JP3560974B2 - 核酸検出における偽陰性の除外 - Google Patents

Description

本発明は、増幅された被分析核酸を検出するアッセイにおいて偽陰性試験結果を除外する方法に係わる。
通常、試料中の増幅された核酸を検出する場合、検査対象試料中に被分析核酸がもともと存在しなかったことを示す陰性試験結果は、別の確認アッセイを実施することによってのみ確証され得る。別の確認試験の実施はかなり時間を要するものであるが故に、増幅された被分析核酸を検出するアッセイにおいて陰性試験結果について対照を与える方法が必要である。アッセイ過程及び増幅方法において各試料に直接内部チェックを与え得るならば、別の確認試験を実施する必要はない。
被分析核酸と同時に増幅され得る他の配列を、被分析核酸を含む試料に加えることがBecker及びHahlbrock（Nucleic Acids Research,Vol.17,Number 22,1989）に記載されている。Becker及びHahlbrockによって記載されている方法は、被分析核酸と１ヌクレオチドだけ異なる核酸配列（点突然変異）を含む種々の既知量の内部標準を、未知量の被分析核酸を含む試料に加え、被分析核酸と共にPCRによって同時増幅するという核酸の定量方法である。内部標準配列中に１塩基の変更を導入することによって特異的制限部位を生成し、適当な制限酵素を用いて突然変異配列を切断してから、増幅された核酸を含む試料を電気泳動ゲルにかける。突然変異配列（の一部）及び被分析核酸を表わすゲル中のバンドを比較することにより、核酸を定量する。Becker及びHahlbrookは彼らの定量方法において内部標準をマーカーとして使用し、そこで被分析物質及びマーカーの両方を非競合的に増幅している。
本発明は、試料中の増幅された被分析核酸を検出するアッセイにおける偽陰性試験結果を除外する方法であって、増幅前に、被分析核酸と同じ増幅試薬を用いて増幅され得る、被分析核酸から区別可能な核酸を含む内部対照を試料に加えることを特徴とする方法に係わる。増幅に使用される試薬は増幅プライマーを含む。本発明の方法に使用される内部対照は、いずれも同じ増幅プライマーを用いてアニーリングし得る点で被分析核酸に類似であるべきである。
試料に内部対照を与えなければ、陰性試験結果からは、増幅された核酸があることは示されない。この場合、被増幅核酸を表わすシグナルの不在は、増幅またはアッセイ方法の誤りに起因するものかもしれず、別の確認試験を実施してこの可能性を排除する必要がある。本発明の全ての試料中に内部対照を用いる方法を使用する１つの利点は、「陰性」試料（即ち被分析物質が存在しない試料）の場合、増幅された内部対照の存在を示すシグナルが得られることである。内部対照を表わすシグナルの出現により陰性試験結果は確認され、後続作業（増幅及び検出作業）における対照として作用する。従って偽陰性試験結果は除外される。
本発明の方法に使用される内部対照は、増幅された内部対照の存在が検出時に、被分析物質を表わすシグナルとは異なるシグナルによって示される点で被分析物質とは異なる必要がある。例えばゲル電気泳動分離の場合は、被分析物質と内部対照はゲル上端から異なる移動距離にバンドが出現することにより示される。固相ハイブリダイゼーションアッセイの場合は、増幅された被分析物質及び内部対照核酸の存在は、固相上の異なるスポットによって示され得る。
本発明の方法は、それによって適当な増幅プライマーを構築し得る試料中に任意に存在する全ての種類の核酸、即ちRNA及びDNAの検出に使用し得る。例えば臨床（血液）試料を、HIV、HCVまたはCMVのごときウイルス由来のRNAの存在について試験し得る。
本発明の方法は、任意の種類の増幅方法、例えば米国特許第4,683,195号明細書及び同第4,683,202号明細書記載のごとき所謂ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に使用し得る。好ましい核酸増幅方法は、欧州特許出願第0,329,822号明細書に記載のごとき「核酸配列基準増幅（NASBA）」である。
例えばPCRを使用するよりもNASBAを使用することの利点は、NASBAは当初存在する核酸から（大量の）一本鎖RNAを生成するが故に、増幅完了後に一本鎖核酸を得るための変性ステップが必要でないことであり、当初存在する核酸はRNAでもDNAでもよい。一本鎖RNAではなくで二本鎖DNAを生成するPCRの別の欠点は、鋳型と相補的な変性プライマーと第２鎖とが再アニーリングのときに競合し、増幅感度を低下させることである。
本発明の方法によれば、増幅前の試料調製の際に内部対照を所定量で加える。加える内部対照の量は、被分析核酸増幅をほとんど妨害しないものである。
