JP2005532818A5

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Publication number: JP2005532818A5
Application number: JP2004522471A
Authority: JP
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2006-08-31

Description

従来、微生物の検出は主に、血清学的または顕微鏡的に行われていた。その方法は、少数の微生物を直接検出するためには感度が十分ではない。従って、従来は微生物を増加させる培養工程を前段に行い検出していた。この方法の１つの不利点は、いくつかの微生物は利用可能な栄養媒地上で全く増加せず、よってそれらを検出することができないことである。現在、すべての細菌のうちたった０．１〜１４％のみが培養可能であることを、様々な環境試料の分析が示している。特に、培養−依存的な方法は、複雑な生物群集の組成物の分析に不適当であることが明らかである。なぜならば、選択した培養条件に依存して、特にこれらの培養条件によく合う微生物の増殖が促進され、結果として、開始試料中の存在比率が大きく変化してしまうためである。これらの集団数の変動のため、微生物の定量分析は全体として不可能である。この方法のもう１つの不利点は、既知のいくつかの培養方法がとても面倒であることと、それらの結果が多くの場合不安定であることである。これは、偽陽性および偽陰性の分析結果の両方を生じることとなる。

蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いたインサイチュ・ハイブリダイゼーション（in situ hybridization）法は、９０年代の初めに開発され、多くの環境試料にて成功裏に用いられている（Amann et al.（1990）, J. Bacteriol. 172, 762）。その方法は、「FISH」（蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーション）と呼称され、どんな細胞にも生じるリボソーム・リボ核酸（ＲＮＡ）が高い保存性と可変性の配列、すなわち属特異的さらには種特異的な、配列を有しているという事実を利用している。相補的オリゴヌクレオチドを、これらの配列ドメインに対して作製することができ、さらに検出可能なマーカーを付与することができる。これらのいわゆる核酸プローブを用いて、微生物種、属または群を、試料中にて高い特異性で直接的に同定することが可能であり、必要であれば、可視化または定量することもできる。この方法は、生物群集の実際のインサイチュ条件を歪曲無しで表す、唯一の方法である。現在までに、培養されておらず、従って、記載もされていない微生物でさえ、同定することができる。

故に、本発明で取り扱う問題は、特にヒトと接触する微生物または微生物群を、これらの微生物を迅速かつ任意に試料中にて定量することができ、さらに個々の種または微生物種の群を、他の微生物の同時存在にもかかわらず安全に検出することができるような方法にて検出することを可能にすることであった。

本発明のキットまたは装置一式は、１つの特定の種にして一つのオリゴヌクレオチド、一つの種に対していくつかのオリゴヌクレオチド、数種の微生物に対して１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドと、２つまたはそれ以上の微生物群に対していくつかのオリゴヌクレオチドを共に含んでいてよい。故に、例えばコリネバクテリウム属の任意の群に対する１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド、例えばプロピオニバクテリウム・アクネス属（Propionibacterium acnes）を検出するための１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを、１つのキットに含ませることができる。

本発明のオリゴヌクレオチドを用いることにより、上述のこれらのおよび他の属の種を定性的のみならず、定量的に検出することができる。この定量情報は、とりわけ活性成分の試験または皮膚疾患の早期診断に有用である。

１つの具体的な態様にて、オリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカー（好ましくは、蛍光マーカー）を担持しており、より好ましくは、それはオリゴヌクレオチドと共有結合している。オリゴヌクレオチドと標的配列の完全なハイブリダイゼーションの検出可能性は、微生物の同定および任意の定量化のための前段要件である。より具体的には、これは多くの場合、オリゴヌクレオチドに対する検出可能なマーカーの共有結合により達成される。用いられる検出可能なマーカーは、蛍光群であることが多く、例えばCy-2、Cy-3またはCy-5（Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USＡ）、FITC（フルオレセイン・イソチオシアナート）、CT（5,(6)-カルボキシテトラメチルローダミン-N-ヒドロキシスクシンイミド・エステル（Molecular Probes Inc., Eugene, USＡ））、TRITC（テトラメチルローダミン-5,6-イソチオシアナート（Molecular Probes Inc.前掲））またはFLUOS（5,(6)-カルボキシフルオレセイン-N-ヒドロキシスクシンミド・エステル（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）である。または、化学発光性の基または放射活性マーカー、例えば、35S、32P、33P、125Jを用いることができる。しかし、オリゴヌクレオチドと酵素的活性分子、例えばアルカリ・ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼまたはグルコース・オキシダーゼのカップリングにより検出能を達成することもできる。これらの酵素それぞれに多数の既知の発色体（色原体）があり、それらは天然基質の代わりに反応し、着色または蛍光産物を供することができる。そのような発色体の例を、以下の表１に一覧とする。

