KR920007664B1

KR920007664B1 - 핵산의 정제, 증폭 및 검사방법

Info

Publication number: KR920007664B1
Application number: KR1019900003590A
Authority: KR
Inventors: 테리 오크스 프레드; 아써 버딕 브렌트; 린 파일스 재넷; 창 추-안
Original assignee: 이스트만 코닥 컴퍼니; 존 디. 후써; 시터스 코포레이션; 알버트 피. 헐루인
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1990-03-17
Publication date: 1992-09-14
Also published as: DE69019770D1; HK58397A; EP0388171A3; JP2609738B2; DE69019770T2; EP0388171B1; JPH0341087A; CA2011818A1; ATE123315T1; KR900014593A; EP0388171A2

Abstract

내용 없음.

Description

핵산의 정제, 증폭 및 검사방법

본 발명은 생물학적 샘플내 미리 알고 있는 핵산을 정제시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 정제된 핵산을 증폭(amplification)시키는 방법 및 이것을 분석 방법으로 검사하는 것에 관한 것이다.

생화학, 분자 생물학, 유전공학 및 여러 진단 방법의 발달에 있어 핵산을 정제하고 분리하는 빠르고 간단한 방법이 종종 필요하다. 예를 들어, 유전공학에 있어서, 여러 다른 핵산의 복합 혼합물로 부터 순수한 핵산 단편을 얻을 수 있는 것이 종종 바람직하다. 흑종의 전염병 존재를 진단하는데 있어, 타겟(target) DNA나 이것의 단편은 검사전에 정제를 필요로할 정도의 적은 농도로 존재할 수 있다. 단일 핵산은 일반적으로 누클레오타이드 서열, 분자량, 크기 및 모양으로 특징된다.

핵산 프로브(probe)기술은 연구자들이 테스트 샘플내에 매우 소량으로 존재하는 여러가지 질병, 미생물 또는 유전자 특징을 검사하는데 있어 이것의 유용성을 발견함에 따라 근년에 빠르게 개발되었다. 프로브 이용은 상보성에 기초한다. 예를 들어, DNA는 이본쇄(double strand)이며 이러한 사슬은 상보적인 누클레오타이드(또한 누클레오타이드 쌍으로서 공지됨)간의 수소결합으로 서로 결합한다.

DNA 복합체는 보통 안정하지만 이러한 이본쇄는 수소결합을 방해하는 조건에 의해 분리(또는 변성)될 수 있다. 풀려진 일본쇄는 단지 상보적인 서열의 누클레오타이드를 갖는 다른 사슬과 재결합할 것이다. 이러한 혼성화(hybridization)과정은 용액내에서 또는 고체 기질상에서 일어날 수 있다. RNA는 보통 일본쇄(single strand)이다. 이것은 또한 상보적인 서열의 누클레오타이드를 갖는 다른 사슬이나 그것의 부분과 혼성화할 것이다.

타겟 미생물이나 세포의 DNA 또는 RNA의 타겟 핵산 서열은 단지 전체 사슬중 적은 부분일 수 있으므로 라벨(label)된 공지의 프로브를 이용해 이러한 핵산 서열의 존재를 검사하는 것이 매우 어렵다. 핵산의 합성 및 프로브 민감성에 있어서의 향상을 포함해서 상기 문제점을 해결하는 여러 연구가 실행되었다.

당 업계에 있어서의 중요한 진보 사항은 US 특허 제4,683,202호(Mullis에 의해 1987년 7월 28일에 출원)에 기재되어 있는 방법이다. 이 방법에 관해 상세하게 설명할 필요없이, 이것은 증폭 방법인데 여기서 프라이머(primer)는 중합체(중합 효소같은) 및 4개의 누클레오타이드 트리포스페이트 존재에서 핵산 주형에 혼성화되며 이러한 프라이머로 부터 증대된 생성물이 형성된다. 이들 생성물은 변성되어 존재하는 핵산의 수와 양을 증폭시켜 이것의 연속적인 검사를 돕는 순환 반응에 주형으로서 사용된다. 이러한 Mullis의 증폭방법은 소량의 타겟 핵산 서열로 부터 다량의 검사가능한 물질을 얻고자 하는 만큼 여러번 순환적으로 행해질 수 있다.

