ES2267717T3 - Procedimiento electroquimico de deteccion de acidos nucleicos. - Google Patents
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- C12Q1/682—Signal amplification
Abstract
Procedimiento de detección y/o de dosificación de ácidos nucleicos en una muestra, que comprende las siguientes etapas realizadas en unos pequeños volúmenes comprendidos entre 5 y 50 µl: a. la fijación de un ácido nucleico por adsorción específica sobre unos electrodos serigrafiados con una tinta a base de carbono, b. la hibridación específica de un ácido nucleico complementario al ácido nucleico fijado, conteniendo dicho ácido nucleico complementario un agente de reconocimiento, c. la adición de un agente complementario al agente de reconocimiento de (b), estando acoplado dicho agente complementario a una enzima, d. la adición de un sustrato de dicha enzima de tal manera que la acción de dicha enzima sobre dicho sustrato lleva a la formación de un compuesto electroactivo que puede ser detectado mediante la medición de la variación de la corriente farádica después de la aplicación de un potencial al electrodo.
Description
Procedimiento electroquímico de detección de
ácidos nucleicos.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento por electroquímica de detección y/o de dosificación de
moléculas de ácidos nucleicos en una muestra biológica, así como a
un estuche de reactivos que permite realizar este procedimiento. Un
modo particular de realización de este procedimiento permite
detectar la presencia de contaminación por un agente patógeno en una
muestra biológica.
Hoy en día se puede detectar la presencia de
agentes patógenos en un organismo mediante varios métodos. La
mayoría realizan una etapa previa de amplificación, generalmente
mediante una reacción de polimerización en cadena (PCR), que permite
amplificar de manera específica unos fragmentos de ADN del genoma
viral. Este método extremadamente sensible permite detectar un
número muy bajo de moléculas en el organismo y, bajo ciertas
condiciones, cuantificar el número de copias del genoma del agente
presentes inicialmente.
Esta técnica es a priori fácil de
utilizar y permite obtener unos resultados fiables.
Los métodos utilizados tradicionalmente para
analizar los productos de PCR son la electroforesis, con coloración
del ADN con bromuro de etidio (BET), o unas pruebas de hibridación,
utilizando unas sondas marcadas por ejemplo con unos compuestos
radioactivos, luminiscentes o también detectables por colorimetría.
Estas técnicas de hibridación son ampliamente utilizadas en los
diagnósticos médicos.
Se han desarrollado recientemente otros métodos
para la obtención de productos de PCR que sean directamente
susceptibles de análisis. Por ejemplo, se pueden utilizar unos
iniciadores marcados de forma específica. La señal emitida por los
fragmentos amplificados es seguidamente analizada utilizando unos
sistemas relativamente pesados. En particular, los iniciadores que
sirven para la amplificación pueden llevar un fluoróforo cuya medida
de la emisión de fluorescencia permitirá determinar la cantidad de
ADN amplificada. Por otra parte, una limitación de estos métodos es
que no son fáciles de realizar, en la medida en que necesitan la
utilización de equipos pesados. Por otra parte, el riesgo de
interferencias limita todavía más estos métodos.
Como el ADN posee unas bases nucleicas
electroactivas, se han desarrollado también unos sistemas
electroquímicos de detección sacando partido de esta propiedad para
detectar directamente el ADN hibridado, sin tener que hacer
intervenir un marcador. De manera general, el ADN es inmovilizado
sobre un electrodo, y la diferencia de corriente eléctrica mediada
antes y después de la hibridación está relacionada con la cantidad
de ADN fijado sobre el electrodo. Se describe en el documento WO
93/20230 la realización de un procedimiento de este tipo. De todas
formas, esta detección directa sin marcador no es muy sensible.
Con la finalidad de mejorar también la
sensibilidad, se han desarrollado otras aproximaciones que hacen
intervenir una molécula sonda electroactiva o un marcador
electroactivo. Así, Palanti et al. (1996, Analytical
Letters, 29. págs. 2309-31) describen
diferentes compuestos electroactivos, que pueden asociarse con el
ADN y así ser detectados por oxidación o reducción aplicando un
potencial al electrodo. Así se han empleado unos complejos de
metales de transición, unos antibióticos, unos colorantes de
acridina o de benzamida y otros intercalados del ADN. Como estas
sondas o marcadores electroactivos poseen mejores propiedades de
oxirreducción que el ADN, su utilización permite obtener una
relación señal/ruido superior y una mejor sensibilidad. El umbral de
detección del ADN de un virus de la inmunodeficiencia adquirida
humano del tipo I, obtenido con unos métodos de este tipo, era del
orden del nanomol (Wang et al., 1996 Analytical
Chemistry. 68. 2699-34).
