JP2023520419A - サンプルのｐＨを測定する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、溶液のｐＨを監視する、より高感度で正確な方法を提供し、溶液のｐＨは、２電極または３電極電気化学セルにおける溶液の電気化学応答に応じて定量化され、溶液は、溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物を含む。本発明はまた、サンプル、例えば生物学的サンプル中の特定のポリヌクレオチド配列の分析が可能になる、高度に加速された方法およびプロセスを提供する。本発明の方法は、例えば、ポイントオブケア環境における大量のサンプルの迅速なスクリーニングに有用である。【選択図】図７ａ

Description

本発明は、溶液のｐＨを監視する、より高感度で正確な方法を提供し、溶液のｐＨは、２電極または３電極電気化学セルにおける溶液の電気化学応答に応じて定量化され、溶液は、溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物を含む。
本発明はまた、サンプル、例えば生物学的サンプル中の特定のポリヌクレオチド配列の分析が可能になる、高度に加速された方法およびプロセスを提供する。本発明の方法は、例えば、ポイントオブケア環境における大量のサンプルの迅速なスクリーニングに有用である。
核酸増幅法は、医療および環境診断にとって重要であり、多くの場合、いくつかの診断用途のゴールドスタンダードと見なされている。従来の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、および定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応などでは、一般的に使用されるポリメラーゼによる変性、アニーリング、および伸長において異なる温度を必要とするため、増幅の作動をサーマルサイクリングに大きく依存している。技術的な問題、およびこれらの方法の結果として生じる高い実装コストにより、ポイントオブケアでの使用が妨げられている。分岐ローリングサークル増幅およびループ媒介等温増幅などの等温増幅法が代替手段である。
核酸アンプリコンの定量化および増幅のリアルタイム監視は、間接的であり、増幅反応には必須ではない標識を必要とする。これらとしては、オリゴヌクレオチドまたはプライマーに付着した蛍光色素または発色団、ＤＮＡインターカレート色素、グルーブバインダー、ヌクレオチドに結合する色素、リン酸基、リボースまたはデオキシリボース基、および核酸に対して内因性の窒素塩基が挙げられ得る。これらの色素または複合体は、ＤＮＡに結合するとスペクトルシフトを示し、好適な波長の光によって励起されたときに、蛍光共鳴エネルギー転移を受け、かつ／または蛍光の大きさの変化を受け、それによって光学的検出が容易になる。この定量化方法には、高価かつ高感度の光学系を必要とするため、これにより、ポイントオブケア用途での分子診断の使用がさらに制限される。
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、メチレンブルーのほか、ルテニウム、オスミウムまたは白金含有錯体などの核酸結合遷移金属錯体など、これらのＤＮＡ結合分子のいくつかも電気活性であり、増幅が成功したときには、これらの分子が、新たに生成されたアンプリコンに対して、連続的に隔離され、その結果、反応混合物の導電率が低下することにより、間接的な電気化学的検出が容易になり得る。
代替的電気化学的検出方法論は、電極表面への酵素、プライマーまたはプローブオリゴヌクレオチドの固定化を含み、それによってアンプリコンまたは副産物の定量化を作動させる。これらの方法のほとんどは、間接的であるか、高価なデバイスを必要とする。
ループ媒介等温増幅技術の最近の開発には、弱緩衝反応混合物中のＲＮＡおよびＤＮＡ標的の比色検出が含まれ、これは、ｐＨ感受性色素によって媒介される（ＷＯ２０１７／２０９９２０、ＷＯ２０１４／０３１７８３）。低濃度のＴｒｉｓによる弱緩衝作用は、増幅中に放出されるプロトンによって克服され、結果として、ｐＨ指示薬の色の変化によって示される終点が検出される。この方法は、ポイントオブケア検査用に展開されているが、反応時間が長い、核酸濃度が低い場合に感度が低い、および定量化に高価な光学装置が必要であるという欠点がある。
本発明は、溶液のｐＨを監視する、より高感度で正確な方法を提供し、溶液のｐＨは、３電極電気化学セルにおける溶液の電気化学応答に応じて定量化され、溶液は、キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬を含む。このより高感度で正確な方法は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドが存在するか否かを決定する際、およびサンプル中に存在する標的ポリヌクレオチドを定量化する際に、迅速かつ正確な結果を提供することがわかっている。
したがって、本発明は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを定量化する方法も提供する。この方法は、定量化のための光学デバイスを必要とすることなく、高感度で、短い反応時間で実施され得る。特に、標的ポリヌクレオチドの定量化は、３電極電気化学セルなどの電気化学セルの電気化学応答（例えば、電流および／または電位および／またはインピーダンス）の変化率から導出され得る。
したがって、本発明は、サンプル中の特定のポリヌクレオチド配列の分析が可能になる、高度に加速された方法およびプロセスを提供する。この方法は、ポイントオブケア環境で、大量のサンプルを迅速にスクリーニングするのに実際に有用である。
これは、３電極電気化学セルまたは複数のフィルム電極を有する電気化学セルなどの電気化学セルを使用した、シグナル伝達物質の電気化学的定量化と組み合わせた核酸増幅技術（ＬＡＭＰなど）の独創的な調査により可能になる。
本発明は、添付の特許請求の範囲で定義される。
本発明の第１の態様によれば、溶液のｐＨを測定する方法が提供され、本方法は、
－キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬を含む溶液を提供するステップと；
－溶液を３電極電気化学セルに適用するステップと；
－電気化学セルの電気化学応答を測定するステップと；
－電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化するステップと、を含む。
本発明の別の態様によれば、溶液のｐＨを測定するための３電極電気化学セルの使用が提供され、使用は、
－キノン、キノン誘導体、ｐＨ指示薬、またはそれらの組み合わせを含む溶液を提供することと；
－溶液を３電極電気化学セルに適用することと；
－電気化学セルの電気化学応答を測定することと；
－電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化することと、を含む。
本発明の別の態様によれば、核酸増幅反応を監視するための３電極電気化学セルの使用が提供され、使用は、
－キノン、キノン誘導体、ｐＨ指示薬、またはそれらの組み合わせを含む溶液を提供することと；
－標的ポリヌクレオチド、少なくとも２つ、例えば少なくとも４つのプライマーを含み、それぞれが標的ポリヌクレオチドに隣接するサンプル、およびＬＡＭＰ試薬を含むＬＡＭＰ混合物を提供することと；
－３電極電気化学セルに溶液およびＬＡＭＰ混合物を適用することと；
－電気化学セルの電気化学応答を測定することと；
－電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化することと、を含む。
本発明の別の態様によれば、溶液のｐＨを測定するためのシステムが提供され、このシステムは、
ａ．ポテンショスタットを含む器具；と
ｉ．３電極電気化学セルを含む第１の容器、ならびにキノン、キノン誘導体、および／もしくはｐＨ指示薬を含む第２の容器、または
ｉｉ．３電極電気化学セル、およびキノン、キノン誘導体、および／もしくはｐＨ指示薬を含む第１の容器と、を備え、
ポテンショスタットは、電気化学セルの電気化学応答を測定するように構成されている。
ＬＡＭＰプライマーとそれらがアニールするポリヌクレオチド配列の模式図を示す図である。矢印は、プライマーがアニーリングする場所を示し、グレーの逆の陰影は、相補性を示す。ＦＩＰ：フォワードインナープライマー。ＢＩＰ：バックワードインナープライマー。Ｆ３：フォワードアウタープライマー。Ｂ３：バックワードアウタープライマー。ＦＬ：フォワードループプライマー。ＢＬ：バックワードループプライマー。 （Ａ）好適なプロセシング（存在する場合）後の好適な担体または輸送培地（存在する場合）中の流体または流動化もしくは再懸濁された生物学的サンプルは、（Ｂ）ＬＡＭＰプライマーおよび（Ｃ）ＷａｒｍＳｔａｒｔ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＬＡＭＰ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ，）と混合し、すぐに（Ｄ）ｐＨセンシングスクリーン印刷電極、または５９～７５℃でポテンショスタットに接続されたスクリーン印刷電極に追加し、ボルタンメトリーまたは他の電気化学測定を１～９０分間実行する。経時的シグナル変化（Ｅ）を測定する。平行化された、または事前に較正された鋳型非含有対照と比較して、１～９０分間でシグナル変化がゼロである場合は、鋳型核酸が存在しない（Ｆ）ことを示す。シグナルの有意なゼロ以外の変化は、鋳型核酸が存在することを示し（Ｇ）、この値の変化率を使用して、ＬＡＭＰプライマーと生物学的サンプルとそのプロセシングに固有である事前に決定された検量線を使用して、生物学的サンプル中の鋳型核酸の量を定量化する。 フェノールレッドのサイクリックボルタモグラムを示す図である。３つのピークがそれぞれ－０．３５Ｖ、０．２Ｖ、および０．５５Ｖで識別される。 裸のガラス状炭素電極上で、０．１ＭＰＢＳ中ｐＨ７．９で緩衝化された１．０ｍＭフェノールレッドを含む溶液の陰極サイクリックボルタンメトリースキャン結果を示す図であり、走査速度１００、３００、５００、７００、および９００ｍＶ／ｓで、１．５Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌから開始した。挿入プロットは、それぞれ走査速度および走査速度の平方根に対する現在の依存性を示している。 １．５Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌから開始された走査速度１００ｍＶ／ｓで、様々なスイッチング電位での裸のガラス状炭素電極上の１．０ｍＭフェノールレッド（０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．９で緩衝）を含む溶液の陰極サイクリックボルタンメトリースキャン結果を示す図である。挿入プロットは、－０．７５Ｖ付近のｉｐｃ／ｉｐａの比率がスイッチング電位に応じて変化することを示している。 ｐＨ（ａ）３．９、（ｂ）７．９、および（ｃ）１１．９で、それぞれ、裸のガラス状炭素電極上で０．１ＭＰＢＳにより緩衝化させた１．０ｍＭフェノールレッドを含む溶液の陽極サイクリックボルタンメトリースキャン結果を示す図である。（ｄ）は、より正の電位から開始された溶液（ｂ）のスキャンを表す。これらの対応するｐＨ溶液の陰極サイクリックボルタンメトリースキャンは、ａ’、ｂ’、およびｃ’として示す。 ｐＨ範囲６．５～８．５でのフェノールレッドの矩形波ボルタンメトリーの例、およびフェノールレッドの異なる濃度を示す図である。図７ｂおよび図７ｄは、フェノールレッドの濃度に対するピーク位置（電圧）および高さ（電流）を示す。 ｐＨ範囲６．５～８．５でのフェノールレッドの矩形波ボルタンメトリーの例、およびフェノールレッドの異なる濃度を示す図である。図７ｂおよび図７ｄは、フェノールレッドの濃度に対するピーク位置（電圧）および高さ（電流）を示す。 ｐＨ範囲６．５～８．５でのフェノールレッドの矩形波ボルタンメトリーの例、およびフェノールレッドの異なる濃度を示す図である。図７ｂおよび図７ｄは、フェノールレッドの濃度に対するピーク位置（電圧）および高さ（電流）を示す。 ｐＨ範囲６．５～８．５でのフェノールレッドの矩形波ボルタンメトリーの例、およびフェノールレッドの異なる濃度を示す図である。図７ｂおよび図７ｄは、フェノールレッドの濃度に対するピーク位置（電圧）および高さ（電流）を示す。 ｐＨをフェノールレッド出力信号と相関させるためのインハウスアルゴリズムの例である。最適化されたアルゴリズムを使用して、ピーク電位（約０．５Ｖ（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ）で同定されるピーク）およびピーク電流の両方を入れ子構造にする。 フェノールレッド溶液のサイクリックボルタンメトリーで観察されたピークを示すボルタモグラムを示す図である。 センサ環境コントローラーの設計を示す概略図である。
定義
本明細書で使用される「ヌクレオチドセンス鎖」という用語は、ヌクレオチドアンチセンス鎖に対して相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を指す。
本明細書で使用される「ヌクレオチドアンチセンス鎖」という用語は、ヌクレオチドセンス鎖に対して相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を指す。
本明細書で使用される「フォワードインナープライマー」または「ＦＩＰ」という用語は、３’末端および５’末端を有するオリゴヌクレオチドを指し、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端に第１の部分を含み、そのオリゴヌクレオチドの５’末端に第２の部分を含む。一般に、第１の部分は、標的ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖内のヌクレオチド配列に相補的であり、第２の部分は、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖内のヌクレオチド配列に相補的である。換言すれば、第１の部分は、Ｆ２領域であり、第２の部分は、Ｆ１ｃ領域であり得る。Ｆ２領域は、標的ＤＮＡ配列内のＦ２ｃ領域と相補的であり、Ｆ１ｃ領域は、標的ＤＮＡ配列内のＦ１領域と相補的である（図１）。
本明細書で使用される「バックワードインナープライマー」または「ＢＩＰ」という用語は、３’末端および５’末端を有するオリゴヌクレオチドを指し、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端に第１の部分を含み、そのオリゴヌクレオチドの５’末端に第２の部分を含む。一般に、第１の部分は、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖内のヌクレオチド配列に相補的であり、第２の部分は、標的ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖内のヌクレオチド配列に相補的である。換言すれば、第１の部分は、Ｂ２領域であり、第２の部分は、Ｂ１ｃ領域であり得る。Ｂ２領域は、標的ＤＮＡ配列内のＢ２ｃ領域と相補的であり、Ｂ１ｃ領域は、標的ＤＮＡ配列内のＢ１領域と相補的である（図１）。
本明細書で使用される「フォワードアウタープライマー」または「Ｆ３」という用語は、標的ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖内のヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを指す。したがって、Ｆ３は、標的ＤＮＡ配列内のＦ３ｃ領域と相補的な領域を含み得る（図１）。
本明細書で使用される「バックワードアウタープライマー」または「Ｂ３」という用語は、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖内のヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを指す。したがって、Ｂ３は、標的ＤＮＡ配列内のＢ３ｃ領域と相補的な領域を含み得る（図１）。
本明細書で使用される「フォワードループプライマー」または「ＦＬ」という用語は、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖内のポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを指す。したがって、ＦＬは、ＦＬｃと称される標的ＤＮＡ配列のセクションに相補的である（図１）。
本明細書で使用される「バックワードループプライマー」または「ＢＬ」という用語は、標的ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖内のポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを指す。したがって、ＢＬは、ＢＬｃと称される標的ＤＮＡ配列のセクションに相補的である（図１）。
本明細書で使用される「核酸増幅」という用語は、サンプル中の特定の核酸配列を複製および増幅するために使用される任意の核酸ステップ／方法／プロトコルを指す。