NASBAのごとき増幅方法を使用する場合、核酸が好ましく増幅されるかどうかは、試料中に存在する被分析核酸の量に対する内部対照の相対添加量に従う。被分析核酸が試料中に内部対照以上の量で存在する場合（例えば百分子の対照を千分子以上の被分析物質を含む試料に添加する場合）、被分析核酸は好ましく増幅される。増幅が完了した後も内部対照の量は依然として極めて低い。一方、検査対象試料が被分析核酸について陰性の場合（被分析核酸、例えばウイルスRNAが試料中にもともと存在しなかったことを意味する）、増幅プライマーを大量の被分析核酸と競合することがないので内部対照が増幅され、増幅作業完了後に対照は大量の検出可能な量で存在する。
内部対照は、被分析核酸から区別されるよう突然変異された、被分析核酸に対応する核酸配列を含むのが好ましい。
内部対照は、後続の検出作業に従って種々の方法で被分析物質から区別し得る。どんな場合でも、内部対照として使用される核酸は、被分析核酸と同じ増幅試薬を用いて増幅され得るべきである点で被分析核酸と類似であらねばならない。内部対照は、被分析核酸から区別されるべく種々の方法で突然変異し得る。例えば挿入物を導入し、被分析物質より長い内部対照を作製したり、欠失によってより短い内部対照を作製し得る。いずれも場合も、内部対照が突然変異（例えば欠失）のために被分析核酸より効率的に増幅され得ることは回避すべきである。試料中に存在し得る被分析核酸の増幅を内部対照が妨害しないよう、被分析核酸よりも非効率的に増幅される内部対照を使用することが好ましい。
本発明の１つの実施態様においては、内部対照及び被分析物質は、１つの同じ相補的オリゴヌクレオチドと検出可能な複合体を形成し得る点で相互に類似である。このオリゴヌクレオチドは、内部対照中にも存在する被分析物質の配列の一部にハイブリダイズする。
増幅された核酸（被分析物質または内部対照）をゲル電気泳動によって検出する場合、被分析核酸と長さが異なる内部対照を使用することが好ましい。被分析物質と内部対照の長さの相違により、電気泳動ゲルにおいて異なる移動度がもたらされる。内部対照は被分析核酸と長さが異なる故に、内部対照は、被分析核酸の特性を表わすスポットとは異なるゲル上端からの移動距離を有するバンドとして出現する。
即ちゲルの上端からの移動距離により被分析物質が増幅されたか内部対照が増幅されたかが判り、内部対照が増幅された場合は、試料中に検出可能量の被分析核酸が不在であることが確認される。
増幅された核酸を電気泳動にかける場合、ゲル中の核酸の存在は当分野における任意の公知の方法によって示し得る。「サザンブロット」として公知の１つの良く知られた方法は、電気泳動後に核酸をニトロセルロースに移し、放射性標識相補的プローブを用いてハイブリダイズすることを含む。次いで核酸をオートラジオグラフィーによって可視化することができる。
上述の方法はかなり時間を要するが故に、電気泳動にかける前に増幅された核酸に相補的オリゴヌクレオチドを加えることが好ましい。得られた複合体をゲル電気泳動によって残りの遊離標識プローブから分離することができる。試料をゲル電気泳動にかける前に検出プローブを試料中に存在する核酸とハイブリダイズする場合、検出プローブは、増幅後に存在する核酸（被分析物質または対照）に加える。被分析物質及び内部対照にハイブリダイズし得る検出プローブは、存在する被増幅核酸と複合体を形成する。加えたオリゴヌクレオチドの量の一部は、増幅された核酸に特異的に結合し、加えたオリゴヌクレオチドの残りは、遊離標識オリゴヌクレオチドとして残存し、ゲル電気泳動のときに複合体から分離される。この残存遊離標識プローブは通常はゲルの底部に別個のバンドとして出現する。
試験結果が陰性である（被分析核酸は存在しない）場合でも、１つのバンドが、ゲル中の、内部対照と標識プローブとの間で形成される複合体の寸法に特徴的な高さのところに出現し、増幅及び標識プローブとのハイブリダイゼーションが実際に起こったことが示される。こうしてアッセイの陰性結果（検出すべき核酸は存在しない）が確認される。
ゲルを横断し得る標識を使用する限りは、検出プローブを種々の方法で標識し得る。酵素標識プローブを使用し、それがハイブリダイズし得る核酸を含む試料に加えて検出可能な複合体を形成し、複合体をゲル電気泳動によって遊離酵素標識プローブから分離することが、本出願人名義の同時係属米国出願特許第07/910,860号明細書に記載されており、該特許出願明細書の開示は参照により本明細書の一部を構成するものとする。
上述の米国特許出願に記載のごとき酵素標識、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼは、電気泳動されたゲル系中に固定された後も活性を維持し、尚適当な基質と反応し、ゲル中の標識核酸（即ち酵素標識複合体核酸及び／または遊離酵素標識オリゴヌクレオチド）の存在を示す呈色反応を与え得る。このように得られる系は使用が単純である。ゲル中の酵素標識を検出するために特別の装置を必要とせず、従って、例えば所定のウイルス由来の所定の核酸の存在について臨床試料を試験するなどの診断目的には極めて有効である。
残存遊離酵素標識オリゴヌクレオチドを酵素標識複合体核酸からゲル電気泳動によって分離した後、適当な酵素基質を用いて染色することによりゲル中の標識複合体を検出する。
染色作業は単純且つ迅速である。ゲルを単に適当な酵素基質を含む溶液中に浸漬すると、ゲル中に存在する酵素標識と基質溶液との間で呈色反応が起こる。使用した基質は、ゲル中に存在する酵素標識核酸を含むバンドと反応する。酵素標識と基質との呈色反応はゲル上またはゲル中で起こり、酵素活性の存在を示すゲル上またはゲル中の発色を目視により検出し得る。オリゴヌクレオチドを西洋ワサビペルオキシダーゼまたはその誘導体で標識し、ゲル中の標識核酸を3,3'5,5'−テトラメチルベンジジン/H₂O₂を用いて染色することにより検出を行うと、優れた結果が得られる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）は過酸化水素の水への変換を触媒する。HRPの非沈殿性基質であるテトラメチルベンジジン（TMB）は、過酸化水を水に変換するための電子供与体として作用する色原体基質であり、HRPによって着色複合体に変換され、それによって酵素活性の存在が示される。呈色は目視により検出し得る。
染色処理は、酵素が依然として活性を示す条件下に実施する必要がある。染色液は、使用した酵素標識に適したpH値を有するべきである。
電気泳動緩衝液は通常、酵素の活性最適値とは異なるpH値を有する。従って、ゲルを電気泳動にかけたあと緩衝液を用いて洗浄することにより、ゲルを酵素反応を起こすのに適したpH値にすべきである。
HRPを酵素標識として使用する場合は、電気泳動にかけた後に酵素基質（例えばTMB/H₂O₂）及びイミダールを含む緩衝液中でゲルを直接染色することができる。イミダールは、HRPの活性最適値をより高いpH値にシフトさせる。従ってイミダールを用いると、ゲルを電気泳動緩衝液中で直接染色することができ、時間を要する洗浄処理を省略し得る。
本発明方法の上記実施態様によれば、核酸増幅が酵素シグナル増幅と組合せられるので（各酵素分子は、ゲル中／上に滞留する多数の基質分子を変換し得る）、高感度が得られる。
勿論本発明の方法は、検出方法が被増幅核酸のゲル電気泳動を含む上述の適用に制限されない。例えば被増幅核酸（被分析物質または内部対照）の検出は、固相上に固定された被分析物質及び内部対照の両方と反応し得る相補的オリゴヌクレオチドを使用して同様に実施し得る。被分析物質または内部対照が固相に結合されたかどうかを検出するためには、２種の異なる標識検出プローブを使用し得る。一方は（被分析核酸の一部と相補的なオリゴヌクレオチドを含むが故に）固相に結合した被分析物質と特異的に反応し、第１検出プローブ上の標識とは区別され得る標識を含む第２標識検出プローブは内部対照と特異的に反応する。この場合に使用される内部対照は、固相上に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る点で被分析物質と類似である必要があるが、被分析物質とは異なる標識検出プローブと反応する点で被分析物質とは異なる必要がある。これは、第１標識検出プローブと相補的な配列を、被分析物質中に存在しない、第２標識検出プローブと相補的な異なるヌクレオチド配列で置き換えることにより内部対照を構築することで行い得る。固相に結合したこの種の標識により、被分析物質または内部対照が存在するかどうかが示され、それによって試験結果が陽性か陰性かが示される。
本発明の別の実施態様は、一方は被分析物質に特異的に結合し、他方は内部対照に特異的に結合する２種のオリゴヌクレオチドを固相上の２つの別個のスポットに固定することを含む。固相上のスポットのいずれかに結合した被増幅核酸を、被分析核酸及び内部対照の両方に存在する配列と相補的な標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより検出し得る。この場合、試験結果が陽性か陰性かを示すのは、標識が結合した固相上のスポットである。例えば被増幅核酸の存在を散乱内面全反射によって検出する場合には標識は金ゾル粒子とし得るが、放射性標識（オートラジオグラフィーによって検出）または適当な酵素基質と呈色反応を与える酵素標識プローブを使用することもできる。
以下、実施例により本発明を更に説明する。
実施例1:
AIDS患者由来の検体から核酸を抽出した。全血、血漿、単球及び血小板を出発材料として使用した。HIV−１に感染させたSCID−huマウスの全血試料から核酸を抽出した。試料を、Boomら（J.Clin.Microbiol.28:495−503.1990）によって記載されている試料処理方法に従って処理した。抽出した核酸をNASBAの入力として使用してRNAを増幅した。夾雑物のチェックとして鋳型は含めず、一連の種々の量のWT HEV−1 RNA（10¹、10²、10³、10⁴分子）を使用して検出感度を判定した。HIV遺伝子gagに対するプライマー対を増幅に使用した（プライマー１（OT270）:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTGCTATGTCACTTCCCCCTTGGTTCTCTCA;プライマー２（OT271）:AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA）。各増幅反応に、10²のRNA分子を処理の対照として加えた。このRNA分子（E2）は、野生型HIV−1 RNAと同じターゲット配列を含むと共に、22bp Sph IxPst Iフラグメントを置き換える140bpの挿入物を含んだ。水浴中45℃で10分間、ハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイズした及びハイブリダイズしなかったHRP標識オリゴヌクレオチドを分離するため、Biometra Multigel G44形状の７％ネイティブアクリルアミドゲルを使用した。１＊TBE（50mM Tris,50mMボレート,1mM EDTA,pH8.5）を移動及びゲル緩衝液として使用した。
2.5μｌのハイブリダイズした試料をゲルに添加した。キシレンシアノールがゲル長の70％に達したときに電気泳動を停止した。ゲル電気泳動完了後、ゲルを洗浄し、クエン酸緩衝液pH5.0中で５分間揺動した。次いでゲルを洗浄し、１％デキストランスルフェートを含むクエン酸緩衝液pH5.0中で15分間揺動してから、クエン酸緩衝液pH5.0中で２分間、再度洗浄した。TMB（0.1mg/ml）及びH₂O₂（１μ130％H₂O₂/10ml）を用いて10分間染色することによりHRPを含むバンドを可視化した。ゲルを水で濯ぎ、50％メタノール中で少なくとも２時間インキュベート（脱水）した。次いでゲルをゲルドライヤー（Bio−radモデル583）内で真空下50℃で乾燥した。表１に目視評価結果をまとめて示す。

実施例2:
実施例１において判定不可と評価されたものを、実施例１に記載の実験と同様に実施した別の実験において再試験した。実施例１で判定不可であった試料は、再試験すると全てが陽性と評価された。入力分子が最低の対照（10²）も陽性と評価された。これらの結果から、かかる実験は実施例１よりも幾分高い感度を与えると結論し得る。結果を表２に与える。

Claims (9)

1. 転写ベースの恒温増幅反応における偽陰性結果を除外する方法であって、該方法は；
   （ａ）内部対照核酸が添加された試料において被分析核酸の転写ベースの恒温増幅を行い、但し該内部対照核酸は、前記被分析核酸が内部対照核酸と同量かそれより多く前記試料中に存在する際には該被分析核酸が優先的に増幅されるように被分析核酸よりも非効率的に増幅されること特徴とし、且つ該内部対照核酸と被分析核酸は同じ増幅試薬を用いて増幅され；および
   （ｂ）増幅されたRNA産物を検出し、被分析核酸だけが増幅されたのか内部対照核酸だけが増幅されたのかを決定すること
   を含み、それにより内部対照核酸の増幅産物のみの検出で被分析核酸の陰性試験結果が確認される、前記方法。
2. 前記内部対照核酸が、前記被分析核酸に対応するが該被分析核酸から区別し得るよう突然変異された核酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記内部対照核酸の長さが被分析核酸の長さと異なることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記内部対照核酸及び被分析核酸の両方が、１つの同じ相補的オリゴヌクレオチドと検出可能な複合体を形成し得ることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記相補的オリゴヌクレオチドを固相上に固定し、前記検出可能な複合体が、別様に標識された反応物質とそれぞれ反応し得ることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記被分析核酸及び内部対照核酸がそれぞれ、異なる相補的オリゴヌクレオチドと検出可能な複合体を形成し得ることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記異なる相補的オリゴヌクレオチドを固相上の異なるスポットにそれぞれ固定する請求項６に記載の方法。
8. 前記工程（ｂ）におけるRNA産物が、該産物を被分析核酸または内部対照核酸から生成した増幅核酸のいずれとも結合し得る酵素標識プローブに反応させて複合体を形成させた後、該複合体をゲル電気泳動に供して残存する遊離酵素標識プローブから該複合体を分離し且つ該ゲルを適切な酵素基質と反応させることにより検出され、それにより、被分析核酸からの増幅産物を含む複合体か又は内部対照核酸からの増幅産物を含む複合体のいずれかの存在をゲル中のそれぞれの複合体の位置に基づいて決定することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
9. 前記酵素標識が西洋ワサビペルオキシダーゼであり、前記基質が3,3',5,5'−テトラメチルベンジジンである、請求項８に記載の方法。