DE60121547T2

DE60121547T2 - Elektrochemisches Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60121547T2
Application number: DE60121547T
Authority: DE
Inventors: Fatima Azek; Pierre Brossier; Martine Joannes; Benoit Limoges
Original assignee: Argene SA
Current assignee: Argene SA
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-20
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2021-02-21
Also published as: WO2001062953A2; AU3571901A; WO2001062953A3; EP1257667B1; ES2267717T3; DE60121547D1; FR2805545B1; EP1257667A2; US20050032049A1; JP2003524168A; ATE333519T1; FR2805545A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in einer biologischen Probe durch Elektrochemie sowie einen Reagenzienkit zur Durchführung dieses Verfahrens. Eine besondere Ausführungsform dieses Verfahrens ermöglicht es, das Vorliegen einer Kontamination durch ein pathogenes Agens in einer biologischen Probe nachzuweisen.
Das Vorliegen von pathogenen Substanzen in einem Organismus kann heute durch mehrere Methoden nachgewiesen werden. Die meisten verwenden einen vorgeschalteten Amplifikationsschritt, im Allgemeinen mittels Polymerasekettenreaktion (PCR), der es ermöglicht, DNA-Fragmente des Virusgenoms spezifisch zu amplifizieren. Diese äußerst empfindliche Methode erlaubt es, eine sehr geringe Anzahl von Molekülen im Organismus nachzuweisen und unter bestimmten Bedingungen die Anzahl der ursprünglich vorliegenden Genomkopien des Agens quantitativ zu bestimmen.
Diese Technik ist im Grunde genommen einfach in der Verwendung und erlaubt es, zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.
Die herkömmlich verwendeten Methoden zur Analyse von PCR-Produkten sind die Elektrophorese, mit Färbung der DNA mit Ethidiumbromid (ETB), oder Hybridisierungstests unter Verwendung von Sonden, die beispielsweise mit radioaktiven, lumineszierenden oder kolorimetrisch nachweisbaren Verbindungen markiert sind. Diese Hybridisierungstechniken werden in der medizinischen Diagnostik viel verwendet.
Unlängst wurden andere Methoden zum Erhalt von PCR-Produkten entwickelt, die direkt analysiert werden können. Zum Beispiel können spezifisch markierte Primer verwendet werden, wobei das von den amplifizierten Fragmenten ausgesendete Signal anschließend unter Verwendung von relativ aufwendigen Systemen analysiert werden kann. Insbesondere können die zur Amplifizierung dienenden Primer ein Fluorophor tragen, wobei die Messung von dessen Fluoreszenzemission dann die quantitative Bestimmung der amplifizierten DNA ermöglicht. Außerdem bleibt eine Einschränkung dieser Methoden die Schwierigkeit, sie leicht durchzuführen, insofern als sie die Verwendung von aufwändigen Apparaturen erfordern. Zudem schränkt die Gefahr von Störungen diese Methoden weiter ein.
Da die DNA elektroaktive Nukleobasen aufweist, wurden auch Systeme zum elektrochemischen Nachweis entwickelt, die aus dieser Eigenschaft Nutzen ziehen, um die hybridisierte DNA direkt nachzuweisen, ohne einen Marker verwenden zu müssen. Allgemein wird die DNA auf einer Elektrode immobilisiert und der Unterschied zwischen dem vor und nach der Hybridisierung gemessenen elektrischen Strom steht mit der Menge der auf der Elektrode fixierten DNA in Beziehung. Die Durchführung eines solchen Verfahrens ist in der Patentanmeldung WO 93/20230 beschrieben. Dieser direkte Nachweis ohne Marker ist jedoch nicht sehr empfindlich.
Um die Empfindlichkeit weiter zu verbessern, wurden andere Vorgehensweisen entwickelt, die ein elektroaktives Sondenmolekül oder einen elektroaktiven Marker einschalten. So beschreiben Palanti et al. (1996, Analytical Letters, 29, S. 2309-31) verschiedene elektroaktive Verbindungen, die mit der DNA assoziieren können und auf diese Weise durch Anlegen einer Spannung an die Elektrode mittels Oxidation oder Reduktion nachgewiesen werden können. So wurden Übergangsmetallkomplexe, Antibiotika, Acridin- oder Benzamidfarbstoffe und andere DNA-Interkalatoren verwendet. Da diese elektroaktiven Sonden oder Marker bessere Oxidoreduktionseigenschaften als die DNA besitzen, ermöglicht ihre Verwendung den Erhalt eines höheren Signal/Rausch-Verhältnisses und einer besseren Empfindlichkeit. Die Nachweisgrenze für die DNA eines Human-Immundefizienz-Virus Typ 1, die mit Methoden dieser Art erzielt wurden, lag im Nanomol-Bereich (Wang et al., 1996, Analytical Chemistry 68, 2629–34).
Die WO 86/03837 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe, umfassend die Schritte der Fixierung einer Nukleinsäure auf Elektroden, der spezifischen Hybridisierung einer zur fixierten Nukleinsäure komplementären Nukleinsäure, die an ein Enzym gekoppelt ist, und der Zugabe eines Substrats des Enzyms auf solche Weise, dass die Einwirkung des Enzyms auf das Substrat zur Bildung einer elektroaktiven Verbindung führt, die durch Messen der Variation des faradischen Stroms nach Anlegen einer Spannung an die Elektrode nachgewiesen werden kann.
