FI111739B - Väärien negatiivisten tulosten eliminointi nukleiinihapon toteamisessa - Google Patents
Väärien negatiivisten tulosten eliminointi nukleiinihapon toteamisessa Download PDFInfo
- Publication number
- FI111739B FI111739B FI950836A FI950836A FI111739B FI 111739 B FI111739 B FI 111739B FI 950836 A FI950836 A FI 950836A FI 950836 A FI950836 A FI 950836A FI 111739 B FI111739 B FI 111739B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- internal control
- analyzed
- sequence
- amplification
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
111739 Väärien negatiivisten tulosten eliminointi nukleiinihapon toteamisessa
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää väärien 5 negatiivisten testitulosten eliminoimiseksi sellaisten määrityksien yhteydessä, jotka on tarkoitettu monistetun analysoitavan nukleiinihapon toteamiseen.
Yleensä kun monistettu nukleiinihappo on todettava näytteestä, niin negatiiviset testitulokset, so. tulokset, 10 jotka osoittavat, että tutkimuksen kohteena oleva näyte ei alun perin sisältänyt analysoitavaa nukleiinihappoa, voidaan varmistaa ainoastaan siten, että suoritetaan erillinen varmistusmääritys. Koska erillisten varmistuskokeiden suorittaminen vie aikaa, esiintyy tarvetta menetelmästä, 15 jolla mahdollistetaan negatiivisten koetulosten kontrolli toteamismäärityksissä, jotka on tarkoitettu monistetuille analysoitaville nukleiinihapoille. Kun jokaiseen näytteeseen voidaan järjestää suora sisäinen tarkistus sekä määritysmenetelmälle että monistusmenetelmälle, niin erilli-20 siä varmistuskokeita ei tarvitse enää suorittaa.
Analysoitavaa nukleiinihappoa sisältävään näytteeseen muiden sekvenssien, jotka kykenevät monistumaan sa-. ,· manaikaisesti analysoitavan nukleiinihapon kanssa, lisäys- v,· tä ovat kuvanneet Becker ja Hahlbrock (Nucleic Acids :: 25 Research, voi 17, nro 22, 1989). Beckerin ja Hahlbrockin • kuvaama menetelmä on tarkoitettu nukleiinihapon kvantita- tiiviseen määritykseen, jolloin menetelmässä erilaisia tunnettuja määriä sisäistä standardia, joka sisältää nuk-leiinihapposekvenssin, joka poikkeaa analysoitavasta nuk-30 leiinihaposta vain yhden nukleotidin osalta (pistemutaa- T tio), lisätään näytteeseen, joka siältää tuntemattoman määrän analysoitavaa nukleiinihappoa, ja monistetaan sa-: : manaikaisesti analysoitavan nukleiinihapon kanssa käyttäen ’ PCR:ää. Sisäisen standardisekvenssin yhdellä emäsmuutok- 35 sella aikaansaadaan spesifinen restriktiokohta, ja mutant- 111739 2 tisekvenssi katkaistaan sopivalla restriktioentsyymillä ennen monistetun nukleiinihapon sisältävän näytteen saattamista elektroforeesigeelille. Nukleiinihappo määritetään kvantitatiivisesti vertaamalla geelissä olevia vyöhykkei-5 tä, jotka edustavat mutanttisekvenssiä (sen osaa) ja analysoitavaa nukleiinihappoa.
Becker ja Hahlbrook käyttävät esittämässään kva-ntitoimismenetelmässä sisäistä standardia markkerina, jolloin sekä analysoitava aine että markkeri monistuvat ei-10 kompetitiivisesti.
Esillä oleva keksintö tuo esiin menetelmiä RNA:n toteamiseksi, joka on saatu monistamalla kohdesekvens-sistä, joka on läsnä analysoitavassa nukleiinihapposek-venssissä, käyttäen transkriptioon perustuvaa monistusme-15 netelmää, jolloin ennen monistamista näytteeseen lisätään sisäistä kontrollia, joka sisältää nukleiinihappoa, joka on erotettavissa analysoitavasta nukleiinihaposta siten, että se on pitempi kuin kohdesekvenssi ja jota voidaan monistaa samoilla monistusreagensseilla kuin analysoitava 20 nukleiinihappo. Monistukseen käytettyihin reagensseihin kuuluu monistusalukkeet. Esillä olevan keksinnön mukai- • sessa menetelmässä käytetyn sisäisen kontrollin tulee
t I I
: .* muistuttaa analysoitavaa nukleiinihappoa siten, että * · *.V molemmat kykenevät sitoutumaan samojen monistusalukkeiden • · > ' · 25 kanssa. Keksinnön mukaisille menetelmille on tunnusomaista • · · ; se, mitä patenttivaatimuksessa 1 tai 8 esitetään.
• i · ·
Kun näytettä ei ole varustettu sisäisellä kontrol- » lilla, negatiivinen koetulos ei anna mitään viittausta monistetun nukleiinihapon läsnäolosta. Tällöin monistettua • · ,··>, 30 nukleiinihappoa edustavan signaalin puuttuminen voi johtua • · *!* myös monistamisessa tai määritystoimenpiteessä tapahtu- neesta virheestä, joten on suoritettava erillinen varmis-tuskoe tällaisen mahdollisuuden poissulkemiseksi.
