ES2928304T3

ES2928304T3 - Un método para medir el pH de una muestra

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Publication number: ES2928304T3
Application number: ES21715927T
Authority: ES
Inventors: Kushagr Punyani; Per Nyberg; Sindre Søpstad; Martin Peacock; Linhongjia Xiong; Jae Shin
Original assignee: Diagonal Bio AB
Current assignee: Diagonal Bio AB
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2021-04-06
Publication date: 2022-11-16
Anticipated expiration: 2041-04-06
Also published as: AU2021249488A1; JP2023520419A; US20230074766A1; CA3168685C; IL296011A; IL296011B2; IL296011B1; DK3987059T3; MX2022012139A; CN115362265A; EP3987059A1; ZA202208804B; WO2021198533A1; CA3168685A1; KR20220161286A; EP3987059B1; BR112022017446A2

Abstract

La presente invención proporciona un método más sensible y preciso para controlar el pH de una solución, en el que el pH de la solución se cuantifica en función de la respuesta electroquímica de la solución en una celda electroquímica de dos o tres electrodos, en el que la solución comprende un compuesto capaz de sufrir un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural en función del pH de la solución. La presente invención también proporciona métodos y procesos muy acelerados que permiten el análisis de secuencias de polinucleótidos específicas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica. Los métodos de las invenciones son, por ejemplo, útiles para la exploración rápida de una gran cantidad de muestras en un entorno de punto de atención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un método para medir el pH de una muestra

La presente invención proporciona un método más sensible y preciso para monitorear el pH de una solución, en donde el pH de la solución se cuantifica como una función de la respuesta electroquímica de la solución en una celda electroquímica de dos o tres electrodos, en donde la solución comprende un compuesto capaz de someterse a un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución.

La presente invención también proporciona métodos altamente acelerados y procesos que permiten el análisis de las secuencias polinucleótidos específicas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica. Los métodos de las invenciones son, por ejemplo, útiles para el cribado rápido de una gran cantidad de muestras en un entorno de punto de cuidado.

Antecedentes

Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos son cruciales para diagnósticos médicos y ambientales y se consideran frecuentemente que son los estándares de oro en varias aplicaciones de diagnóstico. Los métodos tradicionales tales como reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa y reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa son en gran medida dependientes de ciclado térmico para el accionamiento de la amplificación debido a la necesidad de diferentes temperaturas para desnaturalización, hibridación y extensión por las polimerasas comúnmente usadas. Los problemas tecnológicos y el costo de implementación alto resultante de estos métodos ha impedido su uso en el punto de cuidado. Los métodos de amplificación isotérmica tal como amplificación de círculo rodante ramificado y amplificación isotérmica mediada por bucle son alternativas.

La cuantificación de los amplicones de ácido nucleico y el monitoreo en tiempo real de la amplificación son indirectas y requieren etiquetas, que no son esenciales para la reacción de amplificación. Estos pueden incluir tintes fluorescentes o cromóforos unidos a oligonucleótidos o cebadores, tintes de intercalación de ADN, ligadores de hendidura, tintes que se unen a nucleótidos, grupos fosfato, grupos ribosa o desoxirribosa y las bases de nitrógeno endógenas de los ácidos nucleicos. Estos tintes o complejos pueden mostrar un desplazamiento espectral tras la unión a ADN, experimentar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y/o un cambio en la magnitud de la fluorescencia cuando se excitan por luz de longitudes de onda adecuadas, facilitando de esta manera la detección óptica. Este método de cuantificación necesita una óptica costosa y sensible, limitando de esta manera adicionalmente el uso de diagnósticos moleculares para aplicaciones en el punto de cuidado.

Varias de estas moléculas de unión a ADN, tal como Hoechst 33258, azul de metileno, complejos de metal de transición que se unen a ácido nucleico tales como complejos que contienen rutenio, osmio o platino, también son electroactivos y pueden facilitar la detección electroquímica indirecta por el secuestro continuo de dichas moléculas a los amplicones recién generados tras la amplificación exitosa y la conductividad reducida consecuente de la mezcla de reacción.

Las metodologías de detección electroquímica alternativas implican la inmovilización de las enzimas, cebadores o sonda de oligonucleótidos en la superficie del electrodo accionando de esta manera la cuantificación de los amplicones o subproductos. La mayoría de estos métodos son bien indirectos o requieren dispositivos costosos.

El reciente desarrollo en la tecnología de amplificación isotérmica mediada por bucle incluye la detección colorimétrica de ARN y ADN dianas en una mezcla de reacción débilmente tamponada, mediada por un tinte sensible al pH (WO 2017/209920, WO 2014/031783). El tampón débil debido a baja concentración de Tris es superada por los protones liberados durante la amplificación y da lugar a una detección de punto final indicada por el cambio de color del indicador de pH. El método se ha implementado para el ensayo en los puntos de cuidado, pero sufre de tiempos de reacción prolongados, baja sensibilidad para concentraciones de ácido nucleico bajas, y la necesidad de dispositivos ópticos costosos para cuantificación.

Capeletti et al. 2013 describe diversos sensores que engloban especies de rojo de alizarina encapsuladas en sílice.

Aoun et al. 2008 describe la síntesis de derivados de fluoreno que pueden usarse como indicadores del pH. GB 2501769 A describe sensores electroquímicos para mediciones de pH, así como un dispositivo y método para medir el pH usando un sensor electroquímico que tiene un electrodo que comprende una antraquinona inmovilizada en el electrodo y una capa de recubrimiento sobre la antraquinona.

Bartosik et al. 2008 describe un ensayo electroquímico basado en LAMP genomagnético para la determinación de dos tipos de papilomavirus humanos en muestras clínicas.

Resumen

La presente invención proporciona un método más sensible y preciso para monitorear el pH de una solución, en donde el pH de la solución se cuantifica como una función de la respuesta electroquímica de la solución en una celda electroquímica de tres electrodos, en donde la solución comprende una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH, en donde la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH está disuelto en la solución. Se ha encontrado que este método más sensible y preciso proporciona resultados rápidos y precisos para determinar si está presente o no un polinucleótido objetivo en una muestra y también para cuantificar el polinucleótido objetivo presente en la muestra.

La presente invención, por lo tanto, también proporciona un método para cuantificar un polinucleótido objetivo en una muestra. El método se puede llevar a cabo con alta sensibilidad sin la necesidad de dispositivos ópticos para la cuantificación y con un tiempo de reacción bajo. En particular, la cuantificación del polinucleótido objetivo se puede derivar de la velocidad de cambio de la respuesta electroquímica (por ejemplo, corriente y/o potencial y/o impedancia) de la celda electroquímica, tal como la celda electroquímica de tres electrodos.

De esta manera, la presente invención proporciona métodos y procesos altamente acelerados que permiten el análisis de secuencias de polinucleótidos específicas en una muestra. Los métodos son de hecho útiles para el cribado rápido de una gran cantidad de muestras en un entorno de punto de cuidado.

Esto es posible debido a la exploración inventiva de las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (tal como LAMP) combinadas con la cuantificación electroquímica de una sustancia de señalización usando una celda electroquímica, tal como una celda electroquímica de tres electrodos o una celda electroquímica que tiene múltiples electrodos de película.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas a la misma.

De acuerdo con el primer aspecto de la invención, se proporciona un método para medir el pH de una solución, en donde el método comprende los pasos de:

- proporcionar una solución que comprende una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH, en donde la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH está disuelto en la solución;

- aplicar la solución a una celda electroquímica de tres electrodos;

- medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica; y

- cuantificar el pH de la solución como una función de la respuesta electroquímica de la celda electroquímica, en donde la respuesta se correlaciona con el estado electroquímico de la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un uso de una celda electroquímica de tres electrodos para medir el pH de una solución, comprendiendo dicho uso:

- proporcionar una solución que comprende una quinona, un derivado de quinona, un indicador de pH o combinaciones de los mismos, en donde la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH está disuelto en la solución;

- aplicar la solución a la celda electroquímica de tres electrodos;

- medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica; y

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un uso de una celda electroquímica de tres electrodos para monitorear una reacción de amplificación de ácido nucleico, comprendiendo dicho uso: - proporcionar una solución que comprende una quinona, un derivado de quinona, un indicador de pH o combinaciones de los mismos, en donde la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH está disuelto en la solución;

- proporcionar una mezcla de LAMP que comprende: una muestra que comprende un polinucleótido objetivo, al menos dos, tal como al menos cuatro cebadores que flanquean cada uno el polinucleótido objetivo y los reactivos de LAMP;

- aplicar la solución y la mezcla de LAMP a la celda electroquímica de tres electrodos;

- medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica; y

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un sistema para medir el pH de una solución, comprendiendo el sistema:

a. un potenciostato;

b. un kit de medición, comprendiendo dicho kit:

i. un primer receptáculo que comprende una celda electroquímica de tres electrodos, y un segundo receptáculo que comprende una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH, o ii. un primer receptáculo que comprende una celda electroquímica de tres electrodos, y una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH,

en donde la quinona, derivado de quinona y/o indicador de pH está disuelto en una solución acuosa en el primer o en el segundo receptáculo, y en donde dicha solución acuosa comprende al menos cuatro cebadores configurados para flanquear una secuencia de polinucleótido objetivo y reactivos de LAMP; y c. una unidad de calentamiento, configurada para calentar el primer receptáculo, tal como para calentar el primer receptáculo hasta una temperatura en el rango de 59 °C a 75 °C.

La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo para propósitos informativos

Descripción de las figuras

Figura 1: un dibujo esquemático de cebadores de LAMP y las secuencias de polinucleótidos con las que hibridan. Las flechas indican dónde hibrida un cebador y las sombras inversas de gris indican complementariedad. FIP: cebador interior directo. BIP: cebador interior inverso. F3: cebador exterior directo. B3: cebador exterior inverso. FL: cebador de bucle directo. BL: cebador de bucle inverso.

Figura 2: (A) Una muestra biológica fluida o fluidizada o resuspendida, en un vehículo adecuado o medio de transporte (si lo hay) después de procesamiento adecuado (si lo hay) se mezcla con (B) cebadores de LAMP y (C) Mezcla Maestra de WarmStart Colorimetric LAMP 2X de New England Biolabs Inc, y se añade inmediatamente a (D) un electrodo serigrafiado con sensor de pH o un serigrafiado que está a 59-75 °C y se conecta a un potenciostato y se ejecutan mediciones voltamétricas u otras electroquímicas durante 1-90 minutos. Se mide el cambio (E) en la señal a través del tiempo. Un cambio cero en la señal en 1-90 minutos comparado con un control no de molde paralelizado o precalibrado indica (F) la ausencia del ácido nucleico molde. Un cambio distinto de cero significativo en la señal indica (G) la presencia del ácido nucleico molde, y la velocidad del cambio de este valor se usa para cuantificar la cantidad del ácido nucleico molde en la muestra biológica usando una curva de calibración predeterminada específica para los cebadores de LAMP y la muestra biológica y su procesamiento.

Figura 3: Un voltamograma cíclico de rojo fenol. Se identifican tres picos en -0,35V, 0,2V y 0,55V respectivamente.

Figura 4: Escaneos de voltametría cíclica catódica de soluciones que contienen rojo fenol 1,0 mM tamponado a pH 7,9 en PBS 0,1 M sobre un electrodo de carbono vítreo desnudo a una velocidad de escaneo de 100, 300, 500, 700 y 900 mV/s, iniciada de 1,5 V frente a Ag/AgCl. La gráfica insertada muestra la dependencia de la corriente en la velocidad de escaneo y la raíz cuadrada de la velocidad de escaneo, respectivamente. Figura 5: Escaneos de voltametría cíclica catódica de soluciones que contienen rojo fenol 1,0 mM (tamponado a pH 7,9 en PBS 0,1 M) sobre un electrodo de carbono vítreo desnudo sobre diferentes potenciales de cambio, a una velocidad de escaneo de 100 mV/s iniciada de 1,5 V frente a Ag/AgCl. La gráfica insertada revela la relación de ipc/ipa cerca de -0,75V variada de acuerdo con el potencial de cambio. Figura 6: Escaneos de voltametría cíclica anódica de soluciones que contienen rojo fenol 1,0 mM tamponado a pH (a) 3,9, (b) 7,9 y (c) 11,9 con PBS 0,1 M sobre un electrodo de carbono vítreo desnudo, respectivamente; (d) representa el escaneo de la solución (b) iniciada desde un potencial más positivo. Los escaneos de voltametría cíclica catódica de aquellos que corresponden a las soluciones de pH se indican como a', b' y c'.

Figuras 7a-d: Ejemplo de la voltametría de onda cuadrada de rojo fenol en el rango de pH de 6,5 a 8,5, y a diferentes concentraciones de rojo fenol. Las Figuras 7b y 7d muestran posiciones pico (voltaje) y alturas (corriente) frente a concentraciones de rojo fenol.

Figura 8: Un ejemplo del algoritmo interno para correlacionar el pH con la señal de salida de rojo fenol, donde se usa un algoritmo optimizado para anidar tanto el potencial máximo (pico identificado a alrededor de 0,5 V (frente a Ag/AgCl) y corriente máxima.

Figura 9: Voltamograma que muestra los picos observados en la voltametría cíclica de la solución de rojo fenol.

Figura 10: Esquema que muestra el diseño del controlador de entorno del sensor.

Descripción detallada

Definiciones

El término “cadena de nucleótidos con sentido” como se usa en la presente se refiere a una cadena de ADN o ARN que es complementaria a una cadena de nucleótidos antisentido.

El término “cadena de nucleótidos antisentido” como se usa en la presente se refiere a una cadena de ADN o ARN que es complementaria a una cadena de nucleótidos con sentido.