El documento WO86/03837 describe un
procedimiento de detección y/o de dosificación de ácidos nucleicos
en una muestra, que comprende las etapas de fijación de un ácido
nucleico sobre unos electrodos, la hibridación específica de un
ácido nucleico complementario con el ácido nucleico fijado acoplado
a una enzima, y adición de un sustrato de dicha enzima de tal manera
que la acción de dicha enzima sobre dicho sustrato lleve a la
formación de un compuesto electroactivo que pueda ser detectado
mediante la medición de la variación de la corriente farádica
después de aplicar un potencial al electrodo.
La presente invención permite mejorar la
sensibilidad de una detección electroquímica del ADN gracias a la
utilización de un marcador enzimático capaz de transformar
rápidamente un sustrato inactivo en la superficie del electrodo en
un compuesto detectable electroquímicamente.
Así, la presente invención tiene por objeto un
procedimiento de detección y/o de dosificación de ácidos nucleicos
en una muestra que comprende las siguientes etapas en pequeños
volúmenes comprendidos entre 5 y 50 \mul:
- a.
- la fijación de un ácido nucleico por adsorción específica sobre unos electrodos serigrafiados con una tinta a base de carbono,
- b.
- la hibridación específica de un ácido nucleico complementario del ácido nucleico fijado, conteniendo dicho ácido nucleico complementario un agente de reconocimiento,
\newpage
- c.
- la adición de un agente complementario del agente de reconocimiento de (b), estando acoplado dicho agente complementario a una enzima,
- d.
- la adición de un sustrato de dicha enzima de tal manera que la acción de dicha enzima sobre dicho sustrato lleve a la formación de un compuesto electroactivo que pueda ser detectado mediante la medición de la variación de la corriente farádica después de la aplicación de un potencial al electrodo.
Cuando tiene lugar la etapa d, se puede tener
una sucesión en cascada de reacciones enzimáticas antes de la
formación del compuesto electroactivo. Si unas enzimas diferentes
son acopladas al agente complementario definido en la etapa c, el
compuesto obtenido después de la acción de la primera enzima sobre
el sustrato añadido puede, a su vez, ser el sustrato de otra enzima,
y así sucesivamente, hasta obtener finalmente el compuesto
electroactivo.
La medición de la corriente puede ser realizada
a partir de técnicas electroquímicas tales como la voltametría
lineal, cíclica, de impulsos, de impulso diferencial, de onda
cuadrada, o también la amperometría. La cronoamperometría, la
coulometría, cronocoulometría voltamétrica, la potenciometría por
redisolución anódica o catódica.
El ácido nucleico fijado sobre el electrodo
puede ser el ácido que se está buscando detectar (diana) o puede ser
una sonda. En este caso, el ácido nucleico diana es añadido
posteriormente. Es marcado con el agente de reconocimiento. Se puede
realizar un marcado de este tipo, por ejemplo durante una
amplificación en particular por PCR, utilizando unos iniciadores
marcados.
Como se ha precisado anteriormente, el ácido
nucleico diana puede ser amplificado, en particular por PCR. El
ácido nucleico que se adsorbe en la superficie del electrodo es
preferentemente de rama simple, o bien porque lo es naturalmente, o
bien porque es un ácido nucleico de doble rama desnaturalizado, con
la finalidad de permitir la hibridación del ácido nucleico
complementario. Un ácido de este tipo de doble rama desnaturalizado
es también considerado como de rama simple en el sentido de la
invención. Si el ácido nucleico diana es de doble rama, la
hibridación es entendida como la formación de un complejo de un
ácido nucleico de triple hélice.
Una "sonda" se define, en el sentido de la
invención, como un fragmento de ácido nucleico de rama simple o un
fragmento de doble rama desnaturalizado que comprende por ejemplo de
12 a algunas kilobases, en particular de 15 a algunos centenares de
bases, preferentemente de 15 a 50 ó 100 bases, que poseen una
especificidad de hibridación en unas condiciones determinadas para
formar un complejo de hibridación con un ácido nucleico diana.
Por "ácido nucleico", se entiende en
particular el ADN, el ARN, o unos PNA. Este ácido nucleico puede ser
de la forma rama simple o doble rama. Puede también ser modificado,
en particular a nivel de los enlaces entre los diferentes elementos.
En particular, se puede pensar en unos enlaces fosfortioatos, más
que en unos enlaces fosfodiésteres. Puede también ser marcado
radiactivamente, o por unos compuestos fluorescentes, luminiscentes
o por unos organometálicos.
Por "agente de reconocimiento", se entiende
un compuesto susceptible de ser acoplado a los ácidos nucleicos y
ser reconocido específicamente para otro compuesto, que se denomina
agente complementario. Unos ejemplos de agentes de reconocimiento y
complementario que pueden ser utilizados comprenden en particular
los complejos antígeno-anticuerpo,
hapteno-anticuerpo o
biotina-estreptavidina o avidina. Estos últimos
agentes serán los preferidos para la realización del procedimiento
según la invención.
