JP2003524168A

JP2003524168A - 核酸検出のための電気化学的方法

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Publication number: JP2003524168A
Application number: JP2001561762A
Authority: JP
Inventors: ファティマ、アゼック; ピエール、ブロシェ; マルティーヌ、ジョアンヌ; ブノワ、リモージュ
Original assignee: アルジェンヌ
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-20
Publication date: 2003-08-12
Also published as: EP1257667A2; WO2001062953A3; FR2805545B1; DE60121547D1; ATE333519T1; WO2001062953A2; ES2267717T3; FR2805545A1; DE60121547T2; EP1257667B1; US20050032049A1; AU3571901A

Abstract

(57)【要約】本発明は、電気化学により生物学的試料中の核酸分子を検出しおよび／または定量する新規な方法、およびこの方法を実行するための試薬のキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、電気化学により生物学的試料中の核酸分子を検出しおよび／または
分析するための新規な方法に関し、およびこの方法を行うための試薬のキットに
も関する。この方法の具体的態様により、生物学的試料中の病原体による汚染の
存在を検出することができる。

【０００２】背景技術生体中の病原体の存在は、今日では幾つかの方法によって検出することができ
る。これらの方法のほとんどは、一般にウイルスゲノムのＤＮＡ断片を特異的に
増幅することができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅の前工程を用
いている。この極端に感受性高い方法によって、生体中の極めて少数の分子を検
出することができ、且つある条件下では、最初に存在する作因のゲノムのコピー
数を定量することができる。

【０００３】この手法は容易に用いられると思われ、信頼性のある結果を得ることができる
。

【０００４】ＰＣＲ生成物の分析に慣用的に用いられる方法は、臭化エチジウム（ＥＴＢ）
によるＤＮＡの染色を伴う電気泳動、または放射性または発光化合物または比色
法によって検出可能な化合物などで標識したプローブを用いるハイブリダイゼー
ション試験である。これらのハイブリダイゼーションによる手法は、医用診断に
広く用いられている。

【０００５】最近、直接分析することができるＰＣＲ生成物を得るための他の方法が開発さ
れている。例えば、特異的に標識したプライマーを用い、次いで増幅した断片が
発するシグナルを比較的手数のかかる系を用いて分析することができる。特に、
増幅に用いるプライマーは蛍光物質を有することができ、これからの蛍光放射を
測定することによって増幅したＤＮＡの量を測定することができる。更に、これ
らの方法を容易に行うことが困難であるという限界は、大きな部品の装置を使用
する必要がある限りは、そのままである。更に、干渉の危険性によっても、これ
らの方法が制限される。

【０００６】ＤＮＡは電気活性な核塩基を有しているので、標識を包含する必要なしに、こ
の特性を利用してハイブリダイゼーションしたＤＮＡを直接検出する電気化学検
出系も開発されている。一般的には、ＤＮＡを電極に固定し、ハイブリダイゼー
ションの前後で測定した電流の差を電極に付着したＤＮＡの量に関連づける。こ
のような方法の使用は、特許出願ＷＯ９３／２０２３０号に記載されている。し
かしながら、標識なしのこの直接検出法は、余り感受性が高くない。

【０００７】感受性を更に向上させるため、電気反応性プローブ分子または電気活性標識を
用いる他の方法が開発されている。例えば、Palanti et al. (1996, Analytical
Letters, 29, pp. 2309-31)には、ＤＮＡと結合し、従って電極に電位をかける
ことによる酸化または還元によって検出することができる様々な電気活性化合物
が記載されている。このようにして、遷移金属錯体、抗生物質、アクリジンまた
はベンズアミド色素、および他のＤＮＡ−インターカレート剤が用いられている
。これらの電気活性プローブまたは標識は、ＤＮＡよりも良好なレドックス特性
を有する。それらを用いて、一層高いシグナル／ノイズ比および一層良好な感度
を得ることができる。このような方法で得られるヒト免疫不全症ウイルス１型の
ＤＮＡの検出限界は、ナノモルのオーダーであった(Wang et al., 1996, Analyt
ical Chemistry, 68, 2629-34)。

【０００８】

【発明の概要】

本発明によれば、電極表面で不活性な基質を電気化学的に検出可能な化合物に
速やかに変換することができる酵素標識を用いて、ＤＮＡの電気化学的検出の感
度を改良することができる。