El término “cebador interior directo” o “FIP”, como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido que tiene un extremo 3' y un extremo 5', en donde el oligonucleótido comprende una primera parte en el extremo 3' del oligonucleótido y una segunda parte en el extremo 5' del oligonucleótido. En general, la primera parte es complementaria a una secuencia de nucleótidos en la cadena antisentido del polinucleótido objetivo y la segunda parte es complementaria a una secuencia de nucleótidos en la cadena con sentido del polinucleótido objetivo. En otras palabras, la primera parte puede ser una región F2 y la segunda parte puede ser una región F1c. La región F2 es complementaria a la región F2c en la secuencia de ^aDⁿobjetivo, mientras que la región F1c es complementaria a la región F1 en la secuencia de ADN objetivo (Fig. 1).

El término “cebador interior inverso” o “BIP”, como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido que tiene un extremo 3' y un extremo 5', en donde el oligonucleótido comprende una primera parte en el extremo 3' del oligonucleótido y una segunda parte en el extremo 5' del oligonucleótido. En general, la primera parte es complementaria a una secuencia de nucleótidos en la cadena con sentido del polinucleótido objetivo y la segunda parte es complementaria a una secuencia de nucleótidos en la cadena antisentido del polinucleótido objetivo. En otras palabras, la primera parte puede ser una región B2 y la segunda parte puede ser una región B1c. La región B2 es complementaria a la región B2c en la secuencia de ADN objetivo, mientras que la región B1c es complementaria a la región B1 en la secuencia de ADN objetivo (Fig. 1).

El término “cebador exterior directo” o “F3”, como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido, que es complementario a una secuencia de nucleótidos en la cadena antisentido del polinucleótido objetivo. De esta manera, F3 puede comprender una región que es complementaria a una región F3c en la secuencia de ADN objetivo (Fig. 1).

El término “cebador exterior inverso” o “B3”, como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido que es complementario a una secuencia de nucleótidos en la cadena con sentido del polinucleótido objetivo. De esta manera, B3 puede comprender una región que es complementaria a una región B3c en la secuencia de ADN objetivo (Fig. 1).

El término “cebador de bucle directo” o “FL”, como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido que es complementario a una secuencia de polinucleótidos en la cadena con sentido del polinucleótido objetivo. De esta manera, FL es complementario a una sección en la secuencia de ADN objetivo designada FLc (Fig. 1).

El término “cebador de bucle inverso” o “BL”, como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido que es complementario a una secuencia de polinucleótidos en la cadena antisentido del polinucleótido objetivo. De esta manera, BL es complementario a una sección de la secuencia de ADN objetivo designada BLc (Fig. 1).

El término “amplificación de ácido nucleico” como se usa en la presente se refiere a cualquier paso/método/protocolo de ácido nucleico que se usa para replicar y multiplicar una secuencia de ácido nucleico particular en una muestra.

El término “LAMP” se refiere a amplificación isotérmica mediada por bucle. La LAMP es una reacción para la amplificación de ácidos nucleicos. La LAMP usa 4 (o 6) cebadores que se dirigen a 6 (u 8) regiones dentro o alrededor de la secuencia objetivo (Fig, 1). El método se basa en las condiciones isotérmicas, es decir, se lleva a cabo a una temperatura constante y no requiere un ciclador térmico. Brevemente, la amplificación por LAMP del gen objetivo ocurre cuando se incuba con los cebadores específicos del objetivo FIP, BIP, F3 y B3, y una polimerasa a una temperatura constante en el rango de 59 y 75 °C. La inclusión de los cebadores de bucle directos e inversos, FL y BL respectivamente, se puede añadir a la amplificación por LAMP. El producto de amplificación se puede detectar por cualquier método apropiado. El resultado del método se puede correlacionar con el número de copias de ADN producidas durante la amplificación por LAMP y de esta manera sirven como la base para la cuantificación de la cantidad de ADN presente en la muestra. La detección cuantitativa se puede llevar a cabo tanto por mediciones de punto final como en tiempo real. El ADN también puede ser ADNc:

El término “RT-LAMP” se refiere a amplificación isotérmica mediada por bucle con transcripción inversa. RT-LAMP combina LAMP con un paso de transcripción inversa para permitir la detección de ^aRⁿ.

El término “reactivos de amplificación de ácidos nucleicos” como se usa en la presente se refiere a agentes que se añaden a una muestra con el fin de llevar a cabo la amplificación de cualquiera de los polinucleótidos objetivos dentro de la muestra.

El término “reactivos de LAMP” como se usa en la presente se refiere a agentes, que se añaden a un LAMP además de una muestra y al menos cuatro cebadores. Los reactivos de LAMP comprenden al menos nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico. Además, los reactivos de LAMP pueden comprender otros compuestos tal como sales y tampones. La polimerasa de ácido nucleico tiene preferiblemente una alta actividad de desplazamiento de cadena y actividad de replicación.

El término “sustancia de señalización”, como se usa en la presente, se refiere a cualquier cantidad física de los reactivos de amplificación (tales como reactivos de LAMP) o muestra que experimenta un cambio, o un agente producido, consumido o que experimenta un cambio de fase durante la amplificación del ácido nucleico y la cantidad del cual se puede detectar y de esta manera usar para demostrar o cuantificar la reacción de amplificación, tal como una producción de iones H+, o una caída en el pH o conductividad de la muestra/mezcla de reacción.

El término “secuencia objetivo”, como se usa en la presente, se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que se desee detectar. En una realización, la secuencia objetivo es una secuencia de ácido nucleico, preferiblemente secuencias de ácido nucleico que se pueden amplificar por cualquier tecnología de amplificación de ácidos nucleicos, tal como LAMP, preferiblemente en donde la secuencia de ácido nucleico objetivo se amplifica usando al menos cuatro cebadores que flanquean la secuencia objetivo.

El término “polinucleótido objetivo” como se usa en la presente abarca el término “ácido nucleico objetivo” y las dos definiciones se pueden usar intercambiablemente a menos que se establezca expresamente de otra manera.

El término “dispositivo electroquímico”, como se usa en la presente, se refiere a cualquier dispositivo capaz de estudiar un analito al medir el potencial (voltios) y/o corriente (amperios) en una celda electroquímica que contiene el analito. Típicamente, las tres categorías principales para la medición usando un dispositivo electroquímico son potenciometría (se mide la diferencia en los potenciales de los electrodos), coulombimetría (se mide la corriente de la celda a lo largo del tiempo) y voltametría (se mide la corriente de la celda mientras se altera activamente el potencial de la celda). El término “dispositivo electroquímico”, como se usa en la presente, también se puede usar intercambiablemente con el término “celda electroquímica de tres electrodos” cuando se refiere al primer aspecto de la invención. Para evitar dudas, a menos que se establezca expresamente lo contrario, todas las realizaciones como se describen en la presente con referencia al “dispositivo electroquímico” se refieren tanto al dispositivo electroquímico del segundo aspecto de la invención como a la celda electroquímica de tres electrodos del primer aspecto de la invención.

El término “celda electroquímica de tres electrodos”, como se usa en la presente, se refiere a una celda electroquímica que comprende tres electrodos diferentes, que es un electrodo de trabajo, un contraelectrodo y un electrodo de referencia. En el uso, los tres electrodos de la celda electroquímica están en contacto con la solución que se analiza. Durante los experimentos de tres electrodos, el flujo de carga (corriente) ocurre principalmente entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo mientras que el potencial del electrodo de trabajo se mide con respecto al electrodo de referencia.

El término “celda electroquímica de dos electrodos” como se usa en la presente se refiere a una celda electroquímica que comprende dos electrodos, en donde un electrodo es un electrodo de trabajo y el segundo electrodo es un electrodo de referencia y contraelectrodo combinado. Es decir, el segundo electrodo es una variación de una celda de tres electrodos en donde el electrodo de referencia y contraelectrodo están en cortocircuito y actúan como un electrodo, es decir, son el mismo electrodo.

El término “electrodo”, como se usa en la presente, se refiere a un material eléctricamente conductor (fabricado frecuentemente de carbono, metal o un compuesto) que proporciona una ruta para que la corriente fluya en o fuera de, un sistema electroquímico. Durante una medición electroquímica, alguna porción de la superficie del electrodo está en contacto directo con un medio iónicamente conductor, o electrolito, a través del cual se transfiere la carga entre otros electrodos.

Por el término “quinona”, como se usa en la presente, este se refiere a compuestos orgánicos que son compuestos orgánicos cíclicos que contienen dos grupos carbonilo (C=O) ya sea adyacentes o separados por un grupo vinileno (-CH=CH-).

Por el término “derivado de quinona” como se usa en la presente, este se refiere a compuestos que se derivan de quinonas como se han definido anteriormente en donde uno o más de los átomos de hidrógeno en el núcleo cíclico del compuesto se ha reemplazado por otros átomos o radicales.

Como se usa en la presente, el término “voltametría de onda cuadrada” se refiere a una forma de voltametría de barrido de potencial lineal que usa una onda cuadrada combinada y un potencial de escalera aplicado a un electrodo estacionario.

Como se usa en la presente, el término “respuesta electroquímica” se refiere a cualquier proceso mensurable que bien provoca o está acompañado por el paso de una corriente eléctrica. Dichas respuestas electroquímicas mensurables incluyen medir el potencial, la corriente, o la impedancia de un sistema, o en realidad una combinación de cualquiera de estas mediciones.

El término “indicador de pH” como se usa en la presente se refiere a un compuesto químico halocrómico, que es un compuesto químico que cambia de color cuando se producen cambios de pH y que, si se añade en pequeñas cantidades a una solución, permite que el pH (acidez o basicidad) de la solución se determine visualmente.

El término catecol, como se usa en la presente, comprende todos los grupos que tienen un motivo estructural de acuerdo con la siguiente fórmula general I:

Fórmula I

De esta manera, los residuos R¹, R², R³y R⁴pueden estar ausentes, hidrógeno o cualquier residuo orgánico u organometálico. Los residuos preferidos son cadenas alifáticas o aromáticas (tal como, por ejemplo, cadenas alifáticas C¹-C¹⁰o residuos aromáticos C⁶-C²⁰) que se pueden estar interrumpidos o sustituidos opcionalmente por restos que contienen átomos de nitrógeno, oxígeno y/o azufre, por ejemplo, por -NH², -NH-, -OH, =O, -O-, -SH y/o -S-S-. Los residuos R¹, R², R³y R⁴pueden tener independientemente entre sí el mismo significado o diferentes significados en cada caso. El término catecol, como se usa en la presente, también se refiere a un derivado de ortodihidroxibenceno sustituido. Se representan dos conformaciones isoméricas diferentes por el catecol que también es conocido como pirocatecol y benceno-1,2-diol.

El término “grupo catecólico” también se refiere a la forma oxidada del catecol y sus derivados que también se conocen como quinona y corresponde a la siguiente fórmula general II:

Formula II

Los residuos R1, R2, R3 y R4 pueden tener el mismo significado como se explicó previamente.

El término “receptáculo”, como se usa en la presente, se refiere a un recipiente tal como un contenedor adecuado para alojar un líquido, tal como una solución acuosa. Un receptáculo comprende usualmente una abertura y una tapa que se puede usar para cerrar la abertura. Un receptáculo de acuerdo con la presente descripción también puede comprender una celda electroquímica de tres electrodos.

Método para medir el pH de una solución

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para medir el pH de una solución, en donde el método comprende los pasos de:

- proporcionar una solución que comprende un compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución, siendo dicho compuesto una quinona, un derivado de quinona, y/o un indicador de pH, en donde la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH está disuelto en la solución;

- aplicar la solución a una celda electroquímica de tres electrodos;

- medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica; y

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para medir el pH de una solución, en donde el método comprende los pasos de:

- aplicar la solución a una celda electroquímica de tres electrodos;

- medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica; y

En una realización, la solución comprende una pluralidad de compuestos capaces de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución. Es decir que la solución puede comprender una pluralidad de compuestos estructuralmente diferentes capaces de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución, tal como dos o más compuestos, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o más compuestos.

En otra realización, el compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución es un catecol, un derivado de catecol y/o un compuesto que comprende un grupo catecólico.

En otra realización, el compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución es una quinona, un derivado de quinona, un indicador de pH, o combinaciones de los mismos.

En una realización adicional, el compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución es una quinona o un derivado de quinona seleccionado de la lista que consiste en 1,2-benzoquinona, 1,4-benzoquinona, 1,4-naftoquinona, 9,10-antraquinona y derivados y combinaciones de las mismas.

En otra realización, el compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución es un indicador de pH seleccionado de la lista que consiste en oxalato de verde de malaquita, verde brillante, amarillo eosina, eritrosina B, verde metilo, violeta metilo, ácido pícrico, rojo cresol, cristal violeta, púrpura m-cresol, azul timol, azul p-xilenol, Eosina (azulada), rojo quinaldina, 2,4-dinitrofenol, 4-(dimetilamino) azobenzol, azul bromoclorofenol, azul bromofenol, rojo congo, naranja de metilo, verde de bromocresol, 2,5-dinitrofenol, ácido alizarin sulfónico, rojo de metilo, rojo de clorofenol, litmo, púrpura de bromocresol, rojo de bromofenol, 4-nitrofenol, azul de bromoxilenol, azul de bromotimol, rojo de fenol, 3-nitrofenol, rojo neutro, rojo de cresol, 1-naftolftaleína, púrpura de m-cresol, azul de timol, azul de p-xilenol, fenolftaleína, timolftaleína, azul alcalino, amarillo GG alizarina, carmín índigo, azul épsilon, amarillo titanio, y combinaciones de los mismos. En una realización, la solución comprende al menos dos de los compuestos listados en este párrafo, por ejemplo, al menos tres, cuatro o cinco compuestos listados en este párrafo.

En una realización de la presente descripción, dos o más compuestos, siendo dichos compuestos un catecol, un derivado de catecol, un compuesto que comprende un grupo catecol, una quinona, un derivado de quinona o un indicador de pH, se proporcionan en la misma solución acuosa. De esta manera, las mediciones de pH y la cuantificación se pueden llevar a cabo en una escala de pH más grande, tal como entre pH 5 y 8, tal como entre pH 4 y 8, tal como entre pH 3 y 8, tal como entre pH 3 y 9, tal como entre pH 4 y 9, tal como entre pH 5 y 9, tal como entre pH 6 y 9, tal como a través de todo el rango de pH.