Por "muestra biológica", se entiende
cualquier muestra que contiene material biológico. El material
comprende en particular cultivos celulares mantenidos in
vitro, o las muestras que pueden ser obtenidas a partir de un
animal o de un ser humano (biopsias. muestras sanguíneas).
El solicitante ha demostrado que el
procedimiento según la invención permite obtener un umbral de
sensibilidad de detección de ácidos nucleicos, en particular del ADN
amplificado, extremadamente bajo, del orden del atomol. En efecto,
este método tiene la ventaja respecto a los métodos descritos
anteriormente de poseer varias etapas de amplificación:
- -
- la etapa de amplificación del ADN por PCR cuando ésta es realizada.
- -
- una etapa denominada de amplificación enzimática, durante la adición del sustrato de la peroxidasa. En efecto, la variación de corriente farádica medida se deberá a la concentración del compuesto electroactivo presente en la solución, pudiendo ser modificada dicha concentración actuando sobre el tiempo de incubación sustrato/enzima,
- -
- la eventual etapa de cascada enzimática tal como se ha descrito más arriba.
Por otra parte, una molécula de agente
complementario puede ser acoplada a varias moléculas de enzimas, lo
que es una fuente suplementaria de amplificación de la señal.
La detección del ácido nucleico por el
procedimiento según la invención se realiza en efecto por la
detección de un compuesto electroquímico más que por la detección
del ácido nucleico, y está más bien basado en la amplificación de
una señal que en la amplificación de la diana.
Por otra parte, el procedimiento según la
invención puede ser fácilmente miniaturizado y/o automatizado, lo
que reduce los riesgos de contaminación de las muestras, y permite
realizar unos análisis a un coste reducido. Es incluso ventajoso
realizar una miniaturización de este tipo.
El solicitante ha demostrado en efecto que, de
manera sorprendente, se mejora la sensibilidad del sistema cuando se
trabaja con pequeños volúmenes. Por pequeños volúmenes, se entienden
unos volúmenes comprendidos entre algunos microlitros y algunas
decenas de microlitros, en particular de 5 a 50 \mul, de manera
preferida 10 \mul.
En efecto, en la medida en que se detecta la
variación de la corriente farádica en la superficie del electrodo,
es ventajoso aumentar la relación S/V (superficie del
electrodo/volumen de la solución), con la finalidad de obtener una
mejor señal.
Los electrodos serán unos electrodos
serigrafiados con una tinta a base de carbono, modificados o no. En
el estado de la técnica se han descrito anteriormente electrodos de
este tipo, por ejemplo en el documento WO 93/20230 o en Bagel et
al. (1997, Analytical Chemistry. 69. págs.
4688-94). En particular, se utilizan unos electrodos
serigrafiados, con una tinta que contiene carbono y unos derivados
estirénicos. Un derivado preferido es el poliestireno. La proporción
(en peso) grafito/poliestireno está comprendida entre 1/10 y 10/1,
preferentemente 1/5 y 5/1, y aún de forma más preferida entre ½ y
2/1. Se prefiere, muy en particular, una proporción entre 5/4 y
7/4, en particular 3/2. El solvente utilizado debe permitir una
buena homogeneización de los compuestos presentes en la tinta y
poder "secarse" rápidamente (aproximadamente de 30 minutos a 3
horas), en particular por evaporación. Se prefiere que la
evaporación se realice a temperatura ambiente. Se realiza
preferentemente la serigrafía sobre unas hojas flexibles de
poliéster o de PVC. Estas descripciones corresponden a unos ejemplos
particulares de electrodos, pero se entiende que el experto en la
materia sabrá optimizarlos en función del uso buscado.
La invención se caracteriza en particular por el
hecho de que los ácidos nucleicos presentes en la solución que se
analiza (que puede ser una muestra biológica) son adsorbidos de
manera específica sobre el electrodo.
Para realizar lo anteriormente mencionado, se
utiliza un tampón de fijación, que se caracteriza por contener 1,5 M
de acetato de amonio. Dicho tampón puede en particular ser realizado
a base de PBS (4,3 mM NaH_{2}PO_{4}; 15,1 mM Na_{2}HPO_{4};
50 nM NaCl, pH 7,4) o de Tris (50 mM Tris; 1 mM
MgCl_{2}.6H_{2}O_{4}; 50 mM NaCl, pH 7,4).
En el momento de añadir la sonda marcada con el
agente de reconocimiento, es preferible que ésta sólo se fije al ADN
diana, y que no se fije de manera no específica a los electrodos. En
efecto, una fijación de este tipo produciría posteriormente al
enlace del agente complementario y la formación del compuesto
electroactivo, después de añadir el sustrato de la enzima. Se
obtendría entonces una reacción falsamente positiva.
