker (203), der in der Lage ist, ein Signal (207) zu erzeugen, das durch einen Beobachter optisch erkannt werden kann. Beispiele für nachweisbare Marker können ohne Einschränkung kolloidales Gold, wie in Form von Gold-Nanopartikeln, oder gefärbte Latexpartikel beinhalten. In dieser Hinsicht ist ein von einem Beobachter zu erkennendes Signal (207) eine Veränderung der Farbe in der Testzone (4), die nach der Population und Akkumulation von mit dem Marker markierten Analyt- Konjugat-Komplexen auftritt, die von dem in der Zone immobilisierten Einfangmolekül (205) eingefangen werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann ein nachweisbares Signal auch im Zuge einer oder als Reaktion auf eine enzymatische Reaktion hervorgerufen werden, die nach der Population und Akkumulation von mit dem Marker markierten Analyt-Konjugat-Komplexen auftritt, die von dem in der Zone immobilisierten Einfangmolekül (205) eingefangen werden. In dieser Hinsicht kann ein von einem Beobachter zu erkennendes Signal (207) eine Veränderung der Farbe, wie eine chemochromische Veränderung, oder die Erzeugung eines Fluoreszenzsignals in der Testzone (4), die durch eine enzymatische Reaktion gefördert wird, sein. Angesichts des verstärkenden Charakters einer enzymbasierten Signalerzeugung ist der Einsatz von Enzymen (301) als Marker, die ein nachweisbares Signal erzeugen, im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders vorteilhaft, da selbst kleinste Inhalte an Analyt in einer Probe sichtbar gemacht und dementsprechend erkannt werden können. Damit eine enzymatische Reaktion auftritt, muss/müssen (ein) Substrat(e) (300) und gegebenenfalls (ein) Cofaktor(en) vorhanden sein und für das Enzym (301) verfügbar gemacht werden. Sowohl die Menge als auch die Art des Substrats (300) und Cofaktors hängen von dem jeweiligen eingesetzten Enzym (301) ab.
[0048] So ist gemäß bestimmten Ausführungsformen der Marker ein Enzym (301) und der Streifen umfasst weiterhin ein oder mehrere Substrate (300) und/oder Cofaktoren für das Enzym (301) und der Nachweis basiert gegebenenfalls auf einem durch die katalytische Aktivität des Enzyms (301) erzeugten Signal (207). Damit eine enzymatische Reaktion nur in der Testzone (4) auftritt, sollte(n) sich das/die Substrat(e) (300) und gegebenenfalls der/die Cofaktor(en) nur in der Testzone (4) befinden. Dadurch kann nur nach Population und Akkumulation von mit dem Marker markierten Analyt-Konjugat-Komplexen in der Testzone (4) über die Bindung an das in der Zone immobilisierte Einfangmolekül (205) ein entsprechendes Signal (207) erzeugt werden und falsch-positive Testergebnisse können verhindert werden.
[0049] Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuremolekülen mit Markern, wie Enzymen (301 ), sind im Stand der Technik bekannt und folglich ist die vorliegende Erfindung in dieser Hinsicht nicht besonders eingeschränkt, solange für eine ausreichende Funktionalität des mit dem Marker markierten Konjugat-Nukleinsäuremoleküls, wie hier beschrieben, gesorgt ist.
[0050] Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Klassen von Enzymen (301) und deren entsprechende Substrate (300) und gegebenenfalls Cofaktoren eingesetzt. Die vorliegende Erfindung ist in dieser Hinsicht nicht besonders eingeschränkt, solange ein nachweisbares Signal (207) nach der enzymatischen Reaktion des/der jeweiligen als Marker verwendeten Enzym(s/e) erzeugt werden kann. Zum Beispiel kann eine Veränderung der Farbe in der Testzone (4) nach einer Veränderung des pH-Werts in der Zone induziert werden, wobei eine oder mehrere halochromische Substanzen (pH-Indikatoren) ihre Farbe als Reaktion auf Veränderungen des pH-Werts in der Zone verändern und wobei eine Veränderung im pH-Wert in der Zone durch eine enzymatische Reaktion verursacht wird. Folglich umfasst der Teststreifen der vorliegenden Erfindung in bestimmten Ausführungsformen weiterhin mindestens ein pH-Indikator. Gemäß bestimmten Ausführungsformen befindet sich der mindestens eine pH-Indikator nur in der Testzone (4).