【０００９】従って、本発明の主題は、直接、または、特異的核酸、特に病原体に特異的な
核酸の増幅後に、電気化学によって試料中の核酸を検出しおよび／または分析す
るための方法であって、（ａ）核酸を電極に付着させ、（ｂ）付着した核酸に相補的な核酸であって、認識薬を含む相補的な核酸を
特異的にハイブリダイズし、（ｃ）（ｂ）の認識薬に相補的な薬剤であって、酵素にカップリングしてい
る相補的な薬剤を加え、（ｄ）上記酵素が基質に作用して、電極に電位をかけた後にファラデー電流
の変化を測定することによって検出することができる電気活性化合物を形成する
ように前記酵素に対する基質を加える工程を含んでなる、方法である。

【００１０】この方法には、下記の電気活性化合物を検出する工程がさらに加えられてもよ
い：（ｅ）このようにして生成した電気活性化合物の蓄積を、電極に電位をかけ
た後にファラデー電流の変化を測定することによって検出する。

【００１１】工程（ｄ）においては、電気活性化合物の形成前に酵素反応のカスケードを有
することができる。異なる酵素を工程（ｃ）で定義した相補的薬剤にカップリン
グさせると、加えた基質へ第一の酵素が作用した後に得られる化合物は、電気活
性化合物が最終的に得られるまではそれ自身がもう一つの酵素の基質であること
ができる。

【００１２】電流は、線形、環状、通常のパルス、差分パルスまたは方形波ボルタンメトリ
ー、あるいはアンペロメトリー、クロノアンペロメトリー、クーロメトリー、ク
ロノクーロメトリー、またはアノードストリッピングまたはカソードストリッピ
ング電位差測定法のような電気化学的手法を用いて測定することができる。

【００１３】電極に付着した核酸は、その検出を探索する核酸（ターゲット）であることが
でき、またはプローブであることができる。この場合には、ターゲット核酸を次
に加える。これを認識薬で標識する。例えば、特に標識プライマーを用いるＰＣ
Ｒによる増幅の際に、このような標識を行うことができる。

【００１４】上記のように、ターゲット核酸は、特にＰＣＲによって増幅することができる
。電極表面に吸着する核酸は、好ましくは天然のものであるかどうかに関わらず
一本鎖形態であるか、または変性した二本鎖核酸であって、相補的核酸をハイブ
リダイゼーションする。このような二本鎖核酸は、本発明の目的については一本
鎖とも考えられる。ターゲット核酸が二本鎖であるときには、ハイブリダイゼー
ションは三重らせん核酸複合体の形成であると理解される。

【００１５】

【発明の具体的説明】

本発明の目的に対して、「プローブ」は一本鎖核酸断片、または変性した二本
鎖断片であって、例えば、１２塩基〜数キロ塩基、特に１５〜数百塩基、好まし
くは１５〜５０または１００塩基を含んでなり、所定条件下特異的なハイブリダ
イゼーションを有し、ターゲット核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成す
るものと定義される。

【００１６】「核酸」という用語は、特にＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを意味するものであ
る。この核酸は、一本鎖形態または二本鎖形態であることができる。これは、様
々な要素間の結合のレベルで修飾されていてもよい。特に、ホスホジエステル結
合よりはホスホロチオエート結合が考えられる。これは、放射性物質で、または
蛍光または発光化合物で、または有機金属化合物で標識することもできる。

【００１７】「認識薬」という用語は、核酸にカップリングし且つ相補的薬剤と呼ばれる別
の化合物が特異的に認識することができる化合物を意味するものである。用いる
ことができる認識薬および相補的薬剤の例としては、特に抗原／抗体、ハプテン
／抗体、またはビオチン／ストレプトアビジンまたはアビジン複合体が挙げられ
る。後者の薬剤が、本発明による方法を行うのに好ましい。

【００１８】「生物学的試料」という用語は、生物学的材料を含む任意の試料を意味するも
のである。これには、特にイン・ビトロで保持された細胞培養物、または動物ま
たはヒトから得ることができる試料（生験材料、血液試料）が挙げられる。

【００１９】本発明者は、本発明の方法により核酸、特に増幅したＤＮＡを検出するためア
トモルの次数の極めて低い感度限界を得ることができることを明らかにした。と
りわけ、この方法は、上記の方法と比較して、これを行うときの、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅工程、ペルオキシダーゼの基質を加えるときの「酵素増幅」工程（実際に、測定した
ファラデー電流は溶液に含まれる電気活性化合物の濃度によって変化し、この濃
度は基質／酵素インキュベーション時間を調整することによって改変することが
できる）、上記のような任意の酵素カスケード工程という幾つかの増幅工程を有するという利点を有する。