Die vorliegende Erfindung erlaubt es, die Empfindlichkeit eines elektrochemischen Nachweises von DNA dank der Verwendung eines Enzymmarkers zu verbessern, der in der Lage ist, ein inaktives Substrat auf der Oberfläche der Elektrode schnell in eine Verbindung umzuformen, die elektrochemisch nachweisbar ist.
So betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte, die in kleinen Volumina zwischen 5 und 50 μl einschließlich vorgenommen werden:

a. Fixieren einer Nukleinsäure durch spezifische Adsorption auf Elektroden, die mit einer Druckfarbe auf Kohlenstoff-Basis siebgedruckt sind,
b. spezifische Hybridisierung einer komplementären Nukleinsäure mit der fixierten Nukleinsäure, wobei die komplementäre Nukleinsäure ein Erkennungsmittel enthält,
c. Zugabe eines zu dem Erkennungsmittel von (b) komplementären Mittels, wobei das komplementäre Mittel an ein Enzym gekoppelt ist,
d. Zugabe eines Substrats des Enzyms auf solche Weise, dass die Einwirkung des Enzyms auf das Substrat zur Bildung einer elektroaktiven Verbindung führt, die durch Messen der Variation des faradischen Stroms nach Anlegen einer Spannung an die Elektrode nachgewiesen werden kann.

Während des Schritts d) kann man vor der Bildung der elektroaktiven Verbindung eine Kaskade enzymatischer Reaktionen erhalten. Wenn verschiedene Enzyme an das in Schritt c) definierte komplementäre Mittel gekoppelt sind, kann die Verbindung, die nach Einwirkung des ersten Enzyms auf das zugegebene Substrat erhalten wird, selbst Substrat eines anderen Enzyms sein und so weiter, bis schließlich die elektroaktive Verbindung erhalten wird.
Die Messung des Stroms kann mittels elektrochemischer Techniken durchgeführt werden, wie der linearen, zyklischen, Puls-, Differentialpuls-, Rechteckwellen-Voltammetrie oder auch der Amperometrie, der Chronoamperometrie, der Coulometrie, der Chronocoulometrie, der anodischen oder kathodischen Stripping-Potentiometrie.
Die auf der Elektrode fixierte Nukleinsäure kann die Säure sein, die nachgewiesen werden soll (Ziel) oder kann eine Sonde sein. In diesem Fall wird die Zielnukleinsäure später zugegeben. Sie ist mit dem Erkennungsmittel markiert. Eine derartige Markierung kann unter Verwendung von markierten Primern durchgeführt werden, beispielsweise bei einer Amplifikation insbesondere mittels PCR.
Wie vorstehend angegeben, kann die Zielnukleinsäure amplifiziert worden sein, insbesondere mittels PCR. Die Nukleinsäure, die an der Oberfläche der Elektrode adsorbiert wird, liegt bevorzugt als Einzelstrang vor, entweder weil sie auf natürliche Weise als solcher vorliegt oder weil sie eine denaturierte doppelsträngige Nukleinsäure ist, um die Hybridisierung der komplementären Nukleinsäure zu ermöglichen. Eine solche denaturierte doppelsträngige Nukleinsäure wird im Sinn der Erfindung auch als einzelsträngig bezeichnet. Wenn die Zielnukleinsäure doppelsträngig ist, wird die Hybridisierung als die Bildung eines dreisträngigen Nukleinsäurekomplexes verstanden.
Eine 'Sonde' wird im Sinn der Erfindung als ein einzelsträngiges Nukleinsäurefragment oder als ein denaturiertes doppelsträngiges Fragment definiert, das zum Beispiel 12 bis mehrere Kilobasen, insbesondere 15 bis mehrere hundert Basen, vorzugsweise 15 bis 50 oder 100 Basen, umfasst, das unter vorgegebenen Bedingungen eine Hybridisierungsspezifität besitzt, um einen Hybridisierungskomplex mit einer Zielnukleinsäure zu bilden.
Unter 'Nukleinsäure' werden insbesondere DNA, RNA oder PNAs verstanden. Diese Nukleinsäure kann als Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Sie kann auch modifiziert sein, insbesondere auf der Ebene der Bindungen zwischen den verschiedenen Elementen. Insbesondere kann eher an Thiophosphatbindungen als an Phosphodiesterbindungen gedacht werden. Sie kann auch radioaktiv oder mit fluoreszierenden, lumineszierenden oder metallorganischen Verbindungen markiert sein.
Unter 'Erkennungsmittel' wird eine Verbindung verstanden, die an die Nukleinsäuren gekoppelt und von einer anderen Verbindung, die als komplementäres Mittel bezeichnet wird, spezifisch erkannt werden kann. Beispiele für Erkennungs- und komplementäre Mittel, die verwendet werden können, umfassen insbesondere Antigen-Antikörper-, Hapten-Antikörper- oder Biotin-Streptavidin oder -Avidin-Komplexe. Diese letzteren Mittel werden für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt.
Unter 'biologischer Probe' wird jede Probe verstanden, die biologisches Material enthält. Dies umfasst insbesondere in vitro gehaltene Zellkulturen oder Proben, die aus einem Tier oder einem Menschen erhalten werden können (Biopsien, Blutproben).