El tampón de hibridación debe permitir por lo
tanto la hibridación específica de la sonda marcada con el ADN
diana. Se utilizan unos tampones de hibridación clásicos, tales como
los descritos en Sambrook et al. (Molecular cloning: a
laboratory manual, 1989, 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Cold Spring Harbor. NY.USA. ver en particular p 9.54). Un
tampón de hibridación utilizable en el procedimiento según la
invención contiene 6 X SSC. 0,1% SDS.
Preferentemente, si se utiliza una enzima
solamente, esta posee la actividad de una oxidasa. Por ejemplo,
puede ser una peroxidasa, una glucosa oxidasa, pero también puede
ser otro tipo de enzima del tipo hidrolasa como la fosfatasa
alcalina. De forma preferida, se utiliza la peroxidasa, en
particular la peroxidasa de rábano blanco (Horseraddish peroxydase,
HRP). Un sustrato preferido de la peroxidasa unida a la
estreptavidina será la ortofenilendiamina (OPD). La peroxidasa
cataliza la interacción de la OPD con H_{2}O_{2} para dar un
compuesto coloreado electroactivo soluble en agua: el
2.2'-diaminoazobenzeno (DAA). De todas formas se
pueden utilizar otros sustratos de la peroxidasa, por ejemplo la
tetrametilbencidina (TMB), los derivados de la
o-fenilendiamina y diaminobencenos, la hidroquinona
y sus derivados, el ácido
2,2'-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico),
las fenoxacinas y sus análogos, los sistemas
4-aminoantipirina/fenol ó
4-aminoantipirina/anilina, los ferrocenos y sus
análogos.
Cuando se realiza la detección después de una
cascada enzimática, es importante que la última enzima en juego
transforme el último sustrato en un compuesto electroactivo. Las
enzimas anteriores, que sirven para la amplificación de la señal
pueden ser unas enzimas clásicas utilizadas en biología, y activas
en las condiciones experimentales. Unas enzimas ventajosas don por
ejemplo las enzimas que permiten la hidrólisis de los azúcares, como
las glucosidasas y las emparentadas.
La invención se refiere también a un estuche de
reactivos, para la realización del procedimiento según la invención
que contiene:
- a.
- un tampón de fijación que contiene 1,5 M de acetato de amonio que permite la fijación del ácido nucleico sobre unos electrodos serigrafiados con una tinta a base de carbono,
- b.
- un tampón de hibridación que permite la hibridación específica del ácido nucleico complementario sobre el ácido nucleico fijado sobre los electrodos,
- c.
- un agente de reconocimiento con la finalidad de marcar el ácido nucleico complementario,
- d.
- un agente complementario del agente de reconocimiento (c), acoplado a una enzima, y
- e.
- un sustrato de dicha enzima, que lleva a la formación de un compuesto electroactivo que permite una medición de la variación de la corriente farádica de la solución.
Se pueden añadir otros elementos, en particular
unos iniciadores para la amplificación del ácido nucleico diana, o
un tampón que permita la desnaturalización del ácido nucleico de
doble rama en el caso en que el ácido nucleico de partida sea de
doble rama y se fija un ácido nucleico de rama simple sobre los
electrodos.
El procedimiento según la invención puede
realizarse para la detección y/o la dosificación del ADN proveniente
de fuentes diversas. En particular, se pueden citar la detección del
ADN de origen bacteriano, viral o celular.
En efecto se puede utilizar el procedimiento
según la invención para detectar la sobrexpresión o la subexpresión
de ciertos genes implicados en fenómenos cancerosos, por ejemplo
después de las etapas de trascripción
inversa-amplificación a partir del ARN mensajero que
puede ser preparado a partir de una biopsia. En efecto, el
procedimiento según la invención permite la cuantificación del ácido
nucleico diana, a condición de disponer de un patrón interno.
Se puede también realizar el procedimiento según
la invención para detectar y/o cuantificar eventuales
contaminaciones bacterianas, sea en muestras alimenticias (en
particular las contaminaciones de Salmonella, Listeria, E.
coli, enterohemorrágicas O157 y/o O11...). El procedimiento
según la invención es también de gran utilidad para la detección y
el diagnóstico de infecciones bacterianas en el hombre o en la
medicina veterinaria. Se pueden citar las infecciones de M.
Tuberculosis que podrán ser detectadas a partir de sputum
humano, o la caracterización de otras infecciones para las que se
quiere un resultado rápido y fiable.
El procedimiento según la invención es
particularmente útil para la detección de virus en el organismo, lo
que permite obtener una excelente sensibilidad, y por lo tanto
detectar un número muy reducido de copias de ADN viral. En
particular, se puede detectar la presencia de un virus en una
muestra biológica siguiendo el protocolo que comprende las
siguientes etapas:
- a.
- una amplificación específica del ADN de la muestra biológica, preferentemente por PCR utilizando unos iniciadores específicos del virus buscado,
- b.