【００２０】更に、相補的薬剤の一分子を酵素数分子にカップリングすることができ、これ
はシグナル増幅のもう一つの供給源である。

【００２１】本発明の方法による核酸の検出は、実際には核酸を検出することによるよりは
電気化学的化合物を検出することによって行われ、ターゲットの増幅によるより
はシグナルの増幅によるものである。

【００２２】更に、本発明の方法は、容易に小規模化および／または自動化し、試料の汚染
の危険性を少なくし、少ない経費で分析を行うことができるようにすることがで
きる。このような小規模化を行うことも有利である。

【００２３】本発明者は、驚くべきことに、小容積で操作すると系の感度が向上することを
実際に明らかにした。「小容積」という用語は、数μl〜数十μl、詳しくは５〜
５０μl、好ましくは１０μlの容積を意味しようとするものである。

【００２４】実際に、電極表面のファラデー電流の変化が検出される限り、Ｓ／Ｖ（電極表
面／溶液の容積）比を増加させて一層良好なシグナルを得るのが有利である。

【００２５】電極は、好ましくは炭素を基剤としたインキでスクリーン印刷されており、且
つ改変されていてもまたは改変されていなくてもよい。このような電極は、当該
技術分野において以前に記載されており、例えば特許出願ＷＯ９３／２０２３０
号明細書またはBagel et al., 1997, Analytical Chemistry, 69, pp. 4688-94
に記載されている。特に、炭素とスチレン誘導体を含むインキによりスクリーン
印刷した電極を使用する。好ましい誘導体は、ポリスチレンである。黒鉛／ポリ
スチレン比（重量）は、１／１０〜１０／１であり、好ましくは１／５〜５／１
であり、更に好ましくは１／２〜２／１である。５／４〜７／４、特に３／２の
比が、もっとも好ましい。用いる溶媒は、インキに含まれる化合物を良好に均一
化し且つ速やかに（約３０分〜３時間）、特に蒸発によって、「乾燥」すること
ができるものでなければならない。蒸発は、好ましくは周囲温度で起こる。スク
リーン印刷は、好ましくはポリエステルまたはＰＶＣの柔軟なシート上で行う。
これらの説明は電極の特定の例に相当するが、当業者であれば所望する用途によ
ってそれらを最適化できることが理解されよう。

【００２６】本発明は、特に分析を行う溶液（生物学的試料であることができる）に含まれ
る核酸を、電極に特異的に吸着させることを特徴とする。

【００２７】これを行うために、１．５M酢酸アンモニウムを含むことを特徴とする付着緩
衝液を用いる。この緩衝液は、特にＰＢＳ（４．３mM ＮａＨ_２ＰＯ_４，１５．
１mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４，５０mM ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）またはＴｒｉｓ（５０mM Ｔｒｉｓ，１mM ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ，５０mM ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を基
剤とすることができる。

【００２８】認識薬で標識したプローブを加えるときには、認識薬がターゲットＤＮＡのみ
に付着し且つ電極に非特異的に付着しないことが好ましい。実際に、このような
付着により、続いて相補的薬剤が結合し、酵素の基質を加えた後には電気活性化
合物が形成する。次いで、擬陽性反応が得られることになる。

【００２９】従って、ハイブリダイゼーション緩衝液は、標識したプローブをターゲットＤ
ＮＡに特異的にハイブリダイゼーションできるものでなければならない。Sambro
ok et al., （分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning: a laborator
y manual)，１９８９年，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，コー
ルドスプリングハーバー，ニューヨーク，米国、詳細にはp.9.54を参照されたい
）に記載の通常のハイブリダイゼーション緩衝液が用いられる。本発明の方法に
用いることができるハイブリダイゼーション緩衝液は、６×ＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳを含む。