[0051 ] Als nicht einschränkendes Beispiel für Enzyme, die Reaktionen, die pH-Wert- Veränderungen induzieren, katalysieren, können Ureasen genannt werden. Gemäß bestimmten Ausführungsformen umfasst der Marker eine Urease oder besteht daraus und der Streifen umfasst weiterhin Harnstoff und mindestens einen pH-Indikator. Gemäß anderen Ausführungsformen umfasst der Marker eine Meerrettich-Peroxidase oder besteht daraus und der Streifen umfasst weiterhin ein chromogenes und/oder ein chemilumineszierendes Substrat und Wasserstoffperoxid. Gemäß anderen Ausführungsformen umfasst der Marker eine alkalische Phosphatase oder besteht daraus und der Streifen umfasst weiterhin mindestens ein Substrat, das einer Dephosphorylierung unterliegen kann. Gemäß anderen Ausführungsformen umfasst der Marker eine Luciferase oder besteht daraus und der Streifen umfasst weiterhin Luciferin und Adenosintriphosphat (ATP).
[0052] Das grundlegende Funktionsprinzip des nukleinsäurebasierten Lateral Flow-Assay(LFNA)- Streifens gemäß der vorliegenden Erfindung ist in Figur 2 dargestellt. Nach dem Inkontaktbringen einer das nachzuweisende Analyt-Nukleinsäuremolekül enthaltenden Probe (100) (in Figur 2 nicht gezeigt) kommt der Analyt in Kontakt mit dem mit dem Marker markierten Konjugat ("komplementärer Strang") (203,204), das an der Oberfläche der Konjugationsregion (2) immobilisiert ist. Dank der Komplementarität zwischen einem Teil der Analyt-Nukleotidsequenz und dem Konjugat bildet sich ein Komplex, der in der Kapillarströmung (206) der Probe über den Teststreifen das Einfangmolekül ("einfangender Strang") (205) erreicht, das in der Testzone (4) der Nachweisregion (3) immobilisiert ist. Wie in Figur 2 dargestellt ist, ist ein Teil der Einfang-Nukleotidsequenz in der Lage, mit dem Analyten zu hybridisieren, wodurch ein Einfangmolekül-Analyt-Konjugat-Komplex in der Testzone (4) gebildet und ein nachweisbares Signal (207) durch den Marker (203) erzeugt wird. In Figur 3 ist das grundlegende Funktionsprinzip der enzymbasierten Signalerzeugung dargestellt, wobei ein Substrat (300) in ein nachweisbares Signal (207) umgewandelt wird.