상기 기술된 증폭방법이 매우 민감하지만, 여러 경우에, 생물학적 샘플내 목적하는 DNA물질의 양이 매우 적다. 비특이적인 핵산이나 세포 파편에 의한 상당한 백그라운드(background)가 분석 감도를 감소시킬 수 있다. 상당한 노력과 시간없이 이러한 물질을 제거하는 것이 불가능하며 이러한 경우 분석이 지연되고 원하는 진단과 처리 또한 지연된다.

불필요한 세포 파편과 핵산을 제거하여 미리 알고 있는 핵산의 증폭 및 검사를 증진시키기 위해, Blin과 그의 동료, Nucleic Acid Res., 3, pp. 2303-2308(1976), Marmur, J. Mol. Biol., 3, pp. 208-218(1961), Birnbion 과 그의 동료, Nucleic Acid Res. 7, pp. 1513-1523(1979). Bowtell, Anal. Biochem., 162, pp. 463-456(1987), Beji와 그의 동료, Anal. Biochem., 162, pp. 18-32(1987), Buffone과 그의 동료, Clin. Chem., 31, pp. 164-165(1985) 및 기타 여러가지 것들에 기재되어 있는 방법들을 포함해서 다수의 공지된 방법중 어느 것을 사용할 수 있다.

샘플내 다른 물질로 부터 분자, 거대분자 또는 핵산을 분리하는데 자성(magnetic)입자를 사용하는 것이 US 출원 제4,672,040호(Josephson에 의한 1987년 6월 9일에 출원)에 기재 되어 있다. 이러한 방법이 복잡한 임상 환경에 유용할 수 있지만 진단 결과를 빠르고 효과적으로 필요로하는 진찰실, 진료소 및 기타 상황에서 핵산을 분리할 수 있을 빠르고 간단한 정제방법을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 문제점과 특징을 생각해 볼 때 본 발명은 유리하다.

상기 기술된 문제점은 핵산의 혼합물을 함유하고 있는 생물학적 샘플내에 존재하는 최소한 하나의 일본쇄 타겟 핵산을 정제하는 방법으로써 해결되며 이 방법은 A.불용성 하이브리드(hybrid)를 형성시키기에 적당한 조건하에서 샘플을 타겟 핵산 서열에 상보적인 핵산 단편이 직접 부착되어 있는 비다공성이고 비자기성인 입자로 구성된 정제시약과 접촉시키고, B. 하이브리드를 남아있는 샘플로 부터 분리하는 것으로 구성된다.

또한, 중합효소 연결반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 헥산의 혼합물을 함유하고 있는 생물학적 샘플내 최소한 하나의 일본쇄 타겟 헥산을 증폭시키는 방법은 A. 불용성 하이브리드를 형성시키기에 적당한 조건하에서 샘플을 타겟 헥산 서열에 상보적인 헥산 단편이 직접 부여되어 있는 비다공성이고 비자기성인 입자로 구성된 정제시약과 접촉시키고, B. 하이브리드를 나머지 샘플로 부터 분리하며, C. 불용성 하이브리드의 변성이 일어나거나 일어남없이 중합효소 연결반응을 이용해 문제의 헥산 서열을 증폭시키는 것으로 구성된다.

본 발명은 또한 핵산의 혼합물을 함유하고 있는 생물학적 샘플내에 존재하는 두개의 상보적인 사슬을 갖는 최소한 하나의 타겟 핵산의 검사 방법을 제공하며 이 방법은 A. 샘플내 상보적인 사슬을 변성시키고, B. 불용성 하이브리드를 형성시키기에 적당한 조건하에서 샘플을 타겟 핵산 서열에 상보적인 핵산 단편이 직접 부착되어 있는 비다공성이고 비자기성인 입자로 구성된 정제시약과 접촉시키며, C. 하이브리드를 나머지 샘플로 부터 분리하여 정제된 타겟 핵산을 얻고, D. 이 하이브리드를 변성시켜 타겟 핵산으로 부터 상보적인 불용성 단편을 분리하며, E. 하나의 프라이머가 문제의 핵산 서열에 상보적이고 다른 하나가 타겟 핵산의 다른 사슬에 상보적인 제1 및 제2프라이머를 변성된 타겟 핵산의 샘플과 접속시켜 제1 및 제2프라이머와 상보적인 핵산 사슬의 혼성화 생성물을 얻으며, F.상보체와 분리될 때 프라이머의 증대 생성물 합성에서 주형으로 작용할 수 있는, 혼성화 생성물내 프라이머의 제1 및 제2증대 생성물을 형성시키고, G. 프라이머 증대 생성물이 합성되는 주형으로 부터 프라이머 증대 생성물을 분리하며, H. 분리된 증대 생성물과 타겟 핵산을 부가적인 제1 및 제2프라이머와 접촉시키므로써 특이적인 핵산 서열을 증폭시켜 상보적인 생성물을 형성시키고, I. 프라이머 증대 생성물을 단계 H에서 형성된 상보적인 생성물로 부터 분리시키며, J. 단계 I에서 분리한 최소한 하나의 프라이머 증대 생성물을 이것에 상보적이고 검사를 위해 라벨된 올리고누클레오타이드프로브와 접촉시켜 프라이머 증대 생성물과 프로브의 상보적인 생성물을 형성시키고, K. 샘플내 타겟 핵산의 존재 표시로서 단계 J에서 형성된 상보적인 생성물을 검사하는 것으로 구성된다.