Die Anmelderin hat gezeigt, dass es das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, für den Nachweis von Nukleinsäuren, insbesondere amplifizierter DNA, eine extrem niedrige Empfindlichkeitsgrenze im Attomol-Bereich zu erreichen. Diese Methode hat im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Methoden den Vorteil, mehrere Amplifikationsschritte aufzuweisen:

– den DNA-Amplifikationsschritt mittels PCR, wenn dieser durchgeführt wird,
– einen als enzymatische Amplifikation bezeichneten Schritt bei der Zugabe des Peroxidasesubstrates. Die gemessene Variation des faradischen Stroms ist auf die Konzentration der in der Lösung vorliegenden elektroaktiven Verbindung zurückzuführen, wobei die Konzentration verändert werden kann, indem die Inkubationszeit Substrat/Enzym variiert wird,
– gegebenenfalls den Schritt der Enzymkaskade, wie er weiter oben beschrieben wurde.

Außerdem kann ein Molekül des komplementären Mittels an mehrere Enzymmoleküle gekoppelt sein, was eine zusätzliche Quelle der Signalamplifikation ist.
Der Nachweis der Nukleinsäure durch das erfindungsgemäße Verfahren erfolgt in der Tat eher durch den Nachweis einer elektrochemischen Verbindung, als durch den Nachweis der Nukleinsäure und beruht eher auf der Amplifikation eines Signals als auf der Amplifikation des Ziels.
Außerdem kann das erfindungsgemäße Verfahren mühelos miniaturisiert und/oder automatisiert werden, was die Gefahr der Kontamination der Proben verringert und das Durchführen von Analysen zu geringen Kosten ermöglicht. Es ist sogar vorteilhaft, eine solche Miniaturisierung vorzunehmen.
Die Anmelderin hat gezeigt, dass die Empfindlichkeit des Systems überraschenderweise verbessert ist, wenn in kleinen Volumina gearbeitet wird. Unter kleinen Volumina sind Volumina zu verstehen, die zwischen mehreren Mikrolitern und mehreren zehn Mikrolitern liegen, insbesondere 5 bis 50 μl, vorzugsweise 10 μl betragen.
Dadurch, dass die Variation des faradischen Stroms an der Oberfläche der Elektrode nachgewiesen wird, ist es vorteilhaft, das Verhältnis S/V (Oberfläche der Elektrode/Volumen der Lösung) zu erhöhen, um ein besseres Signal zu erhalten.
Die Elektroden sind modifizierte oder nicht-modifizierte Elektroden, welche mit einer Druckfarbe auf Kohlenstoffbasis siebgedruckt sind. Derartige Elektroden wurden zuvor im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in der Patentanmeldung WO 93/20230 oder in Bagel et al. (1997, Analytical Chemistry, 69, S. 4688–94). Insbesondere werden Elektroden verwendet, die mit einer Druckfarbe siebgedruckt sind, welche Kohlenstoff und Styrolderivate enthält. Ein bevorzugtes Derivat ist Polystyrol. Das (Gewichts-)Verhältnis Graphit/Polystyrol beträgt zwischen 1/10 und 10/1, vorzugsweise zwischen 1/5 und 5/1, noch bevorzugter zwischen 1/2 und 2/1 einschließlich. Besonders bevorzugt wird ein Verhältnis zwischen 5/4 und 7/4, insbesondere 3/2 einschließlich. Das verwendete Lösungsmittel muss eine gute Homogenisierung der in der Druckfarbe vorliegenden Verbindungen zulassen und schnell 'trocknen' können (ungefähr 30 Minuten bis 3 Stunden), insbesondere durch Verdampfung. Es wird bevorzugt, dass die Verdampfung bei Umgebungstemperatur erfolgt. Der Siebdruck wird vorzugsweise auf flexiblen Blättern aus Polyester oder PVC durchgeführt. Diese Beschreibungen entsprechen speziellen Beispielen von Elektroden, aber der Fachmann kann diese selbstverständlich entsprechend der angestrebten Verwendung optimieren.
Die Erfindung ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren, die in der analysierten Lösung (die eine biologische Probe sein kann) vorliegen, auf der Elektrode spezifisch adsorbiert werden.
Hierfür wird ein Fixierungspuffer verwendet, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er 1,5 M Ammoniumacetat enthält. Der Puffer kann insbesondere auf der Basis von PBS (4,3 mM NaH₂PO₄; 15,1 mM Na₂HPO₄; 50 mM NaCl, pH 7,4) oder Tris (50 mM Tris; 1 mM MgCl₂ 6H₂O; 50 mM NaCl, pH 7,4) sein.
Bei der Zugabe der mit dem Erkennungsmittel markierten Sonde ist es besser, wenn diese nur an die Ziel-DNA und nicht unspezifisch an die Elektroden bindet. Eine solche Bindung würde nämlich zur späteren Bindung des komplementären Mittels und nach Zugabe des Enzymsubstrates zur Bildung der elektroaktiven Verbindung führen. Man würde dann fälschlicherweise eine positive Reaktion erhalten.