【００３０】単一の酵素を用いるときには、これがオキシダーゼ活性を有するのが好ましい
。これは、例えば、ペルオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼでよいが、
ヒドロキシラーゼ、例えばアルカリホスファターゼのような別の種類の酵素であ
ってもよい。ペルオキシダーゼは、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
が好ましく用いられる。ストレプトアビジンに結合したペルオキシダーゼの好ま
しい基質は、オルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）である。ペルオキシダーゼ
はＯＰＤとＨ_２Ｏ_２との相互作用を触媒して、着色した電気活性な水溶性化合物
２，２′−ジアミノアゾベンゼン（ＤＡＡ）を生成する。しかしながら、ペルオ
キシダーゼの他の基質、例えばテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−フェニ
レンジアミンジアミンとジアミノベンゼンの誘導体、ヒドロキノンおよびその誘
導体、２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン）酸
、フェノキサジンなど、４−アミノアンチピリン／フェノールまたは４−アミノ
アンチピリン／アニリン系、フェロセンなどを用いることができる。

【００３１】酵素カスケードの後に検出を行うときには、最後の基質を電気活性化合物に変
換するのに用いる最後の酵素が重要である。シグナルを増幅する働きをする選考
する酵素は生物学で用いられ且つ実験条件下で活性な通常の酵素でよい。有利な
酵素は、例えばグルコシダーゼおよび関連酵素のような糖を加水分解する酵素で
ある。

【００３２】本発明は、本発明の方法を行うための試薬のキットであって、（ａ）核酸を電極に付着させる、付着緩衝液、（ｂ）電極に付着した核酸に相補的な核酸を特異的にハイブリダイゼーショ
ンさせるため、のハイブリダイゼーション緩衝液、（ｃ）相補的な核酸を標識するための、認識薬、（ｄ）酵素にカップリングした認識薬（ｄ）に相補的な、薬剤、および（ｅ）測定する溶液のファラデー電流を変化させる電気活性化合物を形成す
る前記酵素の基質を含む、キットにも関する。

【００３３】他の要素、特にターゲット核酸を増幅するためのプライマー、または出発核酸
が二本鎖であり且つ一本鎖核酸を電極に付着させるときには二本鎖核酸を変性さ
せるための緩衝液を加えることができる。

【００３４】本発明の方法を用いて、様々な起源から得られるＤＮＡを検出しおよび／また
は分析することができる。特に、細菌、ウイルスまたは細胞性のＤＮＡを検出す
ることができる。

【００３５】本発明の方法を、実際に、例えば逆転写工程−生験試料から調製することがで
きるメッセンジャーＲＮＡからの増幅の後の癌現象に関与するある種の遺伝子の
過剰発現または過小発現の検出に用いることができる。実際に、本発明の方法に
より、内部標準があるという条件でターゲット核酸を定量することができる。

【００３６】本発明の方法を用いて、食品試料で起こり得る細菌汚染（特に、サルモネラ、
リステリア、腸管出血性E. coli O157および／またはO11など）を検出しおよび
／または定量することもできる。本発明による方法は、ヒトまたは獣医学におけ
る細菌感染症の検出および診断にも極めて有用である。ヒトの喀痰を用いて検出
することができるM. tuberculosis感染症、または迅速且つ信頼のある結果が所
望な他の感染症の特性決定を挙げることができる。

【００３７】本発明の方法は、生体におけるウイルスを検出し、優れた感度を得ることによ
って、ウイルスＤＮＡの極めて少数のコピーを検出することができるようにする
のに特に有用である。特に、（ａ）生物学的試料のＤＮＡを、好ましくは検索するウイルスに特異的なプ
ライマーを用いるＰＣＲにより、特異的増幅させ、および（ｂ）本発明の方法を用いるまたは本発明のキットを用いて、増幅の後に得
られたＤＮＡを単離および分析することを含んでなる、プロトコールを行うことによって、生物学的試料中のウイル
スの存在を検出することができる。

【００３８】本発明の方法によって、様々な起源または生物に由来する核酸の試料中の存在
を同時に検出することもできる。実際に、本発明による方法の原理は、酵素の基
質への作用によって形成される電気化学的化合物に特異的なファラデー電流の検
出である。

【００３９】様々な起源に由来する核酸の試料中における存在を検出しようとするときには
、下記のプロトコールを行うことができる：（ａ）ターゲット核酸を任意に増幅させ、およびそれを電極に付着させ、（ｂ）ターゲットに相補的な核酸であって、それぞれが異なる認識薬に結合
している核酸とハイブリダイゼーションさせ、（ｃ）異なる標識にカップリングした、認識薬に相補的な薬剤を添加し、（ｄ）様々な電気活性化合物を生成させるための、酵素に対する様々な基質
を添加し、および（ｅ）それぞれの化合物に特異的な電位をかけることにより電極の表面での
様々な電気活性化合物に相当するファラデー電流を測定する。