본 발명은 당 업계에 공지되어 있는 다공성이거나 자기성인 입자 또는 기타 복잡한 장치나 시약을 사용함 없이 핵산 혼합물내 원하는 핵산을 정제하는 유리한 방법을 제공한다. 핵산에 대해 친화력에 의한 분리법이 공지되었지만, 지금까지 중합효소 연결반응을 이용해 매우 소량인 타겟 핵산의 증폭을 증가시키기 위해 상기 방법을 이용하지 않았다. 그러므로, 본 발명으로써 이미 매우 유용한 방법이 더욱 바람직하고 민감하도록 되었다. 이러한 바람직한 결과는 적당한 모양과 크기를 지닌 비다공성이고 비자기성인 입자에 직접 부착된 상보적인 핵산 단편으로 구성된 정제시약을 사용해 성취된다.

본 발명은 테스트 샘플내 하나 이상의 타겟 핵산(즉, 미리 알고 있는)을 정제하거나 증폭시키거나 검사하는 것에 관한 것이다. 이러한 샘플로는 검사될 수 있는 유전자 DNA 나 RNA를 함유하고 있는 세포 또는 비루스 물질, 머리카락 체액(body fluids) 또는 기타 물질들이 있다. 주된 정제목적은 주로 나중의 진단 과정을 위한 것이지만, 정제된 핵산은 또한 클로닝(cloning) DNA 나 전령(messenger) RNA 의 효과를 증가시키는데 사용되거나 화학 합성으로 결과되는 핵산 혼합물로 부터 다량의 원하는 핵산을 얻는데 사용될 수 있다. 정제된 타겟 핵산의 기타 용도는 당업계의 숙련자에게 있어 명백하다.

플라즈미드, 어느 소스(source))(박테리아, 효모, 바이러스, 식물 및 고등 동물, 사람같은)로 부터 얻은 천연적으로 존재하는 DNA 또는 RNA를 포함해서 여러가지 소스로 부터 핵산을 얻을 수 있다. 이것들은 공지된 방법을 이용해 혈액, 조직 물질 또는 기타 당 업계에 공지된 소스를 포함해서 여러 조직들로 부터 추출될 수 있다. 본 발명은 특히 게놈(genom) DNA, 박테리아 DNA, 바이러스 RNA 또는 박테리아나 바이러스로 감염된 세포에서 발견된 DNA 나 RNA같이 어느 생물체의 세포나 바이러스에서 발견되는 핵산 서열을 검사하는데 유용하다. 본 발명은 특히 HIV-I이나 기타 레트로바이러스(retroviruse)로 감염된 세포로 부터 프로바이러스 DNA를 검사하는데 유용하다.

바람직한 구체예에서, 정제된 핵산은 포함된 반응 단계의 수에 대해 십의 배수량(exponential quantities)으로 최소한 하나의 특이적인 핵산을 생성시키는 연결반응에 바람직하게 사용된다. 생성물은 사용된 특징 프라이머의 말단에 상응하는 말단을 갖는 별개의 핵산 중복체일 것이다. 어느 핵산 소스가 검사하고자 하는 특이적인 타겟 핵산을 함유한다고 여겨지거나 함유한다면 이것은 출발물질로서 사용될 수 있다. 정제되고 중복될 ＂핵산＂이라함은 단편 또는 전체 핵산을 의미한다. 또한, 하나 이상의 핵산은 각각의 타겟 핵산에 대해 라벨된 프로브, 프라이머 및 정제시약의 특정 세트를 이용해 동시에 정제되고 증폭될 수 있다.