Der Hybridisierungspuffer muss demgemäß die spezifische Hybridisierung der markierten Sonde an die Ziel-DNA erlauben. Man verwendet klassische Hybridisierungspuffer, wie sie in Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, siehe insbesondere S. 9.54) beschrieben werden. Ein Hybridisierungspuffer, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, enthält 6 × SSC, 0,1% SDS.
Wird ein einziges Enzym verwendet, so besitzt dieses vorzugsweise eine Oxidaseaktivität. Es kann zum Beispiel eine Peroxidase, eine Glucoseoxidase sein, aber es kann auch eine andere Enzymart sein, wie eine Hydrolase, wie alkalische Phophatase. Es wird bevorzugt eine Peroxidase verwendet, insbesondere Meerrettichperoxidase (horseraddish peroxydase, HRP). Ein bevorzugtes Substrat der an Streptavidin gebundenen Peroxidase ist ortho-Phenylendiamin (OPD). Die Peroxidase katalysiert die Wechselwirkung von OPD mit H₂O₂, was eine elektroaktive wasserlösliche Farbverbindung ergibt: 2,2'-Diaminoazobenzol (DAA). Es können aber auch andere Substrate der Peroxidase verwendet werden, zum Beispiel Tetramethylbenzidin (TMP), o-Phenylendiamin- und Diaminoazobenzolderivate, Hydrochinon und dessen Derivate, 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure), Phenoxazine und Analoga, 4-Aminoantipyrin/Phenol- oder 4-Aminoantipyrin/Anilin-Systeme, Ferrocene und Analoga.
Wenn der Nachweis nach einer Enzymkaskade durchgeführt wird, ist es wichtig, dass das zuletzt einwirkende Enzym das letzte Substrat in eine elektroaktive Verbindung umwandelt. Die vorangehenden Enzyme, die zur Amplifikation des Signals dienen, können klassische in der Biologie verwendete Enzyme sein und unter den Versuchsbedingungen aktiv sein. Vorteilhafte Enzyme sind zum Beispiel Enzyme, die die Hydrolyse von Zuckern ermöglichen, wie Glucosidasen und dergleichen.
Die Erfindung betrifft auch einen Reagenzienkit für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der

a. einen 1,5 M Ammoniumacetat enthaltenden Fixierungspuffer, der die Fixierung der Nukleinsäure auf den Elektroden ermöglicht, die mit einer Druckfarbe auf der Basis von Kohlenstoff siebgedruckt sind,
b. einen Hybridisierungspuffer, der die spezifische Hybridisierung der komplementären Nukleinsäure mit der auf den Elektroden fixierten Nukleinsäure ermöglicht,
c. ein Erkennungsmittel, um die komplementäre Nukleinsäure zu markieren,
d. ein zum Erkennungsmittel (c) komplementäres Mittel, das an ein Enzym gekoppelt ist, und
e. ein Substrat des Enzyms, das zur Bildung einer elektroaktiven Verbindung führt, welche eine Messung der Variation des faradischen Stroms der Lösung ermöglicht

Weitere Elemente können hinzugefügt werden, insbesondere Primer zur Amplifikation der Zielnukleinsäure, oder ein Puffer, der die Denaturierung der doppelsträngigen Nukleinsäure erlaubt, falls die Ausgangsnukleinsäure als Doppelstrang vorliegt und eine einzelsträngige Nukleinsäure an der Elektroden fixiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung von DNA aus verschiedenen Quellen durchgeführt werden. Insbesondere kann der Nachweis von DNA bakterieller, viraler oder zellulärer Herkunft genannt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um die Über- oder Unterexpression bestimmter Gene nachzuweisen, die bei Krebserscheinungen eine Rolle spielen, zum Beispiel nach Schritten der reversen Transkription – Amplifikation von Boten-RNA, die aus einer Biopsie präpariert werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die quantitative Bestimmung der Zielnukleinsäure, vorausgesetzt, man verfügt über einen internen Standard.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch durchgeführt werden, um mögliche bakterielle Kontaminationen nachzuweisen und/oder quantitativ zu bestimmen, entweder in Lebensmittelproben (insbesondere Kontaminationen mit Salmonella, Listeria, enterohämorrhagischen E. coli O157 und/oder O11 ...). Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch beim Nachweis und bei der Diagnose von bakteriellen Infektionen beim Menschen oder in der Veterinärmedizin von großem Nutzen. Genannt werden können Infektionen mit M. tuberculosis, die in menschlichem Sputum nachgewiesen werden können, oder die Charakterisierung anderer Infektionen, für die man ein schnelles und zuverlässiges Ergebnis wünscht.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders für den Nachweis von Viren im Organismus geeignet, da es es ermöglicht, eine ausgezeichnete Empfindlichkeit zu erzielen und somit eine sehr geringe Anzahl von Kopien viraler DNA nachzuweisen. Insbesondere kann das Vorliegen eines Virus in einer biologischen Probe nachgewiesen werden, indem nach einem Protokoll verfahren wird, das die folgenden Schritte umfasst:

a. eine spezifische Amplifikation der DNA der biologischen Probe, bevorzugt mittels PCR unter Verwendung von Primern, die für den gesuchten Virus spezifisch sind,
b. die Isolierung und Analyse der durch Amplifikation erhaltenen DNA durch ein erfindungsgemäßes Verfahren oder unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Kits.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es außerdem, in einer Probe gleichzeitig das Vorliegen von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Quellen oder Organismen nachzuweisen. Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Nachweis eines faradischen Stroms, der spezifisch für die elektrochemische Verbindung ist, die durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat gebildet wird.