- el aislamiento y el análisis del ADN obtenido después de la amplificación mediante un procedimiento según la invención o utilizando un estuche según la invención.
El procedimiento según la invención permite
también detectar al mismo tiempo la presencia en una muestra de
ácidos nucleicos provenientes de fuentes u organismos variados. En
efecto, el principio del procedimiento según la invención es la
detección de una corriente farádica específica del compuesto
electroquímico formado por la acción de la enzima sobre el
sustrato.
Cuando se quiere detectar la presencia de ácido
nucleico proveniente de diferentes fuentes en una muestra, se puede
seguir el siguiente procedimiento:
- a.
- se realiza la amplificación opcional y la fijación de los ácidos nucleicos diana de dichos organismos diferentes sobre los electrodos serigrafiados con una tinta a base de carbono,
- b.
- se realiza la hibridación con los ácidos nucleicos complementarios de las dianas, estando unido cada uno de ellos a un agente de reconocimiento diferente,
- c.
- se añaden los agentes complementarios a los agentes de reconocimiento acoplados a unos marcadores diferentes,
- d.
- se añaden los diferentes sustratos de las enzimas con la finalidad de generar los diferentes compuestos electroactivos,
- e.
- se mide la corriente farádica correspondiente a los diferentes compuestos electroactivos, en la superficie del electrodo, aplicando el potencial específico de cada compuesto.
Los marcadores diferentes de la etapa c son unos
marcadores enzimáticos u otros. Los sustratos de las enzimas generan
diferentes compuestos electroactivos, siendo los otros marcadores
unos marcadores redox específicos. Los ácidos nucleicos diana
fijados sobre los electrodos son preferentemente de rama simple.
Como la generación de corriente farádica va
unida a la presencia del compuesto electroactivo específico, se
puede por lo tanto deducir la presencia o la ausencia de ácidos
nucleicos en las muestras de partida.
Se entiende que el ejemplo de procedimiento dado
anteriormente puede ser modificado, por ejemplo fijando las sondas
específicas de diferentes ácidos nucleicos sobre los electrodos, y
acoplando los ácidos nucleicos diana con los diferentes agentes de
reconocimiento, por ejemplo durante una etapa de amplificación por
PCR.
Este procedimiento permite por lo tanto
identificar rápidamente y fácilmente los contaminantes microbianos o
virales en unas muestras alimenticias, o en una muestra
biológica.
Para la realización del procedimiento según la
invención cuando tiene lugar el análisis de una muestra biológica,
se aconseja en general efectuar una amplificación previa del ADN que
se quiere detectar. Se puede realizar la reacción PCR directamente
sobre la muestra, o después de una purificación previa del ADN de la
muestra. Se escoge una u otra técnica en función de la cantidad de
muestra de la que se dispone y de los objetivos buscados por la
persona que realiza el procedimiento según la invención. El experto
en la materia conoce las técnicas a emplear para aislar el ADN de
una muestra biológica.
En el caso en que el procedimiento es realizado
en un sistema automatizado y/o miniaturizado, se puede realizar el
aislamiento del ADN directamente sobre los electrodos, por ejemplo
utilizando las enseñanzas de la patente WO 97/41219. El ADN aislado
de esta forma puede ser posteriormente amplificado por PCR.
Figura 1: Representación esquemática del
procedimiento de detección según la invención sobre electrodo
serigrafiado.
Figura 2: Voltammogramas obtenidos con el
procedimiento según la invención sobre unos electrodos revestidos de
(a) el ADN del HCMV (4.10^{9} copias en la solución) y (b) del ADN
amplificado del gen ETS2.
Figura 3: Curvas de calibración (S/B,
Señal/Ruido) del ADN amplificado del HCMV por varios métodos. Se
utiliza una escala logarítmica.
- \bullet
- a-c: hibridación sobre electrodo, con detección colorimétrica (a), o electroquímica (b, c),
- \bullet
- d: hibridación y detección convencional colorimétrica sobre placa de microtitulación
- \bullet
- e: cuantificación del ADN por fluorescencia del BET a partir de una electroforesis sobre gel de agarosa.
Figura 4: Estudio comparativo de la
especificidad del procedimiento según la invención, por detección
electroquímica (negro), espectrofotométrica (blanco) sobre
electrodos, o por el método colorimétrico convencional (gris). Se
utilizan unos fragmentos amplificados del gen ETS2, del virus EBV y
HCV, y un control positivo y un control negativo del ADN amplificado
del HCMV. Escala logarítmica.
Figura 5: Estudio comparativo de la capacidad de
detección del ADN amplificado del HCMV en unas muestras humanas
(1-10), por el método convencional colorimétrico
sobre unas microplacas (blanco) o el procedimiento según la
invención (negro). Se ha incluido un control positivo (+) y dos
controles negativos (-). Escala logarítmica.