「ＬＡＭＰ」という用語は、ループ媒介等温増幅を指す。ＬＡＭＰは、核酸増幅反応である。ＬＡＭＰは、標的配列内またはその周囲の６（または８）領域を標的とする４（または６）のプライマーを使用する（図１）。この方法は、等温条件に依存する。すなわち、一定温度で実施され、サーマルサイクラーを必要としない。簡潔に言えば、標的遺伝子のＬＡＭＰ増幅は、標的特異的プライマーＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、およびＢ３、およびポリメラーゼと共に、５９～７５℃の範囲の一定温度でインキュベートしたときに発生する。フォワードおよびバックワードループプライマー、それぞれＦＬおよびＢＬを含めることをＬＡＭＰ増幅に追加することができる。増幅産物は、任意の適切な方法によって検出することができる。本方法の結果は、ＬＡＭＰ増幅中に生成されたＤＮＡコピーの数と関連付けることができるため、サンプル中に存在するＤＮＡ量の定量化の基礎として機能する。定量的検出は、エンドポイント測定およびリアルタイム測定の両方により実施され得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡであってもよい。
「ＲＴ－ＬＡＭＰ」という用語は、逆転写ループ媒介等温増幅を指す。ＲＴ－ＬＡＭＰは、ＬＡＭＰおよび逆転写ステップを組み合わせて、ＲＮＡの検出を可能にする。
本明細書で使用される「核酸増幅試薬」という用語は、サンプル内の任意の標的ポリヌクレオチド（複数可）の増幅をもたらすためにサンプルに添加される試薬を指す。
本明細書で使用される「ＬＡＭＰ試薬」という用語は、サンプルおよび少なくとも４つのプライマーに加えてＬＡＭＰに添加される剤を指す。ＬＡＭＰ試薬は、少なくともヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼを含む。さらに、ＬＡＭＰ試薬は、塩（複数可）および緩衝液（複数可）などの他の化合物を含んでもよい。核酸ポリメラーゼは、好ましくは、高い鎖置換活性および複製活性を有する。
本明細書で使用される「シグナル伝達物質」という用語は、変化を受ける増幅試薬（ＬＡＭＰ試薬など）もしくはサンプルの任意の物理量、または核酸増幅中に産生、消費される、もしくは相変化を受ける剤、および検出することができ、したがって例えば、Ｈ＋イオンの産生、またはサンプル／反応混合物のｐＨまたは導電率の低下など、増幅反応を実証または定量化するために使用することができる量を指す。
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、検出が望まれる任意の核酸配列を指す。一実施形態では、標的配列は、核酸配列であり、好ましくは、ＬＡＭＰなどの任意の核酸増幅技術によって増幅することができる核酸配列であり、好ましくは、標的核酸配列は、標的配列に隣接する少なくとも４つのプライマーを使用して増幅される。
本明細書で使用される「標的ポリヌクレオチド」という用語は、「標的核酸」という用語を包含し、特に明記しない限り、この２つの定義は、同義的に使用され得る。
本明細書で使用される「電気化学デバイス」という用語は、分析物を含む電気化学セル内の電位（ボルト）および／または電流（アンペア）を測定することによって、分析物を研究できる任意のデバイスを指す。典型的には、電気化学デバイスを使用して測定するための３つの主なカテゴリは、ポテンショメトリー（電極電位の差を測定する）、クーロメトリー（セルの電流を経時的に測定する）、およびボルタンメトリー（セルの電位を積極的に変化させながらセルの電流を測定する）である。本明細書で使用される「電気化学デバイス」という用語は、本発明の第１の態様に言及する場合、「３電極電気化学セル」という用語と同義的に使用され得る。疑義を避けるために、反対のことが明示的に述べられていない限り、「電気化学デバイス」に関して本明細書に記載されるすべての実施形態は、本発明の第２の態様の電気化学デバイスおよび本発明の第１の態様の３電極電気化学セルの両方を指す。
本明細書で使用される「３電極電気化学セル」という用語は、作用電極、対電極および参照電極である３つの異なる電極を含む電気化学セルを指す。使用時には、電気化学セルの３つの電極すべてを、分析する溶液と接触させる。３電極実験中には、参照電極に対する作用電極の電位を測定しながら、主に作用電極と対電極との間で電荷の流れ（電流）が発生する。
本明細書で使用される「２電極電気化学セル」という用語は、２つの電極を含む電気化学セルを指し、ここでは、１つの電極が作用電極であり、第２の電極が参照電極と対電極とを組み合わせたものである。すなわち、第２の電極は、参照電極と対電極が短絡されて１つの電極として作用する、すなわちそれらが同じ電極である、３電極セルの変形である。
本明細書で使用される「電極」という用語は、電気化学システムに入る、または電気化学システムから出る電流の経路を提供する導電性材料（多くの場合、炭素、金属、または複合材料から作られる）を指す。電気化学測定中、電極表面の一部がイオン伝導性培地または電解質と直接接触し、それを介して他の電極間で電荷が移動する。
本明細書で使用される「キノン」という用語は、ビニレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）基によって隣接しているかまたは分離された２つのカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基を含む環状有機化合物である有機化合物を指す。
本明細書で使用される「キノン誘導体」という用語は、化合物の環状骨格中の水素原子のうちの１つ以上が、他の原子またはラジカルによって置換されている、上で定義したキノンから誘導される化合物を指す。
本明細書で使用する場合、「矩形波ボルタンメトリー」という用語は、静止電極に印加される矩形波と階段電位との組み合わせを使用する線形電位掃引ボルタンメトリーの形態を指す。
本明細書で使用される「電気化学応答」という用語は、電流の通過を引き起こすか、または電流の通過を伴うかのいずれかの任意の測定可能なプロセスを指す。このような測定可能な電気化学応答には、システムの電位、電流、またはインピーダンスの測定、あるいは実際にこれらの測定値のいずれかの組み合わせの測定が含まれる。
本明細書で使用される「ｐＨ指示薬」という用語は、ハロクロミック化合物を指し、これは、ｐＨの変化が起こると変色する化合物であり、溶液に少量添加した場合、その溶液のｐＨ（酸性度または塩基性度）を視覚的に決定できる化合物である。
本明細書で使用されるカテコールという用語は、以下の一般式Ｉによる構造的動機を有するすべての基を含む：
Figure 2023520419000002
これにより、残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、存在しなくてもよく、水素または任意の有機もしくは有機金属残基であり得る。好ましい残基は、窒素、酸素および／または硫黄原子を含む部分、例えば、－ＮＨ２、－ＮＨ－、－ＯＨ、＝Ｏ、－Ｏ－、－ＳＨ、および／または－Ｓ－Ｓ－によって、任意により中断または置換することができる、脂肪族または芳香族鎖（例えば、Ｃ１－Ｃ１０脂肪族鎖またはＣ６－Ｃ２０芳香族残基など）である。残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれの場合において、互いに独立して同じ意味または異なる意味を有することができる。本明細書で使用するカテコールという用語は、置換オルト－ジヒドロキシベンゼン誘導体も指す。２つの異なる異性体コンフォメーションは、カテコールによって表され、これは、ピロカテコールおよびベンゼン－１，２－ジオールとしても知られている。
「カテコール基」という用語は、キノンとしても知られ、次の一般式ＩＩに対応するカテコールおよびその誘導体の酸化形態も指す：
Figure 2023520419000003
 残基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記に説明したのと同じ意味を有し得る。
本明細書で使用される「容器」という用語は、水溶液などの液体を収容するのに好適であるコンテナなどの容器に関する。容器は、通常、開口部、およびその開口部を閉じるために使用できる蓋を備える。本開示による容器は、また、３電極電気化学セルを備えてもよい。
溶液のｐＨを測定する方法
本発明の一態様によれば、溶液のｐＨを測定する方法が提供され、本方法は、
－溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物を含む溶液を提供するステップと；
－溶液を２電極電気化学セルまたは３電極電気化学セルに適用するステップと；
－電気化学セルの電気化学応答を測定するステップと；
－電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化するステップと、を含む。
本発明の別の態様によれば、溶液のｐＨを測定する方法が提供され、本方法は、
－キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬を含む溶液を提供するステップと；
－溶液を３電極電気化学セルに適用するステップと；
－電気化学セルの電気化学応答を測定するステップと；
－電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化するステップと、を含む。
一実施形態では、溶液は、溶液のｐＨに応じて、それらの酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる複数の化合物を含む。すなわち、溶液は、溶液のｐＨに応じて、それらの酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる複数の構造的に異なる化合物、例えば２つ以上の化合物、例えば３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の化合物を含み得る。
別の実施形態では、溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物は、カテコール、カテコール誘導体および／またはカテコール基を含む化合物である。
別の実施形態では、溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物は、キノン、キノン誘導体、ｐＨ指示薬、またはそれらの組み合わせである。
さらなる実施形態では、溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物は、キノンまたは１，２－ベンゾキノン、１、４－ベンゾキノン、１，４－ナフトキノン、９，１０－アントラキノン、およびそれらの誘導体からなるリストから選択されるキノン誘導体およびそれらの組み合わせである。
別の実施形態では、溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物は、マラカイトグリーンシュウ酸塩、ブリリアントグリーン、エオシンイエロー、エリスロシンＢ、メチルグリーン、メチルバイオレット、ピクリン酸、クレゾールレッド、クリスタルバイオレット、ｍ－クレゾールパープル、チモールブルー、ｐ－キシレノールブルー、エオシン（ブルー）、キナルジンレッド、２，４－ジニトロフェノール、４－（ジメチルアミノ）アゾベンゾール、ブロモクロロフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、コンゴーレッド、メチルオレンジ、ブロモクレゾールグリーン、２，５－ジニトロフェノール、アリザリンスルホン酸、メチルレッド、クロロフェノールレッド、リトマス、ブロモクレゾールパープル、ブロモフェノールレッド、４－ニトロフェノール、ブロモキシレノールブルー、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、３－ニトロフェノール、ニュートラルレッド、クレゾールレッド、１－ナフトールフタレイン、ｍ－クレゾールパープル、チモールブルー、ｐ－キシレノールブルー、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、アルカリブルー、アリザリンイエローＧＧ、インジゴカルミン、イプシロンブルー、チタンイエロー、およびこれらの組み合わせからなるリストから選択されるｐＨ指示薬である。一実施形態では、溶液は、この段落に列挙された化合物のうちの少なくとも２つ、例えば、この段落に列挙された少なくとも３つ、４つまたは５つの化合物を含む。
本開示の一実施形態では、２つ以上の化合物が、同じ水溶液中に提供され、ここで、化合物は、カテコール、カテコール誘導体、カテコール基を含む化合物、キノン、キノン誘導体またはｐＨ指示薬である。したがって、ｐＨの測定および定量化は、より大きいｐＨスケール、例えばｐＨ５～８、例えばｐＨ４～８、例えばｐＨ３～８、例えばｐＨ３～９、例えばｐＨ４～９、例えばｐＨ５～９、例えばｐＨ６～９、すべてのｐＨ範囲にわたってなどで行うことができる。
本開示の一実施形態では、３電極電気化学セルは、キンヒドロン電極を含まない。実際、キンヒドロン電極は、試験溶液自体が生化学的または化学的反応により、経時的に開回路電位（ＯＣＰ）の変化を引き起こす溶液のｐＨを効果的に測定することはできない。さらに、キンヒドロン電極は、塩誤差を受ける。キンヒドロン電極の機能は、酸化剤および還元剤の存在によって損なわれる可能性があり、キンヒドロン電極は、銅、銀、および起電系列のアンチモン以下の他の金属などの微量の金属によって被毒されており、錯化剤が、分析する溶液中に存在する場合、これは、ｐＨ測定にも干渉し得る。
さらに重要なことに、キンヒドロン電極は、３電極電気化学セルでの使用には好適ではない。これは、３電極電気化学セルでは、キンヒドロンとその水性解離生成物とを、電気化学的に分析する（例えば、区別する）ことができないためである。したがって、キンヒドロン電極は、本明細書に開示される方法およびシステムでの使用には適していない。
したがって、本開示の一実施形態では、キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬は、キンヒドロンではない。
カテコール、カテコール誘導体、および／またはカテコール基を含む化合物、例えば、キノンまたはキノン誘導体、例えば、フェノールレッドなどの列挙された特定の化合物のうちのいずれか一つなどを使用することにより、溶液のｐＨの定量化によりいくつかの利点がもたらされる。利点の１つは、ｐＨ測定において高分解能であることである。特に、水溶液中の水素イオン活性を測定する標準的ｐＨメーターでｐＨを定量化する場合と比較して、高分解能となる。これは、本開示の実施例３において詳細に提供するとおり、カテコール、カテコール誘導体、および／またはカテコール基を含む化合物、例えば、キノンまたはキノン誘導体など（列挙された特定の化合物のいずれか１つ、例えばフェノールレッドなど）の特徴を明らかにする豊富な酸化還元化学によるものである。
したがって、本開示で開示される方法およびシステムは、ｐＨ測定の応答時間が、半透膜または吸着膜を通るイオン、例えばプロトンの拡散に依存しないため、正確かつ瞬時のｐＨ測定を提供するが、代わりに、カテコール、カテコール誘導体および／またはキノンもしくはキノン誘導体などのカテコール基を含む化合物、またはｐＨ指示薬の電気化学的状態と相関する電気化学応答の測定に基づく。
さらなる実施形態では、溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物は、フェノールレッドである。
別の実施形態では、溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物は、弱酸、例えば、約２～約１４のｐＫａ、約４～約１２のｐＫａなど、例えば、約６～約１０のｐＫａを有する弱酸である。
一実施形態では、溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物は、溶液中に溶解される。すなわち、サンプル溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物は、２電極または３電極化学セルのうちのいずれの電極にも結合しない、特に、化学的またはあらゆる物理的手段のいずれかによって、不可逆的に結合されない。
別の実施形態では、溶液は、水溶液である。特に、溶液は、少なくとも９０体積％の水、例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９体積％の水などを含む水溶液である。例えば、溶液は、９９体積％を超える水を含む水溶液である。
一実施形態では、２電極または３電極電気化学セルの電位は、動電位電気化学、例えば、サイクリック矩形波ボルタンメトリー、矩形波ボルタンメトリー、線形電位掃引ボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリーまたは開回路電位差測定などによって測定される。
さらなる実施形態では、電気化学セルは、２電極化学セルであり、セルの電位は、開回路電位差測定法によって測定される。
一実施形態では、電気化学セルは３電極化学セルであり、セルの電位は、サイクリック矩形波ボルタンメトリー、矩形波ボルタンメトリー、線形電位掃引ボルタンメトリー、またはサイクリックボルタンメトリーによって測定される。