配列番号：28に示す配列を有するオリゴヌクレオチドは、特にペプトニフィルス・ラクリマリス（Peptoniphilus lacrimalis）種の微生物を検出する。
配列番号：29に示す配列を有するオリゴヌクレオチドもまた、特に好ましい。このオリゴヌクレオチドは、総称して「ペプトストレプトコッシ（Peptostreptococci）」として知られている微生物のうち、少なくともフィネゴルリア・マグナ（Finegoldia magna）を検出し、rＲＮＡがこの種と非常によく似ている微生物も検出する。一方、以下の微生物は同時に検出されない：アネロコッカス・ヒドロジェナリス（Anaerococcus hydrogenalis）、ペプトストレプトコッカス・アネロビルス（Peptostreptococcus anaerobius）、ペプトニフィルス・ラクリマリス（Peptoniphilus lacrimalis）、スタフィロコッカス・エピダルミジス、Halocella cellulosilytica、プロピオニバクテリウム・アクネス、ミクロモナス・ミクロス（Micromonas micros）、ベイヨネラ・ディスパル、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ならびにAnaerococcus属、コリネバクテリウム属およびPeptoniphilus属の他の一種。

１つの具体的な好ましい態様にて、本発明のキットは、標識したオリゴヌクレオチドだけでなく、標識していないオリゴヌクレオチドをも含み、微生物の検出に用いることができる。標識していないオリゴヌクレオチドおよび標識したオリゴヌクレオチドの両方を含む試料のインキュベーションは、プローブの特異性を増大するために用いられることが好ましい。例えば、近親の関係（極近縁）の微生物種を、検出されるべき微生物種と極近縁検出されるべきでない微生物種に対する１つのオリゴヌクレオチドを用いて識別することができ、そのオリゴヌクレオチドは、選択された条件下で標識プローブよりもｒＲＮＡの標的配列を有する検出されるべきでない微生物とよりハイブリダイズする。非標識プローブが、標識プローブよりも検出されるべきでない微生物のｒＲＮＡとよりハイブリダイズするので、標識プローブと検出されるべきでない微生物のｒＲＮＡとの結合、すなわち、偽陽性結果が、非標識オリゴヌクレオチド（competitor）の使用によって防止される。任意の微生物種または微生物群の特異的な検出がこうして可能となり、とりわけ非常によく似たｒＲＮＡ配列を有する極近縁関係の種の存在下でも可能となる。

【０１１１】
例えば、配列番号：１９〜３０の配列を有する１つまたはそれ以上あるいはすべてのオリゴヌクレオチドを添加したキットは、検出すべきより多くの群の微生物を検出することを可能にする１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含むことが、特に好ましい。
例えば、実際にまず、１つまたはそれ以上のプローブを用いてコリネバクテリウム属の微生物を含む試料を同定し、その後、コリネバクテリウム属の個々の微生物種または群に特異的な陽性試料を調べることが可能である。
【０１１２】
コリネバクテリウム属の多くの異なる種を検出するため、好ましくはコリネバクテリウム属の皮膚関連種を検出するために用いられる（より詳細には組合せて用いられる）る好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号：７〜１２に示す配列を有するオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは配列番号：７、８、１０および１１であり、特に配列番号：７、８、１０および１１のオリゴヌクレオチドは同時に用いられる場合が好ましい。この目的のために、上述した配列番号：１９〜２６のオリゴヌクレオチドの１つまたはそれ以上を、コリネバクテリウム属の所望の微生物の一種に依存してキットに添加しても良い。

本発明の方法は、以下の工程を含む：
ａ）皮膚の試料を採取し、
ｂ）採取した試料に存在する微生物を固定し、
ｃ）固定した微生物を少なくとも１つのオリゴヌクレオチド一緒にインキュベートし、ハイブリダイゼーションを誘導し、
ｄ）ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを除去し、そして
ｅ）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした微生物を検出し、場合により定量する。

他の添加物としては、例えばハイブリダイゼーション反応における非特異的結合を防ぐためのサケ精子ＤＮＡまたはブロッキング試薬、あるいはハイブリダイゼーション反応を加速させるためのポリエチレン・グリコール、ポリビニル・ピロリドンまたは硫酸デキストランをも含んで用いることができる。さらに、すべての生存微生物および／または試料中に存在する微生物のＤＮＡを着色するために、基質（例えば、DAPI、4', 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩）を添加することもできる。相当する添加剤は、専門家によく知られており、既知の典型的な濃度で添加することができる。