En una realización de la presente descripción, la celda electroquímica de tres electrodos no comprende un electrodo de quinhidrona. De hecho, un electrodo de quinhidrona no puede medir de manera eficaz el pH de las soluciones donde la solución de prueba misma provoca un cambio en el potencial de circuito abierto (OCP) a lo largo del tiempo debido a las reacciones bioquímicas o químicas. Adicionalmente, los electrodos de quinhidrona padecen de un error de sal. El funcionamiento del electrodo de quinhidrona se puede deteriorar por la presencia de agentes de oxidación y reducción y el electrodo de quinhidrona se contamina por trazas de metales tales como cobre, plata, y otros metales por debajo del antimonio en la serie electromotriz, que también pueden interferir con las mediciones de pH si los agentes formadores de complejo están presentes en la solución a ser analizada.

De manera más importante, un electrodo de quinhidrona no es adecuado para su uso en una celda electroquímica de tres electrodos, debido a que la quinhidrona y sus productos de disociación acuosos no se pueden analizar electroquímicamente, tal como distinguir, en una celda electroquímica de tres electrodos. De esta manera, un electrodo de quinhidrona no es adecuado para su uso en los métodos y sistemas descritos en la presente.

Por consiguiente, en una realización de la presente descripción, la quinona, el derivado de quinona y/o el indicador de pH no es quinhidrona.

El uso de un catecol, un derivado de catecol y/o un compuesto que comprende un grupo catecólico, tal como una quinona o derivado de quinona, tal como uno cualquiera de los compuestos específicos listados, por ejemplo, rojo fenol, proporciona varias ventajas con la cuantificación del pH de una solución. Una de las ventajas es una alta resolución en la medición del pH, en particular una mayor resolución comparada con cuantificar el pH con un medidor de pH estándar que mide la actividad de iones de hidrógeno en soluciones acuosas. Esto es debido a la química redox rica que caracteriza un catecol, un derivado de catecol y/o un compuesto que comprende un grupo catecólico, tal como una quinona o derivado de quinona, tal como uno cualquiera de los compuestos específicos listados, por ejemplo, rojo de fenol, como se proporciona en detalle en el Ejemplo 3 de la presente descripción.

De esta manera, el método y sistema descritos en la presente descripción proporcionan mediciones de pH precisas e instantáneas ya que el tiempo de respuesta de la medición del pH no depende de la difusión de iones, por ejemplo, protones, a través de una membrana semipermeable o una membrana adsorbente, sino que se basa en la medición de una respuesta electroquímica que se correlaciona con el estado electroquímico de un catecol, un derivado de catecol y/o un compuesto que comprende un grupo catecólico, tal como una quinona o derivado de quinona, o un indicador de pH.

En una realización adicional, el compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución es rojo de fenol.

En otra realización, el compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución es un ácido débil, por ejemplo, un ácido débil que tiene una pKa de aproximadamente 2 a aproximadamente 14, tal como una pKa de aproximadamente 4 a aproximadamente 12, por ejemplo, una pKa de aproximadamente 6 a aproximadamente 10.

De acuerdo con la presente descripción, el compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución está disuelto en la solución. Es decir, el compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución de muestra no se une, en particular no se une irreversiblemente, ya sea químicamente o a través de cualquier medio físico, a cualquiera de los electrodos de la celda química de dos o tres electrodos.

En otra realización, la solución es una solución acuosa. En particular, la solución es una solución acuosa que comprende al menos 90 % en volumen de agua, tal como al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % en volumen de agua. Por ejemplo, la solución es una solución acuosa que comprende más del 99 % en volumen de agua.

En una realización, el potencial de la celda electroquímica de tres electrodos, se mide a través electroquímica potenciodinámica, tal como voltametría de onda cuadrada cíclica, voltametría de onda cuadrada, voltametría de barrido lineal, voltametría cíclica o potenciometría de circuito abierto.

En una realización, la celda electroquímica es una celda química de tres electrodos y el potencial de la celda se mide por voltametría de onda cuadrada cíclica, voltametría de onda cuadrada, voltametría de barrido lineal, o voltametría cíclica.

En otra realización, el paso de voltametría de onda cuadrada se ejecuta en un rango de escaneo de alrededor de -2 a aproximadamente 2 V frente a Ag/AgCl, tal como de aproximadamente -1 a aproximadamente 1 V frente a Ag/AgCl, por ejemplo, de aproximadamente -0,6 a aproximadamente 0,6 V frente a Ag/AgCl.

En una realización adicional, el paso de voltametría de onda cuadrada se ejecuta en una frecuencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 Hz, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 Hz. En una realización, el paso de voltametría de onda cuadrada se ejecuta en un paso potencial de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mV, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mV. En otra realización, el paso de voltametría de onda cuadrada se ejecuta en una amplitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mV, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mV, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mV.

En una realización adicional, la concentración del compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación y/o conformación estructural como una función del pH de la solución dentro de la solución es de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1.000 pM, tal como de aproximadamente 1 pM a aproximadamente

500 pM, por ejemplo de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 250 pM, en particular de aproximadamente

50 pM a aproximadamente 200 pM, por ejemplo de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 150 pM, tal como de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 100 pM.

En una realización, el paso de cuantificar el pH de la solución como una función de la respuesta electroquímica de la celda electroquímica se lleva a cabo a través de la aplicación de un algoritmo de regresión, tal como un algoritmo de regresión lineal. Sin que se desee estar limitado por la teoría, el algoritmo de regresión lineal correlaciona el pH con la función del potencial redox y corriente en una forma lineal. En otra realización, la solución comprende un tampón.

En una realización, el tampón comprende trisaminometano en una cantidad de 20 a 450 pM.

En una realización adicional, el tampón comprende (NH4)2SO4 en una cantidad de 5 a 20 mM.

En otra realización, el tampón comprende KCl en una cantidad de 25 a 100 mM.

En una realización, el tampón comprende MgSO4 en una cantidad de 5 a 20 mM.

En una realización, el tampón comprende trifosfato de desoxinucleósido en una cantidad de 1 a 5 mM.

En otra realización, el tampón comprende tween-20 en una cantidad del 0,05 al 1 % v/v.

Otro aspecto de la presente descripción se refiere al uso de una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH para cuantificar el pH de una solución, en donde la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH está disuelto en la solución,

en donde la solución está en una celda electroquímica, y

en donde el pH se cuantifica midiendo una respuesta electroquímica en la celda electroquímica, en donde la respuesta se correlaciona con el estado electroquímico de la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH.

Métodos para cuantificar un polinucleótido objetivo

Como se define adicionalmente a continuación, el método del primer aspecto de la invención también puede comprender un paso de proporcionar una muestra. En una realización, la muestra se proporciona en la solución, es decir, la solución puede comprender la muestra. La muestra puede ser cualquier muestra. En una realización preferida, la muestra es una muestra biológica. Ninguno de los ejemplos limitantes en la misma son muestras de fluido corporal o muestras de tejido como se define a continuación adicionalmente. Se prevé que la muestra pueda o no comprender un polinucleótido objetivo/ácido nucleico objetivo. Por lo tanto, en una realización del primer aspecto de la invención, el método permite determinar la presencia de un polinucleótido objetivo en la solución. Es decir, el método permite medir el pH de la solución y a partir de este permite determinar si está presente o no un polinucleótido objetivo en la solución.

En una realización, la solución comprende además cebadores y reactivos de amplificación de ácido nucleico, preferiblemente en donde los reactivos de amplificación de ácido nucleico son reactivos de LAMP.

En una realización adicional, los reactivos de amplificación de ácido nucleico comprenden una sustancia de señalización, o son capaces de liberar una sustancia de señalización, o comprenden tanto una sustancia de señalización como una sustancia capaz de liberar una sustancia de señalización.

En otra realización, la sustancia de señalización es H⁺y/o H³O⁺.

En otra realización, los reactivos de LAMP comprenden una transcriptasa inversa.

En una realización adicional, los cebadores comprenden un cebador interior directo, un cebador interior inverso, un cebador exterior directo y un cebador exterior inverso.

En una realización, la amplificación por LAMP se lleva a cabo con un par adicional de cebadores de bucle, tal como cebador de bucle directo y/o cebador de bucle inverso.

En una realización, el FIP/BIP está presente en la solución en una cantidad de 1,6 pM, el F3/B3 está presente en una cantidad de 0,2 pM y el F/B de bucleestá presente en una cantidad de 0,4 pM.

En una realización, la ADN polimerasa Bst está presente en la solución en una cantidad de 0,32 U/pL y la transcriptasa inversa está presente en una cantidad de 0,3 U/pL.

En una realización, el método comprende un paso de llevar a cabo un paso de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, un paso de amplificación de ácido nucleico isotérmico), preferiblemente una pluralidad de pasos de amplificación de ácido nucleico. El o los pasos de amplificación de ácido nucleico se llevan a cabo ventajosamente después de que la solución se aplica a la celda electroquímica de dos o tres electrodos. En una realización adicional, los pasos de llevar a cabo las amplificaciones de ácido nucleico, medir la respuesta electroquímica de la celda electroquímica y cuantificar el pH de la solución como una función de la respuesta electroquímica de la celda electroquímica se pueden llevar a cabo secuencialmente en este orden, o en cualquier otro orden, o se pueden llevar a cabo simultáneamente, y los pasos también se pueden llevar a cabo simultánea y continuamente.

Se prevé que cualquier paso/protocolo/método de amplificación de ácidos nucleicos se pueda usar en el método del primer aspecto de la invención y dichos métodos de amplificación se pueden seleccionar de la lista que consiste en reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (incluida PCR anidada (n), cuantitativa (q) o en tiempo real con transcriptasa inversa (RT)), LAMP como se define en cualquier parte en la presente, amplificación de círculo rodante, y amplificación basada en secuencia de ácido nucleico cuantitativa (QT-NASBA).

En una realización particular, el paso/protocolo/ método de amplificación de ácidos nucleicos es isotérmico, tal como en donde la amplificación del ácido nucleico es isotérmica y se lleva a cabo en una temperatura en el rango de 40 a 80 °C, tal como de 50 a 70 °C, por ejemplo, de 57 a 65 °C.

En una realización, el paso de amplificación isotérmica del ácido nucleico es un paso de LAMP o un paso de amplificación de círculo rodante.

En una realización adicional, el o los pasos de amplificación del ácido nucleico son un paso de LAMP. Para evitar dudas, cuando se lleva a cabo solo un paso de amplificación del ácido nucleico, entonces en esta realización solo se lleva a cabo un paso de LAMP. Sin embargo, cuando se prevén múltiples pasos de amplificación del ácido nucleico, entonces se llevan a cabo múltiples pasos de LAMP.

En una realización, el método es para cuantificar la cantidad de un polinucleótido objetivo en la solución o muestra proporcionada en la solución.

En otra realización, el paso de medir la respuesta electroquímica de la celda electroquímica comprende medir un cambio en la corriente e/o impedancia y/o potencial de la celda electroquímica debido a un cambio de concentración de la sustancia de señalización.

En una realización adicional, el método comprende un paso de derivar una velocidad de amplificación del ácido nucleico de la velocidad del cambio de la respuesta electroquímica (por ejemplo, corriente e/o impedancia y/o potencial) de la celda electroquímica de tres electrodos.

En una realización, el paso de derivar la velocidad de amplificación del ácido nucleico se lleva a cabo simultáneamente al paso de medir la respuesta electroquímica de la celda electroquímica de dos o tres electrodos.

En una realización adicional, el paso de amplificación del ácido nucleico produce o consume una sustancia de señalización, tal como H+, conforme el ácido nucleico se amplifica. Esto es con la condición de que un ácido nucleico/polinucleótido esté presente en la solución en primera instancia. La producción o consumo de la sustancia de señalización a su vez provoca un cambio en la corriente y/o potencial e/o impedancia de la celda electroquímica debido a un cambio de concentración en la sustancia de señalización. Como resultado del cambio en la corriente y/o potencial e/o impedancia de la celda electroquímica, el valor del pH cuantificado también cambia y de este cambio en el pH se puede derivar una velocidad de amplificación del ácido nucleico/polinucleótido objetivo. Para evitar dudas, el paso de derivar una velocidad de amplificación no es necesario con el fin de determinar si está presente o no un polinucleótido objetivo en la solución ya que cualquier cambio detectable en la corriente y/o potencial e/o impedancia de la celda electroquímica y el cambio de pH subsecuentemente cuantificado indicaría la presencia del polinucleótido.

Por lo tanto, un primer aspecto particular de la invención proporciona un método para medir el pH de una solución y determinar la presencia de un polinucleótido objetivo en la solución, en donde el método comprende los pasos de:

a. proporcionar una solución que comprende un compuesto capaz de experimentar un cambio en su estado de oxidación o conformación estructural como una función del pH de la solución, en donde dicho compuesto es una quinona, un derivado de quinona, un indicador de pH, o combinaciones de los mismos, y en donde la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH está disuelto en la solución y una muestra;

b. aplicar la solución a una celda electroquímica de tres electrodos;

c. llevar a cabo al menos una, o una pluralidad de, pasos de amplificación del ácido nucleico en donde la o las amplificaciones del ácido nucleico producen o consumen una sustancia de señalización, si está presente un polinucleótido objetivo;

d. medir la respuesta electroquímica de la celda electroquímica, tal como el cambio en la corriente, y/o potencial, e/o impedancia de la celda electroquímica, debido a un cambio de concentración de la sustancia de señalización;

e. cuantificar el pH de la solución y/o el cambio en el pH de la solución como una función de la respuesta electroquímica de la celda electroquímica, en donde la respuesta se correlaciona con el estado electroquímico de la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH; y

f. derivar opcionalmente la velocidad de amplificación de un polinucleótido objetivo en la muestra, si está originalmente presente, por la velocidad del cambio de la respuesta electroquímica de la celda electroquímica y cuantificar de esta manera la cantidad de polinucleótido objetivo en la muestra.

a. proporcionar una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH, en donde la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH está disuelto en la solución;

b. aplicar la solución a una celda electroquímica de tres electrodos;

c. llevar a cabo al menos uno, o una pluralidad de pasos de amplificación del ácido nucleico en donde la o las amplificaciones del ácido nucleico producen o consumen una sustancia de señalización, si está presente un polinucleótido objetivo;

f. derivar opcionalmente la velocidad de amplificación de un polinucleótido objetivo en la muestra, si está originalmente presente, por la velocidad de cambio de la respuesta electroquímica de la celda electroquímica y cuantificar de esta manera la cantidad de polinucleótido objetivo en la muestra.