【００４０】工程（ｃ）の様々な標識は、酵素または他の標識である。酵素の基質が様々な
電気活性化合物を生成し、他の標識は特異的なレドックス標識である。電極に付
着したターゲット核酸は、好ましくは一本鎖である。

【００４１】ファラデー電流の生成は特異的な電気活性化合物の存在に関連づけられるので
、それから出発試料中の核酸の存在または非存在を推論することができる。

【００４２】上記の方法の例は、例えば様々な核酸に特異的なプローブを電極に付着させる
ことによって、およびターゲット核酸を、例えばＰＣＲ増幅工程での様々な認識
薬にカップリングさせることによって改変できることが理解される。

【００４３】従って、この方法によって、食品試料または生物学的試料中の微生物またはウ
イルス汚染物を迅速且つ容易に同定することができる。

【００４４】生物学的試料の分析の際に本発明の方法を行うには、検出しようとするＤＮＡ
の特異的増幅を前もって行うことが一般的に勧められる。ＰＣＲ反応は、試料で
直接、または試料のＤＮＡを前もって精製した後に、行うことができる。利用可
能な試料の量および本発明の方法を行う個人によって探索しようとする目的物に
よって、いずれかの手法が選択される。当業者であれば、生物学的試料由来のＤ
ＮＡの単離に用いる手法は既知である。

【００４５】この方法を自動化および／または小規模化した系で用いるときには、ＤＮＡの
単離を、特許ＷＯ９７／４１２１９号の教示などを用いて電極上で直接行い、こ
うして得られるＤＮＡを次にＰＣＲによって増幅することができる。

【００４６】

【実施例】例１：ＤＮＡ抽出ＨＣＭＶＤＮＡを、ウイルス株AD169に感染したヒト胎性肺繊維芽細胞系か
ら市販のＤＮＡ抽出キットを用いて製造業者の勧告に従って抽出する。この手法
は当業者に知られており、様々な製造業者がこのような抽出用キットを提供して
いる。特に、Invitek製のInvisorbキットまたはQiagen製のQiaAmpBloodキットに
より良好な結果を得ることができることが観察された。

【００４７】細胞を溶解し、シリカに吸着した後、遠心分離によって洗浄する。ＤＮＡを適
当な緩衝液で溶出させ、支持体を除く。次に、ＤＮＡを増幅することができる。

【００４８】例２：ＰＣＲによるＨＣＭＶＤＮＡの増幅サイトメガロウイルスのＵＳゲノムのHind III X領域に位置する保存領域の４
０６個の塩基対の断片を増幅するプライマーＡＣ１（配列番号：１）およびＡＣ
２（配列番号：２）を用いる(Drouet et al., 1993, J. Virol. Methods, 45, 2
59-76)。

【００４９】ＰＣＲ反応を、例１で調製したＤＮＡのマトリックスについて、当業者に知ら
れている常法によって行う。下記の特徴を有する３５サイクルを行う：９２℃で
の変性１５秒，５５℃でのハイブリダイゼーション３０秒，７２℃での伸張３０
秒。変性工程は、一回目のサイクルについては７分間であり、最終サイクルの伸
張工程は、温度を７２℃に保持して更に２分間行う。

【００５０】ＤＮＡマトリックスを全く含まないネガティブコントロールを、それぞれのシ
リーズの実験に包含させる。

【００５１】例３：ＤＮＡの定量および増幅したＨＣＭＶＤＮＡについての濃度範囲の調
製例２の増幅したＤＮＡの連続希釈物を調製し、較正量のＤＮＡの存在下でＥＴ
Ｂを含むアガロースゲル上で検討する。従って、増幅したＤＮＡ濃度は１０．５
ピコモル/mlであり、６．３・１０^１２個のコピー/mlに相当することが分かる。

【００５２】ＰＣＲについてのネガティブコントロール中で、増幅ＤＮＡの濃縮溶液の連続
希釈によって、ある範囲のもの（６．３・１０^４〜６．３・１０^１２コピー/ml
）が生成する。