用いたオリゴヌクレオチドの標識の性質に依存して、最終評価を光学顕微鏡、epifluorescence顕微鏡（落射蛍光顕微鏡）、化学発光測定装置（chemoluminometer）、蛍光光度計などを用いて行うことができる。
本発明の方法の利点は、多種多様である。

具体的な利点としては、この検出工程の速さである。従来の培養が、検出に最高７日までを要するのに対し、本発明の工程を利用後３時間で結果が得られる。これは初めて、用いた処置の効果および望ましくない効果に関する、随伴的な診断上のコントロールを提供する。この点に関するもう１つの利点としては、本発明の方法が、記載したすべての微生物を同時に検出することを可能ならしめることであり、サンプル採取から評価までのすべての工程を１度に行うことができるという別の時間的に有利な点がある。

さらに、本発明の方法により、（陽性シグナルの場合に）特定のプローブを用いたハイブリダイゼーション方法による生化学的な検出を基に系統樹に未知の微生物種を組込むことができ、または行われている帰属の確認を行うことが可能となる。

粗い表面のプラスチック・スパチュラ、例えばガラス−ファイバー−強化ポリアミドのサンプリング用スパチュラ（Merck, Art. No. 231J2412、二重スパチュラ、長さ180 mm）は、特に適している。綿棒で擦り、比較的粘性の培地を軽く塗ることによりサンプリングし、または接着膜（例えば、商業的に利用可能な家庭用接着テープ）で皮膚サンプリングすることもまた、本発明の目的に適当である。これらの方法を用いて、例えば、適切な緩衝溶液で洗い流すことにより微生物を入手することが可能である。他の方法としては、接着テープ自体上でも行うことができる。

ハイブリダイゼーション前の細胞の透過性化は、オリゴヌクレオチドは細胞内に透過し得るが、リボソーム、従ってそのｒＲＮＡは細胞から脱出できないという利点を有する。全細胞ハイブリダイゼーションのこの技術の主な利点は、細菌の形態が原型のまま残り、これらの原型の細菌をインサイチュウ（in situ）、すなわちそれらの自然な環境にて検出することができることである。従って、細菌の定量のみでなく、様々な細菌群で可能な関連性も検出することができる。

さらに、具体的な好まし態様にて、本発明は、陽性対照として適切なオリゴヌクレオチドを供する。このオリゴヌクレオチドは、分析した試料中に存在する多くの、任意にはすべての細菌または原核生物を検出することを特徴とする。例えば、オリゴヌクレオチド EUB338（細菌）は、Amann et al.（1990）に記載されており、オリゴヌクレオチド EUK（真核生物）は、この方法に適している。このような陽性対照を、適用した方法が適切に行われるかどうかをモニターするために用いることができる。しかし、とりわけ、測定された全体としての細菌集団内に特異的に検出される微生物の割合を決定することが可能である。

2. 微生物試料を、上述のサンプリング方法により他の女性ボランティアの皮膚から採取した。
微生物の16 S ｒＲＮＡ遺伝子を、試料の一部から単離した。その後の配列決定が、配列が新規の配列であるが、コリネバクテリウム属に属しうる微生物であることを示した。この配列を、この微生物を検出できる対応プローブ（配列番号：２１）の作成における起源に基づき、配列プロトコール中の配列番号：３１に示した。

試料の他の部分を、皮膚関連コリネバクテリアを検出するために、前述の細菌特異的プローブEUBおよび混合プローブ（配列番号：０７〜１１）とハイブリダイズさせた。
蛍光シグナルを計測し、結果を細菌特異的プローブにより測定した全細胞数と比較することにより、高比率のコリネバクテリアを測定した（約73％）。

配列番号：２１の標識したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする、この試料の低比率（約５％）のコリネバクテリアを、同時に競合物質として標識していない配列番号：２２のオリゴヌクレオチドを用い、蛍光シグナルを計測し、結果を前述の検出したコリネバクテリア数と比較することにより測定した。