검시될 핵산 단편, 프라이머 또는 프로브에 관해 본원에서 사용된 바와 같이, ＂올리고누클레오타이드＂라함은 두개 이상, 바람직하게 세개 이상의 데옥시리보누클레오타이드나 리보누클레어타이드로 구성된 분자를 의미한다. 정확한 크기는 중요하지 않지만 올리고누클레오타이드의 최종 용도나 작용같은 여러 요소에 따라 달라진다. 올리고누클레오타이드는 합성적으로 또는 클로닝에 의해 유도될 수 있다.

＂프라이머＂라 함은 천연적으로 존재하던 합성적으로 생성됐던, 핵산 사슬에 상보적인 프라이머 증대 생성물을 합성시키는 조건하에 두었을때 합성 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고누클레오타이드를 의미한다. 이러한 조건으로는 적당한 온도와 pH, DNA 중합효소같은 중합 시약 및 누클레오타이드(4개의 표준 데옥시리보누클레오사이드 트리포스페이트 같은)의 존재가 포함된다.

본 발명을 실행하는데 있어, 프라이머, 프로브 및 단편은 실질적으로 타겟핵산의 특이적인 핵산 서열에 상보적이다. ＂실질적으로 상보적＂이라 함은 조화를 이루어 혼성화가 일어날 상보적인 물질상에 충분한 수의 염기들이 있음을 의미한다. 그러나 이것은 모든 염기쌍이 조화를 이룰 것임을 의미하지 않는다.

본 발명에 유용한 정제시약은 타겟 핵산의 최소한 하나의 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 핵산 단편으로 구성된다. 이러한 단편은 타겟과의 적당한 혼성화와 상보성을 제공할 어느 적당한 길이일 수 있다. 일반적으로, 단편의 길이는 최소한 10개의 염기, 바람직하게 약 15-50개의 염기이다. 이러한 단편은 최소한 하나의 타겟 핵산 서열에 맞추어진다. 정제시약의 혼합물을 사용하는 것이 또한 가능하며 각 시약은 특별한 단편을 갖고 있지만 혼합물내 각각의 단편을 타겟 핵산의 같거나 다른 서열과 혼성화할 수 있다. 유용한 단편을 다수의 소스로 부터 얻을 수 있거나 프라이머 제조에 대해 다음에 기술된 것과 같은 장치 및 공지된 방법을 이용해 제조할 수 있다.

상기 핵산 단편은 적당한 방법으로 중합 입자(이후에 기술함)에 직접 부착된다. 화학적 방법이나 물리적 방법(즉, 흡착 또는 공유 반응)으로 부착될 수 있고 누클레오타이드로 부터 지지체로 직접 부착된다. 즉, 입자와 단편사이에 중간 결합물질이 없다. 하나의 구체예에서, 핵산은 중합 입자의 표면에 흡착된다. 그러나, 핵산 단편을 화학적으로 변형시켜 고체 지지체상의 상응하는 반응 그룹에 공유 결합하는 반응그룹을 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 여러 방법들이 당 업계에 공지 되었으며 이러한 것으로는 WO-A-89/02931에 기재된 것이 있다. 이러한 방법에 관해 더 상세한 사항이 다음 실시예 1에 기재되어 있다.

정제시약을 제조하기 위한 유용한 입자는 셀룰로스 물질, 유리, 세라믹, 천연적으로 존재하거나 합성된 중합체, 금속 및 기타 당 업계의 숙련자에게 명백한 것과 같은 어느 적당한 물질로 만들어질 수 있다. 그러나, 이러한 입자는 자성이나 자력을 띠지 않는데 왜냐하면 이것이 중합효소의 활성을 억제할 수 있기 때문이다. 이것은 약 0.3-3㎛의 평균 크기 및 구형, 타원형, 입방형, 불규칙한 형 또는 판형 같이 어느 유용한 형태와 크기일 수 있다.