El ADN del HCMV es extraído a partir de una
descendencia celular embrionaria humana de fibroblastos del pulmón
MRC5 infectada por la cepa viral AD169, con un estuche comercial de
extracción del ADN, según las recomendaciones del fabricante. El
experto en la materia conoce esta técnica, y diversos fabricantes
proponen unos estuches que permiten una extracción de este tipo. Se
ha observado, en particular, que los estuches Invisorb de Invitek o
QiaAmpBlood de Qiagen, permiten obtener unos buenos resultados.
Las células son lisadas, adsorbidas sobre sílice
y seguidamente lavadas por centrifugación. El ADN es eluido en un
tampón apropiado y el soporte es eliminado. El ADN puede ser
seguidamente amplificado.
Se utilizan los iniciadores AC1 (SEC ID nº 1) y
AC2 (SEC ID nº 2) que amplifican un fragmento de 406 pares de bases
de una región conservada situada en la región HIND III X del genoma
US del citomegalovirus (Drouet et al. 1993/Virol
Methods, 45, 259-76).
Se realizan las reacciones de PCR según las
técnicas habituales conocidas por el experto en la materia, sobre
una matriz de ADN del tipo preparado en el ejemplo 1. Se realizan 35
ciclos que poseen las siguientes características: desnaturalización
a 92ºC-15 seg. hibridación a
55ºC-30 seg., extensión a 72ºC-30
seg. La etapa de desnaturalización es de 7 min para el primer ciclo,
y se continúa la etapa de extensión del último ciclo con un
mantenimiento de la temperatura de 72ºC durante 2 minutos
adicionales.
Se incluye un control negativo para cada serie
de experiencias, que no contiene matriz de ADN.
Se realizan unas diluciones en serie del ADN
amplificado según el ejemplo 2, y se las estudia sobre gel de
agarosa con BET, en presencia de una cantidad de ADN calibrada. Se
observa por lo tanto que la concentración de ADN amplificado es de
10,5 pmol/ml, lo que corresponde a 6,3 10^{12} copias/ml.
Se prepara una gama (de 6,3 10^{4} a 6,3
10^{12} copias/ml) mediante unas diluciones en serie de la
solución concentrada del ADN amplificado, en el control negativo de
la PCR.
La detección el ADN por el procedimiento según
la invención se realiza en cuatro etapas:
- a.
- inmovilización del ADN diana
- b.
- hibridación de la sonda marcada
- c.
- incubación del conjugado enzimático
- d.
- aporte del sustrato de detección
- e.
- detección voltammétrica o colorimétrica del producto generado por la enzima.
Se desnaturalizan 2 \mul de ADN amplificado
en un medio alcalino (sosa 0,4 M) a temperatura ambiente, durante 10
min.
Se añaden seguidamente 300 \mul de tampón de
fijación que contienen 1,5 M de acetato de amonio y se sumergen los
electrodos. Se deja incubar a 37ºC durante una noche.
Seguidamente se lavan los electrodos con agua
destilada, y se les incuba durante 30 min a 37ºC en un tampón de
hibridación (6 X SSC, 0,1% SDS) que contiene 100 ng/ml de sonda AC3
específica de la secuencia amplificada del HCMV (SEC ID nº 3),
biotinilada.
Seguidamente se procede a un ciclo de lavado,
que consiste en 5 incubaciones de 1 minuto en 500 \mul de solución
de lavado preparada en frío (6 X SSC, 1% SDS).
Seguidamente se incuban los electrodos durante
15 min a temperatura ambiente, en 100 \mul de tampón (100 mM Tris
HCL pH 7,5-50 mM NaCl-5 g/l de leche
desnatada) que contiene el conjugado
estreptavidina-peroxidasa (1,6 unidades/ml),
inmediatamente después se realiza un ciclo de lavado, del tipo
descrito anteriormente.
Se sumerge entonces el electrodo en 50 \mul de
una solución de sustrato OPD (40 mM de ácido cítrico, 150 mM de
Na_{2}HPO_{4}. 5 mM, NaCl. 0,02% H_{2}O_{2}, una pastilla de
OPD (Argène-Biosoft) en 10 ml de tampón), y se
incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min.
El producto hidrosoluble de la reacción,
coloreado y electroactivo, 2,2'-diaminoazobenceno es
detectado por espectrofotometría de absorción y por voltammetría
diferencial de impulso (DPV) con la finalidad de comparar los dos
métodos.
Para la lectura espectrofotométrica, se retiran
los electrodos y se realiza la lectura de los pocillos a 492 nm.
Para la lectura por DVP, se utiliza un electrodo
de Pt como contra electrodo y un electrodo de Ag/AgCl como
pseudoelectrodo de referencia. Se utiliza un potencioestato
\mu-Autolab (de EcoChemie) conectado a una
interfase sobre PC, utilizando un sistema lógico GPSE 3 (EcoChemie).