Los pasos c., d., e. y f. en los párrafos anteriores se pueden llevar a cabo individualmente ya sea secuencialmente en el orden indicado, o en otro orden, o se pueden llevar a cabo simultáneamente, por ejemplo, simultánea y continuamente.

Para evitar dudas, la invención no se prevé que se limite a si está originalmente presente o no un polinucleótido objetivo en la muestra. Es decir, el paso de amplificación del ácido nucleico se puede llevar a cabo en una solución que contiene una muestra que no comprende un polinucleótido objetivo y en este escenario esto daría por resultado cero, o al menos un cambio no detectable en la respuesta electroquímica (por ejemplo, la corriente y/o potencial e/o impedancia) de la celda electroquímica, dando lugar a un resultado negativo para el polinucleótido objetivo.

Polinucleótido objetivo

El polinucleótido objetivo puede ser cualquier secuencia de polinucleótido. El polinucleótido objetivo en particular puede ser un polinucleótido viral o bacteriano. El polinucleótido objetivo es idealmente una cadena de ADN que es único para un tipo de virus o especie bacteriana y cadena, y al mismo tiempo evolucionariamente conservado lo suficiente como para ser estable en el genoma del virus o bacteria particular.

En una realización, el virus se selecciona del grupo que consiste en virus de ADNds, virus de ADNss, virus de ARNds, virus de ARN (+)ARNss, virus de A^rN ^aRⁿ(-)ARNss, virus de ARN ARN ARNss-RT y virus de ADN ADNds-RT.

En una realización preferida, el virus es un virus de ARN (+)ARNss.

En una realización, el polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido presente en un virus influenza A, virus influenza B, virus Zika, virus SARS-CoV o virus MERS-CoV.

En una realización, el polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido presente en un coronavirus.

En una realización, el polinucleótido objetivo puede ser cualquier polinucleótido presente en el coronavirus, tal como ARN de SARS-CoV-2.

En una realización, la secuencia del polinucleótido objetivo es una secuencia de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.

En una realización, la secuencia del polinucleótido objetivo comprende un 70,0 por ciento, 71,0 por ciento, 72.0 por ciento, 73,0 por ciento, 74,0 por ciento, 75,0 por ciento, 76,0 por ciento, 77,0 por ciento, 78,0 por ciento, 79,0 por ciento, 80,0 por ciento, 81,0 por ciento, 82,0 por ciento, 83,0 por ciento, 84,0 por ciento, 85,0 por ciento, 86,0 por ciento, 87,0 por ciento, 88,0 por ciento, 89,0 por ciento, 90,0 por ciento, 91,0 por ciento, 92.0 por ciento, 93,0 por ciento, 94,0 por ciento, 95,0 por ciento, 96,0 por ciento, 97,0 por ciento, 98,0 por ciento, 99,0 por ciento y 100,0 por ciento de homología o identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.

El porcentaje de identidad de secuencia (u homología) entre dos polipéptidos se puede determinar usando programas informáticos adecuados, por ejemplo, el programa GAP del grupo informático genético de la Universidad de Wisconsin y se apreciará que el porcentaje de identidad se calcula con relación a los polipéptidos cuya secuencia se ha alineado óptimamente. La alineación se puede llevar a cabo alternativamente usando el programa Clustal W (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res 22, 4673-80). Los parámetros usados pueden ser como sigue: Parámetros de alineación en pares rápidos: tamaño K-tuple (palabra); 1, tamaño de ventana; 5, penalización de hueco; 3, número de diagonales superiores; 5. Método de clasificación: x por ciento.

Múltiples parámetros de alineación: penalización por abertura de hueco; 10, penalización por extensión de hueco; 0,05. Matriz de clasificación: BLOSUM.

Muestra

En el segundo aspecto de la invención, el método comprende un paso de proporcionar una muestra. La muestra puede ser cualquier muestra. En una realización preferida, la muestra es una muestra biológica. Ninguno de los ejemplos limitantes en la misma son muestras de fluido corporal o muestras de tejido.

En una realización aún más preferida, la muestra comprende células humanas, animales, vegetales, bacterianas, fúngicas o de protozoos.

En el primer aspecto de la invención, el método también puede comprender un paso de proporcionar una muestra. En una realización, la muestra se proporciona en la solución, es decir, la solución puede comprender la muestra. La muestra puede ser cualquier muestra. En una realización preferida, la muestra es una muestra biológica. Ninguno de los ejemplos limitantes de la misma son muestras de fluido corporal o muestras de tejido.

La muestra puede comprender un polinucleótido objetivo como se ha definido anteriormente. Específicamente, el polinucleótido objetivo puede ser cualquier secuencia de polinucleótidos/secuencia de ácido nucleico. El polinucleótido objetivo en la muestra en particular puede ser un polinucleótido viral o bacteriano. El polinucleótido objetivo en la muestra puede ser una cadena de ADN que es única para un tipo de virus o especie de bacteria y cepa, y al mismo tiempo evolutivamente conservado lo suficiente como para ser estable en el genoma del virus o bacteria particular.

En una realización, la muestra puede ser una muestra de ADN aislado, una muestra de ARN aislado, una muestra de extracto de ADN crudo o una muestra de extracto de ARN crudo.

En una realización, la muestra es una muestra nasal, una muestra de garganta, una muestra anal, una muestra vaginal, una muestra de otitis supurada, una muestra de hisopo de superficie de piel, una muestra de orina, una muestra de sangre completa, una muestra de suero, una muestra de plasma o una muestra de drenaje linfático.

En otra realización, la muestra es una muestra de tejido. La muestra de tejido puede ser cualquier muestra de tejido, tal como una muestra de tejido epitelial, muestra de tejido conjuntivo, muestra de tejido muscular y/o muestra de tejido nervioso.

Los métodos pueden comprender adicionalmente un paso de preparar la muestra antes de aplicar la muestra al dispositivo electroquímico/celda electroquímica de tres electrodos. La muestra se puede preparar por cualquier método adecuado. Ejemplos de los mismos se describen en el Ejemplo 1 en la presente a continuación.

En general, la muestra se puede mezclar con cualquier medio adecuado. Una persona experta en la técnica conocería un medio adecuado para muestras específicas. El medio puede ser un medio de transporte. La muestra y el medio de transporte se pueden añadir directamente al dispositivo electroquímico o calentarse antes de aplicar la muestra y el medio a cualquier temperatura adecuada durante una cantidad de tiempo adecuada.

En una realización, la muestra se inocula en el medio de transporte. Un medio de transporte puede ser cualquier medio adecuado para transportar la secuencia de polinucleótido objetivo. En una realización preferida, el medio de transporte es un medio de transporte viral.

En otra realización, la muestra se mezcla con un anticoagulante como heparina, EDTA o citrato de sodio. La muestra, opcionalmente mezclada con un medio, se puede lisar, por ejemplo, por lisis mecánica, lisis térmica, cavitación acústica, choque osmótico, lisis enzimática o lisis química.

En una realización, la muestra se mezcla con al menos cuatro cebadores y reactivos de LAMP antes de aplicar la muestra al dispositivo electroquímico.

En una realización, la muestra se calienta a 60-100 °C, por ejemplo, a 65-95 °C, por ejemplo a 70-90 °C, por ejemplo a 75-85 °C.

En una realización, la muestra se calienta durante al menos 1 minuto, tal como al menos 2 minutos, tal como al menos 5 minutos.

En una realización, los métodos de la presente invención son capaces de detectar si un polinucleótido objetivo está presente en la muestra.

En otra realización, los métodos de la presente invención son capaces de cuantificar la cantidad de polinucleótido objetivo en una muestra.

Dispositivo electrolítico

En el primer aspecto de la invención, el método comprende el paso de añadir la solución a una celda electroquímica de tres electrodos.

En el segundo aspecto de la invención, el método comprende un paso de proporcionar un dispositivo electroquímico que comprende una celda electroquímica que tiene múltiples electrodos de película.

En ambos aspectos de la invención, el dispositivo electroquímico/celda electroquímica de tres electrodos puede ser un dispositivo plano con electrodos de película colocados en una sola capa. De esta manera, los electrodos de película se pueden grabar sobre un sustrato plano, con un espesor por bajo de 2 mm, tal como por serigrafía o tecnología de película gruesa. Los electrodos serigrafiados (SPE) se usan comúnmente para formar sensores y biosensores desechables y de bajo costo. Los electrodos de dicho sensor se pueden fabricar por el uso de una amplia gama de tintas conductoras y en varias formas y dimensiones dependiendo de las necesidades analíticas. Además de su fabricación, estas plataformas son adecuadas para ser personalizadas con una variedad de materiales, incluidos nanomateriales y bioelementos. En consecuencia, en una realización de la presente divulgación, los electrodos son electrodos serigrafiados, preferiblemente serigrafiados sobre un substrato plano de un material inerte.

En una realización de la presente descripción, los electrodos de la celda electroquímica de tres electrodos son electrodos de alambre.

Preferiblemente, el área del dispositivo electroquímico/celda electroquímica de tres electrodos es más pequeña que 500 mm2, todavía más preferiblemente más pequeña que 300 mm2, haciendo el dispositivo electroquímico/celda electroquímica de tres electrodos portátil y adecuado para un entorno en el punto de cuidado. Los electrodos del dispositivo electroquímico/celda electroquímica de tres electrodos se pueden extender hacia un borde del substrato plano, y formar de esta manera una conexión de borde, para conexión eléctrica a una configuración de medición, tal como un potenciostato. El potenciostato puede ser en sí mismo un potenciostato portátil, tal como un potenciostato de mano.

El dispositivo electroquímico en el segundo aspecto de la invención puede comprender múltiples electrodos de película, por ejemplo, un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un contraelectrodo, en donde los electrodos forman preferiblemente una parte del sistema de tres electrodos, tal como un sistema de tres electrodos electroquímico.

Un electrodo de trabajo de un sistema de tres electrodos es típicamente el electrodo en el cual se produce el proceso redox de interés. De esta manera, el enfoque de una medición electroanalítica es típicamente en una reacción electroquímica particular que ocurre en el electrodo de trabajo.

Un electrodo de referencia tiene típicamente un potencial termodinámico estable y bien conocido. La alta estabilidad del electrodo de referencia se logra usualmente al emplear un sistema redox con concentraciones constantes (tamponadas o saturadas) de iones o moléculas implicadas en la semireacción redox. Cuando se usa como parte de un sistema de tres electrodos, la corriente no pasa a través del electrodo de referencia. Un contraelectrodo, también llamado el electrodo auxiliar, se usa típicamente en un sistema electroquímico para completar el circuito eléctrico con el electrodo de trabajo. Aunque el proceso de redox de interés ocurre típicamente en el electrodo de trabajo, el contraelectrodo puede servir como una fuente o depósito de corriente, de manera que no se limiten las reacciones electroquímicas en el electrodo de trabajo.

Los electrodos del dispositivo electroquímico/ celda electroquímica de tres electrodos se pueden fabricar en un material adecuado, tal como oro, plata, carbono, platino, dióxido de rutenio, o una combinación de los mismos. El material de los electrodos se puede seleccionar individualmente, de esta manera el material de una variedad de electrodos, tal como cada electrodo puede ser diferente. Alternativamente, los electrodos se pueden proporcionar en el mismo material. Sin embargo, para proporcionar simplicidad, estabilidad y una capacidad de miniaturización, puede ser una preferencia que el material del electrodo de referencia y el contraelectrodo sea Ag/AgCl. En una realización alternativa de la presente descripción, el material de los electrodos puede ser idéntico.

Adicionalmente, cualquiera, o todos, los electrodos pueden comprender una membrana selectiva de iones, dicho electrodo puede ser referido como un electrodo selectivo de iones. Dicha membrana se puede usar para convertir la actividad de un ion específico disuelto en una muestra en un potencial eléctrico. La membrana puede cubrir al menos una parte del electrodo, y situarse de manera tal que forme una interfaz a una solución durante una medición. La membrana es preferiblemente una membrana de vidrio, típicamente un tipo de intercambio iónico (silicato o calcogenuro). Alternativamente, la membrana puede ser una membrana cristalina, una membrana de resina de intercambio iónico o una membrana enzimática.

Alternativamente, o adicionalmente, al uso de una membrana selectiva de iones, la superficie de cualquiera de los electrodos se puede modificar. Por ejemplo, la superficie del electrodo de trabajo se puede modificar químicamente para permitir la unión de iones de hidróxido OH- y/o hidronio H3O+. En una realización de la presente descripción, la superficie de cualquiera de los electrodos puede comprender una capa sensora de pH de una membrana en estado sólido con una combinación de óxido de cobalto y óxido de iridio. Preferiblemente, la superficie del electrodo de trabajo comprende una capa sensora de pH de una membrana en estado sólido con combinación de óxido de cobalto y óxido de iridio.

Las modificaciones adicionales de las superficies del electrodo incluyen modificación química por, óxido de rutenio, plaquetas de grafeno, grupo tiol expuesto y/o grupos hidroxilo expuestos.

Preferiblemente, la superficie de cualquiera de los electrodos, para formar el contacto con la muestra/ solución, tiene una concentración fija de iones de cloruro, tal como para una cierta medición de electrodo de referencia. De esta manera, cualquiera, o todos los electrodos pueden comprender una superficie que tiene una concentración fija de iones de cloruro.