Claims

皮膚に生じる少なくとも一種または数種の微生物に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、微生物を検出するためのキット。
微生物が、スタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオニバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ベイヨネラ属、マラセチア属、またはスポロミュサ分類群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のキット。
微生物を、インサイチュ・ハイブリダイゼーションにより検出する、より好ましくは蛍光インサイチュ・ハイブリダイゼーションにより検出することを特徴とする、請求項１または２に記載のキット。
キットが、プロピオニバクテリウム・アクネス種に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のキット。
キットがさらに、少なくとも一種または数種のスタフィロコッカスに対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項４に記載のキット。
キットが、少なくとも一種または数種のマラセチアに対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
オリゴヌクレオチドが、特に、オリゴヌクレオチドと共有結合している検出可能なマーカーを担持していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
検出可能なマーカーが、
ａ）蛍光マーカー、
ｂ）化学発光マーカー、
ｃ）放射性マーカー,
ｄ）酵素活性な基、
ｅ）ハプテン、
ｆ）ハイブリダイゼーションにより検出可能な核酸、
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載のキット。
酵素マーカーが、ペルオキシダーゼ、好ましくはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、およびホスファターゼ、好ましくはアルカリ・ホスファターゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のキット。
ｉ）配列番号：０１〜３０に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％のヌクレオチドが、ｉ）のオリゴヌクレオチドと一致するオリゴヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）のいずれかに記載の１つのオリゴヌクレオチドに由来し、１つまたはそれ以上のヌクレオチドがその配列から欠失されているか、または伸長されているオリゴヌクレオチド、および
ｉｖ）ストリンジェントな条件下でｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のキット。
ｉ）ａ）配列番号：０１〜０３に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるスタフィロコッカス属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｉｉ）ａ）配列番号：０４〜０６および２７〜２９に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるペプトストレプトコッカス属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｉｉｉ）ａ）配列番号：０７〜１２および１９〜２６に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるコリネバクテリウム属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｉｖ）ａ）配列番号：１３〜１５に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるベイヨネラ属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｖ）ａ）配列番号：１６および１７に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるプロピオニバクテリウム・アクネス属の細菌を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｖｉ）ａ）配列番号：１８に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるマラセチア属の菌類を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
および／または
ｖｉｉ）ａ）配列番号：３０に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、
ｂ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、
ｃ）ａ）のオリゴヌクレオチドと請求項１０のｉｉｉ）に記載のように一致するオリゴヌクレオチド、および
ｄ）ストリンジェントな条件下でａ）、ｂ）またはｃ）のオリゴヌクレオチドの１つに相補的な配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるスポロミュサ分類群由来の微生物を特異的に検出するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、
を含む請求項１０に記載のキット。
キットが、１つまたはそれ以上の標識したオリゴヌクレオチドに加えて、少なくとも１つ、好ましくは１つまたはそれ以上の標識していないオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載のキット。
キットがさらに、オリゴヌクレオチドを含まない少なくとも１つのハイブリダイゼーション溶液を含むことを特徴とする、請求項１〜１２に記載のキット。
キットがさらに、少なくとも１つの適切な洗浄液または該洗浄液の濃縮液を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載のキット。
キットがさらに、少なくとも１つの適切な透過処理液を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のキット。
キットがさらに、少なくとも１つの適切な固定液を含むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のキット。
キットがさらに、少なくとも１つの適切なポジティブコントロール溶液を含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載のキット。
キットがさらに、少なくとも１つの適切なネガティブコントロール溶液を含むことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載のキット。
キットがさらに、包埋液を含むことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載のキット。
皮膚に生じる微生物、より詳細にはスタフィロコッカス属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオニバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ベイヨネラ属、マラセチア属および／またはスポロミュサ分類群を請求項１〜１９のいずれかに記載のキットを用いたインサイチュ・ハイブリダイゼーションにより検出する方法であって、次の工程：
ａ）皮膚の試料を採取し、
ｂ）採取した試料に存在する微生物を固定し、
ｃ）固定した微生物を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組合せと一緒にインキュベートし、ハイブリダイゼーションを誘導し、
ｄ）ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを除去し、そして
ｅ）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした微生物を検出し、場合により定量する
を含むことを特徴とする、微生物を検出する方法。
工程ａ）にて試料を皮膚表面から採取することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
ｉ）好ましくはエタノール、アセトンおよびエタノール／酢酸混合液からなる群から選択される変性試薬、
ｉｉ）好ましくはホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される架橋試薬、または
ｉｉｉ）熱固定処理
により固定を行うことを特徴とする、請求項２０または２１に記載の方法。
固定後、微生物を担体に固定化することを特徴とする、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
ハイブリダイゼーションの前に、微生物を透過性にすることを特徴とする、請求項２０〜２３に記載の方法。
透過性化を、好ましくはリゾチーム、リソスタフィン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼおよびムタノリシンからなる群から選択される細胞壁溶解酵素を用いた部分分解により行うことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
皮膚上の微生物を検出および／または定量するために、請求項１〜１９のいずれかに記載のキットを使用する方法。