공유 결합에 대해, 시약을 제조하는데 유리하게 사용된 바람직한 중합 입자는 핵산 단편(변형되거나 변형되지 않은)이 반응할 수 있는 반응 표면 그룹을 갖는다. 유용한 반응그룹으로는 카복시, 아미노, 설프하이드릴, 알데하이드, 활성화된 2-치환에틸설폰일, 비닐설폰일, 활성인 할로겐 원자, 니트로아릴, 에스테르 및 기타 당 업계의 숙련자에게 명백한 것들이 있다. 특히 유용한 그룹으로는 EP-A-0 302 715에 상세히 기술되어 있는 에틸렌성으로 불포화된 중합가능한 단량체의 부분으로서의 활성화된 2-치환 에틸설폰일, 카복시, 에스테르, 활성인 할로겐 원자, 및 비닐설폰일이 있다.

본원에 기술된 정제시약은 타겟 핵산과의 혼성화에 사용되어 핵산을 불용성으로 만들고 나머지 샘플로 부터 분리가능하도록 만든다. 이러한 샘플과 시약과의 접촉은 당 업계에 공지된 혼성화 조건하에서 행해지며 일반적으로 최소한 1분, 적당한 교반, 약 5-9인 pH 및 약 0-75℃의 온도를 필요로 한다. 당 업계의 숙련자는 상기 조건을 최적 혼성화 조건이 되도록 조절할 수 있다. 대표적인 방법이 다음 실시예 1에 기술되어 있다.

혼성화한후에 불용화된 타겟 핵산을 원심분리, 여과, 불용성 매트릭스에 대한 선택적인 흡착, 침전 또는 결합종의 세척같은 적당한 분리방법을 이용해 샘플로 부터 분리하는 것이 보통 바람직하다. 원심분리 또는 여과가 바람직하다.

본 발명의 증폭 및 검사 방법에서, 유용한 프라이머가 다수의 소스로 부터 얻어질 수 있거나 예를 들어 ABI DNA Synthesizer(Applied Biosystems로 부터 입수가능) 또는 Biosearch 8600 시리즈 또는 8800 시리즈 Synthesizer(Milligen-Biosearch, Inc.로 부터 입수가능) 및 이것을 이용하기 위한 공지된 방법같이 공지된 기술과 장치를 이용해 제조될 수 있다. 생물학적 소스로 부터 분리한 천연적으로 존재하는 프라이머 또한 유용하다(예를 들어 제한 엔도누클레아제절단체).

어떤 구체예에서, 상기 검사 방법에 사용한 최소한 하나의 프라이머(또는 이것의 세트)가 특이적인 결합리간드로 라벨된다. ＂라벨된＂이라 함은 리간드가 쉽사리 분리되지 않을 방법으로 상기 프라이머에 결합된다는 사실을 의미한다. 특이적인 결합 리간드는 비오틴이나 이것의 유도체, 아비딘, 스트렙타비딘이나 이것의 유도체, 렉틴, 당, 단백질, 합텐, 약제또는항체나항원 물질같은 면역학적 종류일 수 있다.

본 발명은 두개의 상보적인 사슬을 갖는 정제된 타겟 핵산의 증폭이나 검사에 유용하다. 대부분의 핵산 서열은 DNA에서 발견된 것과 같이 이본쇄이다. 그러나, mRNA같은 일본쇄 핵산 서열이 유사하게 증폭되고 검사될 수 있다.

특이적인 핵산 서열은 주형으로서 이러한 서열을 갖고 있는 핵산을 이용해 생성된다. 핵산이 두개의 사슬을 함유한다면, 분리단계로서 또는 프라이머 증대 생성물의 형성과 동시에 사슬을 분리하는 것(소위, 변성)이 필요하다. 이러한 변성은 당업계에 공지되어 있는 어느 적당한 물리적, 화학적 또는 효소적 방법을 이용해 이루어질 수 있다. 적당한 온도까지 가열하는 것이 바람직한 방법이다.

분리된 사슬이 이용된다면, 부가적인 핵산 사슬의 합성은 두개 이상의 프라이머(이것중 최소한 하나는 상기된 바와 같이 라벨됨)를 이용해 pH가 약 7-9인 수성 완충용액에서 행해질 수 있다. 바람직하게, 몰 과량인 두개의 프라이머가 완충용액에 부가되며 특정한 양이 당 업계에 공지되어 있다.