En una realización preferida de la presente divulgación, el material del electrodo de trabajo es carbono, y el material del contraelectrodo y del electrodo de referencia es Ag/AgCl.

El dispositivo electroquímico/celda electroquímica de tres electrodos, se puede formar por serigrafía de los electrodos en un substrato plano. De esta manera, los electrodos pueden ser electrodos serigrafiados en donde los electrodos están en una sola capa. El material del substrato plano es preferiblemente un material químicamente inerte, tal como alúmina, cerámica, vidrio, o un plástico inerte. El dispositivo electroquímico/celda electroquímica de tres electrodos, tiene preferiblemente un factor de forma pequeña, haciéndolo portátil, y adecuado para mediciones en el punto de cuidado.

Es una preferencia que el dispositivo electroquímico/celda electroquímica de tres electrodos, comprenda una entrada para recibir la solución a analizar. La entrada puede ser una entrada microfluídica y se puede conectar adicionalmente a la celda electroquímica por una zona hidrófila. La zona hidrófila está idealmente configurada de manera que una solución proporcionada en la entrada microfluídica se transporta, por acción capilar, a la celda electroquímica. Los medios alternativos para almacenar y proporcionar una solución a la celda electroquímica comprenden el uso de un micropocillo superpuesto en la celda electroquímica. El micropocillo se puede unir al dispositivo electroquímico y/o por litografía.

Cuando la solución se proporciona a la celda electroquímica, puede ser una ventaja aplicar una barrera de vapor para impedir la evaporación de la solución. Esto puede ser especialmente un requisito durante una medición más prolongada, tal como al menos varios minutos. La barrera de vapor se puede formar al sellar fluidamente la entrada del dispositivo electroquímico, o el micropocillo, con una tapa física, una tapa calentada, un aceite mineral y/o una cera de parafina. De esta manera, la barrera de vapor actúa para formar un dispositivo fluidamente sellado que comprende la solución.

En una realización de la presente descripción, el dispositivo electroquímico puede comprender los cebadores y los reactivos de LAMP. En otras palabras, los cebadores y los reactivos de LAMP se pueden precargar en el dispositivo antes de la carga de la muestra/solución.

En un aspecto de la presente descripción, se proporciona un sistema para medir el pH de una solución, comprendiendo el sistema:

a. Un instrumento que comprende un potenciostato, en donde el potenciostato está configurado para medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica;

b. Un kit de medición, comprendiendo dicho kit:

i. Un primer receptáculo que comprende una celda electroquímica de tres electrodos, y un segundo receptáculo que comprende una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH, o ii. Un primer receptáculo que comprende una celda electroquímica de tres electrodos y una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH,

en donde la quinona, derivado de quinona y/o indicador de pH está disuelto en una solución acuosa en el primer o en el segundo receptáculo,

en donde dicha solución acuosa comprende al menos cuatro cebadores configurados para flanquear una secuencia de polinucleótido objetivo y reactivos de LAMP; y

c. una unidad de calentamiento, configurada para calentar el primer receptáculo, tal como para calentar el primer receptáculo hasta una temperatura en el rango de 59 °C a 75 °C.

La quinona, derivado de quinona y/o el indicador de pH del sistema descrito en la presente se disuelven en una solución acuosa en el primer o segundo receptáculo.

La quinona, derivado de quinona y/o el indicador de pH del sistema descrito en la presente se disuelven en una solución acuosa en el primer receptáculo, en donde dicha solución acuosa también comprende un sistema de reacción de amplificación de ácido nucleico, tal como al menos dos cebadores configurados para flanquear una secuencia objetivo y los reactivos de LAMP.

En una realización, la quinona, derivado de quinona y/o el indicador de pH del sistema descrito en la presente se disuelven en una solución acuosa en el segundo receptáculo, mientras que el primer receptáculo comprende otra solución acuosa. De esta manera, antes de medir el pH de la solución acuosa en el primer receptáculo, un volumen adecuado de la solución acuosa que comprende la quinona, derivado de quinona y/o el indicador de pH se transfiere al primer receptáculo.

En una realización, el potenciostato está configurado para medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica.

En una realización, el potenciostato está configurado para medir una respuesta electroquímica, en donde la respuesta electroquímica es representativa del estado de oxidación de la quinona, derivado de quinona y/o indicador de pH en el primer receptáculo.

El sistema comprende además una unidad de calentamiento, configurada para calentar el primer y/o segundo receptáculo, tal como hasta una temperatura en el rango de 59 °C a 75 °C.

El primer receptáculo aloja un sistema de reacción de amplificación de ácido nucleico, tal como al menos dos o al menos cuatro cebadores configurados para flanquear una secuencia de polinucleótidos objetivo y reactivos de LAMP.

En una realización, el primer receptáculo comprende una entrada microfluídica para recibir una solución y/o una muestra.

En una realización, el primer y/o el segundo receptáculo se reemplazan por un nuevo primer y/o segundo receptáculo después de cada uso.

En una realización, la entrada microfluídica se conecta a la celda electroquímica por una zona hidrófila, tal como una estructura porosa/fibrosa o un canal hidrófilo, configurado para transportar la muestra por acción capilar.

En una realización, el primer receptáculo y/o el segundo receptáculo es un tubo Eppendorf, un micropocillo o un matraz de cultivo.

En una realización, los electrodos en el sistema de la presente descripción son como se definen en la presente.

Amplificación por LAMP

Los métodos del segundo aspecto de la invención comprenden un paso de llevar a cabo una pluralidad de amplificaciones por LAMP que comprenden cada uno la muestra (por ejemplo, proporcionada y/o preparada como se describe en la sección de “Muestra” en la presente anteriormente) amplificando de esta manera la secuencia de polinucleótido objetivo. Cada amplificación por LAMP comprende al menos cuatro cebadores flanqueando cada conjunto la secuencia objetivo y los reactivos de LAMP. La amplificación por LAMP se lleva a cabo bajo condiciones isotérmicas.

En una realización del primer aspecto de la invención, el método también puede comprender un paso de llevar a cabo una amplificación por LAMP, o una pluralidad de amplificaciones por LAMP, que comprende cada una la muestra (por ejemplo, proporcionada y/o preparada como se describe en la sección de “Muestra” en la presente anteriormente) amplificando de esta manera la secuencia de polinucleótido objetivo. Cada amplificación por LAMP comprende al menos cuatro cebadores, flanqueando cada conjunto la secuencia objetivo y los reactivos de LAMP. La amplificación por LAMP se puede llevar a cabo bajo condiciones isotérmicas.

La amplificación completa por LAMP se puede preparar en una variedad de diferentes formas. Cualquier amplificación por LAMP conocida por el experto en la técnica se puede usar con la invención.

Un ejemplo no limitante de amplificación por LAMP se describe en este punto: el FIP hibrida con la región F2c en la cadena de nucleótidos antisentido del ADN objetivo. La síntesis de ADN se inicia por la polimerasa, que desplaza y libera las cadenas de ADN. De esta manera, la polimerasa sintetiza una cadena complementaria a la secuencia de ADN objetivo. Después, el F3 hibrida con la región F3c en esta cadena antisentido e inicia una nueva ronda de síntesis de ADN por la polimerasa. El desplazamiento mediado por F3 de la cadena antisentido da por resultado la formación de una estructura de tallo-bucle conectada por las regiones F1c y F1 complementarias. Después, el BIP hibrida con la cadena de ADN y el ADN complementario se sintetiza por la polimerasa. De esta manera, el ADN se transforma de un bucle a una estructura lineal de doble cadena. Las cadenas de ADN se separan y se forma una estructura similar a mancuerna con dos tallos-bucles, uno en cada extremo de la cadena. Esta estructura sirve como el punto de partida para el ciclo de amplificación. Después, la estructura se convierte en un tallo-bucle a través de síntesis de ADN con auto-cebado. El FIP hibrida con la región monocatenaria en el tallo-bucle e inicia la síntesis. Al hacerlo de esta manera, libera la cadena complementaria. La cadena liberada forma una nueva estructura similar a mancuerna debido a la complementariedad entre las regiones B1c-B1 y F1-F1c, respectivamente. Iniciando del extremo 3' de la región B1, se inicia la síntesis de ADN. Esto libera la cadena complementaria ligada a FIP, que a su vez forma todavía otra estructura de tallo-bucle doble debido a la complementariedad entre las regiones F1-F1c y B1c-B1, respectivamente. Después, la síntesis de ADN autocebada comienza en el extremo 3' de la región B1. El proceso produce estructuras de amplificación que consisten en repeticiones alternativamente invertidas de la secuencia objetivo.

La muestra se puede mezclar con los cebadores y los reactivos de LAMP antes de aplicar la muestra al dispositivo electroquímico.

En contraste a la amplificación por PCR convencional, la amplificación por LAMP se lleva a cabo usando condiciones isotérmicas. En una realización, la amplificación por LAMP se puede llevar a cabo a una temperatura constante a 59-75 °C, tal como 62-73 °C, tal como 64-70 °C, tal como 66-68 °C.

Reactivos de LAMP

El método tanto del primer como del segundo aspecto de la invención abarca llevar a cabo varias amplificaciones por LAMP. Las amplificaciones por LAMP en general comprenderán una muestra, al menos cuatro cebadores que flanquean la secuencia objetivo y los reactivos de LAMP. Dichos reactivos de LAMP pueden ser cualquiera de los reactivos de LAMP descritos en la presente en esta sección.

Los reactivos de LAMP, en general, comprenden al menos nucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico. Los nucleótidos pueden ser moléculas de trifosfato de desoxirribonucleótido, y preferiblemente los reactivos de LAMP comprenden al menos dATP, dCTP, dGTP y dTTP. En algunos casos, los reactivos de LAMP también comprenden dUTP. Los reactivos de LAMP también comprenden una sustancia de señalización, tal como iones de H+ y/o tintes fluorescentes.

La polimerasa de ácido nucleico puede ser cualquier enzima capaz de catalizar la polimerización dependiente de molde de los nucleótidos, es decir replicación. La polimerasa de ácido nucleico debe tolerar las temperaturas usadas para la amplificación por LAMP y debe tener actividad catalítica en la temperatura de elongación. Varias polimerasas de ácido nucleico termoestables son conocidas por el experto en la técnica. En algunas realizaciones de ambos aspectos de la invención, la polimerasa de ácido nucleico tiene alta actividad de desplazamiento de cadena además de una actividad de replicación.

La polimerasa de ácido nucleico puede ser una polimerasa bacteriana o arcabacteriana. En específico, la polimerasa de ácido nucleico puede ser una ADN polimerasa I de Escherichia coli. La polimerasa de ácido nucleico también puede ser la ADN polimerasa Taq, que tiene una cadena dependiente de síntesis de ADN que reemplaza la actividad de exonucleasa 5'-3'. Otras polimerasas incluyen, pero no se limitan a Taq, Tfi, Tzi, Tth, Pwo, Pfu, Q5®, Phusion®, One Taq®, Vent®, Deep Vent®, Klenow (exo-), Bst 2.0 y Bst 3.0 (New England Biolabs, Ipswich, Mass.), PyroPhage® (Lucigen, Middleton, Wis.) ADN polimerasa Tin, ADN polimerasa GspSSD LF, Rsp (OptiGene, Horsham, Reino Unido) y polimerasa phi29.

La ADN polimerasa Taq, por ejemplo, obtenida de New England Biolabs, puede incluir ADN polimerasa Taq Crimon LongAmp®, ADN polimerasa Taq Crimson, Hemo KlenTaq™, , o Taq LongAmp®.

Los reactivos de LAMP pueden comprender una transcriptasa inversa (RT). La RT es una enzima capaz de generar ADN complementario (ADNc) a partir de un molde de ARN. De esta manera, habilita la medición del ARN. En una realización, los reactivos de LAMP comprenden una transcriptasa inversa.

Además, los reactivos de LAMP pueden comprender sales, tampones y medios de detección. El tampón puede ser cualquier tampón útil, por ejemplo, TRIS. La sal puede ser cualquier sal útil, por ejemplo, cloruro de potasio, cloruro de magnesio o acetato de magnesio o sulfato de magnesio.

Los reactivos de LAMP pueden comprender un agente de bloqueo no específico, tal como BSA, gelatina de piel de bovino, beta-lactoglobulina, caseína, leche seca, ADN de esperma de salmón u otros agentes de bloqueo comunes.

Los reactivos de LAMP también pueden contener bio-conservadores (por ejemplo, NaN3), mejoradores de LAMP (por ejemplo, betaína, trehalosa, etc.) e inhibidores (por ejemplo, inhibidores de ARNasa). Otros aditivos pueden incluir sulfóxido de dimetilo (DMSO), glicerol, (mono)-hidrato de betaína, trehalosa, trifosfato de 7-deaza-2'-desoxiguanosina (7-deaza-2'-dGTP), albúmina de suero bovino (BSA), formamida (metanamida), cloruro de tetrametilamonio (TMAC), otros derivados de tetraalquilamonio [por ejemplo cloruro de tetraetilamonio (TEA-Cl)]; cloruro de tetrapropilamonio (TPrA-Cl) o detergente no iónico, por ejemplo, Tritón X-100, Tween 20, Nonidet P-40 (NP-40) o PREXCEL-Q.

Adicionalmente, los reactivos de LAMP también pueden comprender uno o más medios adicionales para la detección del o los productos de amplificación de LAMP. Los medios pueden ser cualquiera de los medios detectables, y se pueden añadir como compuestos individuales o se pueden asociar con, o incluso unir covalentemente con, uno de los cebadores. Los medios detectables incluyen, pero no se limitan a, tintes, compuestos radiactivos, compuestos bioluminiscentes y fluorescentes. En una realización preferida, los medios para la detección es una o más sondas.