. ,·. Keksinnön mukaisen menetelmän, jossa jokaiseen 35 näytteeseen sisällytetään sisäinen kontrolli, käytön yh-
* I
111739 3 tenä etuna on, että "negatiivisen" näytteen (so. näytteen, jossa ei ollut läsnä analysoitavaa tuotetta) tapauksessa saadaan signaali, joka osoittaa monistetun sisäisen kontrollin läsnäolon. Sisäistä kontrollia edustavan signaalin 5 esiintyminen varmistaa negatiivisen koetuloksen ja toimii kontrollina tehdyille toimenpiteille (monistus- ja to-teamistoimenpide). Väärät negatiiviset koetulokset tulevat näin ollen eliminoiduksi.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävän si-10 säisen kontrollin täytyy poiketa analysoitavasta tuotteesta siten, että toteamisen aikana monistetun sisäisen kontrollin läsnäolo näkyy signaalina, joka poikkeaa analysoitavaa tuotetta edustavasta signaalista. Esimerkiksi gee-lielektroforeettisen erotuksen tapauksessa analysoitavan 15 tuotteen ja sisäisen kontrollin osoittaisi sellaisten vyöhykkeiden esiintyminen, joilla on erilaiset ajoetäisyydet geelin päästä katsottuna. Kiinteäfaasihybridisaatiomääri-tyksen tapauksessa monistetun analysoitavan nukleiinihapon tai sisäisen kontrollinukleiinihapon esiintyminen voidaan 20 osoittaa kiinteällä faasilla olevien eri kohtien avulla.
Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää näytteessä mahdollisesti esiintyvän minkä tahansa sellai- t i » i *.· sen nukleiinihapon toteamiseen, jolle voidaan konstruoida
• I
V.·· sopivia monistusalukkeita, ja se voi olla RNA tai DNA.
( * · l"/> 25 Esimerkiksi kliinisistä (veri) näytteistä voidaan tutkia I viruksesta, kuten HIV:stä, HCV:stä tai CMVrstä, peräisin mi · olevan RNA:n läsnäoloa.
• · «
Keksinnössä käytettävä menetelmä nukleiinihapon monistamiseksi on "nukleiinihapposekvenssiin perustuva • · \.!f 30 monistus (nucleic acid sequence based amplification, • · ‘I' NASBA) ", jota on kuvattu EP-patenttihakemusjulkaisussa 0 329 822. NASBA:n käytön etuna esim. PCR:n käyttöön verrattuna on, että sen yhteydessä ei tarvita mitään ,denaturointivaihetta yksisäikeisen nukleiinihapon saa- * < * 3 5 miseksi sen jälkeen, kun monistus on päättynyt, sillä 4 111739 NASBA muodostaa (suuria määriä) yksisäikeistä RNA:ta alun perin läsnä olevasta nukleiinihaposta, joka voi olla RNA:ta kuin myös DNA:ta. Kaksisäikeistä DNA:ta yksisäi-keisen RNA:n sijasta muodostavan PCR:n eräänä toisena 5 epäkohtana on, että denaturoinnin jälkeen alukkeet ja toiset säikeet, jotka ovat komplementaarisia templaatille, kilpailevat templaatista uudelleensitoutumisen aikana, mikä vähentää monistuksen herkkyyttä.
Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä 10 sisäistä kontrollia lisätään määrätty määrä näytteen valmistuksen aikana, ennen monistamista. Lisätty sisäisen kontrollin määrä ei juuri lainkaan häiritse analysoitavan nukleiinihapon monistusta.
Kun käytetään monistusmenetelmää, kuten NASBA:ta, 15 niin lisätyn sisäisen kontrollin suhteellisesta määrästä näytteessä läsnä olevan analysoitavan nukleiinihapon määrään nähden riippuu, kumpi nukleiinihappo monistuu paremmin.
Kun analysoitavaa nukleiinihappoa on näytteessä 20 läsnä enemmän tai yhtä paljon kuin sisäistä kontrollia (esim. kontrollia lisätään 100 molekyyliä näytteeseen, f · joka sisältää yli tuhat molekyyliä analysoitavaa tuotet- i ,* ta) , niin analysoitava nukleiinihappo monistuu paremmin.
• > V.·* Kun monistus on päättynyt, niin sisäisen kontrollin määrä : : 25 voi olla yhä pieni. Toisaalta kun tutkittava näyte on ne- • gatiivinen analysoitavan nukleiinihapon suhteen (tarkoit-taa, että analysoitavaa nukleiinihappoa, esim. viraalista RNA:ta, ei alun perin ollut läsnä näytteessä), niin sisäi-nen kontrolli monistuu ja, koska ei esiinny kilpailua mo- • · 30 nistusalukkeista suurempien analysoitavien nukleiinihap-*; pomäärien kanssa, kontrollia esiintyy suuria todettavia määriä monistustoimenpiteen jälkeen.
: Sisäinen kontrolli sisältää edullisesti nukleiini- , happosekvenssin, joka vastaa analysoitavaa nukleiinihap- 35 111739 5 poa, jota on mutatoitu, sen erottamiseksi analysoitavasta nukleiinihaposta.
Sisäinen kontrolli voi poiketa analysoitavasta tuotteesa eri tavoin riippuen käytettävistä toteamistoi-5 menpiteistä. Kaikissa tapauksissa sisäisenä kontrollina käytetyn nukleiinihapon täytyy muistuttaa analysoitavaa nukleiinihappoa siten, että sitä voidaan monistaa samoilla monistusreagensseilla kuin analysoitavaa nukleiinihappoa. Sisäinen kontrolli voidaan mutatoida eri tavoin sen erot-10 tamiseksi analysoitavasta nukleiinihaposta. Esimerkiksi voidaan tehdä insertio, jonka ansiosta sisäinen kontrolli tulee analysoitavaa tuotetta pidemmäksi.
Kaikissa tapauksissa on estettävä mahdollisuus, että sisäinen kontrolli, mutaatiosta (esim. deleetiosta) 15 johtuen, monistuisi tehokkaammin kuin analysoitava nukle iinihappo. Edullisesti käytetään sellaista sisäistä kontrollia, joka monistuu vähemmän tehokkaasti kuin anlysoi-tava nukeliinihappo, sisäisen kontrollin estämiseksi pääsemästä häiritsemään näytteessä mahdollisesti läsnä olevan 20 analysoitavan nukleiinihapon monistumista.