Se realiza la DPV con una altura de impulso de 25 mV, una marca de
potencial de 5 mV, una duración del impulso de 0,05 seg. y un
intervalo entre dos impulsos de 0,5 seg.
Para cada serie de experiencias, se incluyen 2
controles negativos (todos los reactivos, pero sin ADN). Así, se
dividen los valores ópticos o de corriente por los valores
obtenidos para este control, y se considera que las muestras son
positivas cuando la relación respuesta/blanco es superior a 2.
Se obtiene los siguientes resultados:
La figura 2 muestra los picos registrados por
DPV obtenidos para un electrodo puesto en contacto con el ADN del
HCMV amplificado (figura 2a) o por el control negativo (figura 2b).
Esta figura muestra sin ambigüedades que el procedimiento según la
invención permite detectar el ADN presente en solución, por DPV.
Con la finalidad de medir la especificidad y la
reproductibilidad del procedimiento según la invención, se han
comparado los picos obtenidos con 30 electrodos recubiertos, o bien
por ADN amplificado del HCMV, o bien por el ADN amplificado de un
gen humano ETS2. Siendo la sonda AC3 específica del HCMV, no debe
unirse al ADN del gen ETS2. Por lo tanto no habrá reacción
enzimática, y por lo tanto, no se deberían observar picos de
corriente para el gen ETS2.
Se obtienen los siguientes valores de
corriente:
| HCMV: | 3300 \pm 100 nA | (desviación tipo 3%) |
| ETS2: | 61 \pm 12 nA | (desviación tipo 19%) |
Esto demuestra que el procedimiento es
reproducible y que, en el tampón específico de hibridación
utilizado, la sonda no se une de forma pasiva a los electrodos, pero
se une a las secuencias complementarias ya adsorbidas sobre los
electrodos.
Se hace variar la concentración del ADN
amplificado del HCMV en la gama de 0,1 a 10^{6} atomoles
(6,3\cdot10^{4} a 6,3\cdot10^{11} copias/ml). Se utilizan
las propiedades del producto generado por la reacción enzimática
para comparar los métodos voltamétrico y colorimétrico.
Las figuras 3a y 3b muestran respectivamente las
curvas obtenidas con los métodos colorimétrico y electroquímico.
Se realiza también una comparación con otros
métodos: colorimetría según el estuche comercial Hybridowll^{TM}
(Argène Biosoft) (3d), o densitometría de fluorescencia sobre gel de
agarosa (3e).
Se observa que la curva de calibración (3b) del
ADN amplificado del HCMV es lineal, en el marco de
50-2000 atomoles (3\cdot10^{7} moléculas de ADN
amplificado) lo que permite una detección de aproximadamente 10
veces menos moléculas de ADN que por el método colorimétrico en las
mismas condiciones (3a). La sensibilidad del método es de todas
maneras muy superior a la fluorescencia sobre gel de agarosa (figura
3e, limite de detección de 14 femtomoles) y es equivalente a los
sistemas colorimétricos sobre placas de microtitulación (figura
3d).
Con la finalidad de aumentar la sensibilidad del
procedimiento según la invención, se ha reducido el volumen del
sustrato OPD aportado para la detección (10 \mul en vez de 50
\mul). La curva obtenida está indicada en la figura 3c, y se
observa que el límite de detección es entonces llevado a 0,6
atomoles (3\cdot6\cdot10^{5} moléculas de ADN amplificado).
Esto es 83 veces más sensible que la técnica colorimétrica sobre
placas de microtitulación.
De todas formas en los experimentos siguientes,
se conserva el volumen de 50 \mul para la solución de
sustrato.
Se han utilizado diferentes ADN para juzgar la
especificidad del procedimiento según la invención. Los resultados
son presentados en la figura 4. Se ha realizado una comparación con
los otros dos métodos colorimétricos, el descrito en la presente
invención, y el método sobre placas de microtitulación. Los ADN
utilizados son el ADN amplificado del HCMV y el ADN del gen humano
ETS2 y los ADN virales del virus de Epstein-Barr
(EBV) o de la hepatitis C (HCV).
Se observa que el método permite una detección
específica y selectiva del ADN del HCMV, cuando la sonda específica
del ADN es utilizada, lo que confirma que esta sonda no es adsorbida
de forma pasiva sobre los electrodos durante la etapa de
hibridación.
Se aplica el procedimiento según la invención a
10 muestras de suero humano (4 negativos, 6 positivos, tal como se
ha determinado anteriormente por PCR cuantitativo que poseen de 2 a
99 copias/\mul de ADN del HCMV antes de la amplificación) sobre
las que se ha procedido a la amplificación tal como se ha descrito
en el ejemplo 2.