데옥시리보누클레오사이드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 또한 적당한 양으로 합성 혼합물에 부가하고 결과의 용액을 10분 동안, 바람직하게 약 1-4분 동안 약 90-100℃까지 가열한다. 마그네슘 또는 망간 이온같은 효소 보인자가 또한 트리포스페이트에 대해 몰 과량으로 바람직하게 존재한다.

상기와 같이 가열한 후에, 용액을 바람직하게 상온까지 냉각시키고 트라이머 증대 생성물의 형성을 유도(또는 촉매)하는 적당한 시약을 부가한다. 이러한 유도 시약은 일반적으로 중합체로서 당 업계에 공지되었다. 이러한 생성물을 형성시키는 반응을 공지된 조건(일반적으로 상온 내지 중합이 더 이상 일어나지 않는 온도)하에서 행한다.

중합제는 효소(예를 들어, E.Coli DNA 중합효소 I, T4 DNA 중합효소, Klenow 중합효소, 역전사효소 및 기타 당 업계에 공지된 것)를 포함해서 프라이머 증대 생성물을 합성시키는 작용을 할 어느 화합물 또는 시약들의 결합체일 수 있다. 특히 유용한 효소는 여러가지 Thermus 박테리아종으로 부터 얻은 것과 같이 클론 되거나 천연적으로 존재하며 열에 안정한 효소이다. 기타 중합제가 US-A-4,683,202(상기 기술됨)에 기재되어 있다.

열에 안정한 바람직한 효소는 EP-A-0 258 017(1988년 3월 2일에 공개)에 기재되어 있는 Thermus aquaticus의 DNA 중합효소이다. 이들 중합효소는 일반적으로 분자량이 약 86,000-90,000 달톤이라고 여겨진다. 기타 유용한 효소가 Rossi와 그의 동료 Syst.Appl.Microbiol. 7(2-3), pp. 337-341, 1986에 기재되어 있다.

여러가지 유용한 중합효소는 통상적으로 입수가능하다. 일반적으로, 증대 생성물의 합성은 각각의 프라이머의 3'말단에서 개시되어 합성이 종결될때까지 주형을 따라 5'에서 3'방향으로 진행할 것이다. 어떤 중합제(예를 들어, 역전사 효소)는 주형을 따라 3'에서 5'방향으로 진행할 수 있다.

새롭게 합성된 사슬과 그것의 각각의 프라이머로 구성된 새로 형성된 프라이머 증대 생성물은 본 방법의 계속되는 단계에 사용한 초기의 타겟 사슬과 함께 이본쇄 분자를 형성한다. 다음에 이들 사슬을 상기된 바와 같이 변성에 의해 분리하여 일본쇄분자를 얻으며 이것에 새로운 핵산이 상기와 같이 합성된다. 증폭 과정을 계속 유지시키기 위해 부가적인 시약이 필요하며 이렇게 한 후에 대부분의 증대 생성물은 두개의 프라이머에 의해 결합된 특이적인 핵산 서열(즉, 상보적인 생성물)로 구성될 것이다.

검사하기 위해 요구되는 필요한 양의 특이적인 핵산을 생성하고자 하는 만큼 사슬 분리와 증대 생성물 합성 단계를 반복할 수 있다. 일반적으로 단계 순서를 최소한 1번 바람직하게 최소한 10-50번 반복한다.

하나 이상의 정제된 타겟 핵산을 생성하고자 할 때, 적당한 수의 프라이머 세트를 상기된 일반적인 방법에 사용한다. 최소한 하나의 프라이머 증대 생성물을 생성시킨 후에 본 발명 방법의 어느 과정에서 이 생성물을 검사 가능하도록 라벨한 프로브(이후에 기술됨)와 혼성화시킬 수 있다.

Southern 블럿(blot), 겔 전기영동법, 염색법 및 기타 당 업계에 공지된 것과 같은 여러가지 검사방법이 검사가능한 하이브리드의 존재를 알아보는데 사용될 수 있다.

일반적으로, 필요한 양의 핵산 서열이 생성되고 프라이머 증대 생성물이 마지막으로 분리되면, 첫번째 프라이머 증대 생성물은 검사를 위해 라벨되고 이것에 상보적인 올리고누클레오타이드 프로브와 접촉하여 생성물을 형성한다. 프로브는 타겟 핵산 서열과 상보적인 핵산 서열이다. 프로브는 어느 적당한 길이의 핵산일 수 있지만 바람직하게 이것은 약 15-40핵산이다.