Keksinnön eräässä sovellutuksessa sisäinen kont-rolli ja analysoitava tuote muistuttavat toisiaan siten, • · i .* että molemmat kykenevät muodostamaan todettavan kompleksin yhden ja saman komplementaarisen oligonukleotidin kanssa.
·,,/ 25 Tämä oligonukleotidi hybridisoituu analysoitavan tuotteen : : : sellaisen sekvenssiosan kanssa, joka esiintyy myös sisäi- sessä kontrollissa.
Mikäli monistettu nukleiinihappo (analysoitava tai sisäinen kontrolli) todetaan geelielektroforeesin avulla, * · ,···, 30 on edullista käyttää sellaista sisäistä kontrollia, joka poikkeaa pituuden osalta analysoitavasta nukleiinihaposta.
·.!.* Analysoitavan tuotteen ja sisäisen kontrollin välinen pi- tuusero aiheuttaa erilaiset liikkuvuudet elektroforeesi- . geelissä. Koska sisäinen kontrolli poikkeaa pituudeltaan 35 analysoitavasta nukleiinihaposta, sisäinen kontrolli ilme- 6 111739 nee vyöhykkeenä, jonka ajoetäisyys geelin päästä poikkeaa paikasta, jossa esiintyisi analysoitavalle nukleiinihapolle tunnusomainen täplä. Siten ajoetäisyys geelin päästä osoittaa, monistuiko analysoitavaa tuotetta vai sisäistä 5 kontrollia, ja sisäisen kontrollin monistuminen varmistaa analysoitavan nukleiinihapon todettavien määrien puuttumisen näytteestä.
Kun monistetulle nukleiinihapolle suoritetaan e-lektroforeesi, nukleiinihapon esiintyminen geelissä voi-10 daan osoittaa millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä. Eräs hyvin tunnettu menetelmä, joka tunnetaan "Southern blotting" -menetelmänä, käsittää nukleiinihapon siirron elektroforeesin jälkeen nitroselluloosalle ja sen hybridisoimisen radioleimatun komplementaarisen koettimen 15 kanssa. Nukleiinihappo voidaan sitten visualisoida autora-diografian avulla.
Koska edellä kuvattu menetelmä on kohtalaisen aikaa vievä, on edullista lisätä komplementaarista oligo-nukleotidiä monistettuun nukleiinihappoon ennen sen 20 elektroforeesin suorittamista. Muodostuneet kompleksit voidaan tässä tapauksessa erottaa jäljellä olevista va-'> paista leimatuista koettimista geelielektroforeesin avul- : .· la. Kun toteamiskoetin hybridisoidaan näytteessä läsnä olevan nukleiinihapon kanssa, ennen kuin näytteelle suo-: 25 ritetaan geelielektroforeesi, toteamiskoetin lisätään läs- : nä olevaan nukleiinihappoon (analysoitavaan tai kontrol- li in) monistuksen jälkeen. Toteamiskoetin, joka kykenee hybridisoitumaan sekä analysoitavaan tuotteeseen että sisäiseen kontrolliin, muodostaa kompleksin sen monistetun
• I
30 nukleiinihapon kanssa, jota on läsnä. Osa lisätystä oli-gonukleotidimäärästä sitoutuu spesifisesti monistettuun nukleiinihappoon ja loput lisätystä oligonukleotidista :,t(: säilyy vapaana leimattuna oligonukleotidina, joka erottuu . komplekseista geelielektroforeesin aikana. Tämä jäljellä 35 7 111739 oleva vapaa leimattu koetin ilmenee tavallisesti erillisenä vyöhykkeenä geelin alaosassa.
Kun koetulos on negatiivinen (analysoitavaa nukleiinihappoa ei ollut läsnä), geelissä esiintyy silti vyöhy-5 ke korkeudella, joka on tunnusomainen sisäisen kontrollin ja leimatun koettimen välille muodostuneen kompleksin koolle ja joka osoittaa, että monistus ja hybridisointi leimatun koettimen kanssa oli todella tapahtunut. Siten varmistuu määrityksen negatiivinen tulos (todettavaa nuk-10 leiinihappoa ei ollut läsnä).
Toteamiskoetin voidaan leimata eri tavoin käyttäen kuitenkin leimaa, joka kykenee kulkemaan geelissä. Sellaisten entsyymileimattujen koettimien käyttöä, jossa koettimia lisätään niihin hybridisoituvaa nukleiinihappoa 15 sisältävään näytteeseen sellaisten todettavien kompleksien muodostamiseksi, jotka voidaan erottaa vapaasta entsyymi-leimatusta koettimesta geelielektroforeesin avulla, on kuvattu US-patentissa 5 482 832, jonka sisältö sisälly tetään tähän hakemukseen viitteellä.
20 Entsyymileimat, kuten on kuvattu edellä mainitussa US-patentissa, esim. piparjuuriperoksidaasi, säilyttävät ‘ aktiivisuutensa elektroforeesin suorittamisen ja geelijär- f * i • ,* jestelmään sulkemisen jälkeen ja kykenevät vielä reagoiva maan sopivan substraatin kanssa sellaisen värireaktion 25 tuottamiseksi, jolla osoitetaan leimatun nukleiinihapon (so. entsyymi leimatun kompleksin nukleiinihapon ja/tai i < · · vapaan entsyymi leimatun oligonukleotidin) läsnäolo geelissä .
; · t«i Näin saatua järjestelmää on helppo käyttää. Ei » · 30 tarvita mitään erityistä instrumentointia entsyymi leiman • · toteamiseen geelissä ja siten se on erittäin hyödyllinen : diagnostisiin käyttötarkoituksiin, esim. kliinisistä näyt- V : teistä tietyn nukleiinihapon, joka on peräisin esim. tie- . tystä viruksesta, läsnäolon tutkimiseen.