Se comparan los resultados obtenidos con el
procedimiento según la invención con los obtenidos por el método
colorimétrico convencional en unas placas de microtitulación.
La figura 5 muestra que el procedimiento según
la invención no da falsos positivos o falsos negativos, los
resultados obtenidos para todas las muestras examinadas son
conformes a lo esperado.
Se observa por otra parte que el procedimiento
según la invención es al menos tan sensible como el método
colorimétrico convencional, y que, en el caso en que el número de
copias iniciales sea bajo, el procedimiento según la invención
permite obtener una mejor relación señal/ruido (muestras 5 y 6).
<110> ARGENE SA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> KIT ELECTROQUÍMICO DE DETECCIÓN DE
ÁCIDOS NUCLÉICOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D18496
\vskip0.400000\baselineskip
<140> FR 00 02323
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-02-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HCMV AD169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatccgcat ggcattcacg tatgt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HCMV AD169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcagtg gataacctgc ggcga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HCMV AD169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaccgcag atagtaagcg c
\hfill25
Claims (13)
1. Procedimiento de detección y/o de
dosificación de ácidos nucleicos en una muestra, que comprende las
siguientes etapas realizadas en unos pequeños volúmenes comprendidos
entre 5 y 50 \mul:
- a.
- la fijación de un ácido nucleico por adsorción específica sobre unos electrodos serigrafiados con una tinta a base de carbono,
- b.
- la hibridación específica de un ácido nucleico complementario al ácido nucleico fijado, conteniendo dicho ácido nucleico complementario un agente de reconocimiento,
- c.
- la adición de un agente complementario al agente de reconocimiento de (b), estando acoplado dicho agente complementario a una enzima,
- d.
- la adición de un sustrato de dicha enzima de tal manera que la acción de dicha enzima sobre dicho sustrato lleva a la formación de un compuesto electroactivo que puede ser detectado mediante la medición de la variación de la corriente farádica después de la aplicación de un potencial al electrodo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende una cascada de las reacciones
enzimáticas durante la etapa d), antes de la formación del compuesto
electroactivo.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el ácido
nucleico de rama simple fijado sobre los electrodos es el ácido
nucleico diana.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque comprende además una etapa de
amplificación antes de la etapa de fijación del ácido nucleico sobre
los electrodos.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la etapa a) de
fijación es realizada con un tampón de fijación que contiene 1,5 M
de acetato de amonio.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque la tinta para la serigrafía contiene una
mezcla de carbono y derivados estirénicos.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la enzima que
permite la formación del compuesto electroactivo es una oxidasa.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la oxidasa es una peroxidasa.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque la peroxidasa es la peroxidasa de rábano
blanco.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque el sustrato de
la peroxidasa es la ortofenilendiamina OPD.
11. Estuche de reactivos para la realización de
un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10,
caracterizado porque contiene:
- a.
- un tampón de fijación que contiene 1,5 M de acetato de amonio que permite la fijación específica del ácido nucleico sobre unos electrodos serigrafiados con una tinta a base de carbono,
- b.
- un tampón de hibridación que permite la hibridación específica del ácido nucleico complementario sobre el ácido nucleico fijado sobre unos electrodos,
- c.
- un agente de reconocimiento con la finalidad de marcar el ácido nucleico complementario,
- d.
- un agente complementario del agente de reconocimiento (c), acoplado a una enzima, y
- e.
- un sustrato de dicha enzima, que lleva a la formación de un compuesto electroactivo que permite una medición de la variación de la corriente farádica de la solución.
12. Procedimiento para la detección de virus en
una muestra biológica, caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- a.
- una amplificación específica del ADN de la muestra biológica, preferentemente por PCR utilizando unos iniciadores específicos del virus buscado,
- b.
- el aislamiento y el análisis del ADN obtenido después de la amplificación por un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o utilizando un estuche según la reivindicación 11.
13. Procedimiento de detección de varios
organismos diferentes en una muestra, caracterizado porque
comprende las siguientes etapas realizadas en unos pequeños
volúmenes comprendidos entre 5 y 50 \mul:
- a.
- se realiza una amplificación opcional y la fijación de los ácidos nucleicos diana de dichos organismos diferentes por adsorción específica sobre el electrodo serigrafiado con una tinta a base de carbono,
- b.
- se realiza una hibridación con unos ácidos nucleicos complementarios a las dianas, estando unido cada uno de ellos a un agente de reconocimiento diferente,
- c.
- se añaden los agentes complementarios a los agentes de reconocimiento acoplados a unos marcadores enzimáticos diferentes,
- d.
- se añaden los diferentes sustratos de las enzimas con la finalidad de generar los diferentes compuestos electroactivos,
- e.
- se mide la corriente farádica correspondiente a los diferentes compuestos electroactivos, en la superficie del electrodo, aplicando el potencial específico de cada compuesto.
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