Will man das Vorliegen von Nukleinsäuren aus verschiedenen Quellen in einer Probe nachweisen, kann man nach folgendem Protokoll verfahren:

a. man bewirkt eine fakultative Amplifikation und die Fixierung der Ziel-Nukleinsäuren der verschiedenen Organismen auf den Elektroden, die mit einer Druckfarbe auf Kohlenstoff-Basis siebgedruckt sind,
b. man bewirkt die Hybridisierung mit den zu den Zielen komplementären Nukleinsäuren, wobei jede von ihnen an ein verschiedenes Erkennungsmittel gebunden ist,
c. man gibt die zu den Erkennungsmitteln komplementären Mittel zu, die an verschiedene enzymatische Marker gekoppelt sind,
d. man gibt die verschiedenen Substrate der Enzyme zu, um die verschiedenen elektroaktiven Verbindungen zu erzeugen,
e. man misst den faradischen Strom, der den verschiedenen elektroaktiven Verbindungen auf der Oberfläche der Elektrode entspricht, indem man die für jede Verbindung spezifische Spannung anlegt.

Die unterschiedlichen Marker aus Schritt c) sind enzymatische oder andere Marker. Die Substrate der Enzyme erzeugen verschiedene elektroaktive Verbindungen und die anderen Marker sind redoxspezifische Marker. Die auf den Elektroden fixierten Zielnukleinsäuren sind bevorzugt einzelsträngig.
Da die Erzeugung des faradischen Stroms mit dem Vorliegen der spezifischen elektroaktiven Verbindung verbunden ist, kann daraus auf das Vorliegen oder Fehlen der Nukleinsäuren in der Ausgangsprobe geschlossen werden.
Selbstverständlich kann das vorstehend angeführte Verfahrensbeispiel abgeändert werden, zum Beispiel indem die für die verschiedenen Nukleinsäuren spezifischen Sonden auf den Elektroden fixiert werden und indem die Zielnukleinsäuren an die verschiedenen Erkennungsmittel gekoppelt werden, zum Beispiel während eines Amplifikationsschrittes mittels PCR.
Dieses Verfahren ermöglicht es somit, mikrobielle oder virale Verunreinigungen in Lebensmittelproben oder in einer biologischen Probe schnell und mühelos zu identifizieren.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Analyse einer biologischen Probe ist es allgemein zu empfehlen, eine vorherige spezifische Amplifikation der nachzuweisenden DNA vorzunehmen. Die PCR-Reaktion kann direkt an der Probe oder nach vorheriger Reinigung der Proben-DNA vorgenommen werden. Entsprechend der zur Verfügung stehenden Probenmenge und den Zielen, die von der Person verfolgt werden, die das erfindungsgemäße Verfahren durchführt, wählt man die eine oder andere Technik. Der Fachmann kennt die Techniken, die zur Isolierung von DNA aus einer biologischen Probe anzuwenden sind.
Für den Fall, dass das Verfahren in einem automatisierten und/oder miniaturisierten System durchgeführt wird, kann die Isolierung der DNA direkt auf den Elektroden durchgeführt werden, zum Beispiel unter Verwendung der Lehre des Patents WO 97/41219, so dass die auf diese Weise isolierte DNA anschließend mittels PCR amplifiziert werden kann.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens auf einer siebgedruckten Elektrode.
2: Voltammogramm, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf Elektroden erhalten wurde, die a) mit der amplifizierten DNA des HCMV (4.10⁹ Kopien in der Lösung) und b) mit der amplifizierten DNA des ETS2-Gens beschichtet sind.
3: Eichkurven (S/R, Signal/Rauschen) der mittels mehrerer Methoden amplifizierten DNA des HCMV. Man verwendet eine logarithmische Skala.

• a–c: Hybridisierung auf Elektroden mit kolorimetrischem (a) oder elektrochemischem (b, c) Nachweis.
• d: Hybridisierung und konventioneller kolorimetrischer Nachweis auf Mikrotiterplatten.
• e: Quantitative Bestimmung der DNA mittels ETB-Fluoreszenz ausgehend von einer Agarosegelelektrophorese.

4: Vergleichsstudie der Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens durch elektrochemischen (schwarz), spektrophotometrischen (weiss) Nachweis auf Elektroden oder durch die konventionelle kolorimetrische Methode (grau). Es werden amplifizierte Fragmente des ETS2-Gens, von EBV- und HCV-Viren und eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle der amplifizierten HCMV-DNA verwendet. Logarithmische Skala.
5: Vergleichsstudie der Kapazität des Nachweises von amplifizierter HCMV-DNA in menschlichen Proben (1–10) durch die konventionelle kolorimetrische Methode auf Mikroplatten (weiss) oder das erfindungsgemäße Verfahren (schwarz). Es wurde eine Positivkontrolle (+) und zwei Negativkontrollen (–) eingeschlossen. Logarithmische Skala.
BEISPIELE
Beispiel 1: DNA-Extraktion
Die HCMV-DNA wird gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit aus der humanen embryonalen Lungenfibroblastenzelllinie MRC5 extrahiert, die mit dem Virusstamm AD169 infiziert wurde. Diese Technik ist dem Fachmann bekannt und verschiedene Hersteller bieten Kits an, die eine solche Extraktion ermöglichen. Insbesondere konnte festgestellt werden, dass es die Kits Invisorb von Invitek oder QiaAmpBlood von Qiagen erlauben, gute Ergebnisse zu erzielen.
Die Zellen werden lysiert, auf Siliciumdioxid adsorbiert und dann mittels Zentrifugation gewaschen. Die DNA wird in einem geeigneten Puffer eluiert und der Träger wird verworfen. Die DNA kann anschließend amplifiziert werden.
Beispiel 2: PCR-Amplifikation der HCMV-DNA
Man verwendet die Primer AC1 (SEQ ID NO 1) und AC2 (SEQ ID NO 2), die ein 406 Basenpaare langes Fragment eines konservierten Bereichs amplifizieren, der in der HIND III X-Region des US-Genoms des Cytomegalovirus liegt (Drouet et al., 1993, J. Virol. Methods, 45, 259–76).
Die PCR-Reaktionen werden gemäß den üblichen dem Fachmann bekannten Techniken an einer DNA-Matrize durchgeführt, wie sie in Beispiel 1 hergestellt wird. Es werden 35 Zyklen mit den folgenden Merkmalen durchgeführt: Denaturierung bei 92°C – 15 s, Hybridisierung bei 55°C – 30 s, Elongation bei 72°C – 30 s. Der Denaturierungsschritt dauert 7 min für den ersten Zyklus und auf den Elongationsschritt des letzten Zyklus folgt ein Halten der Temperatur bei 72°C während 2 weiterer Minuten.
Bei jeder Versuchsserie wird eine Negativkontrolle eingeschlossen, die keine DNA-Matrize enthält.
Beispiel 3: Quantitative Bestimmung der DNA und Herstellung einer Konzentrationsreihe von amplifizierter HMVC-DNA
Es werden Verdünnungsreihen der gemäß Beispiel 2 amplifizierten DNA hergestellt und in Gegenwart einer kalibrierten Menge DNA auf Agarosegel mit ETB analysiert. Man stellt fest, dass die Konzentration der amplifizierten DNA 10,5 pmol/ml beträgt, was 6,3·10¹² Kopien/ml entspricht.
Durch serielle Verdünnungen der konzentrierten Lösung der amplifizierten DNA in der Negativkontrolle der PCR wird eine Verdünnungsreihe (von 6,3·10⁴ bis 6,3·10¹² Kopien/ml) hergestellt.
Beispiel 4: Hybridisierung auf Elektroden und elektrochemischer oder kolorimetrischer Nachweis
Der Nachweis der DNA durch das erfindungsgemäße Verfahren erfolgt in vier Schritten:

a. Immobilisierung der Ziel-DNA
b. Hybridisierung der markierten Sonde
c. Inkubation des Enzymkonjugates
d. Zugabe des Nachweissubstrates
e. Voltammetrischer oder kolorimetrischer Nachweis des von dem Enzym erzeugten Produkts.

2 μl amplifizierte DNA werden in einem alkalischen Medium (0,4 M Natronlauge) 10 min bei Umgebungstemperatur denaturiert.
Anschließend werden 300 μl des 1,5 M Ammoniumacetat enthaltenden Fixierungspuffers zugegeben und die Elektroden eingetaucht. Es wird über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Elektroden werden dann mit destilliertem Wasser gewaschen und 30 min bei 37°C in einem Hybridisierungspuffer (6 × SSC, 0,1% SDS) inkubiert, der 100 ng/ml einer biotinylierten AC3-Sonde enthält, die für die amplifizierte Sequenz des HCMV (SEQ ID NO 3) spezifisch ist.
Dann wird ein Waschzyklus durchgeführt, der aus 5 1-minütigen Inkubationen in 500 μl frisch hergestellter Waschlösung (6 × SSC, 1% SDS) besteht.
Anschließend werden die Elektroden 15 min bei Umgebungstemperatur in 100 μl Puffer (100 mM Tris HCl pH 7,5–50 mM NaCl–5 g/l Magermilch) inkubiert, der das Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (1,6 Einheiten/ml) enthält, und unmittelbar danach wird ein Waschzyklus durchgeführt, wie er vorstehend beschrieben ist.
Die Elektrode wird dann in 50 μl einer OPD-Substratlösung (40 mM Zitronensäure, 150 mM Na₂HPO₄, 5 mM NaCl, 0,02% H₂O₂, eine OPD-Tablette (Argène-Biosoft) in 10 ml Puffer) eingetaucht und es wird bei Umgebungstemperatur 30 min im Dunkeln inkubiert.
Das wasserlösliche, farbige und elektroaktive Reaktionsprodukt 2,2'-Diaminoazobenzol wird mittels Absorptionsspektrophotometrie und Differentialpulsvoltammetrie (DPV) nachgewiesen, um die beiden Methoden zu vergleichen.
Für die spektrophotometrische Ablesung werden die Elektroden entfernt und die Ablesung der Vertiefungen wird bei 492 nm durchgeführt.