[0053] Gemäß bestimmten Ausführungsformen kann die Nachweisregion (3) weiterhin mindestens eine Kontrollzone (5) umfassen. Vorzugsweise befindet sich eine Kontrollzone (5) zwischen der Testzone (4) und dem distalen Ende der Nachweisregion (3), d. h. gegenüber ihrem proximalen Ende, das an die Konjugationsregion (2) angeheftet ist (Figur 1). Gemäß bestimmten Ausführungsformen ist die Kontrollzone (5) weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Substanz umfasst, die nach dem Kontakt mit einer Flüssigkeit eine optische Veränderung erfährt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "optische Veränderung" auf eine sichtbare Veränderung in den optischen Eigenschaften einer entsprechenden Substanz oder eines entsprechenden Materials. Zum Beispiel kann eine chemochromische Veränderung als eine optische Veränderung bezeichnet werden. Als nicht-einschränkende Beispiele für Substanzen oder Materialien, die einer optischen Veränderung nach Kontakt mit Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Wasser, unterliegen, lassen sich superhydrophobe Beschichtungen, nass sichtbare Partikel und flüssigkeitsaktivierte Farbe nennen. Insbesondere wird auf US20140088534 A1 verwiesen, in dem eine flüssigkeitsaktivierte Farbwechselfarbe und Verfahren für ihre Verwendung offenbart sind. Die vorliegende Erfindung ist jedoch in dieser Hinsicht nicht besonders auf eine Art des spezifischen Materials oder der spezifischen Substanz, die beim Kontakt mit einer Flüssigkeit eine Farbveränderung erfährt, eingeschränkt. Die Kontrollzone (5) kann jede beliebige gewünschte Form haben. Wiederum kann zum Beispiel eine einfache Linie geeignet sein, obwohl andere Formen ebenfalls akzeptabel sein können. Durch Beobachtung des Auftretens einer optischen Veränderung in der Kontrollzone (5) kann die Validität des jeweiligen durchgeführten Tests ermittelt werden, da die Benetzung der Kontrollzone (5) darauf hindeutet, dass alle Probenkomponenten die Möglichkeit hatten, die Testzone (4) zu durchqueren und gegebenenfalls mit dem Konjugatmolekül und dem Einfangmolekül (205) zu reagieren. Ein positives Signal, d. h. eine optische Veränderung, in der Kontrollzone (5) sollte jedoch nicht mit einem positiven Signal, d. h. einer Veränderung der Farbe, in der Testzone (4), wie vorstehend beschrieben, verwechselt werden. Daher kann es günstig sein, wenn die Kontrollzone (5) eine andere Form hat als die Testzone (4), um Verwechslungen zu vermeiden. Darüber hinaus kann es günstig sein, wenn auch die Farbveränderung in der Testzone (4) leicht von der optischen Veränderung in der Kontrollzone (5) im Fall der Erzeugung eines positiven Signals in beiden Zone (4,5) zu unterscheiden ist. Im Hinblick auf die allgemeine Praktikabilität des Teststreifens gemäß der vorliegenden Erfindung kann es weiterhin vorteilhaft sein, wenn vorgegebene Markierungen auf Bereiche hindeuten, in denen ein positives Signal für die Testzone (4) bzw. die Kontrollzone (5) zu erwarten ist.
[0054] Gemäß bestimmten Ausführungsformen umfasst der Teststreifen gemäß der vorliegenden Erfindung weiterhin mindestens eine Absorptionsregion (6) für überschüssige Flüssigkeit, die sich am distalen Ende der Nachweisregion (3), d. h. gegenüber dem an die Konjugationsregion angehefteten proximalen Ende, befindet. Wie der Name schon andeutet, dient die Absorptionsregion (6) für überschüssige Flüssigkeit dem Zweck, überschüssige Flüssigkeit, die das am weitesten distal gelegene Ende des Streifens gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht, zu absorbieren. Darüber hinaus fördert die Absorption von Flüssigkeit am distalen Ende des Teststreifens insgesamt die Flüssigkeitsströmung von der Probenkontaktierungsregion (1) über den Teststreifen. Die Absorptionsregion (6) für überschüssige Flüssigkeit kann aus einer beliebigen Art des absorptionsfähigen Materials bestehen, das zum Beispiel aus verschiedenen Arten von Papier, wie Filterpapier und Chromatographiepapier, ausgewählt werden kann. Im Allgemeinen können hydrophile Polymere, wie Cellulose, Agarose, Gelatine, Carageen, Alginat, Alginsäure, Xanthangummen, Guargummen und ähnliche Polymere, sowie beliebige Kombinationen der vorstehend Genannten in dieser Hinsicht als geeignete Materialien angeführt werden.