35 111739 8
Sen jälkeen kun jäljelle jäänyt vapaa entsyymileimattu oligonukleotidi on erotettu geelielektroforeesilla, leimatun kompleksin toteaminen geelistä suoritetaan värjäämällä sopivalla entsyymisubstraatilla.
5 Värjäystoimenpide on helppo ja nopea. Geeliä yksin kertaisesti liotetaan liuoksessa, joka sisältää sopivaa entsyymisubstraattia, ja värireaktio tapahtuu geelissä läsnä olevan entsyymileiman ja substraattiliuoksen välillä. Käytetty substraatti reagoi sellaisten geelissä ole-10 vien vyöhykkeiden kanssa, jotka sisältävät entsyymileimat-tua nukleiinihappoa. Värireaktio entsyymileiman ja substraatin välillä tapahtuu geelin päällä tai sisässä, ja värin esiintyminen geelin päällä tai sisässä, osoittaen entsyymiaktiivisuuden läsnäolon, voidaan todeta visuaalises-15 ti. Hyviä tuloksia on saavutettu leimattaessa oligonukleotidi piparjuuriperoksidaasilla tai sen johdannaisella, jolloin toteaminen suoritetaan värjäämällä geelin leimattu nukleiinihappo 3,3', 5,5'-tetrametyylibentsidiini/ H202:lla. Piparjuuriperoksidaasi (horseradish peroxidase, 20 HRP) katalysoi vetyperoksidin konversiota vedeksi. Tetra-metyylibentsidiini (TMB), joka on HRP:n ei-saostava subst-.· raatti, on kromogeeninen aine toimien elektronin luovutta- : \* jana vetyperoksidin konvertoimiseksi vedeksi, ja se kon- vertoituu HRP: 11a värilliseksi kompleksiksi osoittaen ent-: 25 syymiaktiivisuuden esiintymisen. Muodostunut väri voidaan • todeta visuaalisesti.
I·· t Vär j äystoimenpide täytyy suorittaa olosuhteissa, joissa entsyymi on yhä aktiivinen. Värjäysliuoksen pH:n ... tulee olla käytetylle entsyymileimalle sopiva.
30 Elektroforeettisten puskureiden pH-arvo poikkeaa ’ tavallisesti entsyymin aktiivisuuden suhteen optimiarvos- \·.·> ta. Siten geelin pH-arvo täytyy säätää sopivaksi, jotta : : entsyymireaktion voi tapahtua, pesemällä geeliä puskuri- t liuoksella elektroforeesin suorittamisen jälkeen.
111739 9
Kun HRPrtä käytetään entsyymileimana, geeli voidaan värjätä välittömästi elektroforeesin suorittamisen jälkeen puskurissa, joka sisältää entsyymisubstraattia (esim. TMB/H202) ja imidatsolia. Imidatsoli nostaa HRP:n aktiivi-5 suusoptimin korkeampaan pH-arvoon. Siten imidatsolin käytön ansiosta geeli voidaan värjätä välittömästi elektrofo-reesipuskurissa, jolloin vältetään aikaa vievä pesutoimen-pide.
Koska tässä keksinnön mukaisessa menetelmäsovellu-10 tuksessa nukleiinihappomonistukseen voidaan yhdistää ent-symaattisen signaalin monistus (jokainen entsyymimolekyyli kykenee konvertoimaan useita substraattimolekyylejä, jotka värjäytyvät geelissä/geelin päällä), saavutetaan suuri herkkyys.
15 Keksinnön mukainen menetelmä ei luonnollisesti ra joitu edellä kuvattuun käyttösovellutukseen, jossa totea-mistoimenpide käsittää monistetun nukleiinihapon geeli-elektroforeesin. Esimerkiksi monistetun nukleiinihapon (analysoitavan tai kontrollin) toteaminen voidaan vastaa-20 vasti suorittaa käyttäen komplementaarista oligonukleoti-dia, joka kykenee reagoimaan sekä analysoitavan tuotteen että sisäisen kontrollin kanssa ja on immobilisoitu kiin-: teään faasiin. Tässä tapauksessa sen toteamiseen, onko : : : analysoitava tuote vai sisäinen kontrolli sitoutunut kii- 25 nteään faasiin, voidaan käyttää kahta eri tavoin leimattua
« « I
: koetinta. Ensimmäinen reagoi spesifisesti kiinteään faa- siin sidotun analysoitavan tuotteen kanssa (koska se sisältää oligonukleotidin, joka on komplemantaarinen analy-, . soitavan nukleiinihapon osan kanssa), kun taas toinen lei- ;* 30 mattu toteamiskoetin, joka sisältää ensimmäisen toteamis- '··' koettimen leimasta erottuvan leiman, reagoi spesifisesti : ; sisäisen kontrollin kanssa. Tässä tapauksessa käytetyn ; ‘; sisäisen kontrollin täytyy muistuttaa analysoitavaa tuo tetta siinä, että se kykenee hybridisortumaan kiinteään ’ ‘ 35 faasiin immobilisoidun oligonukelotidin, mutta sen täytyy 111739 10 poiketa analysoitavasta tuotteesta siinä, että se reagoi erilaisen leimatun toteamiskoettimen kanssa kuin analysoitava tuote. Tämä voidaan saavuttaa konstruoimalla sisäinen kontrolli siten, että sekvenssi, joka on komplementaarinen 5 ensimmäiselle leimatulle toteamiskoettimelle, korvataan eri nukleotidisekvenssillä, jota ei esiinny analysoitavassa tuotteessa ja joka on komplementaarinen toiselle leimatulle toteamiskoettimelle. Kiinteään faasiin sitoutuneen leiman laadusta nähdään, oliko läsnä analysoitavaa tuotet-10 ta vai sisäistä kontrollia, jolloin myös nähdään, onko koetulos positiivinen vai negatiivinen.