【００５３】例４：電極上でのハイブリダイゼーションおよび電気化学的または比色法による検出本発明による方法を用いるＤＮＡの検出は、下記の四工程で行う。ａ．ターゲットＤＮＡの固定、ｂ．標識プローブのハイブリダイゼーション、ｃ．酵素接合体のインキュベーション、ｄ．検出用基質の導入、ｅ．酵素によって生成した生成物のボルタンメトリーまたは比色法による検出
。

【００５４】増幅ＤＮＡ２μlを、周囲温度でアルカリ媒質（０．４M水酸化ナトリウム）中
で１０分間変性する。

【００５５】次に、酢酸アンモニウム１．５Mを含む付着緩衝液３００μlを加え、電極を浸
漬する。これを、３７℃で一晩インキュベーションする。

【００５６】次に、電極を蒸留水で洗浄し、ビオチン化した増幅ＨＣＭＶ配列（配列番号：
３）に特異的なプローブＡＣ３を１００ng/ml含むハイブリダイゼーション緩衝
液（６×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）中３７℃で３０分間インキュベーションする
。

【００５７】次に、新たに調製した洗浄溶液（６×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ）５００μl中で１
分間の５回のインキュベーションからなる洗浄サイクルを行う。

【００５８】次に、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体（１．６単位/ml）を含
む緩衝液（１００mMＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５−５０mMＮａＣｌ−５g/l脱脂
乳）１００μl中周囲温度で１５分間インキュベーションした後、上記のような
洗浄サイクルを直ちに行う。

【００５９】次に、電極をＯＰＤ基質の溶液（緩衝液１０ml中４０mM クエン酸，１５０mM
Ｎａ_２ＨＰＯ_４，５mM ＮａＣｌ，０．０２％Ｈ_２Ｏ_２，ＯＰＤ錠剤（Argene-Bi
osoft））５０μlに浸漬し、暗所にて周囲温度で３０分間インキュベーションす
る。

【００６０】水溶性の着色した電気活性反応生成物２，２′−ジアミノアゾベンゼンを、吸
収スペクトル光度法および差分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）によって検出
し、二つの方法を比較する。

【００６１】スペクトル光度法の読みに対して、電極を引き出して、ウェルを４９２nmで読
みとる。

【００６２】ＤＰＶによる読みに対して、Ｐｔ電極を対電極として用い、Ａｇ／ＡｇＣｌ電
極を参照疑電極として用いる。μ-Autolabポテンシオスタット（EcoChemie製）
を用い、ＧＰＳＥ３(EcoChemie)を用いてＰＣ上のインターフェースに接続する
。ＤＰＶは、２５mVパルス高、５mVポテンシャル工程、０．０５秒のパルス時間
、および０．５秒の二つのパルス間の間隔で行う。

【００６３】それぞれのシリーズの実験については、２つのネガティブコントロール（総て
の試薬を含むが、ＤＮＡを含まない）を含んでいる。従って、光学的値または電
流値を個のコントロールについて得た値で割り、応答／ブランク比が２を上回る
ときには試料はポジティブであると考える。

【００６４】下記の結果が得られている。ａ．本発明の方法の使用によるＤＮＡの検出図２は、増幅したＨＣＭＶＤＮＡと接触した電極（図２ａ）またはネガティブ
コントロール（図２ｂ）について得たＤＰＶによって記録したピークを示す。こ
の図は、本発明の方法によれば、ＤＰＶによって溶液中に含まれるＤＮＡを検出
することができることを明らかに示している。

【００６５】ｂ．本発明の方法の特異性および再現性本発明の方法の特異性および再現性を測定するため、増幅したＨＣＭＶＤＮＡ
またはヒトＥＴＳ２遺伝子の増幅したＤＮＡで被覆した３０個の電極で得たピー
クを比較した。プローブＡＣ３はＨＣＭＶに特異的であるので、ＥＴＳ２遺伝子
のＤＮＡには結合しないはずである。従って、酵素反応は全くなく、従って、Ｅ
ＴＳ２遺伝子については電流ピークが見られない。

【００６６】下記の電流値が得られている。

【００６７】

【表１】

【００６８】これは、この方法に再現性があり、且つ用いた特異的ハイブリダイゼーション
緩衝液では、プローブは電極に受動的に結合せずに、電極にすでに吸着した相補
的配列に結合することを示している。

【００６９】ｃ．比色法と比較した本発明の方法の検出限界増幅したＨＣＭＶＤＮＡの濃度を、０．１〜１０^６アトモル（６．３・１０^４〜６．３・１０^１１コピー/ml）の範囲内で変化させる。酵素反応によって生成
した生成物の特性を用いて、ボルタンメトリーと比色法とを比較する。

【００７０】図３ａおよび３ｂは、それぞれ比色法および電気化学的方法を用いて得た曲線
を示す。

【００７１】他の方法、すなわち市販のキットHybridowell(商品名)(Argene Biosoft)（３
ｄ）による比色法、またはアガロースゲル上での蛍光デンシトメトリー（３ｅ）
との比較も行う。

【００７２】増幅したサイトメガロウイルスＤＮＡの検量線（３ｂ）は、５０〜２０００ア
トモルの範囲（３・１０^７個の増幅ＤＮＡ分子）で線形であり、同じ条件下での
比色法（３ａ）によるよりも約１０分の１のＤＮＡ分子を検出することができる
ことが観察される。この方法の感度はいずれの場合でもアガロースゲル蛍光より
明らかに大きく（図３ｅ，検出限界１４フェトモル）、微量滴定プレート上の比
色法と同等である（図３ｄ）。

【００７３】本発明による方法の感度を増加させるため、検出の目的で導入したＯＰＤ基質
の容積を減少させた（５０μlの代わりに１０μl）。得られた曲線を図３ｃに示
しており、次いで検出限界が０．６アトモル（３．６・１０^５個の増幅ＤＮＡ分
子）まで下がることが観察されている。これは、微量滴定プレート上での比色法
より８３倍感度が高い。

【００７４】しかしながら、下記の実験では、５０μlの容積を基質溶液について保持して
いる。

【００７５】ｄ．本発明の方法の選択性および特異性様々なＤＮＡを用いて、本発明の方法の特異性を判定し、結果を図４に示す。
図４では、２種類の他の比色法である、本発明で記載した方法、および微量滴定
プレート上の方法と比較した。用いたＤＮＡは、ＨＣＭＶの増幅したＤＮＡ、ヒ
トＥＴＳ２遺伝子のＤＮＡ、Epstein-Barrウイルス（ＥＢＶ）またはＣ型肝炎ウ
イルス（ＨＣＶ）のウイルスＤＮＡである。

【００７６】このＤＮＡに特異的なプローブを用いるときには、この方法はＨＣＭＶＤＮＡ
を特異的且つ選択的に検出できることが観察され、このプローブはハイブリダイ
ゼーション工程中に電極に受動的に吸着しないことが確認される。

【００７７】ｅ．臨床試料の特性決定本発明による方法を、ヒト血清の１０個の試料（定量的ＰＣＲによってあらか
じめ決定したところ、４ネガティブ、６ポジティブであり、増幅前にＨＣＭＶＤ
ＮＡ２〜９９コピー/μlを含んでいる）に応用し、例２で記載した増幅を行った
。

【００７８】本発明による方法で得た結果を、ビリ用滴定プレートでの通常の比色法を用い
て得た結果と比較する。

【００７９】図５は、本発明による方法が擬陽性または擬陰性を全く生じないことを示して
おり、検討を行った総ての試料について得た結果は、予想された結果に準じるも
のであった。

【００８０】更に、本発明による方法は通常の比色法と少なくとも同等の感度であり、初期
コピー数が少ないときには、本発明による方法によって一層良好なシグナル／ノ
イズ比を得ることができることが観察される（試料５および６）。

【図面の簡単な説明】

【図１】スクリーン印刷した電極上での本発明の検出法の模式的に表したものである。

【図２】（ａ）ＨＣＭＶの増幅したＤＮＡ（溶液中４・１０^９個のコピー）と、（ｂ）
ＥＴＳ２遺伝子の増幅したＤＮＡとを用いてコーティングした電極上で、本発明
の方法を用いて得たボルタモグラムである。

【図３】幾つかの方法を用いるＨＣＭＶの増幅したＤＮＡについての検量線（Ｓ／Ｎ，
シグナル／ノイズ）である。対数尺度を用いている。ａ〜ｃ：比色法による検出（ａ）または電気化学的検出（ｂ，ｃ）による電極
上でのハイブリダイゼーション。ｄ：ハイブリダイゼーションおよび通常の比色法による微量滴定プレート上で
の検出。ｅ：アガロースゲル電気泳動を用いるＥＴＢ蛍光によるＤＮＡの定量。