Für die Ablesung mittels DPV wird eine Pt-Elektrode als Gegenelektrode und eine Ag/AgCl-Elektrode als Pseudoreferenzelektrode verwendet. Man verwendet einen Potentiostat μ-Autolab (von EcoChemie), der durch Verwendung des Programms GPSE 3 (EcoChemie) mit einer Benutzeroberfläche eines PC verbunden ist. Die DPV wird mit einer Impulshöhe von 25 mV, einer Spannungsstufe von 5 mV, einer Impulsdauer von 0,05 s und einem Intervall von 0,5 s zwischen zwei Impulsen durchgeführt.
Bei jeder Versuchsreihe werden 2 Negativkontrollen (alle Reagenzien, aber keine DNA) eingeschlossen. So werden die optischen Werte oder die Stromwerte durch die Werte dividiert, die sich für diese Kontrolle ergeben, und es wird angenommen, dass die Proben positiv sind, wenn das Verhältnis Antwort/Blindwert über 2 beträgt.
Man erhält folgende Ergebnisse:
a. Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von DNA
Die 2 zeigt die durch DPV aufgenommenen Peaks, die für eine Elektrode, die mit der DNA des amplifizierten HCMV in Kontakt gebracht wurde (2a), oder für die Negativkontrolle (2b) erhalten wurden. Diese Figur zeigt eindeutig, dass das erfindungsgemäße Verfahren den Nachweis von in Lösung vorliegender DNA mittels DPV erlaubt.
b. Spezifität, Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens
Um die Spezifität und die Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu messen, wurden die Peaks verglichen, die mit 30 Elektroden erhalten wurden, welche entweder mit amplifizierter HCMV-DNA oder mit amplifizierter DNA eines humanen ETS2-Gens beschichtet waren. Da die AC3-Sonde spezifisch für HCMV ist, darf sie nicht an die DNA des ETS2-Gens binden. Es wird demnach keine enzymatische Reaktion stattfinden und man sollte somit keinen Strompeak für das ETS2-Gen beobachten.
Man erhält die folgenden Stromwerte:
HCMV: 3300 ± 100 nA (Standardabweichung 3%)
ETS2: 61 ± 12 nA (Standardabweichung 19%)
Dies zeigt, dass das Verfahren reproduzierbar ist und dass sich die Sonde in dem verwendeten spezifischen Hybridisierungspuffer nicht passiv an die Elektroden bindet, sondern an die komplementären Sequenzen, die bereits auf den Elektroden adsorbiert sind.
c. Nachweisgrenzen des erfindungsgemäßen Verfahrens Vergleich mit der kolorimetrischen Methode
Die Konzentration der amplifizierten HCMV-DNA wird im Bereich von 0,1 bis 10⁶ Attomol (6,3·10⁴ bis 6,3·10¹¹ Kopien/ml) variiert. Man verwendet die Eigenschaften des durch die Enzymreaktion erzeugten Produkts zum Vergleich der voltammetrischen und kolorimetrischen Methoden.
Die 3a und 3b zeigen die Kurven, die mit der kolorimetrischen beziehungsweise elektrochemischen Methode erzielt wurden.
Es wird ebenfalls ein Vergleich mit anderen Methoden durchgeführt: Kolorimetrie gemäß dem kommerziellen Kit Hybridowell^TM (ArgèneBiosoft) (3d) oder Fluoreszenzdensitometrie auf Agarosegel (3e).
Es ist zu beobachten, dass die Eichkurve (3b) der amplifizierten HCMV-DNA im Bereich 50–2000 Attomol (3·10⁷ amplifizierte DNA-Moleküle) linear ist, was einen Nachweis von ungefähr 10-mal weniger DNA-Molekülen ermöglicht als mit der kolorimetrischen Methode unter den gleichen Bedingungen (3a). Auf alle Fälle ist die Empfindlichkeit der Methode weit höher als die der Fluoreszenz auf Agarosegel (3e, Nachweisgrenze von 14 Femtomol) und entspricht derjenigen der kolorimetrischen Systeme auf Mikrotiterplatten (3d).
Um die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erhöhen, wurde das OPD-Substratvolumen, das zum Nachweis zugegeben wurde, verringert (10 μl anstellen von 50 μl). Die erhaltene Kurve ist in 3c dargestellt, und es ist festzustellen, dass die Nachweisgrenze dann auf 0,6 Attomol (3,6.10⁵ amplifizierte DNA-Moleküle) gebracht wird. Das ist 83-mal empfindlicher als die kolorimetrische Technik auf Mikrotiterplatten.
In den nachfolgenden Versuchen wird jedoch für die Substratlösung ein Volumen von 50 μl beibehalten.
d. Selektivität, Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens
Es wurden unterschiedliche DNAs verwendet, um die Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens zu bewerten. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Es wurde ein Vergleich mit den anderen beiden kolorimetrischen Methoden, der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen und der Methode auf Mikrotiterplatten, durchgeführt. Die verwendeten DNAs sind die amplifizierte HCMV-DNA und die DNA des humanen ETS2-Gens und die viralen DNAs des Epstein-Barr-Virus (EBV) oder des Hepatitis C-Virus (HCV).