Keksinnön edelleen eräässä sovellutuksessa immobi-lisoidaan kiinteään faasiin, kahteen toisistaan erotettavaan kohtaan kahta erilaista oligonukleotidia, joista en-15 simmäinen sitoutuu spesifisesti analysoitavan tuotteen kanssa ja toinen spesifisesti sisäisen kontrollin kanssa. Kumpi tahansa monistettu nukleiinihappo, joka sitoutuu yhteen kiinteässä faasissa olevista kohdista, voidaan todeta hybridisoimalla se leimattuun oligonukleotidiin, joka 20 on komplementaarinen sellaisen sekvenssin kanssa, joka esiintyy sekä analysoitavassa nukleiinihapossa että sisäi- - 'I/· sessä kontrollissa. Tässä tapauksessa kiinteässä faasissa oleva kohta, johon leima sitoutuu, osoittaa, onko koetulos :Y: positiivinen vai negatiivinen. Käytetystä toteamismenetel- 25 mästä riippuen leima voi olla mikä tahansa. Esimerkiksi « * · : ,·. kun monistetun nukleiinihapon läsnäolo todetaan sironneen • * ;·’ sisäisen heijastussuhteen avulla, leima voi olla kultasoo- lipartikkeli, mutta voidaan myös käyttää radioleimattuja , , koettimia (toteaminen autoradiografisesti) tai entsyymi- • · 30 leimattuja koettimia, jotka antavat värireaktion sopivan entsyymisubstraatin kanssa.
: Keksintöä selostetaan edelleen seuraavien esimerk-
» » I
kien avulla: 11 111739
Esimerkki 1
Nukleiinihappo uutettiin AIDS-potilailta saaduista näytteistä. Lähtömateriaalina käytettiin kokoverta, plasmaa, monosyyttejä ja trombosyyttejä. Nukleiinihappo uutet-5 tiin HIV-l:llä infektoitunen SCID-hu-hiirten kokoverestä. Näytteet käsiteltiin näytteen käsittelymenetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Boom et ai. (J. Clin. Microbiol. 28; 495 - 503, 1990). RNA:ta monistettiin käyttäen uutettua nukleiinihappoa panoksena NASBA:lie. Mitään templaat-10 teja ei sisällytetty kontaminaation kontrolleiksi ja WT HIV-1 RNA:n eri määristä koostuvaa sarjaa (101, 102, 103, 104 molekyyliä) käytettiin toteamisherkkyyden määrittämiseen. HIV-geenille gag käytettiin seuraavaa alukeparia monistamista varten (Primeri 1 (OT270): 15 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGCTATGTCACTTCCCCCTTGGTTCTCTCA;
Primeri 2: (OT271) AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA).
Jokaiseen monistusreaktioon lisätään 102 RNA-mole-kyyliä toimenpiteen kontrolliksi. Tämä RNA-molekyyli (E2) sisältää saman kohdesekvenssin kuin villityyppinen HIV-1 20 RNA sekä 140 bp insertion, joka korvaa 22 bp Sph IxPst I -fragmentin. Hybridisointi suoritettiin 10 minuutin ajan ; : 45 °C:ssa, vesihauteessa. 7-%:ista natiivia akryyliamidi- geeliä, joka oli Biometra Multigel G44-konfiguraatiossa, käytettiin erottamaan hybridi sortunut ja ei-hybridisoitu-25 nut HRP-leimattu oligonukleotidi toisistaan. l*TBE:tä : (50 mM Tris, 50 mM boraatti, 1 mM EDTA, pH 8,5) käytettiin ajo- ja geelipuskurina.
Hybridisoituja näytteitä saatettiin 2,5 μΐ geelille. Elektroforeesi pysäytettiin, kun ksyleenisyanoli saa- • * * • ‘ 30 vutti 70 % geelin pituudesta. Kun geelielektroforeesi oli
* I
' saatettu päätökseen, geeliä pestiin ja ravisteltiin sit- : : : raattipuskurissa, pH-arvossa 5,0, 5 minuutin ajan. Tämän , jälkeen geeliä pestiin ja ravisteltiin sitraattipuskuris- sa, pH-arvossa 5,0, joka sisälsi 1 % dekstraanisulfaattia, 35 15 minuutin ajan ennen jälleen uutta ravistelua ja pesua 2 i2 111739 minuutin ajan sitraattipuskurissa, pH-arvossa 5,0. HRP:tä sisältävät vyöhykkeet saatettiin näkyviin värjäämällä TMBrllä (0,1 mg/ml) ja H202:lla (1 μΐ, 30 % H202 per 10 ml), 10 minuutin ajan. Geeliä huuhdeltiin vedellä ja inku-5 boitiin (dehydratoitiin) vähintään kahden tunnin ajan 50-%:isessa metanolissa. Geeliä kuivattiin tämän jälkeen kahden tunnin ajan 50 °C:ssa, vakuumissa, geelikuivaimessa (Bio-rad, malli 583). Taulukossa 1 on esitetty yhteenveto tuloksista visuaalisesti arvosteltuna.
10 » ♦ * I » » « » • » 111739 13
Taulukko 1: nro 48, nro 49 ja nro 50 AIDS-potilaita
Potilas Näyte 1. 2.
WT E2 WT E2 Komponentti 48 Kokoveri + - + positiivinen
Plasma + - + positiivinen
Monosyytit + - + positiivinen
Trombosyytit + - + - positiivinen 49 Kokoveri + - + positiivinen
Plasma + - + positiivinen
Monosyytit + epäselvä
Trombosyytit + epäselvä 50 Kokoveri + - + - positiivinen
Plasma + - + positiivinen
Monosyytit + - + - positiivinen
Trombosyytit + - + negatiivinen , Kont- 102 - + negatiivinen rolli 103 + - positiivinen ; ·4 ....