[0055] Der Teststreifen gemäß der vorliegenden Erfindung kann gegebenenfalls zusätzliche Komponenten umfassen, die die analytischen Eigenschaften des Teststreifens weiter steigern und/oder die Gesamtstabilität und/oder Verarbeitbarkeit des Teststreifens verbessern können. Zum Beispiel kann der Teststreifen eine Unterlage-/Trägerkomponente umfassen, auf die die vorstehend beschriebenen funktionellen Komponenten des Teststreifens aufgebracht werden können, so dass eine vergleichsweise starre und belastbare Grund-/Basisstruktur bereitgestellt werden kann. Geeignete Materialien in dieser Hinsicht können ohne Einschränkung aus Kunststoffen, Pappe, Glas usw. ausgewählt werden. Darüber hinaus kann der Teststreifen ein Gehäuse und/oder eine oder mehrere Deckschichten, z. B. Kunststoffdeckschichten umfassen, um die Konjugationsregion (2) und/oder die Nachweisregion (3) und/oder die Absorptionsregion (6) für überschüssige Flüssigkeit gegen mögliche äußere Einflüsse und Beschädigung zu schützen. Um das Inkontaktbringen der Probenkontaktierungsregion (1) mit einer zu testenden Probe (100) zu ermöglichen, sollte die Probenkontaktierungsregion (1) natürlich nicht, zumindest nicht vollständig, durch ein Gehäuse und/oder eine oder mehrere Deckschichten abgedeckt sein. Im Allgemeinen ist bevorzugt, dass alle bei der Gestaltung des Teststreifens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Materialien kostengünstig und dennoch funktionell sind, da der Lateral Flow-Teststreifen gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise für die Einwegverwendung gedacht ist.
[0056] Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des nukleinsäurebasierten Lateral Flow-Assay(LFNA)-Streifens, wie hier beschrieben, zum Nachweis eines Analyt-Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100). Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Probe (100) eine Lebensmittelprobe.
[0057] Unter noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyt-Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100). Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Probe eine Lebensmittelprobe und die Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
[0058] In einem ersten Schritt (200) wird die Probe mit dem (LFNA-)Streifen, wie hier beschrieben, in Kontakt gebracht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Probe (100) mit der Probenkontaktierungsregion (1 ) des Streifens in Kontakt gebracht. Da die Probenkontaktierungsregion (1) aus absorbierende(m/n) Material(ien) besteht, kann eine gründliche Absorption von flüssigen und löslichen Bestandteilen der Probe (100) sichergestellt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass beim Inkontaktbringen des Streifens mit der zu analysierenden Probe (100) nur der Teil des Teststreifens, an dem sich die Probenkontaktierungsregion (1) befindet, mit der Probe (100) in Kontakt gebracht wird. Zum Beispiel kann das Inkontaktbringen durchgeführt werden, indem man einen oder mehrere Tropfen der Probe, d. h. flüssigen Probe, wie vorstehend definiert, auf die Probenkontaktierungsregion (1) des Streifens aufbringt. Das Inkontaktbringen des Teststreifens mit der Probe (100) kann jedoch auch das Eintauchen des einen Endes des Teststreifens, auf dem sich die Probenkontaktierungsregion (1) befindet, in die Probe (100) umfassen.
[0059] In einem nächsten Schritt (201) wird nach einer Zeit, die ausreicht, dass flüssige Bestandteile der Probe über den Streifen wandern, die Nachweisregion (3) auf das Vorhandensein oder Fehlen eines durch den Marker (203) in der Testzone (4) erzeugten Signals (207) untersucht, wie vorstehend beschrieben. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Erzeugung eines Signals (207) in der Testzone (4) ein Hinweis auf die Anwesenheit des Analyt-Nukleinsäuremoleküls in der Probe (100) und das Fehlen eines Signals (207) in der Testzone (4) ist ein Hinweis auf die Abwesenheit des Analyt-Nukleinsäuremoleküls in der Probe (100). [0060] Wenn der Teststreifen gemäß der vorliegenden Erfindung gemäß bestimmten Ausführungsformen, wie vorstehend beschrieben, mindestens eine Kontrollzone (5) umfasst, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin den Schritt der Untersuchung der Nachweisregion (3) auf die An- oder Abwesenheit einer optischen Veränderung in der Kontrollzone (5) umfassen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine optische Veränderung in der Kontrollzone (5) ein Hinweis auf einen gültigen Test und die Abwesenheit einer optischen Veränderung in der Kontrollzone (5) ist ein Hinweis auf einen ungültigen Test.