En una realización, la amplificación por LAMP se lleva a cabo usando el kit WarmStart® LAMP (ADN y ARN). Este kit contiene una ADN polimerasa Bst 2.0, una transcriptasa inversa, una mezcla de nucleótidos, un indicador de pH visible, y una solución tampón baja. El kit comprende adicionalmente un tinte fluorescente. En otro ejemplo, la amplificación por LAMP se lleva a cabo usando una Mezcla Maestra Colorimétrica WarmStart® LAMP 2X (ADN y ARN). Este kit contiene una ADN polimerasa Bst 2.0, una transcriptasa inversa, una mezcla de nucleótidos y una solución tampón. El kit comprende adicionalmente un tinte fluorescente.

Cebadores que flanquean la secuencia objetivo

El método del segundo aspecto de la invención implica el uso de al menos cuatro cebadores que flanquean la secuencia objetivo.

En una realización del primer aspecto de la invención, el método también implica el uso de al menos cuatro cebadores que flanquean la secuencia objetivo.

Los cuatro cebadores pueden comprender

- un cebador interno directo también referido como FIP

- un cebador interno inverso también referido como BIP

- un cebador exterior directo también referido como F3

- un cebador exterior inverso también referido como B3

En una realización, el FIP tiene una secuencia de SEQ ID NO:3.

En una realización, el BIP tiene una secuencia de SEQ ID NO:4.

En una realización, el F3 tiene una secuencia de SEQ ID NO:5.

En una realización, el B3 tiene una secuencia de SEQ ID NO:6.

Los cuatro cebadores hibridan con diferentes partes de la cadena sentido y antisentido del polipéptido objetivo. Véanse las definiciones de los cebadores en la sección “Definiciones” como se describe en la presente.

Los cebadores son capaces de amplificar el polinucleótido objetivo cuando se añaden a los reactivos de LAMP bajo condiciones que permiten la amplificación del polinucleótido objetivo.

En una realización preferida, los al menos cuatro cebadores consisten en BIP, FIP, F3 y B3.

En una realización, la amplificación por LAMP se lleva a cabo con un par adicional de cebadores de bucle. En una realización, la amplificación por LAMP se lleva a cabo con un cebador FL y un cebador BL.

En una realización, el cebador FL tiene una secuencia de SEQ ID NO:7.

En una realización, el cebador BL tiene una secuencia de SEQ ID NO:8.

En una realización de ambos aspectos de la invención, la amplificación por LAMP se lleva a cabo con al menos 5 cebadores, tal como al menos 6 cebadores, tal como al menos 7 cebadores.

En una realización, la amplificación por LAMP se lleva a cabo con los cebadores BIP, FIP, F3, B3, FL y BL. La longitud de los cebadores BIP, FIP, F3, B3, FL y BL puede depender de la secuencia del polinucleótido objetivo. Por ejemplo, la longitud de los cebadores se puede ajustar para lograr una actividad deseable a una temperatura específica, tal como en el rango de 59-75 °C. De esta manera, la longitud de los cebadores, puede estar individualmente en el rango de 10 a 100 nucleótidos, por ejemplo, en el rango de 10 a 50 nucleótidos, tal como en el rango de 15 a 20 nucleótidos, tal como en el rango de 15 a 25 nucleótidos, tal como en el rango de 15 a 30 nucleótidos, tal como en el rango de 15 a 40 nucleótidos, tal como en el rango de 15 a 45 nucleótidos, tal como en el rango de 15 a 50 nucleótidos en longitud. La Tm de los cebadores se ajusta típicamente al rango de 59 a 75 °C.

La concentración de cebador en la fase acuosa de las amplificaciones por LAMP, por ejemplo, puede estar en el rango de 0,05 a 4,0 pM, tal como en el rango de 0,1 a 3,0 pM, tal como en el rango de 0,2 a 2,0 pM. Un ejemplo no limitante de los mismos es FIP 1,6 pM, BIP 1,6 pM, F30,2 pM, B30,2 pM, FL 0,4 pM, BL 0,4 pM. Los cebadores en general comprenden - o aún consisten en - oligonucleótidos. Sin embargo, en algunos casos, los cebadores pueden comprender análogos de nucleótidos. El experto en la técnica conoce numerosos análogos de nucleótidos e incluyen derivados, en donde un azúcar se modifica, como en derivados 2'-O-metilo, 2'-desoxi-2'-fluoro y 2',3'-didesoxinucleósidos, análogos de ácido nucleico basados en otras cadenas principales de azúcar, tal como treosa, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), derivados de LNA, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácido nucleico de glicol (GNA), ácido nucleico de treosa (TNA), azúcares biciclo, o hexosa, glicerol y azúcares de glicol, análogos de ácido nucleico basados en cadenas principales no iónicas, o ácidos nucleicos y sus análogos en topologías no lineales, tales como dendrímeros, estructuras de peine y nanoestructuras.

Los cebadores también se pueden ligar a varias etiquetas (por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas funcionalizadas o etiquetas de unión), que se pueden unirse opcionalmente a sus extremos, azúcares o nucleobases.

Los cebadores se pueden preparar por una variedad de métodos, incluidos - pero no limitados a - clonación de secuencias apropiadas y síntesis química directa usando métodos bien conocidos en la técnica [Narang et al., Methods Enzymol. 68:90 (1979); Brown et al., Methods Enzymol. 68:109 (1979)]. Los cebadores también se pueden obtener de fuentes comerciales.

En una realización, los cebadores se pueden diseñar de una manera en la que los cebadores sean capaces específicamente de amplificación de la secuencia de polinucleótido objetivo.

Medición de una propiedad electroquímica de la solución.

El método del segundo aspecto de la invención comprende un paso de medir, un cambio en la corriente y/o potencial de la celda electroquímica.

Como se ha indicado anteriormente, en una realización, el método del primer aspecto de la invención comprende un paso de medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica, tal como un cambio en la corriente y/o potencial e/o impedancia de la celda electroquímica.

Dicho cambio es preferiblemente un resultado de un cambio en la concentración de una sustancia de señalización de un proceso de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo, H+, por ejemplo, un producto o subproducto de amplificación por LAMP (por ejemplo, H+), o un cambio en una cantidad física como resultado de dicha amplificación por LAMP. En particular, el cambio en H+ da lugar a un cambio en el estado de oxidación de una quinona, un derivado de quinona, y/o un indicador de pH que se disuelve en la celda electroquímica, que se mide como un cambio en la respuesta electroquímica de la celda electroquímica. La medición del cambio en la respuesta electroquímica (por ejemplo, corriente y/o potencial e/o impedancia) de la celda electroquímica del dispositivo electroquímico se lleva a cabo preferiblemente después de poner en contacto el dispositivo electroquímico/ celda electroquímica de tres electrodos con una configuración de medición, para formar un sistema electroquímico.

El sistema electroquímico comprende típicamente el dispositivo electroquímico/celda electroquímica de tres electrodos, que incluye, cuando está presente, los electrodos de película, la solución y una ruta de corriente separada, típicamente un potenciostato. El sistema electroquímico comprende de esta manera múltiples electrodos de película, tal como un electrodo de trabajo, un contraelectrodo y un electrodo de referencia, espacialmente separados y distribuidos por todo o uno o más medios iónicamente conductores, o electrolitos, mientras que también están en contacto eléctrico entre sí a través de una ruta de corriente separada (que comprende preferiblemente, o que consiste en, un potenciostato).

Los electrodos en un sistema electroquímico experimentan reacciones de oxidación y reducción, con movimiento de electrones que producen corriente que se desplaza a través de la ruta de corriente simultáneamente con movimiento de iones a través del medio que produce un equilibrio general de transferencia de carga dentro del sistema.

Un potenciostato es típicamente un instrumento diseñado para controlar los electrodos en un sistema electroquímico al ajustar el potencial (o corriente) y al medir el efecto subsecuente en la corriente (o potencial). Esta tarea se logra típicamente a través de una variedad de circuitos internos, amplificadores de operación y bucles de retroalimentación. Se usan comúnmente cables externos para conectarse físicamente a cada electrodo, que incluye típicamente un electrodo de trabajo, un contraelectrodo y un electrodo de referencia.

Se pueden llevar a cabo las mediciones de acuerdo con cualquier método electroanalítico, por ejemplo, mediciones de potencia de circuito abierto, potenciométricas, impedimétricas, coulométricas, voltamétricas y/o amperométricas. Típicamente, una medición de una solución puede durar entre 1 y 90 minutos, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o 90 minutos.

En una realización, la medición de una solución puede durar en el rango de 1 a 45 minutos, tal como 1 a 30 minutos, tal como 1 a 15 minutos, tal como 5 a 10 minutos.

La voltametría es el estudio de la corriente como una función del potencial aplicado. De esta manera, se producen curvas de voltamogramas I=f(E). Típicamente, en dicha medición, el potencial se varía arbitrariamente ya sea paso a paso o continuamente, y el valor de corriente real se mide como la variable dependiente. Lo opuesto es la amperometría. La forma de las curvas depende de la velocidad de la variación del potencial (naturaleza de la fuerza accionadora) y si la solución se agita o está quiescente (transferencia de masa).

Para la cuantificación, el análisis requiere la consideración de la cinética además de la termodinámica, debido al componente temporal de la voltametría. Las relaciones termodinámicas electroquímicas teóricas idealizadas tal como la ecuación de Nernst se modelan sin un componente de tiempo. Mientras que estos modelos son insuficientes solos para describir los aspectos dinámicos de la voltametría, los modelos tales como la ecuación de Tafel y la ecuación de Butler-Volmer carecen de la base para las relaciones de voltametría modificadas que relacionan con la teoría con los resultados observados.

Un método particular para cuantificar un polinucleótido objetivo en una muestra usando LAMP

En una realización, se proporciona un método para cuantificar un polinucleótido objetivo en una muestra, comprendiendo dicho método los pasos de:

a. Proporcionar una muestra;

b. Aplicar la muestra a un dispositivo electroquímico que comprende una celda electroquímica que tiene múltiples electrodos de película;

c. Llevar a cabo, si el polinucleótido objetivo está presente en la muestra, una pluralidad de amplificaciones por LAMP isotérmicas, que comprende cada una la muestra, al menos cuatro cebadores, que flanquean cada uno el polinucleótido objetivo y reactivos de LAMP que comprenden una sustancia de señalización y/o son capaces de liberar una sustancia de señalización, en donde cada amplificación por LAMP libera o consume la sustancia de señalización;

d. Medir, simultáneamente como en el paso e., un cambio en la corriente y/o potencial de la celda electroquímica debido a un cambio de concentración de la sustancia de señalización; y

e. Derivar una velocidad de amplificación, por la velocidad del cambio de la corriente y/o potencial, cuantificando de esta manera el polinucleótido objetivo en la muestra.

Las siguientes reivindicaciones no se reivindican.

En una realización, la muestra se mezcla con los cebadores y los reactivos de LAMP antes de aplicar la muestra al dispositivo electroquímico.

En otra realización, el dispositivo electroquímico comprende los cebadores y los reactivos de LAMP.

En una realización adicional, los múltiples electrodos de película comprenden un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un contraelectrodo.

En una realización, el electrodo de trabajo comprende una membrana selectiva de iones, situada de manera que excluye el contacto de los iones seleccionados de la solución con el electrodo de trabajo.

En otra realización, la superficie del electrodo de trabajo se modifica químicamente para permitir la unión de iones OH- y H3O+ o es reactiva al pH de la solución.

En una realización, la superficie de cualquiera de los electrodos comprende, o se modifica químicamente por, óxido de rutenio, plaquetas de grafeno, o se modifica químicamente tal que los electrodos tienen grupos tiol/hidroxilo expuestos.

En otra realización, el material del electrodo de referencia y el contraelectrodo es Ag/AgCl en una relación de aproximadamente 60/40 p/p.

En una realización adicional, el material del electrodo de trabajo es carbono.

En una realización, los electrodos comprenden o consisten en oro, plata, carbono, platino, dióxido de rutenio o una combinación de los mismos.

En otra realización, el material de los electrodos es idéntico o diferente.

En una realización adicional, los electrodos de película son electrodos serigrafiados.

En una realización adicional, los electrodos de película son electrodos de alambre.

En una realización, el dispositivo electroquímico comprende un substrato sobre el cual se sitúan los electrodos, y en donde el material de dicho substrato es un material químicamente inerte, tal como alúmina, cerámica, vidrio o un plástico inerte.

En otra realización, el dispositivo electroquímico comprende una entrada microfluídica, en conexión fluídica con la celda electroquímica, para recibir la muestra.

En una realización adicional, después de la aplicación de la solución, se añade una barrera de vapor para impedir la evaporación de la solución. En una realización, la barrera de vapor se forma al sellar fluidamente la entrada del dispositivo electroquímico, o el micropocillo, con una tapa física, una tapa calentada, un aceite mineral y/o una cera de parafina.

En otra realización, un área hidrófila conecta la entrada microfluídica y la celda electroquímica, tal como para el llenado capilar del dispositivo electroquímico.

En una realización adicional, las mediciones se llevan a cabo al usar un potenciostato o circuito similar.

En una realización, las medidas comprenden o consisten en mediciones potenciométricas, impedimétricas, coulométricas, voltammétricas y/o amperométricas.

En otra realización, la solución se mide entre 1 y 90 minutos.

En una realización adicional, los reactivos de LAMP comprenden una transcriptasa inversa.

En una realización, la amplificación de nucleótidos se lleva a cabo en una temperatura constante en el rango de 59-75 °C, tal como 62-73 °C, tal como 64-70 °C, tal como 66-68 °C.

En otra realización, los cebadores comprenden un cebador interno directo, un cebador interno inverso, un cebador externo directo y un cebador externo inverso.

En una realización adicional, la amplificación por LAMP se lleva a cabo con un par adicional de cebadores de bucle, tal como cebador de bucle directo y/o cebador de bucle inverso. Otra realización se refiere a un método para determinar la presencia de un polinucleótido objetivo en una muestra. El método comprende la discriminación entre una muestra positiva para el polinucleótido objetivo y una muestra negativa para el polinucleótido objetivo al cuantificar y/o al determinar la velocidad de amplificación del polinucleótido.