• · 10 + - positiivinen 4 4 105 + - positiivinen 106 + - positiivinen * i t f · · NT-1 - + negatiivinen NT-2 - + negatiivinen NT-3 - + negatiivinen * * t
* I
• · t · «
Esimerkki 2 » i · • » · 5 Ensimmäisessä esimerkissä saadut epäselvät tulok- *;* set testattiin uudelleen toisella kokeella, joka suoritet- tiin esimerkissä 1 kuvattujen kokeiden mukaisesti. Ensim-Ί”ί mäisen esimerkin epäselvät näytteet antoivat kaikki posi- 111739 14 tiivisen tuloksen uudestaan tehdyissä kokeissa. Tässä myös kontrolli, jossa oli alhaisin määrä (102) molekyylejä, antoi positiivisen tuloksen. Tuloksista voidaan päätellä, että tämä koe oli hieman herkempi kuin ensimmäisen 5 esimerkin kokeet. Tulokset on esitetty taulukossa 2.
Taulukko 2: Taulukon 1 epäselvien tulosten uudelleen tutkiminen
Potilas Näyte 1. 2.
WT E2 WT E2 Komponentti 49 Monosyytit + - + positiivinen
Trombosyytit + - + - positiivinen
Kont- 102 + positiivinen rolli 103 + - positiivinen 104 + - positiivinen 105 + - positiivinen 106 + - positiivinen ' NT-1 + negatiivinen ‘ NT-2 - + negatiivinen • » 1 10 ( # 1 • 1 · • · » f « t 1 lii t i t # t » i » » » I # * 1 »
« I
( I » • * • > ·
1 · I
i I I
» t » » t t 1 !
Claims (8)
1. Menetelmä RNA:n toteamiseksi, joka on saatu monistamalla kohdesekvenssistä, joka on läsnä analysoita- 5 vassa nukleiinihapposekvenssissä, käyttäen transkriptioon perustuvaa monistusmenetelmää, tunnettu siitä, että ennen monistamista lisätään sisäinen kontrolli, joka eroaa kohdesekvenssistä siten, että se on pitempi mutta muistuttaa kohdesekvenssiä siinä, että se voidaan monistaa 10 samoilla monistusreagensseilla kuin analysoitava nukleiinihappo .
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sisäinen kontrolli sisältää samat aluketta sitovat alueet kuin analysoitava nukleiini- 15 happo.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sisäinen kontrolli ja analysoitava nukleiinihappo molemmat kykenevät muodostamaan todettavan kompleksin yhden ja saman komplementaari- 20 sen oligonukleotidin kanssa.
. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että komplementaarinen oligonukle-; ·* otidi immobilisoidaan kiinteään faasiin ja todettavista i t komplekseistä kumpikin kykenee reagoimaan eri tavalla lei-*...· 25 matun reagoivan aineen kanssa.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen me- netelmä, tunnettu siitä, että analysoitava nukle-iinihappo ja sisäinen kontrollinukleiinihappo kumpikin ky-kenee muodostamaan todettavan kompleksin erilaisen komple-,···, 30 mentaarisen oligonukleotidin kanssa.
*·* 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • » · tunnettu siitä, että kaikki monistettu nukleiini-·...· happo saatetaan reagoimaan entsyymillä leimatun koettimen . kanssa, joka kykenee hybridisoitumaan sekä RNA:han, joka 35 on tuotettu kohdesekvenssistä että RNA:han, joka on tuotettu sisäisestä kontrollisekvenssistä, kompleksin muodos- 111739 tamiseksi ja sitten näin muodostuneille komplekseille suoritetaan geelielektroforeesi niiden erottamiseksi mahdollisista jäljellä olevista vapaista entsyymillä leimatuista koettimista ja geelissä oleva entsyymileima todetaan saat-5 tamalla geeli reagoimaan tarkoituksenmukaisen entsyy-misubstraatin kanssa, minkä jälkeen joko kompleksit, jotka sisältävät analysoitavasta nukleiinihaposta peräisin olevaa RNA:ta tai kompleksit, jotka sisältävät sisäisestä kontrollista peräisin olevaa RNArta voidaan määrittää kun-10 kin sijainnin perusteella geelissä.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymileima on piparjuuri-peroksidaasi (HRP) ja että käytetty substraatti on 3,3',5,5',-tetrametyylibentsidiini (TMB).