別の実施形態では、矩形波ボルタンメトリーステップは、約－２～約２Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、約－１～約１Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、例えば約－０．６～約０．６Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの走査範囲で実行される。
さらなる実施形態では、矩形波ボルタンメトリーステップは、約１～約５０Ｈｚの周波数、例えば、約５～約２０Ｈｚなどで実行される。
一実施形態では、矩形波ボルタンメトリーステップは、約１～約２０ｍＶの電位ステップ、例えば、約１～約１０ｍＶで実行される。
別の実施形態では、矩形波ボルタンメトリーステップは、約１～約５０ｍＶの振幅、例えば、約１～約２５ｍＶ、例えば約５～約２０ｍＶで実行される。
さらなる実施形態では、溶液内の溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物の濃度は、約１μＭ～約１０００μＭ、例えば、約１μＭ～約５００μＭ、例えば、約５μＭ～約２５０μＭ、特に約５０μＭ～約２００μＭ、例えば、約５０μＭ～約１５０μＭ、例えば、約５０μＭ～約１００μＭなどである。
一実施形態では、電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化するステップは、回帰アルゴリズム、例えば、線形回帰アルゴリズムなどの適用を介して実行される。理論に束縛されることを望むものではないが、線形回帰アルゴリズムは、ｐＨを酸化還元電位および電流に対応させて、線形的に相関させる。
別の実施形態では、溶液は、緩衝液を含む。
一実施形態では、緩衝液は、２０～４５０μＭの量のトリスアミノメタンを含む。
さらなる実施形態では、緩衝液は、（ＮＨ４）２ＳＯ４を５～２０ｍＭの量で含む。
別の実施形態では、緩衝液は、ＫＣｌを２５～１００ｍＭの量で含む。
一実施形態では、緩衝液は、ＭｇＳＯ４を５～２０ｍＭの量で含む。
一実施形態では、緩衝液は、デオキシヌクレオシド三リン酸を１～５ｍＭの量で含む。
別の実施形態では、緩衝液は、ｔｗｅｅｎ－２０を０．０５～１％ｖ／ｖの量で含む。
本開示の別の態様は、溶液のｐＨを定量化するための、キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬の使用に関し、
ここで、溶液は、電気化学セル内にあり、
ｐＨは、電気化学セルにおける電気化学応答を測定することによって定量化される。
標的ポリヌクレオチドを定量化する方法
以下でさらに定義されるように、本発明の第１の態様の方法はまた、サンプルを提供するステップを含んでもよい。一実施形態では、サンプルは溶液中に提供される。すなわち、溶液はサンプルを含み得る。サンプルは、任意のサンプルであり得る。好ましい実施形態では、サンプルは、生物学的サンプルである。本明細書の非限定的な例は、以下でさらに定義される体液サンプルまたは組織サンプルである。
サンプルは、標的ポリヌクレオチド／標的核酸を含んでも含まなくてもよいことが想定される。したがって、本発明の第１の態様の実施形態では、この方法は、溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在を決定することが可能になる。すなわち、この方法は、溶液のｐＨを測定することが可能になり、これにより、標的ポリヌクレオチドが溶液中に存在するか否かを決定することが可能になる。
一実施形態では、溶液は、プライマーおよび核酸増幅試薬をさらに含み、好ましくは、核酸増幅試薬は、ＬＡＭＰ試薬である。
さらなる実施形態では、核酸増幅試薬は、シグナル伝達物質を含むか、またはシグナル伝達物質を放出できるか、またはシグナル伝達物質とシグナル伝達物質を放出できる物質の両方を含む。
別の実施形態では、シグナル伝達物質は、Ｈ＋および／またはＨ３Ｏ＋である。
別の実施形態では、ＬＡＭＰ試薬は逆転写酵素を含む。
さらなる実施形態では、プライマーは、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマーおよびバックワードアウタープライマーを含む。
一実施形態では、ＬＡＭＰ増幅は、フォワードループプライマーおよび／またはバックワードループプライマーなどのループプライマーの追加の対を用いて実施される。
一実施形態では、ＦＩＰ／ＢＩＰは、溶液中に１．６μＭの量で存在し、Ｆ３／Ｂ３は、０．２μＭの量で存在し、ループＦ／Ｂは、０．４μＭの量で存在する。
一実施形態では、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは、溶液中に０．３２Ｕ／μＬの量で存在し、逆転写酵素は、０．３Ｕ／μＬの量で存在する。
一実施形態では、この方法は、核酸増幅ステップ（例えば、等温核酸増幅ステップ）、好ましくは、複数の核酸増幅ステップを実施するステップを含む。核酸増幅ステップ（複数可）は、溶液が２電極または３電極電気化学セルに適用された後に、有利に実施される。さらなる実施形態では、核酸増幅を実施するステップ、電気化学セルの電気化学応答を測定するステップ、および電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化するステップは、この順序で、または他の順序で順次実施され得る、もしくは同時に実施され得るか、または、これらのステップは、同時にかつ連続的に実施され得る。
本発明の第１の態様の方法では、任意の核酸増幅ステップ／プロトコル／方法を使用され得ることが想定されており、このような増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ネステッド（ｎ）、定量的（ｑ）またはリアルタイム逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲなど）、本明細書の他の場所で定義されているＬＡＭＰ、ローリングサークル増幅、および定量的核酸配列ベースの増幅（ＱＴ－ＮＡＳＢＡ）からなるリストから選択され得る。
特定の実施形態では、核酸増幅ステップ／プロトコル／方法は、等温であり、例えば、核酸増幅は、等温であり、４０～８０℃の範囲、例えば、５０～７０℃、例えば、５７～６５℃の温度で実施される。
一実施形態では、核酸等温増幅ステップは、ＬＡＭＰステップまたはローリングサークル増幅ステップである。
さらなる実施形態では、核酸増幅ステップ（複数可）は、ＬＡＭＰステップである。疑義を避けるために、核酸増幅ステップを１つのみ実施する場合、この実施形態では、ＬＡＭＰステップを１つのみ実施する。しかし、複数の核酸増幅ステップが想定される場合には、複数のＬＡＭＰステップが実施される。
一実施形態では、この方法は、溶液中または溶液中に提供されるサンプル中の標的ポリヌクレオチドの量を定量化するためのものである。
別の実施形態では、電気化学セルの電気化学応答を測定するステップは、シグナル伝達物質の濃度変化により、電気化学セルの電流および／またはインピーダンスおよび／または電位の変化を測定することを含む。
さらなる実施形態では、方法は、２電極または３電極電気化学セルの電気化学応答（例えば、電流および／またはインピーダンスおよび／または電位）の変化率から、核酸の増幅率を導出するステップを含む。
一実施形態では、核酸の増幅率を導出するステップは、２電極または３電極電気化学セルの電気化学応答を測定するステップと同時に実施される。
さらなる実施形態では、核酸増幅ステップは、核酸が増幅されるにつれて、Ｈ＋などのシグナル伝達物質を産生または消費する。これは、第一に核酸／ポリヌクレオチドが溶液中に存在するという条件に基づく。シグナル伝達物質の産生または消費によりシグナル伝達物質の濃度が変化することにより、電気化学セルの電流および／または電位および／またはインピーダンスの変化が生じる。電気化学セルの電流および／または電位および／またはインピーダンスの変化の結果として、定量化されたｐＨ値も変化し、このｐＨの変化から核酸／標的ポリヌクレオチドの増幅率を導出できる。疑義を避けるために、電気化学セルの電流および／または電位および／またはインピーダンスのあらゆる検出可能な変化として、標的ポリヌクレオチドが溶液中に存在するかを決定するために、増幅率を導出するステップは必要なく、その後定量化されたｐＨ変化が、ポリヌクレオチドの存在を示す。
したがって、本発明の特定の第１の態様は、溶液のｐＨを測定する、および溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法を提供し、本方法は、
ａ．溶液のｐＨに応じて、その酸化状態または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物を含む溶液、およびサンプルを提供するステップと；
ｂ．溶液を２電極電気化学セルまたは３電極電気化学セルに適用するステップと；
ｃ．標的ポリヌクレオチドが存在する場合、核酸増幅（複数可）がシグナル伝達物質を産生または消費する、少なくとも１つまたは複数の核酸増幅ステップを実施するステップと；
ｄ．シグナル伝達物質の濃度変化により、電気化学セルの電流、および／または電位、および／またはインピーダンスの変化など、電気化学セルの電気化学応答を測定するステップと；
ｅ．溶液のｐＨおよび／または溶液のｐＨの変化を、電気化学セルの電気化学応答に応じて定量化するステップと；
ｆ．任意により、もともと存在する場合、電気化学セルの電気化学応答の変化率によって、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの増幅率を導出し、それによってサンプル中の標的ポリヌクレオチドの量を定量化するステップと、を含む。
したがって、本発明の特定の第１の態様は、溶液のｐＨを測定する、および溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法を提供し、本方法は、
ａ．キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬を提供するステップと；
ｂ．溶液を３電極電気化学セルに適用するステップと；
ｃ．標的ポリヌクレオチドが存在する場合、核酸増幅（複数可）がシグナル伝達物質を産生または消費する、少なくとも１つまたは複数の核酸増幅ステップを実施するステップと；
ｄ．シグナル伝達物質の濃度変化により、電気化学セルの電流、および／または電位、および／またはインピーダンスの変化など、電気化学セルの電気化学応答を測定するステップと；
ｅ．溶液のｐＨおよび／または溶液のｐＨの変化を、電気化学セルの電気化学応答に応じて定量化するステップと；
ｆ．任意により、もともと存在する場合、電気化学セルの電気化学応答の変化率によって、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの増幅率を導出し、それによってサンプル中の標的ポリヌクレオチドの量を定量化するステップと、を含む。
上記の段落のステップｃ、ｄ、ｅおよびｆは、指定された順序で順次、もしくは別の順序で、個別に実施され得るか、または同時に、例えば同時かつ連続的に実施され得る。
疑義を避けるために、本発明は、標的ポリヌクレオチドがサンプル中に元々存在するか否かに限定されることは想定されない。すなわち、核酸増幅ステップは、標的ポリヌクレオチドを含まないサンプルを含む溶液で実施することができ、このシナリオでは、電気化学応答（例えば、電気化学セルの電流および／または電位および／またはインピーダンス）のゼロまたは少なくとも検出不可能な変化がもたらされ、これにより、標的ポリヌクレオチドについて陰性の結果となる。
標的ポリヌクレオチド
標的ポリヌクレオチドは、任意のポリヌクレオチド配列であり得る。標的ポリヌクレオチドは、特に、ウイルスまたは細菌のポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、理想的には、ウイルスの種類または細菌の種および鎖に固有のＤＮＡのストレッチであると同時に、特定のウイルスまたは細菌のゲノム中で安定するのに十分なほど進化的に保存されている。
一実施形態では、ウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、（＋）ｓｓＲＮＡウイルスＲＮＡ、（－）ｓｓＲＮＡウイルスＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルスＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ－ＲＴウイルスＤＮＡからなる群から選択される。
好ましい実施形態では、ウイルスは、（＋）ｓｓＲＮＡウイルスＲＮＡである。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス、またはＭＥＲＳ－ＣｏＶウイルス中に存在する任意のポリヌクレオチドであり得る。
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、コロナウイルス中に存在する任意のポリヌクレオチドであり得る。
一実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡなど、コロナウイルス中に存在する任意のポリヌクレオチドであり得る。
一実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号２の配列である。
一実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号２に対して、７０．０％、７１．０％、７２．０％、７３．０％、７４．０％、７５．０％、７６．０％、７７．０％、７８．０％、７９．０％、８０．０％、８１．０％、８２．０％、８３．０％、８４．０％、８５．０％、８６．０％、８７．０％、８８．０％、８９．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９８．０％、９９．０％、および１００．０％の相同性または配列同一性を含む。
２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性（または相同性）は、好適なコンピュータプログラム、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定することができ、パーセント同一性は、配列が最適に整列されているポリペプチドに関して、計算されることが理解される。あるいは、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２、４６７３－８０）を使用して実施され得る。使用されるパラメータは、次のとおりであり得る：高速ペアワイズアライメントパラメータ：Ｋ－タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、間隙ペナルティ；３、上対角線数；５。スコアリング方法：ｘパーセント。
複数のアライメントパラメータ：間隙オープンペナルティ；１０、間隙エクステンションペナルティ；０．０５。
スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
サンプル
本発明の第２の態様では、この方法は、サンプルを提供するステップを含む。サンプルは、任意のサンプルであり得る。好ましい実施形態では、サンプルは、生物学的サンプルである。本明細書の限定的な例は、体液サンプルまたは組織サンプルである。
さらにより好ましい実施形態では、サンプルは、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、または原生動物の細胞を含む。
本発明の第１の態様では、方法はまた、サンプルを提供するステップを含んでもよい。一実施形態では、サンプルは溶液中に提供される。すなわち、溶液はサンプルを含み得る。サンプルは、任意のサンプルであり得る。好ましい実施形態では、サンプルは、生物学的サンプルである。本明細書の限定的な例は、体液サンプルまたは組織サンプルである。
サンプルは、上記で定義した標的ポリヌクレオチドを含み得る。具体的には、標的ポリヌクレオチドは、任意のポリヌクレオチド配列／核酸配列であり得る。サンプル中の標的ポリヌクレオチドは、特に、ウイルスまたは細菌ポリヌクレオチドであり得る。サンプル中の標的ポリヌクレオチドは、ウイルスの種類または細菌の種および鎖に固有のＤＮＡのストレッチであると同時に、特定のウイルスまたは細菌のゲノム中で安定するのに十分なほど進化的に保存されている。
一実施形態では、サンプルは、単離されたＤＮＡサンプル、単離されたＲＮＡサンプル、粗ＤＮＡ抽出サンプルまたは粗ＲＮＡ抽出サンプルであり得る。
一実施形態では、サンプルは、鼻サンプル、喉サンプル、肛門サンプル、膣サンプル、耳排出サンプル、皮膚表面スワブサンプル、尿サンプル、全血サンプル、血清サンプル、血漿サンプルまたはリンパ排液サンプルである。
別の実施形態では、サンプルは、組織サンプルである。組織サンプルは、上皮組織サンプル、結合組織サンプル、筋肉組織サンプルおよび／または神経組織サンプルなどの任意の組織サンプルであり得る。
この方法は、サンプルを電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルに適用する前に、サンプルを調製する１つのステップをさらに含んでもよい。サンプルは、任意の好適な方法によって調製され得る。これらの例は、以下の実施例１に記載されている。
一般に、サンプルは、任意の好適な培地と混合することができる。当業者は、特定のサンプルについて、好適な培地を知っているであろう。培地は、輸送培地であってもよい。サンプルおよび輸送培地は、電気化学デバイスに直接添加するか、またはサンプルおよび培地を適用する前に、任意の好適な温度で好適な時間、加熱することができる。
一実施形態では、サンプルは、輸送培地に接種される。輸送培地は、標的ポリヌクレオチド配列を輸送するための任意の好適な培地であり得る。好ましい実施形態では、輸送培地は、ウイルス輸送培地である。
別の実施形態では、サンプルは、ヘパリン、ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムのような抗凝固剤と混合される。
サンプルは、任意により培地と混合され、例えば、機械的溶解、熱溶解、音響キャビテーション、浸透圧衝撃、酵素的溶解または化学的溶解によって溶解され得る。
一実施形態では、サンプルを電気化学デバイスに適用する前に、サンプルを少なくとも４つのプライマーおよびＬＡＭＰ試薬と混合する。
一実施形態では、サンプルは、６０～１００℃、例えば６５～９５℃、例えば７０～９０℃、例えば７５～８５℃で加熱される。
一実施形態では、サンプルは、少なくとも１分間、例えば少なくとも２分間、例えば少なくとも５分間加熱される。
一実施形態では、本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドがサンプル中に存在するか否かを検出することができる。
別の実施形態では、本発明の方法は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの量を定量化することができる。
電解デバイス
本発明の第１の態様では、この方法は、溶液を２電極または３電極電気化学セルに添加するステップを含む。
本発明の第２の態様では、この方法は、複数のフィルム電極を有する電気化学セルを含む電気化学デバイスを提供するステップを含む。
本発明の両方の態様では、電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルは、単層に配置されたフィルム電極を有する平面デバイスであってもよい。これにより、フィルム電極は、スクリーン印刷または厚膜技術などによって、２ｍｍ未満の厚さで平面基板上にパターン化され得る。スクリーン印刷電極（ＳＰＥ）は、低コストの使い捨て型センサおよびバイオセンサの形成に一般的に使用される。このようなセンサの電極は、様々な導電性インクを使用して、分析ニーズに応じて様々な形状および寸法で製造できる。製造に加えて、これらのプラットフォームは、ナノ材料およびバイオ要素などの様々な材料でカスタマイズするのに好適である。したがって、本開示の一実施形態では、電極は、スクリーン印刷電極であり、好ましくは、不活性材料の平面基板上に印刷される。
本開示の一実施形態では、３電極電気化学セルの電極は、ワイヤ電極である。
好ましくは、電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルの面積は、５００ｍｍ２未満であり、さらにより好ましくは３００ｍｍ２未満であり、これにより、電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルが携帯型になり、ポイントオブケア環境に好適であるようになる。電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルの電極は、平面基板のエッジに向かって延在し、それによって、ポテンショスタットなどの測定セットアップへの電気接続のためのエッジ接続を形成することができる。ポテンショスタット自体は、ハンドヘルドポテンショスタットなどの携帯型ポテンショスタットであってもよい。
本発明の第２の態様における電気化学デバイスは、複数のフィルム電極、例えば、作用電極、参照電極、および対電極を含むことができ、電極は、好ましくは、電気化学的３電極システムなど、３電極システムの一部を形成する。
３電極システムの作用電極は、典型的には、目的の酸化還元プロセスが発生する電極である。そのため、電気分析測定の焦点は、典型的には、作用電極で発生する特定の電気化学反応にある。
参照電極は、典型的には、安定した周知の熱力学的電位を有する。参照電極の高い安定性は、通常、酸化還元半反応に関与するイオンまたは分子の一定（緩衝または飽和）濃度を有する酸化還元システムを採用することによって達成される。３電極システムの一部として使用する場合、電流は、参照電極を通過しない。
補助電極とも呼ばれる対電極は、典型的には、電気化学システム内で使用され、作用電極を有する電気回路を完成させる。目的の酸化還元プロセスは、典型的には、作用電極で発生するが、対電極は、作用電極での電気化学反応を制限しないように、電流の供給源または保管場所として機能し得る。
電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルの電極は、金、銀、炭素、白金、二酸化ルテニウム、またはそれらの組み合わせなどの好適な材料中で製造することができる。電極の材料は、個別に選択することができ、それによって各電極などの複数の電極の材料は、異なっていてもよい。あるいは、電極は、同じ材料で提供されてもよい。しかし、単純さ、安定性、および小型化の能力を提供するために、参照電極および対電極の材料がＡｇ／ＡｇＣｌであることが好ましい場合がある。本開示の別の実施形態では、電極の材料は、同一であってもよい。
さらに、電極のいずれかまたはすべてが、イオン選択膜を含んでもよく、そのような電極は、イオン選択電極と呼ばれ得る。膜は、サンプル中に溶解した特定のイオンの活性を電位に変換するために使用され得る。膜は、電極の少なくとも一部を覆うことができ、測定中に溶液との界面を形成するように配置してもよい。膜は、好ましくはガラス膜であり、典型的には、イオン交換型のガラス（ケイ酸塩またはカルコゲニド）である。あるいは、膜は、結晶膜、イオン交換樹脂膜または酵素膜であってもよい。
イオン選択膜を使用する代わりに、またはそれに加えて、電極のいずれかの表面を改変してもよい。例えば、作用電極の表面を化学的に修飾して、ヒドロキシドＯＨ－および／またはヒドロニウムＨ３Ｏ＋イオンの結合を可能にしてもよい。本開示の一実施形態では、電極のいずれかの表面は、酸化コバルトと酸化イリジウムとの組み合わせを有する固体膜のｐＨ感受性層を含み得る。好ましくは、作用電極の表面は、酸化コバルトと酸化イリジウムとを組み合わせた固体膜のｐＨ感受性層を含む。
電極表面のさらなる改変には、酸化ルテニウム、グラフェンプレートレット、露出チオール基および／または露出ヒドロキシル基による化学修飾が含まれる。
好ましくは、サンプル／溶液との接触を形成するための電極のいずれかの表面は、真の参照電極測定のためなど、任意の固定濃度の塩化物イオンを有する。それにより、電極のいずれかまたはすべてが、任意の固定濃度の塩化物イオンを有する表面を含むことができる。
本開示の好ましい実施形態では、作用電極の材料は、炭素であり、対電極および参照電極の材料は、Ａｇ／ＡｇＣｌである。
電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルは、平面基板上に電極をスクリーン印刷することによって形成することができる。それにより、電極は、電極が単層内にあるスクリーン印刷電極であってもよい。平面基板の材料は、好ましくは、アルミナ、セラミック、ガラス、または不活性プラスチックなどの化学的不活性材料である。電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルは、小型のフォームファクタを有することが好ましく、これにより携帯型になり、ポイントオブケア測定に好適である。
電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルは、分析される溶液を受け取るための入口を備えることが好ましい。入口は、マイクロ流体入口であってもよく、さらに親水性域によって電気化学セルに接続されていてもよい。親水性域は、理想的には、マイクロ流体入口に提供された溶液がキャピラリー作用によって電気化学セルに輸送されるように構成される。電気化学セルに溶液を貯蔵および提供する別の手段は、電気化学セル上に重ねられたマイクロウェルの使用を含む。マイクロウェルは、電気化学デバイスに、および／またはリソグラフィによって結合され得る。
溶液が、電気化学セルに供給される場合、溶液の蒸発を防ぐために蒸気バリアを適用することが有利であり得る。これは、少なくとも数分間など、より長い時間の測定中に特に必要となり得る。蒸気バリアは、物理的蓋、加熱蓋、鉱油、および／またはパラフィンワックスを用いて、電気化学デバイスまたはマイクロウェルの入口を流体により密閉することによって形成され得る。これにより、蒸気バリアは、溶液を含む流体密閉デバイスを形成するように作用する。
本開示の一実施形態では、電気化学デバイスは、プライマーおよびＬＡＭＰ試薬を含み得る。換言すれば、プライマーおよびＬＡＭＰ試薬は、サンプル／溶液の装填前に、デバイスに予め装填され得る。
本開示の一態様では、溶液のｐＨを測定するためのシステムが提供され、システムは、
ａ．ポテンショスタットを含む器具；と
ｉｉｉ．３電極電気化学セルを含む第１の容器、およびキノン、キノン誘導体、および／もしくはｐＨ指示薬を含む第２容器、または
ｉｖ．３電極電気化学セル、およびキノン、キノン誘導体、および／もしくはｐＨ指示薬を含む第１の容器と、を備え、
ポテンショスタットは、電気化学セルの電気化学応答を測定するように構成されている。
一実施形態では、本明細書に開示されるシステムのキノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬は、第１または第２の容器内の水溶液に溶解される。
一実施形態では、本明細書に開示されるシステムのキノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬は、第１の容器内の水溶液に溶解され、水溶液は、標的配列に隣接するように構成されている少なくとも２つのプライマーおよびＬＡＭＰ試薬などの核酸増幅反応系も含む。
一実施形態では、本明細書に開示されるシステムのキノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬は、第２の容器内の水溶液に溶解され、第１の容器は別の水溶液を含む。したがって、第１の容器中の水溶液のｐＨを測定する前に、キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬を含む好適な量の水溶液を第１の容器に移す。
一実施形態では、ポテンショスタットは、電気化学セルの電気化学応答を測定するように構成されている。
一実施形態では、ポテンショスタットは、電気化学応答を測定するように構成され、電気化学応答は、第１の容器中でのキノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬の酸化状態を表す。
一実施形態では、システムは、第１および／または第２の容器を、５９℃～７５℃の範囲内の温度などまで加熱するように構成された加熱ユニットをさらに備える。
一実施形態では、第１の容器は、標的ポリヌクレオチド配列に隣接するように構成された少なくとも２つまたは少なくとも４つのプライマーおよびＬＡＭＰ試薬などの核酸増幅反応系を収容する。
一実施形態では、第１の容器は、溶液および／またはサンプルを受け取るためのマイクロ流体入口を備える。
一実施形態では、第１および／または第２の容器は、各使用後に新しい第１および／または第２の容器と交換する。
一実施形態では、マイクロ流体入口は、キャピラリー作用によってサンプルを輸送するように構成された多孔質／繊維構造または親水性チャネルなどの親水性域によって電気化学セルに接続される。
一実施形態では、第１の容器および／または第２の容器は、エッペンドルフチューブ、マイクロウェル、または培養フラスコである。
一実施形態では、本開示のシステムにおける電極は、本明細書で定義されるとおりである。
ＬＡＭＰ増幅
本発明の第２の態様の方法は、複数のＬＡＭＰ増幅を実施するステップを含み、それぞれが、サンプル（例えば、上記の「サンプル」の項で説明したように提供および／または調製される）を含み、それによって標的ポリヌクレオチド配列を増幅させる。各ＬＡＭＰ増幅は、少なくとも４つのプライマーを含み、各セットが、標的配列およびＬＡＭＰ試薬に隣接する。ＬＡＭＰ増幅は、等温条件下で実施される。
本発明の第１の態様の実施形態では、方法はまた、ＬＡＭＰ増幅または複数のＬＡＭＰ増幅を実施するステップを含んでもよく、それぞれが、サンプル（例えば、上記の「サンプル」の項で説明したように提供および／または調製される）を含み、これにより、標的ポリヌクレオチド配列が増幅される。各ＬＡＭＰ増幅は、少なくとも４つのプライマーを含み、各セットが、標的配列およびＬＡＭＰ試薬に隣接する。ＬＡＭＰ増幅は、等温条件下で実施され得る。
ＬＡＭＰ増幅全体は、複数の異なる方法で調製され得る。当業者において公知である任意のＬＡＭＰ増幅を本発明と共に使用してもよい。
ＬＡＭＰ増幅の非限定的な一例をここに記載する：ＦＩＰは、標的ＤＮＡのアンチセンスヌクレオチド鎖上のＦ２ｃ領域にアニールする。ＤＮＡ合成は、ポリメラーゼによって開始され、これにより、ＤＮＡ鎖が置換され、解放される。したがって、ポリメラーゼは、標的ＤＮＡ配列に相補的な鎖を合成する。次に、Ｆ３は、このアンチセンス鎖上のＦ３ｃ領域にアニールし、ポリメラーゼによるＤＮＡ合成の新しいラウンドを開始する。アンチセンス鎖のＦ３媒介置換により、相補的なＦ１ｃ領域およびＦ１領域によって接続されたステムループ構造が形成される。次に、ＢＩＰがＤＮＡ鎖にアニールし、相補的ＤＮＡが、ポリメラーゼによって合成される。したがって、ＤＮＡは、ループから二本鎖線状構造に変換される。ＤＮＡ鎖が分離し、鎖の各端に１つずつ、２つのステムループを有するダンベル様構造が形成される。この構造は、増幅サイクルの開始点として機能する。次に、この構造は、自己プライミングＤＮＡ合成を介して、ステムループに変換される。ＦＩＰは、ステムループ中の一本鎖領域にアニールし、合成を開始する。こうすることにより、相補鎖が解放される。解放された鎖は、それぞれ、Ｂ１ｃ－Ｂ１領域とＦ１－Ｆ１ｃ領域との相補性により、新しいダンベル様構造を形成する。Ｂ１領域の３’末端から開始して、ＤＮＡ合成が開始される。これにより、ＦＩＰ連結相補鎖が解放され、それぞれＦ１－Ｆ１ｃ領域とＢ１ｃ－Ｂ１領域との相補性により、さらに別の二重ステムループ構造が形成される。次に、自己プライミングによるＤＮＡ合成がＢ１領域の３’末端から開始される。このプロセスは、標的配列の交互に反転したリピートからなる増幅構造を産生する。
サンプルは、サンプルを電気化学デバイスに適用する前に、プライマーおよびＬＡＭＰ試薬と混合してもよい。
従来のＰＣＲ増幅とは対照的に、ＬＡＭＰ増幅は、等温条件を使用して実施される。一実施形態では、ＬＡＭＰ増幅は、５９～７５℃、例えば６２～７３℃、例えば６４～７０℃、例えば６６～６８℃の一定温度で実施され得る。
ＬＡＭＰ試薬
本発明の第１および第２の態様の両方の方法は、いくつかのＬＡＭＰ増幅を実施することを包含する。ＬＡＭＰ増幅は、一般に、サンプル、標的配列に隣接する少なくとも４つのプライマー、およびＬＡＭＰ試薬を含む。このＬＡＭＰ試薬は、本明細書の本項に記載のＬＡＭＰ試薬のいずれかであり得る。
ＬＡＭＰ試薬は、少なくともヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸分子であってもよく、好ましくは、ＬＡＭＰ試薬は、少なくともｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む。場合によっては、ＬＡＭＰ試薬は、ｄＵＴＰも含む。ＬＡＭＰ試薬はまた、Ｈ＋イオンおよび／または蛍光色素などのシグナル伝達物質を含む。
核酸ポリメラーゼは、ヌクレオチドの鋳型依存性重合、すなわち複製を触媒することができる任意の酵素であり得る。核酸ポリメラーゼは、ＬＡＭＰ増幅に使用される温度に耐性がある必要があり、伸長温度において、触媒活性を有する必要がある。いくつかの熱安定性核酸ポリメラーゼが当業者に知られている。
本発明の両方の態様のいくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、複製活性に加えて、高い鎖置換活性を有する。
核酸ポリメラーゼは、細菌または古細菌のポリメラーゼであり得る。具体的には、核酸ポリメラーゼは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩであってもよい。核酸ポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を置換するＤＮＡ合成依存性鎖を有するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであってもよい。他のポリメラーゼとしては、これらに限定されないが、Ｔａｑ、Ｔｆｉ、Ｔｚｉ、Ｔｔｈ、Ｐｗｏ、Ｐｆｕ、Ｑ５（登録商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）、Ｏｎｅ Ｔａｑ（登録商標）、Ｖｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）、Ｂｓｔ２．０およびＢｓｔ３．０（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｔｉｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ＧｓｐＳＳＤ ＬＦ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｒｓｐ（ＯｐｔｉＧｅｎｅ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＵＫ）およびｐｈｉ２９ポリメラーゼが挙げられる。
例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから得られるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｃｒｉｍｏｎ ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ（商標）、またはＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑを含み得る。
ＬＡＭＰ試薬は、逆転写酵素（ＲＴ）を含み得る。ＲＴは、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成できる酵素である。したがって、ＲＮＡの測定が可能になる。一実施形態では、ＬＡＭＰ試薬は、逆転写酵素を含む。
さらに、ＬＡＭＰ試薬は、塩、緩衝液、および検出手段を含んでもよい。緩衝液は、ＴＲＩＳなど、あらゆる有用な緩衝液であってよい。塩は、任意の有用な塩、例えば塩化カリウム、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウムまたは硫酸マグネシウムであってもよい。
ＬＡＭＰ試薬は、ＢＳＡ、ウシ皮膚からのゼラチン、ベータラクトグロブリン、カゼイン、ドライミルク、サケ精子ＤＮＡまたは他の一般的なブロッキング剤などの非特異的ブロッキング剤を含み得る。
ＬＡＭＰ試薬はまた、生物防腐剤（例えばＮａＮ３）、ＬＡＭＰエンハンサー（例えばベタイン、トレハロースなど）および阻害剤（例えばＲＮａｓｅ阻害剤）を含んでもよい。他の添加剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ベタイン（一）水和物、トレハロース、７－デアザ－２’－デオキシグアノシン三リン酸（７－デアザ－２’－ｄＧＴＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ホルムアミド（メタンアミド）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、他のテトラアルキルアンモニウム誘導体［例えば、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ－Ｃｌ）］；塩化テトラプロピルアンモニウム（ＴＰｒＡ－Ｃｌ）または非イオン性界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０（ＮＰ－４０）またはＰＲＥＸＣＥＬ－Ｑを挙げることができる。
さらに、ＬＡＭＰ試薬はまた、ＬＡＭＰ増幅産物（複数可）を検出するための１つ以上の追加の手段を含んでもよい。手段は、任意の検出可能な手段であり得、それらは、個々の化合物として添加され得るか、またはプライマーのうちの１つと会合するか、または共有結合により連結することさえあり得る。検出可能な手段としては、これらに限定されないが、色素、放射性化合物、生物発光および蛍光化合物が挙げられる。好ましい実施形態では、検出のための手段は、１つ以上のプローブである。
一実施形態では、ＬＡＭＰ増幅は、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＬＡＭＰ Ｋｉｔ（ＤＮＡ＆ＲＮＡ）を使用して実施される。このキットには、Ｂｓｔ ２．０ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレオチドミックス、可視ｐＨ指示薬、および低緩衝液が含まれる。キットは、さらに蛍光色素を含む。
別の例では、ＬＡＭＰ増幅は、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＬＡＭＰ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＤＮＡ＆ＲＮＡ）を使用して実施される。このキットには、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレオチドミックス、および緩衝液が含まれる。キットは、さらに蛍光色素を含む。
標的配列に隣接するプライマー
本発明の第２の態様の方法は、標的配列に隣接する少なくとも４つのプライマーの使用を含む。
本発明の第１の態様の実施形態では、この方法は、標的配列に隣接する少なくとも４つのプライマーの使用も含む。
４つのプライマーは、
－フォワードインナープライマー（ＦＩＰとも呼ばれる）、
－バックワードインナープライマー（ＢＩＰとも呼ばれる）、
－フォワードアウタープライマー（Ｆ３とも呼ばれる）、
－バックワードアウタープライマー（Ｂ３とも呼ばれる）を含み得る。
一実施形態では、ＦＩＰは、配列番号３の配列を有する。
一実施形態では、ＢＩＰは、配列番号４の配列を有する。
一実施形態では、Ｆ３は、配列番号５の配列を有する。
一実施形態では、Ｂ３は、配列番号６の配列を有する。
４つのプライマーは、標的ポリペプチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖の異なる部分にアニールする。本明細書に記載の項目「定義」におけるプライマーの定義を参照されたい。
プライマーは、標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件下で、ＬＡＭＰ試薬に添加されたときに、標的ポリヌクレオチドを増幅することができる。
好ましい実施形態では、少なくとも４つのプライマーは、ＢＩＰ、ＦＩＰ、Ｆ３、およびＢ３からなる。
一実施形態では、ＬＡＭＰ増幅は、ループプライマーの追加の対を用いて実施される。一実施形態では、ＬＡＭＰ増幅は、ＦＬプライマーおよびＢＬプライマーを用いて実施される。
一実施形態では、ＦＬプライマーは、配列番号７の配列を有する。
一実施形態では、ＢＬプライマーは、配列番号８の配列を有する。
本発明の両方の態様の一実施形態では、ＬＡＭＰ増幅は、少なくとも５つのプライマー、例えば、少なくとも６つのプライマー、例えば、少なくとも７つのプライマーを用いて実施される。
一実施形態では、ＬＡＭＰ増幅は、ＢＩＰ、ＦＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬプライマーを用いて行われる。
ＢＩＰ、ＦＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬプライマーの長さは、標的ポリヌクレオチドの配列に依存し得る。例えば、プライマーの長さを調整して、５９～７５℃の範囲などの特定の温度で、望ましい活性を達成することができる。したがって、プライマーの長さは、個々に、１０～１００ヌクレオチドの範囲であり、例えば、長さ１０～５０ヌクレオチドの範囲、例えば、１５～２０ヌクレオチドの範囲、例えば、１５～２５ヌクレオチドの範囲、例えば、１５～３０ヌクレオチドの範囲、例えば、１５～４０ヌクレオチドの範囲、例えば、１５～４５ヌクレオチドの範囲、例えば、１５～５０ヌクレオチドの範囲であり得る。プライマーのＴｍは、典型的には、５９～７５℃の範囲に調整される。
ＬＡＭＰ増幅の水相内のプライマー濃度は、例えば、０．０５～４．０μＭの範囲、例えば、０．１～３．０μＭの範囲、０．２～２．０μＭの範囲などであり得る。本明細書の非限定的な一例は、１．６μＭ ＦＩＰ、１．６μＭ ＢＩＰ、０．２μＭ Ｆ３、０．２μＭ Ｂ３、０．４μＭ ＦＬ、０．４μＭ ＢＬである。
一般に、プライマーは、オリゴヌクレオチドを含むか、オリゴヌクレオチドからさえなる。しかし、場合によっては、プライマーは、ヌクレオチド類似体を含んでもよい。多数のヌクレオチド類似体が当業者に知られており、糖が修飾されている誘導体、例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および２’，３’－ジデオキシヌクレオシド誘導体、他の糖骨格をベースにした核酸類似体、例えば、トレオース、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＬＮＡ誘導体、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ビシクロ糖、またはヘキソース、グリセロールおよびグリコール糖、非イオン性骨格をベースにした核酸類似体、またはデンドリマー、くし型構造、およびナノ構造などの非線形トポロジーの核酸およびその類似体が挙げられる。
プライマーはまた、様々なタグ（例えば、蛍光タグ、機能化タグまたは結合タグ）に連結されてもよく、それらは任意によりそれらの末端、糖、または核酸塩基に結合され得る。
プライマーは、これらに限定されないが、適切な配列のクローニング、および当技術分野で周知の方法を使用した直接化学合成など、様々な方法によって調製することができる［Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎ ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９（１９７９）］。プライマーはまた、商用供給源から入手され得る。
一実施形態では、プライマーは、標的ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるように設計することができる。
溶液の電気化学特性の測定
本発明の第２の態様の方法は、電気化学セルの電流および／または電位の変化を測定するステップを含む。
上記で概説したように、一実施形態では、本発明の第１の態様の方法は、電気化学セルの電流および／または電位および／またはインピーダンスの変化など、電気化学セルの電気化学応答を測定するステップを含む。
変化は、好ましくは、核酸増幅プロセスからのシグナル伝達物質、例えばＨ＋、例えばＬＡＭＰ増幅産物または副産物（例えばＨ＋）の濃度の変化、またはＬＡＭＰ増幅の結果としての物理量の変化の結果である。特に、Ｈ＋の変化は、電気化学セルの電気化学応答の変化として測定される、電気化学セルに溶解するキノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬の酸化状態の変化をもたらす。電気化学デバイスの電気化学セルの電気化学応答（例えば、電流および／または電位および／またはインピーダンス）の変化の測定は、好ましくは、電気化学システムを形成するために電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルを測定セットアップと接触させた後に行われる。
電気化学システムは、典型的には、存在する場合、フィルム電極、溶液、および別個の電流経路、典型的にはポテンショスタットなど、電気化学デバイス／２電極または３電極電気化学セルを含む。したがって、電気化学システムは、空間的に分離され、１つ以上のイオン伝導媒体または電解質全体に分散されると同時に、別個の電流経路（好ましくは、ポテンショスタットを含む、またはポテンショスタットからなる）を介して、互いに電気的に接触している作用電極、対電極、および参照電極などの複数のフィルム電極を含む。
電気化学システム内の電極は、システム内での電荷移動の全体的なバランスを生み出す培地を通るイオンの移動と同時に、電流経路を動く電流を生成する電子の移動により、酸化および還元反応を受ける。
ポテンショスタットは、典型的には、電位（または電流）を調整し、その後の電流（または電位）への影響を測定することによって、電気化学システム内の電極を制御するように設計された器具である。このタスクは、典型的には、様々な内部回路、演算増幅器、およびフィードバックループによって実行される。外部ケーブルは、典型的には、作用電極、対電極、および参照電極を含む各電極に物理的に接続するために一般的に使用される。
測定は、例えば、開回路電位、電位差測定、インピーダンス測定、電量測定、電圧測定、および／または電流測定などの任意の電気分析法に従って実行され得る。典型的には、溶液の測定には、１～９０分、例えば、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、６１分、６２分、６３分、６４分、６５分、６６分、６７分、６８分、６９分、７０分、７１分、７２分、７３分、７４分、７５分、７６分、７７分、７８分、７９分、８０分、８１分、８２分、８３分、８４分、８５分、８６分、８７分、８８分、８９分または９０分要し得る。
一実施形態では、溶液の測定は、１～４５分の範囲、１～３０分など、１～１５分など、５分～１０分などを要し得る。
ボルタンメトリーは、印加電位に応じた電流の研究である。これにより、ボルタンモグラムＩ＝ｆ（Ｅ）曲線が生成される。典型的には、このような測定では、電位を段階的または連続的に任意に変化させ、実際の電流値を、従属変数として測定する。反対は、アンペロメトリーである。曲線の形状は、電位変化率（駆動力の性質）、および溶液が撹拌されているか静止しているか（物質移動）によって異なる。
定量化のために、分析では、ボルタンメトリーの時間成分のために、熱力学に加えて速度論を考慮する必要がある。ネルンスト式などの理想化された理論上の電気化学的熱力学的関係は、時間成分なくモデル化される。これらのモデルのみではボルタンメトリーの動的態様を説明するには不十分であるが、ターフェル方程式およびバトラー－フォルマー方程式などのモデルは、理論を観察結果に関連付ける修正ボルタンメトリー関係の基礎となる。
本発明の第１の態様の特定の実施形態
本発明の第１の態様の特定の実施形態は、以下の付番の段落に提供される。
Ｘ１．溶液のｐＨを測定する方法であって、
－溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物を含む溶液を提供するステップと；
－溶液を２電極電気化学セルまたは３電極電気化学セルに適用するステップと；
－電気化学セルの電気化学応答を測定するステップと；
－電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化するステップと、を含む、方法。
Ｘ２．溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物が、カテコール、カテコール誘導体および／またはカテコール基を含む化合物である、段落Ｘ１に記載の方法。
Ｘ３．溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物が、キノン、キノン誘導体、ｐＨ指示薬、またはそれらの組み合わせである、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ４．化合物が、キノンまたは１，２－ベンゾキノン、１、４－ベンゾキノン、１，４－ナフトキノン、９，１０－アントラキノン、およびそれらの誘導体からなるリストから選択されるキノン誘導体およびそれらの組み合わせである、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ５．溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物が、マラカイトグリーンシュウ酸塩、ブリリアントグリーン、エオシンイエロー、エリスロシンＢ、メチルグリーン、メチルバイオレット、ピクリン酸、クレゾールレッド、クリスタルバイオレット、ｍ－クレゾールパープル、チモールブルー、ｐ－キシレノールブルー、エオシン（ブルー）、キナルジンレッド、２，４－ジニトロフェノール、４－（ジメチルアミノ）アゾベンゾール、ブロモクロロフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、コンゴーレッド、メチルオレンジ、ブロモクレゾールグリーン、２，５－ジニトロフェノール、アリザリンスルホン酸、メチルレッド、クロロフェノールレッド、リトマス、ブロモクレゾールパープル、ブロモフェノールレッド、４－ニトロフェノール、ブロモキシレノールブルー、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、３－ニトロフェノール、ニュートラルレッド、クレゾールレッド、１－ナフトールフタレイン、ｍ－クレゾールパープル、チモールブルー、ｐ－キシレノールブルー、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、アルカリブルー、アリザリンイエローＧＧ、インジゴカルミン、イプシロンブルー、チタンイエロー、およびこれらの組み合わせからなるリストから選択されるｐＨ指示薬である、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ６．溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物が、溶液中に溶解される、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ７．測定される電気化学セルの電気化学応答が、電気化学セルの電位、電気化学セルの電流、電気化学セルのインピーダンス、またはこれらの組み合わせである、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ８．電気化学セルの電位が、サイクリック矩形波ボルタンメトリー、矩形波ボルタンメトリー、線形電位掃引ボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリーまたは開回路電位差測定法によって測定される、段落Ｘ６に記載の方法。
Ｘ９．溶液内の溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物の濃度が、約１μＭ～約１０００μＭ、例えば、約１μＭ～約５００μＭ、例えば、約５μＭ～約２５０μＭ、特に約５０μＭ～約２００μＭである、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ１０．電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化するステップが、回帰アルゴリズムの適用を介して実行される、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ１１．溶液が緩衝液を含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ１２．溶液がサンプルを含み、任意によりサンプルが、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、または原生動物の細胞を含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ１３．溶液が、サンプルをさらに含み、好ましくはサンプルが、鼻サンプル、喉サンプル、肛門サンプル、膣サンプル、耳排出サンプル、皮膚表面スワブサンプル、尿サンプル、全血サンプル、血清サンプル、血漿サンプルまたはリンパ排液サンプルからなるリストから選択される、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ１４．溶液が、プライマーおよび核酸増幅試薬をさらに含み、好ましくは、核酸増幅試薬が、ＬＡＭＰ試薬である、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ１５．核酸増幅試薬が、シグナル伝達物質を含むか、またはシグナル伝達物質を放出できるか、またはシグナル伝達物質およびシグナル伝達物質を放出できる物質の両方を含む、段落Ｘ１３に記載の方法。
Ｘ１６．シグナル伝達物質がＨ＋である、段落Ｘ１４に記載の方法。
Ｘ１７．核酸増幅ステップ、好ましくは複数の核酸増幅ステップを実施するステップを含む、段落Ｘ１３～Ｘ１５のいずれか一つに記載の方法。
Ｘ１８．核酸増幅ステップ（複数可）が、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）ステップである、段落Ｘ１６に記載の方法。
Ｘ１９．溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するためのものである、段落Ｘ１３～Ｘ１７のいずれか一つに記載の方法。
Ｘ２０．電気化学セルの電気化学応答を測定するステップが、シグナル伝達物質の濃度変化により、電気化学セルの電流および／または電位の変化を測定することを含む、段落Ｘ１８に記載の方法。
Ｘ２１．ＬＡＭＰ試薬が、逆転写酵素を含む、段落Ｘ１３～Ｘ１９のいずれか一つに記載の方法。
Ｘ２２．プライマーが、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマーおよびバックワードアウタープライマーを含む、段落Ｘ１３～Ｘ２０のいずれか一つに記載の方法。
Ｘ２３．ＬＡＭＰ増幅が、フォワードループプライマーおよび／またはバックワードループプライマーなどのループプライマーの追加の対を用いて実施される、段落Ｘ２１に記載の方法。
Ｘ２４．３電極電気化学セルが、作用電極、参照電極、および対電極を含む、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ２５．作用電極は、溶液の選択されたイオンが作用電極に接触するのを排除するように配置されたイオン選択膜を含む、段落Ｘ２３に記載の方法。
Ｘ２６．作用電極の表面が、ＯＨ－およびＨ３Ｏ＋イオンの結合を可能にするために化学的に修飾されているか、または溶液のｐＨに対して反応性である、段落Ｘ２３または段落Ｘ２４に記載の方法。
Ｘ２７．参照電極および対電極の材料が、Ａｇ／ＡｇＣｌである、段落Ｘ２３～Ｘ２５のいずれか一つに記載の方法。
Ｘ２８．作用電極の材料が炭素である、段落Ｘ２３～Ｘ２６のいずれか一つに記載の方法。
Ｘ２９．電極が、金、銀、炭素、白金、二酸化ルテニウム、またはそれらの組み合わせを含む、またはそれらからなる、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ３０．電極の材料が同一であるかまたは異なる、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ３１．２電極または３電極電気化学セルの電極が、フィルム電極、好ましくはスクリーン印刷電極である、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ３２．２電極または３電極電気化学セルの電極が、ワイヤ電極である、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ３３．２電極または３電極電気化学セルが、電極が配置されている基板を含み、基板の材料が、アルミナ、セラミック、ガラス、または不活性プラスチックなどの化学的不活性材料である、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ３４．２電極または３電極電気化学セルが、電気化学セルと流体接続して、溶液を受け取るためのマイクロ流体入口を備える、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ３５．溶液の適用後に、溶液の蒸発を防ぐために蒸気バリアが追加される、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ３６．蒸気バリアが、物理的蓋、加熱蓋、鉱油、および／またはパラフィンワックスを用いて、３電極電気化学セルまたはマイクロウェルの入口を流体により密閉することによって形成される、段落Ｘ３３に記載の方法。
Ｘ３７．親水性領域が、２電極または３電極電気化学セルのキャピラリー充填などのために、マイクロ流体入口と２電極または３電極電気化学セルとを接続する、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ３８．ポテンショスタットまたは同様の回路を使用することによって、測定が実施される、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ３９．測定が１分～９０分間実施される、前述の段落のいずれかに記載の方法。
Ｘ４０．ヌクレオチド増幅が、５９～７５℃の範囲の一定温度、例えば、６２～７３℃、例えば、６４～７０℃、例えば、６６～６８℃で行われる、前述の段落のいずれか一つに記載の方法。
Ｙ．溶液のｐＨを測定するための２電極または３電極電気化学セルの使用であって、
－溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物を含む溶液を提供することと；
－溶液を２電極電気化学セルまたは３電極電気化学セルに適用することと；
－電気化学セルの電気化学応答を測定することと；
－電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化することと、を含む、使用。
Ｙ１．溶液のｐＨを測定するための３電極電気化学セルの使用であって、
－溶液のｐＨに応じて、その酸化状態および／または構造的コンフォメーションの変化を受けることができる化合物を含む溶液を提供することと；
－溶液を３電極電気化学セルに適用することと；
－電気化学セルの電気化学応答を測定することと；
－電気化学セルの電気化学応答に応じて、溶液のｐＨを定量化することと、を含む、使用。
Ｙ２．溶液のｐＨを測定するためのシステムであって、
ｂ．ポテンショスタットを含む器具；と
ｖ．３電極電気化学セルを含む第１の容器、およびキノン、キノン誘導体、および／もしくはｐＨ指示薬を含む第２容器、または
ｖｉ．３電極電気化学セル、およびキノン、キノン誘導体、および／もしくはｐＨ指示薬を含む第１の容器と、を備え、
ポテンショスタットが、電気化学セルの電気化学応答を測定するように構成されている、システム。
Ｙ３．キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬が、第１または第２の容器内の水溶液に溶解される、請求項３９に記載のシステム。
Ｙ４．ポテンショスタットが、電気化学セルの電気化学応答を測定するように構成されている、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
Ｙ５．ポテンショスタットが、電気化学応答を測定するように構成され、電気化学応答は、第１の容器中でのキノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬の酸化状態を表す、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
Ｙ６．システムが、第１および／または第２の容器を５９℃～７５℃の範囲内の温度などまで加熱するように構成された加熱ユニットをさらに備える、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
Ｙ７．第１の容器が、標的ポリヌクレオチド配列に隣接するように構成された少なくとも４つのプライマーおよびＬＡＭＰ試薬などの核酸増幅反応システムを収容する、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
Ｙ８．第１の容器が、溶液および／またはサンプルを受け取るためのマイクロ流体入口を備える、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
Ｙ９．マイクロ流体入口が、キャピラリー作用によってサンプルを輸送するように構成された多孔質／繊維構造または親水性チャネルなどの親水性域によって電気化学セルに接続される、請求項４４に記載のシステム。
Ｙ１０．第１の容器および／または第２の容器が、エッペンドルフチューブ、マイクロウェル、または培養フラスコである、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
Ｙ１１．電極が、本明細書で定義されたとおりである、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
ＬＡＭＰを使用して、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを定量化する特定の方法
本発明の第２の態様では、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを定量する方法が提供され、
ａ．サンプルを提供するステップと；
ｂ．複数のフィルム電極を有する電気化学セルを含む電気化学デバイスにサンプルを適用するステップと；
ｃ．標的ポリヌクレオチドがサンプル中に存在する場合、複数の等温ＬＡＭＰ増幅を実施するステップであって、それぞれが、サンプル、それぞれが標的ポリヌクレオチドに隣接する少なくとも４つのプライマー、およびシグナル伝達物質を含むおよび／またはシグナル伝達物質を放出することができるＬＡＭＰ試薬を含み、各ＬＡＭＰ増幅により、シグナル伝達物質を放出するかまたは消費する、ステップと；
ｄ．ステップｅと同時に、シグナル伝達物質の濃度変化により、電気化学セルの電流および／または電位の変化を測定するステップと；
ｅ．電流および／または電位の変化率によって増幅率を導出し、それによってサンプル中の標的ポリヌクレオチドを定量化するステップと；を含む、方法。
疑義を避けるために、本発明の第２の態様の任意の態様は、上記の項のいずれかに詳述されているように、本発明の第１の態様の任意の態様と組み合わせることができる。
本発明の第２の態様の実施形態では、サンプルを電気化学デバイスに適用する前に、サンプルをプライマーおよびＬＡＭＰ試薬と混合する。
本発明の第２の態様の別の実施形態では、電気化学デバイスは、プライマーおよびＬＡＭＰ試薬を含む。
本発明の第２の態様のさらなる実施形態では、複数のフィルム電極は、作用電極、参照電極、および対電極を含む。
本発明の第２の態様の実施形態では、作用電極は、溶液の選択されたイオンが作用電極に接触するのを排除するように配置されたイオン選択膜を含む。
本発明の第２の態様の別の実施形態では、作用電極の表面は、化学的に修飾されて、ＯＨ－およびＨ３Ｏ＋イオンの結合を可能にするか、または溶液のｐＨに対して反応性である。
本発明の第２の態様の実施形態では、電極のいずれかの表面は、酸化ルテニウム、グラフェンプレートレットを含むか、またはそれらによって化学的に修飾されるか、または電極が露出したチオール／ヒドロキシル基を有するように化学的に修飾される。
本発明の第２の態様の別の実施形態では、参照電極および対電極の材料は、約６０／４０ｗ／ｗ比のＡｇ／ＡｇＣｌである。
本発明の第２の態様のさらなる実施形態では、作用電極の材料は、炭素である。
本発明の第２の態様の一実施形態では、電極は、金、銀、炭素、白金、二酸化ルテニウム、またはそれらの組み合わせを含むか、またはそれらからなる。
本発明の第２の態様の別の実施形態では、電極の材料は、同一であるかまたは異なる。
本発明の第２の態様のさらなる実施形態では、フィルム電極は、スクリーン印刷電極である。
本発明の第２の態様のさらなる実施形態では、フィルム電極は、ワイヤ電極である。
本発明の第２の態様の実施形態では、電気化学デバイスは、電極が配置される基板を含み、基板の材料は、アルミナ、セラミック、ガラス、または不活性プラスチックなどの化学的不活性材料である。
本発明の第２の態様の別の実施形態では、電気化学デバイスは、電気化学セルと流体接続している、サンプルを受け取るためのマイクロ流体入口を備える。
本発明の第２の態様のさらなる実施形態では、溶液の適用後、溶液の蒸発を防ぐために蒸気バリアが追加される。
本発明の第２の態様の実施形態では、蒸気バリアは、物理的蓋、加熱蓋、鉱油、および／またはパラフィンワックスを用いて、電気化学デバイスまたはマイクロウェルの入口を流体により密閉することによって形成される。
本発明の第２の態様の別の実施形態では、電気化学デバイスのキャピラリー充填などのために、親水性領域がマイクロ流体入口および電気化学セルを接続する。
本発明の第２の態様のさらなる実施形態では、ポテンショスタットまたは同様の回路を使用することによって、測定が実施される。
本発明の第２の態様の実施形態では、測定値は、電位差測定、インピーダンス測定、電量測定、ボルタンメトリー、および／または電流測定を含むか、またはそれらからなる。
本発明の第２の態様の別の実施形態では、溶液は１分～９０分間測定される。
本発明の第２の態様のさらなる実施形態では、ＬＡＭＰ試薬は、逆転写酵素を含む。
本発明の第２の態様の実施形態では、ヌクレオチド増幅は、５９～７５℃の範囲の一定温度で、例えば、６２～７３℃、例えば、６４～７０℃、例えば、６６～６８℃で実施される。
本発明の第２の態様の別の実施形態では、プライマーは、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマーおよびバックワードアウタープライマーを含む。
本発明の第２の態様のさらなる実施形態では、ＬＡＭＰ増幅は、フォワードループプライマーおよび／またはバックワードループプライマーなどのループプライマーの追加の対を用いて実施される。
別の実施形態では、本発明は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法に関する。この方法は、ポリヌクレオチド増幅率を定量化および／または測定することにより、標的ポリヌクレオチド陽性サンプルと標的ポリヌクレオチド陰性サンプルとを区別することを含む。
配列
配列番号１
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ１断片
CCCTATGTGTTCATCAAACGTTCGGATGCTCGAACTGCACCTCATGGTCATGTTATGGTTGAGCTGGTAGCAGAACTCGAAGGCATTCAGTACGGTCGTAGTGGTGAGACACTTGGTGTCCTTGTCCCTCATGTGGGCGAAATACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAGAACGGTAATAAAGGAGCTGGTGGCCATAGTTACGGCGCCGATCTAAAGTCATTTGACTTAGGCGACGAGCTTGGCACTGATCCTTATGAAGA
配列番号２
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子Ｎ断片
ATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTAC
配列番号３
フォワードインナープライマー（ＦＩＰ）
AGGTGAGGGTTTTCTACATCACTATATTGGAACAAGCAAATTCTATGG
配列番号４
バックワードインナープライマー（ＢＩＰ）
ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGTGCGAGCAAGAACAAGTG
配列番号５
フォワードアウタープライマー（Ｆ３）
CCACTAGAGGAGCTACTGTA
配列番号６
バックワードアウタープライマー（Ｂ３）
TGACAAGCTACAACACGT
配列番号７
フォワードループプライマー（ＦＬ）
CAGTTTTTAACATGTTGTGCCAACC
配列番号８
バックワードループプライマー（ＢＬ）
TAGAGCCATGCCTAACATGCT
実施例
実施例１
ＬＡＭＰ増幅による鼻スワブサンプルの定量的電気分析測定
材料および方法
スクリーン印刷電極
ｉ．作用電極、参照電極、および補助電極として機能するスクリーン印刷３電極を含む、ｐＨ感受性スクリーン印刷３電極システムを使用する。このシステムは、化学的に不活性なアルミナに印刷されている。
１．参照電極の材料は、Ａｇ／ＡｇＣｌ（６０／４０比）で、真の参照電極測定のために任意の固定濃度の塩化物イオンを提供する追加の層を有する。
２．作用電極の材料は、炭素であり、酸化コバルトと酸化イリジウムとを組み合わせた固体膜のｐＨ感受性層を備えている。
３．対電極の材料は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極（６０／４０比）で、真の参照電極測定のために任意の固定濃度の塩化物イオンを提供する追加の層を有する。
ｉｉ．電極の上には、マイクロウェルの形態であるマイクロ流体サンプルポートが重ねられている。
ｉｉｉ．物理的蓋の形態で、マイクロウェルの蒸発バリアが使用される。
プライマー
１６μＭ ＦＩＰ、１６μＭ ＢＩＰ、２μＭ Ｆ３、２μＭ Ｂ３、４μＭループＦ、４μＭループＢおよびヌクレアーゼフリー水（ＴＥではない）を含む１０ｘプライマーミックス。反応開始前の増幅反応ミックスの最終濃度は、１．６μＭ ＦＩＰ、１．６μＭ ＢＩＰ、０．２μＭ Ｆ３、０．２μＭ Ｂ３、０．４μＭループＦ、０．４μＭループＢである。
サンプル
ｉ．ウイルス輸送培地に接種させた鼻スワブサンプルは、８０℃で１分間熱処理後に使用される。使用されるウイルス輸送培地の例は、滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）１ｘ、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含み、フェノールレッド、２％ｖ／ｖウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン硫酸塩およびアムホテリシンＢ０．５μｇ／ｍＬを含む場合と、含まない場合とである。
増幅反応
ｉ．２μＬサンプルを、
ａ．目的のゲノム領域を標的にする２．５μＬ ２５Ｘ ＬＡＭＰ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（最終濃度１．６μＭ ＦＩＰ、１．６μＭ ＢＩＰ、０．２μＭ Ｆ３、０．２μＭ Ｂ３、０．４μＭ ループ Ｆ、０．４μＭループＢ）、
ｂ．１２．５μＬ ＷａｒｍＳｔａｒｔ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＬＡＭＰ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，）および
ｃ．ヌクレアーゼフリー水と混合して、最終容量２５μＬにする。
増幅条件およびアッセイデザイン
１．すでにポテンショスタットに接続されている、６５℃で予熱したｐＨセンサ上で混合した直後に、増幅反応混合物（サンプルを含む）を加える。
２．蒸気バリアは、蒸発を回避するために配置される。
３．電位差測定は、リアルタイムで実行し、電圧は、３０分間連続して測定する。
解釈
ｉ．核酸鋳型の存在は、３０分間のｐＨの低下によって示される（ｐＨセンシング）。変化の時間差は、核酸鋳型の量と相関する。
実施例２
スクリーン印刷電極を使用した、低トリス緩衝液中のループ媒介等温増幅の連続電気化学的リアルタイム定量監視。
材料および方法
スクリーン印刷電極
ｉ．作用電極、参照電極、および補助電極として機能する３つのスクリーン印刷電極で構成され、アルミナ、セラミック、ガラス、または不活性プラスチック基板などの化学的不活性基板上に印刷されているｐＨ感受性スクリーン印刷３電極システム。
ｉｉ．電極は、金、銀、炭素、白金、二酸化ルテニウムなどの同じ材料または異なる材料で作製され得る。
ｉｉｉ．作用電極は、イオン選択膜の層を組み込むことができ、および／または電極表面は、ＯＨ－およびＨ３Ｏ＋イオンの結合を可能にするように改変され得るか、または直接接触を介して溶液にさらされたときに溶液のｐＨに感受性が高い。そのような修飾は、酸化ルテニウム、グラフェンプレートレット、露出したチオール基、露出したヒドロキシル基などを含み得る。
ｉｖ．設定：
１．参照電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極（６０／４０比）で構成され、真の参照電極測定のために任意の固定濃度の塩化物イオンを提供する（任意による）追加の層を有する。
２．作用電極は、炭素で構成されている。
３．対電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極（６０／４０比）で構成され、真の参照電極測定のために任意の固定濃度の塩化物イオンを提供する（任意による）追加の層を有する。
ｖ．電極の上には、マイクロウェル（好ましい）または他のサンプルの導入／封じ込め方法の形態のマイクロ流体サンプルポートが重ねられている。
ｖｉ．マイクロウェル用の蒸気バリアを使用してもよい。代替手段には、物理的蓋、加熱蓋、ミネラルオイル蒸気バリア、パラフィンワックス蒸気バリアが含まれ得る。
プライマー
１６μＭ ＦＩＰ、１６μＭ ＢＩＰ、２μＭ Ｆ３、２μＭ Ｂ３、４μＭループＦ、４μＭループＢおよびヌクレアーゼフリー水（ＴＥではない）を含む１０Ｘプライマーミックス。反応開始前の増幅反応ミックスの最終濃度は、１．６μＭ ＦＩＰ、１．６μＭ ＢＩＰ、０．２μＭ Ｆ３、０．２μＭ Ｂ３、０．４μＭループＦ、０．４μＭループＢである。
サンプル
ｉｉ．ウイルス輸送培地に接種させた鼻スワブサンプルまたは喉スワブサンプルは、直接、または７０～９０℃で１分間熱処理後に使用できる。
ｉｉｉ．ウイルス輸送培地に接種させた肛門サンプルまたは膣サンプルまたは耳排出サンプルまたは皮膚表面スワブサンプルは、直接、または７０～９０℃で１分間熱処理後に使用できる。
ｉｖ．尿サンプルは、直接使用され得るか、または７０～９０℃で１分間熱処理後に使用され得る。
ｖ．ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウムなどの抗凝固剤と混合した全血サンプルに、機械的溶解、熱溶解、音響キャビテーション、浸透圧ショック、酵素的溶解、または化学的溶解による任意の追加溶解を行う。
ｖｉ．リンパ排液サンプルまたは血清サンプルは、直接、または７０～９０℃で１分間加熱処理後に、使用され得る。
ｖｉｉ．生物学的サンプルまたは粗核酸抽出物からの精製された核酸含有量
増幅反応
ｉ．典型的な増幅反応には、プライマー（例えば、４、５、または６つのプライマー）、サンプル（プライマーが結合する鋳型を含む場合と含まない場合がある）、ヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣに対応する）、緩衝剤（１ｍＭ～５ｍＭ Ｔｒｉｓまたは１.５ｍＭ～５ｍＭ Ｔｒｉｓまたはそれらの同等の緩衝剤）、１つ以上の塩（例えば、（ＮＨ）２ＳＯ４、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２など）、細菌または古細菌ポリメラーゼ（熱安定性であってもなくてもよく、鎖置換活性を有しても有してなくてもよい）および任意の必要な補因子、および任意の界面活性剤などを含む。ＰＣＲで使用できる熱安定性ポリメラーゼまたは等温増幅反応で使用するためのポリメラーゼの例としては、これらに限定されないが、Ｔａｑ、Ｔｆｉ、Ｔｚｉ、Ｔｔｈ、Ｐｗｏ、Ｐｆｕ、Ｑ５（登録商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）、Ｏｎｅ Ｔａｑ（登録商標）、Ｖｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）、Ｂｓｔ２．０およびＢｓｔ３．０（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴｉｎＤＮＡポリメラーゼ、ＧｓｐＳＳＤＬＦＤＮＡポリメラーゼ、Ｒｓｐ（ＯｐｔｉＧｅｎｅ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＵＫ）およびｐｈｉ２９ポリメラーゼなどが挙げられる。
ｉｉ．好ましい反応混合物：
２μＬサンプル（ＤＮＡ／ＲＮＡを含むか、鋳型非含有対照；範囲：１～５μＬ；輸送培地が使用されている場合、２μＬを超えるサンプルは反応を阻害する；２μＬ未満の場合は、鋳型が少なすぎる可能性があることを意味する）は、
ａ．目的のゲノム領域を標的にする２．５μＬの２５Ｘ ＬＡＭＰ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（最終濃度１．６μＭ ＦＩＰ、１．６μＭ ＢＩＰ、０．２μＭ Ｆ３、０．２μＭ Ｂ３、０．４μＭループＦ、０．４μＭループＢ）、
ｂ．１２．５μＬ ＷａｒｍＳｔａｒｔ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＬＡＭＰ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）（逆転写酵素も含む）、および
ｃ．ヌクレアーゼフリー水と混合して、最終容量２５μＬにする。
ｉｉｉ．代替反応混合物：
２μＬのサンプル（ＤＮＡ／ＲＮＡを含むか、または鋳型非含有対照を含む；最大５μＬまで可能）を
ａ．目的のゲノム領域を標的にする２．５μＬの２５Ｘ ＬＡＭＰ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ（最終濃度１．６μＭ ＦＩＰ、１．６μＭ ＢＩＰ、０．２μＭ Ｆ３、０．２μＭ Ｂ３、０．４μＭループＦ、０．４μＭループＢ）、
ｂ．１２．５μＬ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，）および
ｃ．ヌクレアーゼフリー水と混合して、最終容量２５μＬにする。
増幅条件およびアッセイデザイン
ｉ．好ましいもの
１．すでにポテンショスタットまたは同等の回路に接続されている、５９～７５℃で予熱したｐＨセンサ上で混合した直後に、増幅反応混合物（サンプルを含む）を加える。
２．蒸気バリアは、蒸発を回避するために配置される。
３．電位差測定は、リアルタイムで実行し、電圧は、１～９０分間連続して測定する。
４．アッセイは、複数のサンプルに対して並列化させ得る。
ｉｉ．代替
１．サンプルと残りの成分との混合は、ピペットまたはマイクロ流体混合を使用して、チップ上で直接発生し得る。
２．増幅反応混合物（サンプルを含む）をＰＣＲまたは微量遠心チューブに加え、５９～７５℃で加熱する。サンプルは、１～９０分後、または１～５分間隔で２～５回分取し、ｐＨは、ポテンショスタットまたは同等の回路に既に接続されているｐＨセンサで、室温で測定される。
３．ｐＨの代わりに、インピーダンス測定、電量測定、電流測定が、追加の酸化還元プローブまたはＤＮＡインターカレート色素を使用することなく実施され得る。
解釈
ｉ．核酸鋳型の存在は、以下によって、１～９０分の間に示される；
ｉ．ｐＨの低下（ｐＨセンシング）
ｉｉ．導電率の低下（アンペロメトリー）
ｉｉｉ．インピーダンスの増加（インピーダンス測定）
ｉｖ．正味電荷の変化（クーロメトリー）
ｉｉ．さらに、この変化の時間差は、核酸鋳型の量と相関する。
実施例３
フェノールレッドを含む溶液のｐＨを監視するための３電極システム法
使用されるパラメータ
この例では、ＰＢＳ、ＮａＯＨまたはＨＣｌ（ｐＨ調整用）、０．１Ｍ ＫＣｌ（支持電解質として）、および１００μＭフェノールレッド（ｐＨプローブとして）を含む５０μＬの水溶液を分析した。
水溶液を３電極電気化学セルに導入し、次のパラメータを使用して、電気化学セルで矩形波ボルタンメトリーを実行した：
ａ．０．５Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌでのピーク。走査範囲０～０．６Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ；周波数：１０Ｈｚ；電位ステップ：５ｍＶ；振幅：１０ｍＶ。
ｂ．－０．４～－０．５５Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌでのピーク。走査範囲０～０．７Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ；周波数：１０Ｈｚ；電位ステップ：５ｍＶ；振幅：１０ｍＶ。
Ｎ２Ｏ３－Ａｕ使い捨て型電極をＡｎａｐｏｔポテンショスタットと共に使用した。
ｐＨ変化は、ピーク高さ（ｉ）および電位（Ｅ）によって定義されるピーク位置に応じて分析した：
Figure 2023520419000004
分析結果
フェノールレッドは、トリキノン構造の化学物質であり、－１Ｖ～１Ｖの電位窓で３電子移動を受ける（ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ、フェノールレッドの酸化還元ピークの概要については図３を参照）。ピーク電流およびピーク電位は、いずれもｐＨに依存する。ｐＨ６～ｐＨ８の限られた可視光スペクトルにもかかわらず、フェノールレッドの酸化還元電位および対応するピーク電流により、完全なｐＨ範囲の識別が可能である。
フェノールレッドは、スルホンフタレイン基の最も単純な形態であり、ｐＫａが７．９の弱酸であり、最も一般的に使用されるｐＨ指示薬の１つである。その化学構造および水溶液中の解離は、次のスキームで見ることができる：
Figure 2023520419000005
フェノールレッドの三芳香族構造におけるキノンメチドのイオン化可能部分は、様々な用途に有利な特徴を示す豊富な酸化還元特性を付与する。構造内のキノンメチドの部分は、豊富な酸化還元化学の中心である。ＰＢＳ中でｐＨ７．９に緩衝された溶液中で裸のＧＣ電極を使用して、様々な走査速度でスキャンしたフェノールレッドのサイクリックボルタモグラムを図４に示す。図４では、６つの重要な波が観察できる。図４の挿入プロットに示すとおり、ピーク電流を走査速度および走査速度の平方根の値と相関させることにより、波（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｆ）が、電極界面でのフェノールレッドの酸化還元反応として分類できることがわかった。これは、走査速度の平方根への比例を示すピーク電流が、拡散制御反応の特徴であるという事実のためである。対照的に、波（ａ）および（ｅ）は、ピーク電流と走査速度の線形関係により、電極表面へのフェノールレッドの吸着プロセスとして分類される。
フェノールレッドの酸化還元対を特定するために、様々なスイッチング電位でフェノールレッドのサイクリックボルタンメトリースキャンを実施し、その結果を図５に示す。スキャンは、それぞれ１．５Ｖから０．４、－０．２、－１．０、および－１．５Ｖのスイッチング電位まで陰極により開始した。図５の挿入グラフの曲線の右端を見ると、曲線（ａ）は、２つの還元ピークおよび１つのみの有意な酸化ピークを示し、曲線（ｂ）は、１つの酸化還元対のみを示す。曲線（ａ）のｉｐｃ／ｉｐａ比は、約２．８であり、曲線（ｂ）のｉｐｃ／ｉｐａ比は、２．３であり、これは、曲線（ａ）のプロセスで、還元種が減少していることを示す。
次の２段階還元により、以下の所見が説明され得る：
Figure 2023520419000006
第１の還元ピークは、－０．７５Ｖで発生し、その後図５の挿入グラフの曲線（ａ）の－１．１２Ｖで第２の還元が発生した。さらに、不均化は、カルバニオン［Ｄ］および開始オキソニウムイオン［Ａ］への第１の還元［Ｃ］のフリーラジカル生成物の一部を消費する。
Figure 2023520419000007
これにより、曲線（ａ）および（ｂ）の両方の酸化ピークが低下し、したがって一般的な可逆プロセスからのｉｐｃ／ｉｐａ比の偏差が生じる。さらに、カルバニオン種のプロトン化は、不可逆反応であるため、－１．１２Ｖでの第２の還元ピークは、－０．７５Ｖでの最初の対応物のピークと比較して、はるかに小さい。これは、前述のことに基づいて、曲線（ｂ）と比較して、曲線（ａ）のｉｐｃ／ｉｐａが比較的低いことを説明している。フェノールレッドの還元および酸化に対するｐＨ値の影響を図６に示す。ｐＨ３．９の溶液（曲線（ａ）および（ａ’）、［Ａ］が主な種）、ｐＨ７．９（曲線（ｂ）および（ｂ’）、両方の形態の量が等しい）、およびフェノールレッドを含む１１．９（曲線（ｃ）および（ｃ’）、主に［Ｂ］）をＰＢＳで緩衝し、これらの溶液のＣＶスキャンを陽極および陰極の両方向において実施した。ピーク電位がｐＨ変動に依存するため、（ａ’）から（ｃ’）への第１の還元には、１つの電子および１つのプロトンの移動が含まれ、第２の還元は、プロトンの移動なく進行することに留意のこと。