Man stellt fest, dass bei Verwendung der für diese DNA spezifischen Sonde die Methode einen spezifischen und selektiven Nachweis der HCMV-DNA ermöglicht, was bestätigt, dass diese Sonde beim Hybridisierungsschritt nicht passiv an die Elektroden adsorbiert wird.
e. Charakterisierung klinischer Proben
Das erfindungsgemäße Verfahren wird auf 10 Proben von humanem Serum (4 negative, 6 positive, wie zuvor durch quantitative PCR bestimmt wurde, und die zwischen 2 und 99 Kopien/μl HCMV-DNA vor Amplifikation aufweisen) angewandt, an welchen eine Amplifikation vorgenommen wurde, wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielten Ergebnisse werden mit denen verglichen, die mit der konventionellen kolorimetrischen Methode in Mikrotiterplatten erzielt wurden.
Die 5 zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren keine falschen Positivproben oder falschen Negativproben liefert und dass die Ergebnisse, die für alle untersuchten Proben erhalten wurden, mit den Erwartungen übereinstimmen.
Es zeigt sich außerdem, dass das erfindungsgemäße Verfahren mindestens genauso empfindlich ist wie die konventionelle kolorimetrische Methode und dass, wenn die Anzahl der Ausgangskopien gering ist, das erfindungsgemäße Verfahren es ermöglicht, ein besseres Signal/Rausch-Verhältnis zu erzielen (Proben 5 und 6).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte, die in kleinen Volumina zwischen 5 und 50 μl einschließlich vorgenommen werden: a. Fixieren einer Nukleinsäure durch spezifische Adsorption auf Elektroden, die mit einer Druckfarbe auf Kohlenstoff-Basis siebgedruckt sind, b. spezifische Hybridisierung einer komplementären Nukleinsäure mit der fixierten Nukleinsäure, wobei die komplementäre Nukleinsäure ein Erkennungsmittel enthält, c. Zugabe eines zu dem Erkennungsmittel von (b) komplementären Mittels, wobei das komplementäre Mittel an ein Enzym gekoppelt ist, d. Zugabe eines Substrats des Enzyms auf solche Weise, dass die Einwirkung des Enzyms auf das Substrat zur Bildung einer elektroaktiven Verbindung führt, die durch Messen der Variation des faradischen Stroms nach Anlegen eines Potentials an der Elektrode nachgewiesen werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Kaskade von enzymatischen Reaktionen während des Schritts d) vor der Bildung der elektroaktiven Zusammensetzung umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die auf den Elektroden fixierte einzelsträngige Nukleinsäure die Ziel-Nukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es darüber hinaus einen Schritt der Amplifikation vor dem Schritt der Fixierung der Nukleinsäure auf den Elektroden umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt a) der Fixierung mit einem Fixierungspuffer bewirkt wird, der 1,5 M Ammoniumacetat enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Druckfarbe für den Siebdruck eine Mischung von Kohlenstoff und styrolischen Derivaten enthält.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym, das die Bildung der elektroaktiven Verbindung ermöglicht, eine Oxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidase eine Peroxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Peroxidase Meerrettichperoxidase ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat der Peroxidase ortho-Phenylendiamin OPD ist.
Reagenzienkit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es enthält: a. einen 1,5 M Ammoniumacetat enthaltenden Fixierungspuffer, der die spezifische Fixierung der Nukleinsäure auf den Elektroden ermöglicht, die mit einer Druckfarbe auf der Basis von Kohlenstoff siebgedruckt sind, b. einen Hybridisierungspuffer, der die spezifische Hybridisierung der komplementären Nukleinsäure mit der auf den Elektroden fixierten Nukleinsäure ermöglicht, c. ein Erkennungsmittel, um die komplementäre Nukleinsäure zu markieren, d. ein zum Erkennungsmittel (c) komplementäres Mittel, das an ein Enzym gekoppelt ist, und e. ein Substrat des Enzyms, das zur Bildung einer elektroaktiven Verbindung führt, welche eine Messung der Variation des faradischen Stroms der Lösung ermöglicht.
Verfahren zum Nachweis von Viren in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a. eine spezifische Amplifikation der DNA der biologischen Probe, bevorzugt mittels PCR unter Verwendung von spezifischen Primern des gesuchten Virus, b. die Isolierung und Analyse der durch Amplifikation erhaltenen DNA durch ein Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 oder unter Verwendung eines Kits nach Anspruch 11.
Verfahren zum Nachweis von mehreren verschiedenen Organismen in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst, die in kleinen Volumina zwischen 5 und 50 μl einschließlich vorgenommen werden: a. man bewirkt eine fakultative Amplifikation und die Fixierung der Ziel-Nukleinsäuren der verschiedenen Organismen durch spezifische Adsorption auf der Elektrode, die mit einer Druckfarbe auf Kohlenstoff-Basis siebgedruckt ist, b. man bewirkt die Hybridisierung mit den zu den Zielen komplementären Nukleinsäuren, wobei jede von ihnen an ein verschiedenes Erkennungsmittel gebunden ist, c. man gibt die zu den Erkennungsmitteln komplementären Mittel dazu, die an verschiedene enzymatische Marker gekoppelt sind, d. man gibt die verschiedenen Substrate der Enzyme dazu, um die verschiedenen elektroaktiven Verbindungen zu erzeugen, e. man misst den faradischen Strom, der den verschiedenen elektroaktiven Verbindungen auf der Oberfläche der Elektrode entspricht, indem man das spezifische Potential jeder Verbindung anlegt.