8. Menetelmä RNA:n toteamiseksi, joka on saatu monistamalla kohdesekvenssistä, joka on läsnä analysoitavassa nukleiinihapposekvenssissä, käyttäen transkriptioon perustuvaa monistusmenetelmää, tunnettu siitä, että sisäinen kontrolli, joka eroaa kohdesekvenssistä si-20 ten, että se on pitempi mutta muistuttaa kohdesekvenssiä siinä, että se voidaan monistaa samoilla monistusreagens-seilla kuin analysoitava nukleiinihappo, lisätään biologi- *. 1 sen materiaalin näytteeseen ennen kuin siitä eristetään monistettava nukleiinihappo. • · • » • i · » » · * 1 ♦ » I * 1 · > · • · · # 17 111739
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92202563 | 1992-08-24 | ||
| EP92202563 | 1992-08-24 | ||
| PCT/EP1993/002248 WO1994004706A1 (en) | 1992-08-24 | 1993-08-20 | Elimination of false negatives in nucleic acid detection |
| EP9302248 | 1993-08-20 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI950836A FI950836A (fi) | 1995-02-23 |
| FI950836A0 FI950836A0 (fi) | 1995-02-23 |
| FI111739B true FI111739B (fi) | 2003-09-15 |
Family
ID=8210876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI950836A FI111739B (fi) | 1992-08-24 | 1995-02-23 | Väärien negatiivisten tulosten eliminointi nukleiinihapon toteamisessa |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5770360A (fi) |
| EP (1) | EP0656955B1 (fi) |
| JP (1) | JP3560974B2 (fi) |
| KR (1) | KR100292925B1 (fi) |
| AT (1) | ATE162226T1 (fi) |
| AU (1) | AU685396B2 (fi) |
| CA (1) | CA2143202C (fi) |
| DE (1) | DE69316372T2 (fi) |
| DK (1) | DK0656955T3 (fi) |
| ES (1) | ES2114066T3 (fi) |
| FI (1) | FI111739B (fi) |
| GR (1) | GR3026631T3 (fi) |
| WO (1) | WO1994004706A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA936015B (fi) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT401270B (de) * | 1994-09-26 | 1996-07-25 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung von genomischer dna |
| ES2093554B1 (es) * | 1995-02-17 | 1997-07-01 | Inst De Salud Carlos Iii | Procedimientos de amplificacion de genoma y mezclas de oligonucleotidos iniciadores para la deteccion y la identificacion de agentes infecciosos relacionados. |
| JPH11512602A (ja) * | 1995-09-20 | 1999-11-02 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | Ｐｃｒのための対照 |
| JP4104657B2 (ja) * | 1996-02-01 | 2008-06-18 | アベンティス・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | ポリヌクレオチド増幅の陽性コントロール |
| US7070962B1 (en) | 1996-02-01 | 2006-07-04 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Positive controls in polynucleotide amplification |
| BE1010608A3 (fr) * | 1996-09-09 | 1998-11-03 | Jose Remacle | Procede de quantification d'une sequence d'acides nucleiques. |
| EP0929696A2 (fr) * | 1996-09-09 | 1999-07-21 | Eppendorf Array Technologies (E.A.T.) | Procede et trousse de diagnostic et/ou de quantification par hybridation de type sandwich de sequences d'acides nucleiques sur support solide |
| US5888740A (en) * | 1997-09-19 | 1999-03-30 | Genaco Biomedical Products, Inc. | Detection of aneuploidy and gene deletion by PCR-based gene- dose co-amplification of chromosome specific sequences with synthetic sequences with synthetic internal controls |
| US6365346B1 (en) * | 1998-02-18 | 2002-04-02 | Dade Behring Inc. | Quantitative determination of nucleic acid amplification products |
| AT407160B (de) * | 1998-06-04 | 2001-01-25 | Immuno Ag | Verfahren zur bestimmung von antigenen |
| GB9902422D0 (en) * | 1999-02-03 | 1999-03-24 | Lgc Teddington Limited | Reference material for nucleic acid amplification |
| AT409383B (de) * | 1999-12-22 | 2002-07-25 | Baxter Ag | Verfahren zur detektion und quantifizierung von nukleinsäuren in einer probe |
| EP1236805B1 (en) * | 2001-03-02 | 2008-05-07 | Roche Diagnostics GmbH | A method for the determination of a nucleic acid using a control |
| EP1236804A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-09-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | A method for determination of a nucleic acid using a control |
| US20050147984A1 (en) * | 2001-08-31 | 2005-07-07 | Clondiag Chip Technologies Gmbh | Interaction detection on several probe arrays |
| US6686162B2 (en) * | 2001-12-04 | 2004-02-03 | Quest Diagnostics Investments, Incorporated | Oligonucleotides and methods for detecting Borrelia burgdorferi |
| US20040023220A1 (en) * | 2002-07-23 | 2004-02-05 | Lawrence Greenfield | Integrated method for PCR cleanup and oligonucleotide removal |
| US20040096829A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-05-20 | Allaire Normand E. | Absolute quantitation of nucleic acids by RT-PCR |
| FR2921064A1 (fr) * | 2007-09-14 | 2009-03-20 | Biomerieux Sa | Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diagnostiquer la presence du gene e1 du virus du chikungunya |
| JP5822824B2 (ja) * | 2009-06-04 | 2015-11-24 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 複合核酸の増幅 |
| US20120135397A1 (en) * | 2009-07-07 | 2012-05-31 | Tan Tock Seng Hospital | Human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) detection method and kit therefor |
| JP5999817B2 (ja) * | 2011-02-25 | 2016-10-05 | ノバルティス アーゲー | 外因性の内部陽性対照 |
| WO2013067413A1 (en) * | 2011-11-04 | 2013-05-10 | Gen-Probe Incorporated | Molecular assay reagents and methods |
| AU2013266341B2 (en) * | 2012-05-22 | 2019-01-03 | The Johns Hopkins University | A quantitative multiplex methylation specific PCR method- cMethDNA, reagents, and its use |
| CN104560982B (zh) * | 2015-01-28 | 2018-05-18 | 中国医科大学附属第一医院 | 不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子 |
| JP7322386B2 (ja) * | 2017-11-24 | 2023-08-08 | 株式会社リコー | 検出判定方法、検出判定装置、検出判定プログラム、及びデバイス |