溶液（ａ）から（ｃ）の対応する陽極スキャンは、（ｃ）では１つのみであるにもかかわらず、曲線（ａ）および（ｂ）では、２つの酸化ピークを呈する。（ａ）および（ｂ）の場合、プロトン化されていないフェノールレッド［Ｂ］が、最初に酸化を受け、その後プロトン化された対応物［Ａ］が、脱プロトンを伴うより正の電位で、別の酸化を受ける。両方の酸化の関係を明らかにするために、曲線（ｄ）に示すとおり、第２の酸化の電位（０．９０Ｖ）の前に開始したスキャンをさらに実行した。この結果は、第２の酸化が、第１の酸化の生成物に由来するものではないことを示唆している。対照的に、曲線（ｃ）において、第２の酸化がないのは、アルカリ性環境での［Ａ］の不足によるものである。したがって、フェノールレッドの両方の種からの酸化は、次の経路で明らかであるとおり、ラジカルカチオン［Ｅ］をもたらす。
Figure 2023520419000008
矩形波ボルタンメトリーは、信号の識別に使用され、サイクリックボルタンメトリーと比較して、優れた信号増強の恩恵を受け、これにより、単純な信号処理が容易になる。フェノールレッドの最適濃度は、約１００μＭであることが観察された。理論に束縛されるものではないが、１００μＭでは、核増幅を阻害することなく明確な酸化還元ピークが得られる。しかし、広範囲のフェノールレッド濃度を使用しても、信号の識別はまだ達成されている。
フェノールレッドの様々な濃度で、ｐＨ範囲６．５～８．５でフェノールレッドに対して矩形波ボルタンメトリーを実施した結果を図７で見ることができる。図７の下の２つのグラフは、フェノールレッドの濃度に対するピーク位置（電圧）および高さ（電流）を示す。
次に線形回帰アルゴリズムを適用して正確なｐＨ値を得た。すなわち、線形回帰アルゴリズムの適用により、得られた出力信号をｐＨ値と相関させた。このアルゴリズムは、予測値を実測値にフィッティングすることで検証され、０．０５ｐＨ以内のエラーであり、その結果を図８に見ることができる。
０～８００ｍＶのスキャンのピークに加えて、他の２つのピークも観察された（図９を参照）。
図９で強調表示されているピークａ）ｂ）およびｃ）は、ｐＨに依存している。ピークｃ）は、不可逆的なＥＣピークである加水分解に近すぎるため、この研究ではピークａ）およびｂ）に焦点を当てた。ピークａ）：高ｐＨから低ｐＨへ：正電位へのシフト；ｐＨ範囲全体で１電子移動（約５０～６０ｍＶ／ｐＨ）。ピークｂ）：高ｐＨから低ｐＨへ：負電位へのシフト；電子移動の数は、ｐＨ（約３０～６０ｍＶ／ｐＨ）に依存する。
必要なサンプルサイズが非常に小さいにもかかわらず、この方法が提供する極めて正確なｐＨ定量化には、実施例４に示すとおり、小さなサンプルからの核酸増幅の高度に加速された監視および定量化など、多くの用途を有する。

Claims (48)

  1. 溶液のｐＨを測定する方法であって、
    －キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬を含む溶液を提供するステップと；
    －前記溶液を３電極電気化学セルに適用するステップと；
    －前記電気化学セルの電気化学応答を測定するステップと；
    －前記電気化学セルの前記電気化学応答に応じて、前記溶液の前記ｐＨを定量化するステップと、を含む、方法。
  2. 前記キノンまたはキノン誘導体が、１，２－ベンゾキノン、１、４－ベンゾキノン、１，４－ナフトキノン、９，１０－アントラキノン、およびそれらの誘導体、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｐＨ指示薬が、マラカイトグリーンシュウ酸塩、ブリリアントグリーン、エオシンイエロー、エリスロシンＢ、メチルグリーン、メチルバイオレット、ピクリン酸、クレゾールレッド、クリスタルバイオレット、ｍ－クレゾールパープル、チモールブルー、ｐ－キシレノールブルー、エオシン（ブルー）、キナルジンレッド、２，４－ジニトロフェノール、４－（ジメチルアミノ）アゾベンゾール、ブロモクロロフェノールブルー、ブロモフェノールブルー、コンゴーレッド、メチルオレンジ、ブロモクレゾールグリーン、２，５－ジニトロフェノール、アリザリンスルホン酸、メチルレッド、クロロフェノールレッド、リトマス、ブロモクレゾールパープル、ブロモフェノールレッド、４－ニトロフェノール、ブロモキシレノールブルー、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、３－ニトロフェノール、ニュートラルレッド、クレゾールレッド、１－ナフトールフタレイン、ｍ－クレゾールパープル、チモールブルー、ｐ－キシレノールブルー、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、アルカリブルー、アリザリンイエローＧＧ、インジゴカルミン、イプシロンブルー、チタンイエロー、およびこれらの組み合わせからなるリストから選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬が、前記溶液に溶解している、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  5. 測定される前記電気化学セルの前記電気化学応答が、前記電気化学セルの電位、前記電気化学セルの電流、前記電気化学セルのインピーダンス、またはこれらの組み合わせである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  6. 測定される前記電気化学セルの前記電気化学応答が、前記電気化学セルの前記電位、前記電気化学セルの前記電流、前記電気化学セルの前記インピーダンス、またはこれらの組み合わせを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記電気化学セルの前記電位が、サイクリック矩形波ボルタンメトリー、矩形波ボルタンメトリー、線形電位掃引ボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリーまたは開回路電位差測定法によって測定される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記溶液中の前記キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬の前記濃度が、約１μＭ～約１０００μＭ、例えば、約１μＭ～約５００μＭ、例えば、約５μＭ～約２５０μＭ、特に約５０μＭ～約２００μＭである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記電気化学セルの前記電気化学応答に応じて、前記溶液の前記ｐＨを定量化するステップは、回帰アルゴリズムの適用を介して実行される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記溶液が緩衝液を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記溶液が、サンプルをさらに含み、好ましくは前記サンプルが、鼻サンプル、喉サンプル、肛門サンプル、膣サンプル、耳排出サンプル、皮膚表面スワブサンプル、尿サンプル、全血サンプル、血清サンプル、血漿サンプルまたはリンパ排液サンプルからなるリストから選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記溶液が、プライマーおよび核酸増幅試薬をさらに含み、好ましくは、前記核酸増幅試薬が、ＬＡＭＰ試薬である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記核酸増幅試薬が、シグナル伝達物質を含むか、またはシグナル伝達物質を放出できるか、またはシグナル伝達物質とシグナル伝達物質を放出できる物質の両方を含む、請求項８に記載の方法。
  14. 前記シグナル伝達物質がＨ＋である、請求項１３に記載の方法。
  15. 核酸増幅ステップ、好ましくは複数の核酸増幅ステップを実施するステップを含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記核酸増幅ステップ（複数可）が、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）ステップである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記溶液中の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するためのものである、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記電気化学セルの前記電気化学応答を測定するステップが、前記シグナル伝達物質の濃度変化により、前記電気化学セルの前記電流および／または前記電位の変化を測定することを含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＬＡＭＰ試薬が、逆転写酵素を含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記プライマーが、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマーおよびバックワードアウタープライマーを含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 任意により、前記ＬＡＭＰ増幅が、フォワードループプライマーおよび／またはバックワードループプライマーなどのループプライマーの追加の対を用いて実施される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記３電極電気化学セルが、作用電極、参照電極、および対電極を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記作用電極は、前記溶液の選択されたイオンが前記作用電極に接触するのを排除するように配置されたイオン選択膜を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記電極が、金、銀、炭素、白金、二酸化ルテニウム、またはそれらの組み合わせを含む、またはそれらからなる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記電極の材料が、同一であるかまたは異なる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記３電極電気化学セルの前記電極が、スクリーン印刷電極などのフィルム電極である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記３電極電気化学セルの前記電極が、ワイヤ電極である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記３電極電気化学セルが、前記電極が配置されている基板を含み、前記基板の材料が、アルミナ、セラミック、ガラス、または不活性プラスチックなどの化学的不活性材料である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記３電極電気化学セルが、前記電気化学セルと流体接続して、前記溶液を受け取るためのマイクロ流体入口を備える、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記溶液の適用後に、前記溶液の蒸発を防ぐために蒸気バリアが追加される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記蒸気バリアが、物理的蓋、加熱蓋、鉱油、および／またはパラフィンワックスを用いて、前記３電極電気化学セルまたは前記マイクロウェルの前記入口を流体により密閉することによって形成される、請求項３０に記載の方法。
  32. 親水性領域が、前記３電極電気化学セルのキャピラリー充填などのために、前記マイクロ流体入口と前記３電極電気化学セルとを接続する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  33. ポテンショスタットまたは同様の回路を使用することによって、測定が実施される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記測定が、１分～９０分間実施される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ヌクレオチド増幅が、５９～７５℃の範囲の一定温度、例えば、６２～７３℃、例えば、６４～７０℃、例えば、６６～６８℃で行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
  36. 溶液のｐＨを測定するための３電極電気化学セルの使用であって、
    －キノン、キノン誘導体、ｐＨ指示薬、またはそれらの組み合わせを含む溶液を提供することと；
    －前記溶液を前記３電極電気化学セルに適用することと；
    －前記電気化学セルの電気化学応答を測定することと；
    －前記電気化学セルの前記電気化学応答に応じて、前記溶液の前記ｐＨを定量化することと、を含む、使用。
  37. 核酸増幅反応を監視するための３電極電気化学セルの使用であって、
    －キノン、キノン誘導体、ｐＨ指示薬、またはそれらの組み合わせを含む溶液を提供することと；
    －標的ポリヌクレオチド、少なくとも２つ、例えば少なくとも４つのプライマーを含み、それぞれが前記標的ポリヌクレオチドに隣接するサンプル、およびＬＡＭＰ試薬を含むＬＡＭＰ混合物を提供することと；
    －前記３電極電気化学セルに前記溶液および前記ＬＡＭＰ混合物を適用することと；
    －前記電気化学セルの電気化学応答を測定することと；
    －前記電気化学セルの前記電気化学応答に応じて、前記溶液のｐＨを定量化することと、を含む、使用。
  38. 前記増幅反応が、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）である、請求項３７に記載の使用。
  39. 溶液のｐＨを測定するためのシステムであって、
    ａ．ポテンショスタットと；
    ｂ．
    ｉ．３電極電気化学セルを含む第１の容器、およびキノン、キノン誘導体、および／もしくはｐＨ指示薬を含む第２容器、または
    ｉｉ．３電極電気化学セル、およびキノン、キノン誘導体、および／もしくはｐＨ指示薬を含む第１の容器を含む、測定キットと：を備える、システム。
  40. キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬が、前記第１または前記第２の容器内の水溶液に溶解される、請求項３９に記載のシステム。
  41. 前記ポテンショスタットが、前記電気化学セルの電気化学応答を測定するように構成されている、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  42. 前記ポテンショスタットが、前記電気化学応答を測定するように構成され、前記電気化学応答は、前記第１の容器中での前記キノン、キノン誘導体、および／またはｐＨ指示薬の前記酸化状態を表す、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  43. 前記システムが、前記第１および／または第２の容器を、５９℃～７５℃の範囲内の温度などまで加熱するように構成された加熱ユニットをさらに備える、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  44. 前記第１の容器が、標的ポリヌクレオチド配列に隣接するように構成された少なくとも４つのプライマーおよびＬＡＭＰ試薬などの核酸増幅反応システムを収容する、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  45. 前記第１の容器が、溶液および／またはサンプルを受け取るためのマイクロ流体入口を備える、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  46. 前記マイクロ流体入口が、キャピラリー作用によって前記サンプルを輸送するように構成された多孔質／繊維構造または親水性チャネルなどの親水性域によって前記電気化学セルに接続される、請求項４４に記載のシステム。
  47. 前記第１の容器および／または第２の容器が、エッペンドルフチューブ、マイクロウェル、または培養フラスコである、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  48. 前記電極が、請求項２２～２９のいずれか一項に記載のとおりである、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

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