Secuencias

SEQ ID NO: 1 Fragmento ORF1 de SARS-CoV-2

CCCT ATGT GTT CAT C A AACGTT CGG ATGCTCG A ACT GCACCT CATGGT CAT GTT AT GGTTGAGCTGGTAGCAGAACTCGAAGGCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGAC ACTTGGTGTCCTTGTCCCTCATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTT CTTCTTCGT AAGAACGGT AATAAAGGAGCTGGT GGCCAT AGTT ACGGCGCCGATC T AAAGT C ATTT G ACTT AGGCGACGAGCTT GGCACT GAT CCTT AT GAAGA SEQ ID NO:2 Fragmento del gen N de SARS-CoV-2

AT GACCAAATTGGCT ACT ACCGAAGAGCTACCAG ACGAATT CGT GGT GGT GACGG

t a a a a t g a a a g a t c t c a g t c c a a g a t g g t a t t t c t a c t a c c t a g g a a c t g g g c c a g AAGCT GGACTTCCCT ATGGTGCTAACAAAGACGGCATC AT AT GGGTT GCAACT GA GGGAGCCTT GAAT ACACCA AAAGAT CAC ATT GGCACCCGCAAT CCTGCT AACAAT GCTGCAATCGTGCTAC SEQ ID NO:3 Cebador Interno Directo (FIP)

AGGTG AGGGTTTTCTAC ATC ACTAT ATTG G AAC AAG C AAATTCTATGG SEQ ID NO:4 Cebador Interno Inverso (BIP)

ATGGGTTGGG ATT ATC CTAAATGTGTG C G AGC AA G AAC AAGTG SEQ ID NO:5 Cebador Externo Directo (F3)

CCACT AGAGGAGCTACTGT A SEQ ID NO:6 Cebador Externo Inverso (B3)

TG AC AAGCTAC AAC AC GT SEQ ID NO:7 Cebador de Bucle Directo (FL)

CAGTTTTTAACATGTTGTGCCAACC SEQ ID NO:8 Cebador de Bucle Inverso (BL)

Ejemplos

Ejemplo 1

Mediciones electroanalíticas cuantitativas de una muestra de hisopo nasal por amplificación por LAMP Materiales y métodos

Electrodo serigrafiado

i. Se usa un sistema de 3 electrodos sensibles al pH serigrafiados, comprendiendo el sistema 3 electrodos serigrafiados que sirven como electrodo de trabajo, electrodo de referencia y electrodo auxiliar. El sistema se imprime sobre alúmina químicamente inerte.

1. El material del electrodo de referencia es Ag/AgCl (relación de 60/40), con una capa adicional que proporciona una concentración fija de iones de cloruro para una medición de electrodos de referencia real.

2. El material del electrodo de trabajo es carbono, con una capa sensible al pH de una membrana en estado sólido con combinación de óxido de cobalto y óxido de iridio.

3. El material del contraelectrodo es el electrodo Ag/AgCl (relación de 60/40), con una capa adicional que proporciona una concentración fija de iones de cloruro para una medición de electrodo de referencia real.

ii. Por encima de los electrodos, se superpone un puerto de muestra microfluídica en la forma de micropocillo iii. Se usa una barrera de vapor para el micropocillo, en la forma de tapa física.

Cebadores

Una mezcla de cebadores 10X que contiene FIP 16 jiM, BIP 16 jiM, F32 jiM, B32 jiM, BucleF 4 jiM, BucleB 4 ^jiM en agua sin nucleasa (sin TE). La concentración final en la mezcla de reacción de amplificación antes de que comience la reacción es FlP 1,6 ^jiM, BIP 1,6 ^jiM, F30,2 ^jiM, B30,2 ^jiM, BucleF 0,4 ^jiM, BucleB 0,4 jiM.

Muestra

i. Se usa una muestra de hisopo nasal inoculada en el medio de transporte viral después del tratamiento con calor a 80 °C durante 1 minuto. Un ejemplo del medio de transporte viral usado es solución salina equilibrada de Hanks estéril (HBSS) 1X con iones de calcio y magnesio, con o sin rojo fenol, suero bovino fetal al 2 % v/v, 100 jig/ml de sulfato de gentamicina y 0,5 jig/ml de Anfotericina B.

Reacción de Amplificación

i. 2 uL de muestra se mezclan con

a. 2,5 uL de Mezcla de Cebador 25X LAMP que se dirigen al área genómica de interés (concentración final de FIP 1,6 jiM, BIP 1,6 jiM, F30,2 jiM, B30,2 jiM, BucleF 0,4 jiM, BucleB 0,4 jiM),

b. 12,5 uL de Mezcla Maestra Colorimétrica WarmStart LAMP 2X de New England Biolabs Inc., y c. Agua sin de nucleasa hasta un volumen final de 25 uL.

Condiciones de Amplificación y Diseño del Ensayo

1. La mezcla de reacción de amplificación (con la muestra) se añade inmediatamente después del mezclado en el sensor de pH precalentado a 65 °C, ya conectado a un potenciostato.

2. La barrera de vapor se pone en su lugar para evitar la evaporación.

3. Las mediciones potenciométricas se ejecutan en tiempo real y el voltaje se mide continuamente durante 30 minutos.

Interpretación

i. La presencia del molde de ácido nucleico se indica durante los 30 minutos por una caída en el pH (detección de pH). La diferencia de tiempo del cambio se correlaciona con la cantidad de molde de ácido nucleico.

Ejemplo 2

Monitoreo electroquímico continuo cuantitativo en tiempo real de amplificación isotérmica mediada por bucle en tampón Tris bajo usando electrodos serigrafiados.

Materiales y Métodos

Electrodo serigrafiado

i. Un sistema de 3 electrodos sensibles al pH serigrafiados que comprende 3 electrodos serigrafiados que sirven como electrodo de trabajo, electrodo de referencia y electrodo auxiliar, impreso sobre un sustrato químicamente inerte como sustratos de alúmina o cerámica o vidrio o plástico inerte.

ii. Los electrodos se pueden fabricar de los mismos o diferentes materiales como oro, plata, carbono, platino, dióxido de rutenio, etc.

iii. El electrodo de trabajo puede incorporar una capa de membrana selectiva de iones y/o la superficie del electrodo se puede modificar para permitir la unión de iones OH- y H3O+ o es sensible al pH de la solución cuando se expone a la solución a través del contacto directo. Dichas modificaciones pueden comprender óxido de rutenio, plaquetas de grafeno, grupos tiol expuestos, grupos hidroxilo expuestos, etc.

iv. Configuración:

1. El electrodo de referencia comprende un electrodo de Ag/AgCl (relación de 60/40), con una capa adicional (opcional) que proporciona una concentración fija de iones de cloruro para una medición de electrodo de referencia real.

2. El electrodo de trabajo comprende carbono

3. El contraelectrodo comprende un electrodo de Ag/AgCl (relación de 60/40), con una capa adicional (opcional) que proporciona una concentración fija de iones de cloruro para una medición de electrodo de referencia real.

v. Por encima de los electrodos, se superpone un puerto de muestra microfluídica en la forma de un micropocillo (preferido) u otros métodos de introducción/contención de muestra.

vi. Se puede usar una barrera de vapor para el micropocillo. Las alternativas pueden incluir tapa física, tapa calentada, barreras de vapor de aceite mineral, barreras de vapor de cera de parafina.

Cebadores

Una mezcla de cebadores 10X que contiene FIP 16 pM, BIP 16 pM, F32 pM, B32 pM, BucleF 4 pM, BucleB 4 pM en agua sin nucleasa (sin TE). La concentración final en la mezcla de reacción de amplificación antes de que comience la reacción es FlP 1,6 pM, BIP 1,6 pM, F30,2 pM, B30,2 pM, BucleF 0,4 pM, BucleB 0,4 pM

Muestras

ii. Se puede usar una muestra de hisopo nasal o garganta inoculada en el medio de transporte viral se puede usar directamente o después de tratamiento con calor a 70-90 °C durante 1 minuto.

iii. Se puede usar una muestra de hisopo anal o vaginal o de otitis supurada o de superficie de piel inoculada en el medio de transporte viral se puede usar directamente o después del tratamiento con calor a 70-90 °C durante 1 minuto.

iv. Se puede usar una muestra de orina directamente o después de tratamiento con calor a 70-90 °C durante 1 minuto.

v. Se puede usar una muestra de sangre completa mezclada con un anticoagulante como heparina, EDTA o citrato de sodio, con lisis adicional opcional a través de lisis mecánica, lisis térmica, cavitación acústica, choque osmótico, lisis enzimática o lisis química.

vi. Se puede usar una muestra de drenaje linfático o una muestra de suero directamente o después de tratamiento con calor a 70-90 °C durante 1 minuto.

vii. El contenido de ácido nucleico purificado de una muestra biológica o un extracto de ácido nucleico crudo Reacción de amplificación

i. Las reacciones de amplificación típicas contienen cebadores (por ejemplo, cuatro, cinco o seis cebadores), muestra (que puede o no contener molde a la cual se unen los cebadores), nucleótidos (que corresponden a G, A, T y C), un agente tampón (Tris 1 mM a 5 mM o Tris 1,5 mM a 5 mM o un tampón equivalente a los mismos), una o más sales (por ejemplo, (NH)2SO4, NaCl, MgSO4, MgCl2, etc.), una polimerasa bacteriana o arqueobacteriana (que puede o no ser termoestable y puede o no tener actividad de desplazamiento de cadena), y cualquiera de los cofactores necesarios y detergentes opcionales, etc. Los ejemplos de polimerasas termoestables que se pueden usar en una PCR o polimerasas para su uso en las reacciones de amplificación isotérmicas incluyen, pero no se limitan a, Taq, Tfi, Tzi, Tth, Pwo, Pfu, Q5®, Phusion®, One Taq®, Vent®, Deep Vent®, Klenow (exo-), Bst 2.0 y Bst 3.0 (New England Biolabs, Ipswich, Mass.), PyroPhage® (Lucigen, Middleton, Wis.), ADN polimerasa Tin, ADN polimerasa GspSSD LF, Rsp (OptiGene, Horsham, Reino Unido) y polimerasa phi29, etc.

ii. Mezcla de reacción preferida: Se mezclan 2 uL de muestra (que contiene ADN/ARN o control sin molde; rango: 1-5 uL; más de 2 uL de la muestra si un medio de transporte está siendo usado inhibe la reacción; menos de 2 uL significará que podría haber demasiado poco molde) con

a. 2,5 uL de Mezcla de Cebador 25X LAMP que se dirigen al área genómica de interés (concentración final de FIP 1,6 uM, BIP 1,6 uM, F30,2 uM, B30,2 uM, BUCLE F 0,4 uM, BUCLE B 0,4 uM), b. 12,5 uL de Mezcla Maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X de New England Biolabs Inc. (también contiene transcriptasa inversa), y

c. Agua sin de nucleasa hasta un volumen final de 25 uL.

iii. Mezcla de reacción alternativa:

Se mezclan 2 uL de muestra (que contiene ADN/ARN o control sin molde; puede ser de hasta 5 uL) con a. 2,5 uL de Mezcla de Cebador 25X LAMP que se dirigen al área genómica de interés (concentración final de FIP 1,6 uM, BIP 1,6 uM, F30,2 uM, B30,2 uM, BUCLE F 0,4 uM, BUCLE B 0,4 uM), b. 12,5 uL de Mezcla Maestra WarmStart LAMP 2X de New England Biolabs Inc., y

c. Agua sin de nucleasa hasta un volumen final de 25 uL.

Condiciones de Amplificación y Diseño del Ensayo

i. Preferida

1. La mezcla de reacción de amplificación (con la muestra) se añade inmediatamente después del mezclado en el sensor de pH precalentado a 59-75 °C, ya conectado a un potenciostato o circuito equivalente.

2. La barrera de vapor se coloca en su lugar para evitar la evaporación.

3. Las mediciones potenciométricas se ejecutan en tiempo real y el voltaje se mide continuamente durante 1-90 minutos.

4. El ensayo se puede paralelizar para múltiples muestras.

ii. Alternativa

1. El mezclado de la muestra con el resto de componentes puede suceder directamente en el chip usando una pipeta o mezclado microfluídico.

2. La mezcla de reacción de amplificación (con la muestra) se añade en un tubo de PCR o microcentrífuga y se calienta a 59-75 °C. La muestra se divide en alícuotas después de 1-90 minutos, o en intervalos de 1-5 minutos 2-5 veces, y el pH se mide en el sensor de pH a temperatura ambiente ya conectado a un potenciostato o circuito equivalente.

3. En lugar del pH, las mediciones impedimétricas, mediciones coulométricas y mediciones amperométricas se pueden llevar a cabo sin el uso de ninguna sonda redox adicional o tinte de intercalación de ADN.

Interpretación

i. La presencia del molde de ácido nucleico se indica entre 1-90 minutos por

i. Una caída en el pH (detección de pH)

ii. Una caída en la conductividad (amperometría)

iii. Incremento en impedancia (impedimetría)

iv. Cambio en la carga neta (coulometría)

ii. Además, el diferencial de tiempo de este cambio se correlaciona con la cantidad de molde de ácido nucleico

Ejemplo 3

Un método de sistema de tres electrodos para monitorear el pH de una solución que contiene rojo de fenol Parámetros Usados

En este ejemplo, se analizaron 50 pL de una solución acuosa que contiene PBS, NaOH o HCl (para ajuste de pH), KCl 0,1 M como electrolito de soporte y rojo de fenol 100 pM como sonda de pH.

La solución acuosa se introdujo en una celda electroquímica de tres electrodos y se llevó a cabo la voltametría de onda cuadrada en la celda electroquímica con los siguientes parámetros:

a. Pico a 0,5 V frente a Ag/AgCl. Intervalo de escaneo 0 a 0,6 V frente a Ag/AgCl; frecuencia: 10 Hz; paso de potencial: 5mV; Amplitud: 10mV.

b. Pico entre -0,4 y -0,55 V frente a Ag/AgCl. Intervalo de escaneo 0 a -0,7 V frente a Ag/AgCl; frecuencia:

10 Hz; paso de potencial: 5mV; Amplitud: 10mV.

Se usaron electrodos desechables de N203-Au junto con un potenciostato Anapot.

El cambio de pH se analizó como una función de la altura del pico (i) y posición del pico que se define por el potencial (E):

ApH = f(i*E) f(i) f(E)

Resultados del Análisis

El rojo de fenol es un químico estructurado de tri-quinona, que experimenta transferencia de tres electrones en la ventana de potencial de -1V a 1V (frente a Ag/AgCl, véase la Figura 3 para una descripción general de picos redox para rojo de fenol). La corriente máxima y el potencial máximo dependen ambos del pH. A pesar de su espectro de luz visible limitado entre pH 6 - pH 8, los potenciales redox de rojo fenol y las corrientes máximas correspondientes son capaces de la identificación del rango de pH completo.

El rojo de fenol es la forma más simple del grupo sulfonaftaleína y un ácido débil con una pKa de 7,9 y es uno de los indicadores de pH más comúnmente usados. Su estructura química y la disociación en solución acuosa se pueden observar en el siguiente esquema:

El sector ionizable de meturo de quinona en la estructura tri-aromática del rojo fenol imparte propiedades redox ricas que muestran características ventajosas para varias aplicaciones. El sector de meturo de quinona en la estructura es el centro de la química redox rica. Los voltamogramas cíclicos de rojo de fenol escaneados en velocidades de escaneo variadas con un electrodo GC desnudo en soluciones tamponadas a pH 7,9 en PBS se muestran en la Figura 4. Se pueden observar seis ondas significativas en la Figura 4. Al correlacionar las corrientes máximas con los valores de la velocidad de escaneo y la raíz cuadrada de la velocidad de escaneo, como se muestra en la gráfica insertada de la Figura 4, se encontró que las ondas (b), (c), (d) y (f) se pueden categorizar como reacciones redox de rojo de fenol en la interfaz del electrodo, ya que el hecho de que la corriente máxima que muestra que es proporcional a la raíz cuadrada de la velocidad de escaneo es característica de las reacciones controladas por difusión. En contraste, las ondas (a) y (e) se categorizan como procesos de adsorción de rojo fenol en la superficie del electrodo, debido a la relación lineal de la corriente máxima con la velocidad de escaneo. Con el fin de identificar los pares redox de rojo fenol, se llevaron a cabo escaneos de voltametría cíclica de rojo fenol en potenciales de cambio variados, cuyos resultados se muestran en la Figura 5. Los escaneos se iniciaron catódicamente de 1,5 V al potencial de cambio de 0,4, -0,2, -1,0 y -1,5 V, respectivamente. Mirando hacia la derecha más alejada de las curvas en la gráfica insertada en la Figura 5, la curva (a) muestra dos picos de reducción con solo un pico de oxidación significativo, mientras que la curva (b) muestra simplemente un par redox. La relación de ipc/ipa para la curva (a) es aproximadamente 2,8 y la de la curva (b) es 2,3, lo que indica una disminución de las especies reducidas en el proceso de la curva (a).

La siguiente reducción de dos pasos puede explicar el hallazgo:

El pico de la primera reducción tuvo lugar a -0,75 V seguido de la segunda reducción situada a -1,12 V en la curva (a) de la gráfica insertada en la Figura 5. Además, una desprotonación consume una fracción del producto de radical libre de la primera reducción [C] en un carbanión [D] y el ion de oxonio de partida [A]:

Esto provoca la disminución de ambos picos de oxidación en las curvas (a) y (b) y por consiguiente la desviación de la relación de i^pc/i^pade un proceso reversible general. Además, debido a que la protonación de las especies de carbanión es una reacción irreversible, el segundo pico de reducción a -1,12 V es mucho más pequeño comparado con el de la primera contraparte a -0,75 V. Con base en lo mencionado anteriormente, explica el i^pc/i^parelativamente más bajo en la curva (a) comparado con el de la curva (b). La influencia del valor de pH en las reducciones y oxidaciones de rojo de fenol se ilustra en la Figura 6, solución de pH 3,9 (curvas (a) y (a'), siendo [A] la especie principal), 7,9 (curvas (b) y (b'), igual en cantidad de ambas formas), y 11,9 (curvas (c) y (c'), principalmente [B]) que contienen rojo de fenol se tamponaron con PBS y se llevaron a cabo los escaneos CV de estas soluciones tanto en direcciones anódicas como catódicas. Vale la pena señalar que, debido a la dependencia del potencial máximo de la variación del pH, las primeras reducciones de (a') a (c') incluyen la transferencia de un electrón y un protón, mientras que la segunda reducción procede sin transferencia de protones.

Los escaneos anódicos correspondientes de las soluciones (a) a (c) muestran dos picos de oxidación para las curvas (a) y (b) a pesar de solo uno para (c). Para los casos de (a) y (b), el rojo de fenol no protonado [B] experimenta la primera oxidación y es seguida por otra oxidación de la contraparte protonada [A] en un potencial más positivo acompañado por desprotonación. Con el fin de aclarar la conexión entre ambas oxidaciones, un escaneo comenzó antes de que el potencial de la segunda oxidación (0,90 V) se llevara a cabo adicionalmente como se muestra en la curva (d). El resultado sugiere que la segunda oxidación no se deriva del producto de la primera oxidación. En contraste, la ausencia de la segunda oxidación en la curva (c) se debe a un déficit de [A] en un entorno alcalino. Por lo tanto, las oxidaciones de ambas especies de rojo de fenol dan por resultado un catión radical [E], como se revela por las siguientes rutas:

Se usa la voltametría de onda cuadrada para la identificación de la señal, beneficiándose de la excelente mejora de la señal comparada con la voltametría cíclica, facilitando el procesamiento de señal simple. La concentración óptima del rojo de fenol se observó que es de aproximadamente 100 uM. Sin que se desee ser limitado por la teoría, 100 pM proporciona un pico redox bien definido sin inhibir la amplificación de los núcleos. Sin embargo, se puede usar una amplia gama de concentraciones de rojo de fenol aún lográndose la identificación de señal.

Los resultados de llevar a cabo la voltametría de onda cuadrada en el rojo de fenol en el rango de pH de 6,5 a 8,5, a diferentes concentraciones de rojo de fenol, se puede observar en la Figura 7. Las dos gráficas inferiores de la Figura 7 muestran posiciones de picos (voltaje) y alturas (corriente) frente a concentraciones de rojo de fenol.

Después, se aplicó un algoritmo de regresión lineal para obtener un valor preciso de pH, es decir, la señal de salida obtenida se correlacionó con el valor de pH por la aplicación de un algoritmo de regresión lineal. Este algoritmo fue validado con el ajuste del valor predicho con el valor real, con un error dentro de 0,05 de pH, cuyos resultados se pueden observar en la Figura 8.

Además de los picos en el escaneo entre 0-800 mV, también se observaron otros dos picos (véase la Figura 9).

Los picos a), b) y c), como se resalta en la Figura 9, son dependientes del pH. Este estudio se centró en los picos a) y b), ya que el pico c) está muy cercano a la hidrólisis, que es el pico EC irreversible. Pico a): De pH alto a pH bajo: cambia a potencial positivo; Transferencia de 1 electrón en el rango de pH (~50-60 mV/pH). Pico b): De pH alto a pH bajo: cambia a un potencial negativo; el número de transferencia de electrones depende del pH (~30-60mV/pH).

La extrema precisión de la cuantificación del pH que este método proporciona, a pesar del tamaño de muestra muy pequeño requerido, tiene muchas aplicaciones, incluido el monitoreo altamente acelerado y la cuantificación de la amplificación de ácidos nucleicos de muestras pequeñas, como se muestra en el Ejemplo 4.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para medir el pH de una solución, en donde el método comprende los pasos de:

- proporcionar una solución que comprende una quinona, un derivado de quinona, y/o un indicador de pH, en donde la quinona, derivado de quinona, y/o indicador de pH está disuelto en la solución;

- aplicar la solución a una celda electroquímica de tres electrodos;

- medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica; y

- cuantificar el pH de la solución como una función de la respuesta electroquímica de la celda electroquímica, en donde la respuesta se correlaciona con el estado electroquímico de la quinona, derivado de quinona y/o indicador de pH.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la quinona o derivado de quinona se selecciona de la lista que consiste en 1,2-benzoquinona, 1,4-benzoquinona, 1,4-naftoquinona, 9,10-antraquinona y derivados y combinaciones de las mismas y

en donde el indicador de pH se selecciona de la lista que consiste en oxalato verde de malaquita, verde brillante, amarillento de eosina, eritrosina B, verde de metilo, violeta de metilo, ácido pícrico, rojo de cresol, violeta de cristal, púrpura de m-cresol, azul timol, azul de p-xilenol, eosina (azulada), rojo de quinaldina, 2,4-dinitrofenol, 4-(dimetilamino) azobenzol, azul de bromoclorofenol, azul de bromofenol, rojo congo, naranja de metilo, verde de bromocresol, 2,5-dinitrofenol, ácido alizarin sulfónico, rojo de metilo, rojo de clorofenol, litmo, púrpura de bromocresol, rojo de bromofenol, 4-nitrofenol, azul de bromoxilenol, azul de bromotimol, rojo de fenol, 3-nitrofenol, rojo neutro, rojo de creosol, 1-naftolftaleína, púrpura de m-cresol, azul timol, azul de pxilenol, fenolftaleína, timolftaleína, azul alcalino, amarillo de alizarina GG, carmín índigo, azul épsilon, amarillo titán, y combinaciones de los mismos.

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la respuesta electroquímica de la celda electroquímica que se mide es el potencial de la celda electroquímica, la corriente de la celda electroquímica, la impedancia de la celda electroquímica, o una combinación de estos, de tal manera que la respuesta electroquímica de la celda electroquímica que es medida comprende una combinación del potencial de celda electroquímica, la corriente de la celda electroquímica, la impedancia de la celda electroquímica.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el potencial de la celda electroquímica se mide mediante voltametría de onda cuadrada cíclica, voltametría de onda cuadrada, voltametría de barrido lineal, voltametría cíclica o potenciometría de circuito abierto; en donde el paso de cuantificar el pH de la solución como una función de la respuesta electroquímica de la celda electroquímica se lleva a cabo a través de la aplicación de un algoritmo de regresión.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración de la quinona, un derivado de quinona, y/o un indicador de pH dentro de la solución es de aproximadamente 1 |jM a aproximadamente 1.000 jM, tal como de aproximadamente 1 jM a aproximadamente 500 jM, por ejemplo, de aproximadamente 5 jM a aproximadamente 250 jM, en particular de aproximadamente 50 jM a aproximadamente 200 jM.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución comprende un tampón, y en donde la solución comprende, además:

a. una muestra, preferiblemente en donde la muestra se selecciona de la lista que consiste en una muestra nasal, una muestra de garganta, una muestra anal, una muestra vaginal, una muestra de otitis supurada, una muestra de hisopo de superficie de la piel, una muestra de orina, una muestra de sangre completa, una muestra de suero, una muestra de plasma y una muestra de drenaje linfático;

b. cebadores y reactivos de amplificación de ácidos nucleicos, preferiblemente en donde los reactivos de amplificación de ácidos nucleicos son reactivos de LAMP.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el método comprende un paso de realizar un paso de amplificación de ácido nucleico, preferiblemente una pluralidad de pasos de amplificación de ácido nucleico, tal como en donde el paso o pasos de amplificación de ácido nucleico es/son un paso de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), y en donde el método es para determinar la presencia de un polinucleótido objetivo en la solución; y en donde la amplificación de nucleótidos se realiza a una temperatura constante en el rango de 59 a 75 °C, tal como de 62 a 73 °C, tal como de 64 a 70 °C, tal como de 66 a 68 °C.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho método cuantifica un cambio en el pH de la solución.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la celda electroquímica de tres electrodos comprende un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un contraelectrodo; y

en donde los electrodos comprenden o consisten en oro, plata, carbono, platino, dióxido de rutenio o una combinación de los mismos;

en donde el material de los electrodos es idéntico o diferente, y

en donde los electrodos de la celda electroquímica de tres electrodos son electrodos de película, tales como electrodos serigrafiados o electrodos de alambre.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las mediciones se realizan utilizando un potenciostato o circuito similar; y en donde las mediciones se realizan durante un período de 1 minuto a 90 minutos.

11. Uso de una celda electroquímica de tres electrodos para el monitoreo de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, tal como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), comprendiendo dicho uso:

- proporcionar una mezcla de LAMP que comprende: una muestra que comprende un polinucleótido objetivo, al menos dos, tal como al menos cuatro cebadores, cada uno de los cuales flanquea el polinucleótido objetivo y reactivos de LAMP;

- medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica; y

12. Uso de un sistema que comprende:

a. un potenciostato; y

b. un kit de medición, comprendiendo dicho kit:

para medir el pH de una solución.

13. Un sistema para medir el pH de una solución, comprendiendo el sistema:

a. un potenciostato;

b. un kit de medición, comprendiendo dicho kit:

i. un primer receptáculo que comprende una celda electroquímica de tres electrodos y un segundo receptáculo que comprende una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH, o ii. un primer receptáculo que comprende una celda electroquímica de tres electrodos y una quinona, un derivado de quinona y/o un indicador de pH,

en donde la quinona, derivado de quinona y/o indicador de pH está disuelto en una solución acuosa en el primer o en el segundo receptáculo, y

en donde dicha solución acuosa comprende al menos cuatro cebadores configurados para flanquear una secuencia de polinucleótidos objetivo y reactivos de LAMP; y

14. El sistema de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el potenciostato está configurado para medir una respuesta electroquímica de la celda electroquímica, en donde la respuesta electroquímica es representativa del estado de oxidación de la quinona, derivado de quinona y/o indicador de pH en el primer receptáculo.

15. El sistema de acuerdo con ua cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14, en donde el primer receptáculo comprende una entrada microfluídica para recibir una solución y/o una muestra.