[0061 ] Die Erfindung ist hier umfassend und generisch beschrieben worden. Jede der eingeschränkteren Spezies und subgenerischen Gruppierungen, die unter die generische Offenbarung fallen, ist ebenfalls Bestandteil der Erfindung. Dazu gehören die generische Beschreibung der Erfindung mit dem Vorbehalt oder der negativen Beschränkung der Entfernung von jeglichem Gegenstand aus der Gattung, unabhängig davon, ob das herausgenommene Material hier spezifisch genannt ist oder nicht. Weitere Ausführungsformen stehen in den folgenden Patentansprüchen. Wenn Merkmale oder Aspekte der Erfindung als Markush-Gruppen beschrieben sind, erkennt der Fachmann außerdem, dass die Erfindung dadurch auch im Hinblick auf jedes einzelne Mitglied oder jede einzelne Untergruppe der Mitglieder der Markush-Gruppe beschrieben ist.
[0062] Für einen Fachmann wird leicht deutlich, dass die vorliegende Erfindung an die Ausführung der Aufgaben und das Erreichen der genannten sowie der darin innenwohnenden Zwecke und Vorteile gut angepasst ist. Darüber hinaus wird für einen Fachmann leicht deutlich werden, dass verschiedene Ersetzungen und Modifikationen an der hier offenbarten Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Umfang und Geist der Erfindung abzuweichen. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen, Verfahren, Prozeduren, Behandlungen, Moleküle und spezifischen Verbindungen sind hier repräsentativ für die bevorzugten Ausführungsformen, sind beispielhaft und sind nicht als Einschränkungen für den Umfang der Erfindung gedacht. Für den Fachmann sind Veränderungen darin und andere Verwendungen offensichtlich, die vom Geist der Erfindung mit umfasst werden, sind durch den Umfang der Ansprüche definiert. Die Auflistung oder Erläuterung eines zuvor veröffentlichten Dokuments in dieser Beschreibung sollte nicht unbedingt als Bestätigung, dass das Dokument Teil des Standes der Technik oder allgemeines Fachwissen ist, aufgefasst werden.
[0063] Die hier anschaulich beschriebene Erfindung kann geeigneterweise in Abwesenheit irgendeines Elements oder von Elementen, irgendeiner Einschränkung oder von Einschränkungen, die hier nicht ausdrücklich offenbart sind, ausgeführt werden. So sollen zum Beispiel die Begriffe "umfassend", "einschließlich, "enthaltend" usw. weitgefasst und ohne Einschränkung gelesen werden. Das Wort "umfassen" oder Variationen, wie "umfasst" oder "umfassend", werden folglich so verstanden, dass sie den Einschluss einer genannten ganzen Zahl oder von Gruppen ganzer Zahlen, aber nicht den Ausschluss irgendeiner anderen ganzen Zahl oder Gruppe ganzer Zahlen implizieren. Darüber hinaus wurden die hier verwendeten Begriffe und Ausdrücke als Begriffe der Beschreibung und nicht der Einschränkung verwendet und bei der Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke besteht nicht die Absicht, irgendwelche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder von Teilen davon auszuschließen, sondern man sollte erkennen, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung möglich sind. Somit sollte selbstverständlich sein, dass zwar die vorliegende Erfindung anhand von beispielhaften Ausführungsformen und optionalen Merkmalen spezifisch offenbart wurde, dass aber Modifikation und Veränderung der hier offenbarten darin verkörperten Erfindungen vom Fachmann vorgenommen werden können und dass solche Modifikationen und Veränderungen als in den Umfang dieser Erfindung fallend betrachtet werden.