| EP3714062A4 (en) * | 2017-11-24 | 2021-01-13 | Ricoh Company, Ltd. | DETECTION DETERMINATION METHOD, DETECTION DETERMINATION DEVICE, DETECTION DETERMINATION PROGRAM AND DEVICE |
| WO2019103122A1 (en) * | 2017-11-24 | 2019-05-31 | Ricoh Company, Ltd. | Detection determining method, detection determining device, detection determining program, and device |
| EP3790988A4 (en) * | 2018-05-10 | 2021-12-01 | Seegene, Inc. | METHOD OF DETECTING INTESTINAL MICROORGANISMS IN A SAMPLE WITH NORMAL INTESTINAL FLORA AS AN INTERNAL CONTROL |
| KR20230036149A (ko) * | 2020-08-28 | 2023-03-14 | 주식회사 씨젠 | 전-양성 대조군 조성물을 이용한 양성 대조군 반응 방법 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4626501A (en) * | 1983-09-02 | 1986-12-02 | Integrated Genetics, Inc. | Labeled DNA |
| US4965188A (en) * | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US5356774A (en) * | 1986-04-16 | 1994-10-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Replicative RNA-based amplification/detection systems |
| EP0397753B1 (en) * | 1988-01-29 | 1996-06-12 | Advanced Riverina Holdings Limited | Determination of genetic sex in ruminants using y-chromosome-specific polynucleotides |
| CA1340807C (en) * | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| US5219727A (en) * | 1989-08-21 | 1993-06-15 | Hoffmann-Laroche Inc. | Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction |
| DK0461496T3 (da) * | 1990-06-08 | 1997-01-06 | Behringwerke Ag | Fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af DNA-sekvenser |
| GB9016163D0 (en) * | 1990-07-24 | 1990-09-05 | Cemu Bioteknik | Chemical method |
| US5455166A (en) * | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| ATE257860T1 (de) * | 1991-08-02 | 2004-01-15 | Biomerieux Bv | Quantifikation von nukleinsäuren |
| FR2683827B1 (fr) * | 1991-11-15 | 1994-03-04 | Institut Nal Sante Recherc Medic | Procede de determination de la quantite d'un fragment d'adn d'interet par une methode d'amplification enzymatique. |
| US5457027A (en) * | 1993-05-05 | 1995-10-10 | Becton, Dickinson And Company | Internal controls for isothermal nucleic acid amplification reactions |
-
1993
- 1993-08-17 ZA ZA936015A patent/ZA936015B/xx unknown
- 1993-08-20 AU AU49513/93A patent/AU685396B2/en not_active Expired
- 1993-08-20 DK DK93919132T patent/DK0656955T3/da active
- 1993-08-20 EP EP93919132A patent/EP0656955B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-20 JP JP50591594A patent/JP3560974B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-20 DE DE69316372T patent/DE69316372T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-20 CA CA002143202A patent/CA2143202C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-20 US US08/392,932 patent/US5770360A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-20 ES ES93919132T patent/ES2114066T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-20 WO PCT/EP1993/002248 patent/WO1994004706A1/en active IP Right Grant
- 1993-08-20 AT AT93919132T patent/ATE162226T1/de active
- 1993-08-20 KR KR1019950700692A patent/KR100292925B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-02-23 FI FI950836A patent/FI111739B/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-14 GR GR980400827T patent/GR3026631T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2114066T3 (es) | 1998-05-16 |
| DK0656955T3 (da) | 1998-09-14 |
| GR3026631T3 (en) | 1998-07-31 |
| CA2143202A1 (en) | 1994-03-03 |
| ATE162226T1 (de) | 1998-01-15 |
| ZA936015B (en) | 1994-03-10 |
| FI950836A (fi) | 1995-02-23 |
| US5770360A (en) | 1998-06-23 |
| KR950703065A (ko) | 1995-08-23 |
| EP0656955B1 (en) | 1998-01-14 |
| JP3560974B2 (ja) | 2004-09-02 |
| JPH08500732A (ja) | 1996-01-30 |
| EP0656955A1 (en) | 1995-06-14 |
| DE69316372T2 (de) | 1998-08-27 |
| DE69316372D1 (de) | 1998-02-19 |
| WO1994004706A1 (en) | 1994-03-03 |
| CA2143202C (en) | 2007-06-12 |
| FI950836A0 (fi) | 1995-02-23 |
| KR100292925B1 (ko) | 2006-03-31 |
| AU4951393A (en) | 1994-03-15 |
| AU685396B2 (en) | 1998-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI111739B (fi) | Väärien negatiivisten tulosten eliminointi nukleiinihapon toteamisessa | |
| EP1687406B1 (en) | Nucleic acid detection method having increased sensitivity | |
| WO2011001496A1 (ja) | 検体解析方法およびそれに用いるアッセイキット | |
| JP2002536981A (ja) | 核酸標的配列の存在を測定する方法およびその応用 | |
| CN109439735B (zh) | 一种脱碱基核酸内切酶1的荧光检测探针、试剂盒及应用 | |
| CN105136882B (zh) | 基于dna模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测dna甲基转移酶活性的检测方法 | |
| WO1991017264A1 (en) | Assay for specific nucleic acid sequences | |
| CA2032203C (en) | Amplification capture assay | |
| Tang et al. | Electrochemical detection of hepatitis C virus with signal amplification using Bam HI endonuclease and horseradish peroxidase-encapsulated nanogold hollow spheres | |
| EP1668158B1 (en) | Rna detection and quantitation | |
| Lee et al. | Washing-free electrochemical strategy to detect target DNA utilizing peroxidase mimicking DNAzyme | |
| US20050032049A1 (en) | Electrochemical method for detecting nucleic acids | |
| JP2011004733A (ja) | 複数検体中の標的核酸を検出するマイクロアレイ | |
| WO2004050906A1 (fr) | Procede de detection de la methylation de l'adn | |
| CZ120598A3 (cs) | Způsob kvantitativního stanovení a detekce mikroorganizmů, kit pro kvantitativní stanovení a detekci mikroorganizmů a jejich použití | |
| CN115058493B (zh) | 一种用于多重核酸检测的dna探针、crispr-反向点杂交核酸检测系统及应用 | |
| KR101188433B1 (ko) | 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소를 이용한 핵산의 검출방법 | |
| JP4061459B2 (ja) | Ｈｂｖ遺伝子のリアルタイム検出ｐｃｒ法用プライマーおよびプローブ | |
| CN1124351C (zh) | 脱氧核糖核酸分子的通用捕集法 | |
| JP4528889B1 (ja) | 検体解析方法およびそこにおいて使用されるアッセイキット | |
| JPH06261800A (ja) | Ｒｎａウィルスの検出方法 | |
| Singleton et al. | Quantification of Pathogens | |
| CN1202525A (zh) | 脱氧核糖核酸分子的通用捕集法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |