CN1124351C

CN1124351C - 脱氧核糖核酸分子的通用捕集法

Info

Publication number: CN1124351C
Application number: CN 00133662
Authority: CN
Inventors: 黄道培
Original assignee: Individual
Current assignee: Shanghai Haoyuan Biotech Co Ltd
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2003-10-15
Anticipated expiration: 2020-12-01
Also published as: CN1309186A

Abstract

本发明涉及一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，可应用于分子医学的疾病诊断。本方法包括预杂交、杂交、洗板、酶联、洗板、显色、光密度测定等步骤。利用接头液分子的特异性部分与病原体核酸分子的杂交及通用部分与共价键地固定在通用捕集孔上的通用捕集寡核苷酸分子杂交而应用于临床检测。该法与直接法相比较，具有杂交特异性强，杂交效率一致、灵敏度高、操作方便、能做定性定量及分型等多种检测、临检效率高、成本费用低等特点，适合日益增多的临检需要。

Description

脱氧核糖核酸分子的通用捕集法

本发明涉及一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，俗称DNA探针一通用捕集法，可应用于分子医学的疾病诊断。

近年来以核酸为基础的分子诊断技术(简称核酸检测“Nat”)在国际上发展很快，逐步将成为临床检验中的常规手段。核酸检测“Nat”是赖于核酸互补顺序的特异性杂交来判别结果的，利用这个原则，在分子生物学领域中曾提出了“Southern吸印法”、“Northern吸印法”及斑点杂交法等，这些方法的特异性还是靠核酸杂交技术来确定被测的脱氧核糖核酸分子顺序以达到诊断疾病的目的。国际公认的临检多聚酶链锁式反应(简称PCR)检测法，必须包括“探针杂交”这样一个步骤。九十年代初，罗氏公司(Roche)首先发明了“直接捕集法(Capture)”，以代替难以被临床接受的“Southern吸印法”，并广泛地被有酶标板(ELISA板)基础的临检实验室接受，至今在北美、西欧和日本普遍被采用的Amplicor(罗氏公司PCR试剂盒的商标)仍属“直接捕集法”。但是此法每种板只能测定一种病原体，成本费用高、特异性较差、操作不便、杂交效率不一致等，与日益增多的临检要求不相适应。

本发明的目的是在直接捕集法的基础上加以改进而提供一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，具有杂交特异性强，灵敏度高，杂交效率一致、临检准确、生产成本低、适用于定性、定量或分型等检测、医学诊断可靠等特点。

本发明的目的是这样实现的：一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，包括下列步骤：

A)预杂交：取12.5微升的1.6毫微克/微升接头分子液加入到盛有100微升杂交液的通用捕集孔中，37℃保温1小时，进行预杂交反应形成通用捕集杂交链，然后弃去孔中剩余液；

B)杂交：取100微升上述杂交液加入到上述孔中，取待测的生物样品40微升PCR反应液与40微升变性液的混合液25微升加到上述孔中，37℃保温1小时进行杂交链反应；

C)洗板：用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤5次，每次用量300微升，然后弃去洗涤液；

D)酶联：取50毫微克/毫升的酶联液100微升加入到上述孔中，37℃保温15分钟进行酶联反应；

E)洗板：用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤5次，每次用量300微升，然后弃去洗涤液；

F)显色：孔中加入显色液100微升，25℃保持10分钟后加入停显液100微升；

G)测定：上述样品移至在波长450毫微米的酶标仪上测定光密度数。

H)判别：测得光密度数与内对照物光密度数参比，判别检测结果。

本发明中所述的：

生物样品为抽取的血样经国际公认的临检多聚酶链锁式反应(简称PCR)后的产物。

接头液分子为a)乙型肝炎病毒接头液分子；或b)丙型肝炎病毒接头液分子；或c)丙种球蛋白接头液分子；或d)爱滋病毒接头液分子；或e)结核菌接头液分子；或f)沙眼衣原体接头液分子；或其它病原体接头液分子，其接头液分子的结构为一条单链的寡核苷酸，分别由长25个碱基的通用部分、长5到4毫微米的“空间”部分及约22-26个碱基的特异性部分构成，其特异性部分为只能与带有乙型肝炎病毒PCR产物起杂交反应的乙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙型肝炎病毒PCR产物起杂交反应的丙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙种球蛋白PCR产物起杂交反应的丙种球蛋白特异性顺序、或与带有爱滋病毒PCR产物起杂交反应的爱滋病毒特异性顺序、或与带有结核菌PCR产物起杂交反应的结核菌特异性顺序、或与带有沙眼衣原体PCR产物起杂交反应的沙眼衣原体特异性顺序或与任一种待测的特异性顺序；

上述接头分子的结构为一条单链的寡核苷酸，其长度在50到60个碱基对左右，通过PE公司的392型DNA合成仪，采用固相亚磷酸三脂法进行DNA合成。它包括三个组成部分：

1.通用部分：通用部分共长25个碱基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探针互补，能很快地与通用探针杂交。

2.“空间”：介于通用部分和特异性部分之间，为了留出“空间”给二个分子形成夹心式的杂交链，我们的“空间”长度是5到4nm。

3.特异性部分：特异性部分紧接着“空间”，约为22-26个碱基。它的长短是由它本身的G/C％，Tm是否与通用部分配合所决定的，也决定于它自身是否有二级级构，它的顺序是选用在PCR产物，介于一对引物的中间顺序，因而只能和PCR的产物杂交而与生物素标记的引物无反应，所以保证了该部分杂交的特异性。

接头液的分子结构：

1)其中通用部分长25个碱基对，其顺序或用人为排列的(dA)₂₅或5′-ACg，Acg，gAA，cgA，AAc，ggA，Acg，Acgg-3′或从pBlue KS--质粒顺序中选取一段顺序。pBlue KS--质粒顺序已发表在：Short，J.et al(1988)Nucleic AcidsResearch 16(15)7583

具体顺序为：

3′-CCg，AgA，TAg，ggT，TgA，gTg，TTg，TTCC-5′

2)空间由二个空间分子(spacer-phosphoramidite)组成，每个空间为18个碳原子组成的一个长臂，可以在DNA合成仪上加入到接头分子中。

具体结构为：

(已发表在：Nelson、P、et、al(1989)Nucleic Acids Res。17：7187)

3)特异性部分：都选自各待测病原体核酸的全序列中，HBV，HCV，HIV，TB，CT，β-globin等都可在“基因文库”中查找出来。例它们的具体结构为：

(1)HBV 5′-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3′

(2)HCV 5′-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3′

(3)HIV 5′-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3′

(4)TB 5′-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3′

(5)CT 5′-GATGAAAGACAGGAAATACGCATGA-3′

(6)丙种球蛋白5′-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3′

通用捕集孔为具有活性基团的聚苯乙烯微孔板，其活性基团与接头液分子的通用部分(即通用捕集探针)的互补寡核苷酸共价键地联接固定；

杂交液为0.9MNaCl柠檬酸缓冲液，使变性后的PCR产物或接头分子液加入孔中后杂交反应的PH值维持在最适范围内，它的离子浓度和保持温度恰好与形成的二种杂交链(即通用杂交链和特异性杂交链)的Tm(融点温度)配合而使杂交效率维持在一个稳定的水平上；

变性液为0.2MNaOH溶液。

待测生物样品40微升PCR反应液的制备：

待测生物样品40ulPCR反应液中，20ul是主反应，20微升是待测血样稀释液。

a)20ul主反应液中含有氯化钾200mM、三羟甲基氨基甲烷40mM，Taq DNA聚合酶0.5u/20ul，尿嘧啶糖基化酶(UNG)1u/20ul、dNTP0.5mM、引物40μg/ml。

b)20ul待测血样稀释液制备：取50ul裂解液，加50ul待测血样，于裂解管中，37℃保温1小时，取出冷却至室温，加入100ul样品中和液，混匀后，用样品稀释液稀释5倍或25倍，然后取此稀释液20ul，加至20ul主反应液中，体积总共40ul，进行多聚酶链式反应(简称PCR)。40ul PCR产物即是杂交中使用的待测生物样品40ul PCR反应液。

洗涤液为0.15MNaCl溶液，其盐浓度对维护杂交链起了保护作用，有效地洗去非特异性的吸附，保证了杂交反应的特异性；

酶联液为过氧化物酶和亲和素的交联物；

显色液为四甲基联苯胺与过氧化氢的重量比1∶1混合液。

停显液为5％硫酸溶液。

本发明中所述的试剂、仪器均由国内生产厂家提供，如上海生工生物工程公司、上海浩源生物科技有限公司及化工化学试剂商店。

本发明与现有技术相比，具有杂交特异性强、操作方便、杂交效率一致、适用于定量聚合酶链锁式反应(PCR)、易于生产、价格较便宜等特点。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

取12.5微升的1.6毫微克/微升带有乙型肝炎病毒特异性顺序的接头分子液加入到盛有100微升0.9MNaCl柠檬酸缓冲液的通用捕集孔中，37℃保温1小时进行预杂交，然后弃去孔中剩余液，再加入100微升0.9MNaCl柠檬酸缓冲液，取生物样品乙型肝炎病毒PCR的反应液40微升与40微升0.2MNaOH变性液的混合液25微升加入上述孔中，37℃保温1小时进行预杂交，接着用0.15MNaCl洗涤液洗涤孔中产物，洗涤5次，每次用量300微升，洗涤后弃去洗涤液，接着加入100微升过氧化物酶联液，37℃保温15分钟进行酶联反应，再用0.15MNaCl溶液洗涤孔中产物5次，每次300微升，弃去洗涤液后，加入显色液100微升，25℃保持10分钟后加入5％硫酸停显液100微升，样品在波长450毫微米的酶标仪上测定光密度数，4次重复结果为1.123、1.061、1.139、0.932。

实施例2

生物样品为爱滋病毒PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.044、0.043、0.058、0.043。

实施例3

接头液分子的特异性部分为丙型肝炎病毒顺序，生物样品为丙型肝炎病毒PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.929、0.967、0.975、0.844。

实施例4

接头液分子的特异性部分为丙型肝炎病毒顺序，生物样品为丙种球蛋白PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.047、0.042、0.035、0.044。

实施例5

接头液分子的特异性部分为丙种球蛋白顺序，生物样品为丙种球蛋白PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为1.228、1.066、1.141、1.309。

实施例6

接头液分子的特异性部分为丙种球蛋白顺序，生物样品为乙型肝炎病毒PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.040、0.044、0.064、0.061。

实施例7

接头液分子的特异性部分为爱滋病毒顺序，生物样品为爱滋病毒的PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.946、0.947、0.927、1.086。

实施例8

接头液分子的特异性部分为爱滋病毒顺序，生物样品为丙型肝炎病毒PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.047、0.048、0.044、0.043。

实施例9

接头液分子的特异性部分为结核菌顺序，生物样品为结核菌PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.869、0.734、0.748、0.772。

实施例10

接头液分子的特异性部分为沙眼衣原体顺序，生物样品为沙眼衣原体PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.945、0.883、1.058、0.980。

实施例11

接头液分子的特异性部分为沙眼衣原体顺序，生物样品为结核菌PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.051、0.046、0.054、0.041。

将上述实施例数据列入表1中：

实施例	接头液分子特异性部分	生物样品病原体PCR产物	光密度数(重复4次)	是否杂交
实施例	接头液分子特异性部分	生物样品病原体PCR产物	光密度数(重复4次)	是否杂交	1	乙型肝炎病毒	乙型肝炎	1.123、1.061、1.139、0.932	是
2	乙型肝炎病毒	爱滋病	0.044、0.043、0.058、0.043	否	1	乙型肝炎病毒	乙型肝炎	1.123、1.061、1.139、0.932	是
2	乙型肝炎病毒	爱滋病	0.044、0.043、0.058、0.043	否	3	丙型肝炎病毒	丙型肝炎	0.929、0.967、0.975、0.844	是
4	丙型肝炎病毒	丙种球蛋白	0.047、0.042、0.035、0.044	否	3	丙型肝炎病毒	丙型肝炎	0.929、0.967、0.975、0.844	是
4	丙型肝炎病毒	丙种球蛋白	0.047、0.042、0.035、0.044	否	5	丙种球蛋白	丙种球蛋白	1.228、1.066、1.141、1.309	是
6	丙种球蛋白	乙型肝炎	0.040、0.044、0.064、0.061	否	5	丙种球蛋白	丙种球蛋白	1.228、1.066、1.141、1.309	是
6	丙种球蛋白	乙型肝炎	0.040、0.044、0.064、0.061	否	7	爱滋病毒	爱滋病	0.946、0.947、0.927、1.086	是
8	爱滋病毒	丙型肝炎	0.047、0.048、0.044、0.043	否	7	爱滋病毒	爱滋病	0.946、0.947、0.927、1.086	是
8	爱滋病毒	丙型肝炎	0.047、0.048、0.044、0.043	否	9	结核菌病毒	结核菌	0.869、0.734、0.748、0.772	是
10	沙眼衣原体	沙眼衣原体	0.945、0.883、1.058、0.980	是	9	结核菌病毒	结核菌	0.869、0.734、0.748、0.772	是
10	沙眼衣原体	沙眼衣原体	0.945、0.883、1.058、0.980	是	11	沙眼衣原体	结核菌	0.051、0.046、0.054、0.041	否

从表1中可以表明：接头液分子的特异性部分只与相对应的病原体进行杂交反应，与其它病原体无交叉反应，特异性强，杂交效率一致，达到了分子诊断疾病的目的。

表1中光密度是表明接头液分子的特异性部分与相应的病原体进行杂交反应。经过酶联反应，显色反应在波长450毫微米的酶标仪上测得能表明病原体量的光密度读数。在表1中光密度读数0.04说明接头液分子的特异性部分无杂交反应，光密度读数＜0.1是空白数。

在表1中光密度读数在0.9左右，说明接头液分子的特异性部分与病原体进行杂交反应，光密度读数值越高，例1.228，说明病原体与接头分子的特异性部分进行杂交反应的量多，即是通常称为强阳性，光密度读数大于空白数2.5倍，例0.05×2.5＝0.125，为弱阳性。

参考文献

A)直接捕集法：乙型肝炎病毒DNA夹心式直接捕集法

(J.of Clinical Micrlbiology 28，1411，1990)

B)直接捕集法：爱滋病毒DNA

(J.of Clinical Micrlbiology 29，638，1991)

C)分析生物化学

(Analytical Biochemistry 198，138-142，1991)

Claims

1.一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，其特征在于：包括下列操作步骤：

D)酶联：取50毫微克/毫升的酶联液100微升加入到上述孔中，37℃保温15分钟进行酶联反应：

G)测定：上述样品移至在波长450毫微米的酶标仪上测定光密度数；

其中步骤A)的接头分子液为a)乙型肝炎病毒接头分子液；或b)丙型肝炎病毒接头分子液；或c)丙种球蛋白接头分子液；或d)爱滋病毒接头分子液；或e)结核菌接头分子液；或f)沙眼衣原体接头分子液；

上述接头分子的结构为一条单链的寡核苷酸，其长度在50至60个碱基对左右，它包括三个组成部分：

通用部分：通用部分共长25个碱基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探针互补，能很快地与通用探针杂交；

“空间”：介于通用部分和特异性部分之间，为了留出“空间”给二个分子形成夹心式的杂交链，我们的“空间”长度是5到4nm；

特异性部分：特异性部分紧接着“空间”，约为22-26个碱基，它的长短是由它本身的G/C％，Tm是否与通用部分配合所决定的，也决定于它自身是否有二级级构，它的顺序是选用在PCR产物，介于一对引物的中间顺序，因而只能和PCR的产物杂交而与生物素标记的引物无反应，所以保证了该部分杂交的特异性；

接头液的分子结构：

1)其中通用部分长25个碱基对，其顺序或用人为排列的(dA)₂₅或5′-ACg，Acg，gAA，cgA，AAc，ggA，Acg，Acgg-3′或从pBlue KS--质粒顺序中选取一段顺序；

具体顺序为：

3′-CCg，AgA，TAg，ggT，TgA，gTg，TTg，TTCC-5′

2)空间由二个空间分子(spacer-phosphoramidite)组成，每个空间为18个碳原子组成的一个长臂，可以在DNA合成仪上加入到接头分子中；

具体结构为：

3)特异性部分：都选自各待测病原体核酸的全序列中，HBV，HCV，HIV，TB，CT，β-globin都可在“基因文库”中查找出来；它们的具体结构为：

(1)HBV 5′-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3′

(2)HCV 5′-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3′

(3)HIV 5′-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3′

(4)TB 5′-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3′

(5)CT 5′-GATGAAAGACAGGAAATACGCATGA-3′

(6)丙种球蛋白5′-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3′

2.根据权利要求1所述的通用捕集法，其特征在于：生物样品为抽取的血样经多聚酶链锁式反应的产物。

3.根据权利要求1所述的通用捕集法，其特征在于：通用捕集孔为具有活性基团的聚苯乙烯微孔板，或磁粉或戴玻片固相物。

4.根据权利要求1所述的通用捕集法，其特征在于：杂交液为0.9MNaCl柠檬酸缓冲液。

5.根据权利要求1所述的通用捕集法，其特征在于：变性液为0.2MNaOH溶液。

6.根据权利要求1所述的通用捕集法，其特征在于：洗涤液为0.15MNaCl溶液。

7.根据权利要求1所述的通用捕集法，其特征在于：酶联液为过氧化物酶与亲和素的交联物。

8.根据权利要求1所述的通用捕集法，其特征在于：显色液为四甲基联苯胺与过氧化氢的重量比1∶1混合液。

9.根据权利要求1所述的通用捕集法，其特征在于：停显液为5％硫酸溶液。