[0064] Der Inhalt sämtlicher hier genannter Dokumente und Patentschriften wird durch Bezugnahme vollinhaltlich aufgenommen.

Claims

ANSPRÜCHE
1 . Nukleinsäurebasierter Lateral Flow-Assay(LFNA)-Streifen für den Nachweis eines Analyt- Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100), der vom proximalen zum distalen Ende des Streifens Folgendes umfasst:
(a) mindestens eine Probenkontaktierungsregion (1),
(b) mindestens eine Konjugationsregion (2), die an die Probenkontaktierungsregion (1 ) dahingehend angeheftet ist, dass das distale Ende der Probenkontaktierungsregion (1) an das proximale Ende der Konjugationsregion (2) angeheftet ist, und umfassend ein auf ihrer Oberfläche immobilisiertes Konjugat, wobei das Konjugat Folgendes umfasst oder daraus besteht: (i) ein Nukleinsäuremolekül, das eine zu einer ersten Nukleotidsequenz des Analyten (202) komplementäre Nukleotidsequenz (204) umfasst oder daraus besteht, und (ii) einen nachweisbaren Marker (203), und
(c) mindestens eine Nachweisregion (3), die an die Konjugationsregion (2) dahingehend angeheftet ist, dass das distale Ende der Konjugationsregion (2) an das proximale Ende der Nachweisregion (3) angeheftet ist, und umfassend mindestens eine Testzone (4), wobei die Testzone (4) auf ihrer Oberfläche ein Einfangmolekül (205) immobilisiert hat, wobei das Einfangmolekül (205) ein Nukleinsäuremolekül umfasst oder daraus besteht, das eine zu einer zweiten Nukleotidsequenz des Analyten (202) komplementäre Nukleotidsequenz umfasst oder daraus besteht,
wobei die Probe (100) eine Lebensmittelprobe ist und der Nachweis des Analyten (202) auf dem Nachweis des Markers (203) in der Testzone (4) der Nachweisregion (3) nach der Wanderung eines in der Konjugationsregion (2) gebildeten Analyt-Konjugat-Komplexes zur Nachweisregion (3) und nach der Immobilisierung dieses Komplexes über die Bindung des Komplexes an das Einfangmolekül (205) in der Testzone (4) basiert.
2. LFNA-Streifen nach Anspruch 1 , wobei das Analyt-Nukleinsäuremolekül DNA umfasst oder daraus besteht.
3. LFNA-Streifen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Einfang-Nukleinsäuremolekül und/oder das Konjugat-Nukleinsäuremolekül DNA, vorzugsweise ssDNA, umfasst oder daraus besteht.
4. LFNA-Streifen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Marker (203) ein Enzym (301) ist und der Streifen weiterhin ein oder mehrere Substrate (300) und/oder Cofaktoren für das Enzym (301 ) umfasst und der Nachweis gegebenenfalls auf einem durch die katalytische Aktivität des Enzyms (301) erzeugten Signal (207) basiert.
5. LFNA-Streifen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei:
(i) die zu der Konjugat-Nukleotidsequenz komplementäre erste Nukleotidsequenz des Analyten (202) und die zu der Einfangmolekül-Nukleotidsequenz komplementäre zweite Nukleotidsequenz des Analyten (202) verschieden und vorzugsweise nicht überlappend sind; und/oder (ii) das Konjugat-Nukleinsäuremolekül und das Einfang-Nukleinsäuremolekül nicht ausreichend komplementär zueinander sind, um unter Assay-Bedingungen zu hybridisieren (Watson-Crick- Basenpaare zu bilden).
6. LFNA-Streifen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nachweisregion weiterhin mindestens eine Kontrollzone (5) umfasst, die eine Substanz umfasst, die nach Kontakt mit einer Flüssigkeit eine optische Veränderung erfährt, und die sich zwischen der Testzone (4) und dem distalen Ende der Nachweisregion (3), das gegenüber ihrem mit der Konjugationsregion (2) überlappenden proximalen Ende liegt, befindet, und/oder wobei der Streifen weiterhin mindestens eine Absorptionsregion (6) für überschüssige Flüssigkeit umfasst, die sich am distalen Ende der Nachweisregion, das gegenüber dem mit der Konjugationsregion (2) überlappenden proximalen Ende liegt, befindet.
7. LFNA-Streifen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probenkontaktierungsregion (1) die Form eines aus Cellulosefasern bestehenden Kissens hat.
8. LFNA-Streifen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konjugationsregion (2) die Form eines aus einem nicht-absorbierenden Material bestehenden Kissens hat.
9. LFNA-Streifen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nachweiszone (3) die Form eines Nitrocellulosemembran-Kissens hat.
10. LFNA-Streifen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Absorptionsregion (6) für überschüssige Flüssigkeit die Form eines aus Cellulosefasern bestehenden Kissens hat.
1 1 . LFNA-Streifen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei:
(i) das Analyt-Nukleinsäuremolekül eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt hat, das Nukleinsäuremolekül des Konjugats eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt hat und das Einfang-Nukleinsäuremolekül eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 3 dargestellt hat; oder
(ii) das Analyt-Nukleinsäuremolekül eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 4 dargestellt hat, das Nukleinsäuremolekül des Konjugats eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 5 dargestellt hat und das Einfang-Nukleinsäuremolekül eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 6 dargestellt hat; oder
(iii) das Analyt-Nukleinsäuremolekül eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 7 dargestellt hat, das Nukleinsäuremolekül des Konjugats eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 8 dargestellt hat und das Einfang-Nukleinsäuremolekül eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 9 dargestellt hat.
12. LFNA-Streifen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Marker (203) Folgendes umfasst oder daraus besteht:
(i) eine Urease und der Streifen weiterhin Harnstoff und mindestens einen pH-Indikator umfasst; oder (ii) eine Meerrettich-Peroxidase und der Streifen weiterhin ein chromogenes und/oder ein chemilumineszierendes Substrat und Wasserstoffperoxid umfasst; oder
(iii) eine alkalische Phosphatase und der Streifen weiterhin mindestens ein Substrat umfasst, das einer Dephosphorylierung unterliegen kann; oder
(iv) eine Luciferase und der Streifen weiterhin Luciferin und Adenosintriphosphat (ATP) umfasst.
13. Verwendung des nukleinsäurebasierten Lateral Flow-Assay(LFNA)-Streifens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zum Nachweis eines Analyt-Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100).
14. Verfahren zum Nachweis eines Analyt-Nukleinsäuremoleküls in einer Probe (100), wobei die Probe (100) eine Lebensmittelprobe ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(I) Inkontaktbringen der Probe (100) mit dem (LFNA-)Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Probe (100) mit der Probenkontaktierungsregion (1) des Streifens in Kontakt gebracht wird;
(II) nach einer Zeit, die ausreicht, dass flüssige Bestandteile der Probe (100) über den Streifen wandern, Untersuchen der Nachweisregion (3) auf die An- oder Abwesenheit eines Signals (207), das durch den Marker (203) in der Testzone (4) erzeugt wird,
wobei die Erzeugung eines Signals (207) in der Testzone (4) auf die Anwesenheit des Analyt- Nukleinsäuremoleküls in der Probe (100) hindeutet und die Abwesenheit eines Signals (207) in der Testzone (4) auf die Abwesenheit des Analyt-Nukleinsäuremoleküls in der Probe (100) hindeutet.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Verfahren weiterhin den Schritt umfasst:
(III) Untersuchen der Nachweisregion (3) auf die An- oder Abwesenheit einer optischen Veränderung in der Kontrollzone (5),
wobei eine optische Veränderung in der Kontrollzone (5) auf einen gültigen Test hindeutet und das Fehlen einer optischen Veränderung in der Kontrollzone (5) auf einen ungültigen Test hindeutet.
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