【図４】電気化学的検出（黒色）、または分光光度法による検出（白色）、または通常
の比色法（灰色）による本発明の方法の特異性の比較研究である。ＥＴＳ２遺伝
子、ＥＢＶウイルス、およびＨＣＶウイルスの増幅断片、およびＨＣＭＶの増幅
ＤＮＡのポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを用いる。対数
尺度。

【図５】微量プレート上の通常の比色法（白色）、または本発明の方法（黒色）を用い
るヒト試料（１〜１０）におけるＨＣＭＶの増幅ＤＮＡの検出能の比較研究であ
る。ポジティブコントロール（＋）および２つのネガティブコントロール（−）
を含んでいた。対数尺度。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/483 33/566 33/53 27/46 ３３６Ｇ 33/566 27/30 ３５１ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マルティーヌ、ジョアンヌフランス国キャリエール‐シュール‐セーヌ、リュ、デュ、ジェネラル、ルクレルク、28ビス (72)発明者ブノワ、リモージュフランス国ブルティニー‐シュール‐オルジュ、リュ、アントワーヌ、ド、サン‐テグジュペリー、57 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB14 BB29 BB50 DA13 FA34 FB01 FB02 FB05 GC20 4B024 AA11 CA02 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR02 QR58 QS25 QS34 QS36 QS39 QX04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の核酸を検出しおよび／または分析するための方法であって、（ａ）核酸を電極に付着させ、（ｂ）付着した核酸に相補的な核酸であって、認識薬を含む相補的な核酸を
特異的にハイブリダイズし、（ｃ）（ｂ）の認識薬に相補的な薬剤であって、酵素にカップリングしてい
る相補的な薬剤を加え、（ｄ）上記酵素が基質に作用して、電極に電位をかけた後にファラデー電流
の変動を測定することによって検出することができる電気活性化合物を形成する
ように、前記酵素に対する基質を加える工程を含んでなる、方法。
【請求項２】電気活性化合物の形成前に、工程（ｄ）において酵素反応のカスケードを含ん
でなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】電極に付着した一本鎖核酸が、ターゲット核酸である、請求項１または２に記
載の方法。
【請求項４】核酸を電極に付着させる工程の前に、増幅工程をさらに含んでなる、請求項３
に記載の方法。
【請求項５】電極がスクリーン印刷した電極である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項６】スクリーン印刷用インキが、炭素とスチレン誘導体との混合物を含む、請求項
５に記載の方法。
【請求項７】電気活性化合物を形成する酵素がオキシダーゼである、請求項１〜６のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項８】オキシダーゼがペルオキシダーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項８に記載の方
法。
【請求項１０】ペルオキシダーゼの基質が、オルトフェニレンジアミンＯＰＤである、請求項
８または９に記載の方法。
【請求項１１】請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を行うための試薬のキットであっ
て、（ａ）核酸を電極に付着させる、付着緩衝液、（ｂ）電極に付着した核酸に相補的な核酸を特異的にハイブリダイゼーショ
ンさせるための、ハイブリダイゼーション緩衝液、（ｃ）相補的な核酸を標識するための、認識薬、（ｄ）酵素にカップリングした認識薬（ｄ）に相補的な、薬剤、および（ｅ）測定する溶液のファラデー電流を変化させる電気活性化合物を形成す
る、前記酵素の基質を含む、キット。
【請求項１２】生物学的試料においてウイルスを検出する方法であって、（ａ）生物学的試料のＤＮＡを、好ましくは検索するウイルスに特異的なプ
ライマーを用いるＰＣＲにより、特異的増幅させ、および（ｂ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を用いるか、または請求
項１１に記載のキットを用いて、増幅の後に得られたＤＮＡを単離および分析す
る工程を含んでなる、方法。
【請求項１３】試料中の幾つかの異なる生物を検出する方法であって、（ａ）ターゲット核酸を任意に増幅させ、およびそれを電極に付着させ、（ｂ）ターゲットに相補的な核酸であって、それぞれが異なる認識薬に結合
している核酸とハイブリダイゼーションさせ、（ｃ）異なる標識にカップリングした、認識薬に相補的な薬剤を添加し、（ｄ）様々な電気活性化合物を生成させるための、酵素に対する様々な基質
を添加し、および（ｅ）それぞれの化合物に特異的な電位をかけることにより電極の表面での
様々な電気活性化合物に相当するファラデー電流を測定する工程を含んでなる、方法。