이것은 특정 결합 리간드와 이것의 수용체와의 복합화를 방해하지 않을 어느 적당하고 검사가능한 물질로 라벨된다(보통 5'말단에서). 라벨을 결합시키고 프로브를 제조하는 방법은 Agrawal과 그의 동료 Nucleic Acid Res., 14 pp. 6227-45(1986)에 기재된 것 및 특이적인 결합 리간드를 프라이머에 부착하는 것에 대해 상기 기술된 참고문헌에 기재된 것과 같이 당 업계에 공지되었다. 유용한 라벨로는 방사선동위원소, 전자밀도가 높은 시약, 색원체, 형광발생소, 인광성 부분, 페리틴 및 기타 자성 입자, 화학발광성 부분 및 효소(바람직함)가 있다. 유용한 효소로는 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 우리카제, 알칼리 포스파타제및 기타 당 업계에 공지된 것들이 있다. 이러한 효소에 대한 염료형성 조성물 및 기질이 공지되었다.

특히 바람직한 구체예에서, 라벨은 퍼옥시다제이며 분석중 어느 과정에서 과산화수소 및 적당한 염료형성 조성물을 부가하여 검사가능한 염료를 제공한다. 예를 들어, 유용한 염료제공 시약으로는 테트라메틸벤지딘과 이것의 유도체, 및 트리아릴이미다졸 루코(leuco) 염료(Bruschi에 의해 1978년 5월 16일자에 출원된 US-A-4,089,747)에 기재되어 있음)같은 루코 염료 또는 과산화수소와 퍼옥시다제의 존재에서 반응하여 염료를 제공하는 기타 화합물들이 있다.

상보적인 생성물내에 있는 프로브의 존재를 검사하는 것은 공지된 적당한 검사장치와 방법을 이용해 실행될 수 있다. 흑종의 프로브는 검사장치를 이용함없이 육안으로 관찰할 수 있다. 이것은 또한 적당한 용기내에서 실행될 방법에 유용하다. 가장 크루드(crude)한 용기는 테스트 튜브, 플래스크 또는 비이커이지만 상기 방법을 실행하는 자동화 과정을 돕기위해 더욱 복잡한 용기가 만들어졌다. 본 발명의 방법을 자동화로 사용하거나 단독으로 사용하기 위해 기타 유용한 용기가 적당하게 만들어질 수 있다.

검사될 상보적인 생성물내 프로브를 위해, 상보적인 생성물이 반응 매체내 기타 물질로 부터 분리되는 것이 중요하다. 이러한 것은 본 방법의 어느 과정에서 고체 물질에 부착되거나 부착될 수 있게 되는 프라이머 또는 프로브를 이용하는 것과 같은 적당한 불용화 방법에 의해 행해질 수 있다. 결과의 불용화된 복합생성물은, 여과, 원심분리 또는 기타 적당한 분리 방법에 의해 복합되지 않은 물질로 부터 분리될 수 있다.

특히 유용한 분리 수단은 Pall Corp. 에 의해 시판되는 폴리아미드 막(membrane)(예를 들어 Loprodyne^TM또는 Biodyne^TM막)같은 미세 다공성 여과막이다. 이것은 분석 과정을 촉진하는 계면활성제나 기타 물질로 피복되지 않거나 미리 피복되어 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 막은 첫번째 프라이머 증대 생성물을 포획하기 위해(흡착 또는 공유결합에 의해)막에 부착되어 있는 수용체(receptor) 분자를 가질 수 있다.

이러한 막은 분석의 다른 단계를 실행하는데 적당한 용기와 함께 분리 기판으로서 사용될 수 있다. 그러나 바람직하게, 이것은 테스트 장치의 일부분으로서 끼워진다. US-A-3, 825, 410(Bagshewe에 의해 1974년 7월 23일에 출원), US-A-3,888,629(Bagshawe에 의해 1975년 6월 10일에 출원), US-A-3,970,429(Updike에 의해 1976년 7월 20일에 출원) 및 US-A-4,446,232(Liotta에 의해 1984년 5월 1일에 출원)에 기재되어 있는 것을 포함해서 여러 테스트 장치가 당 업계에 공지되어 있다. 특히 유용한 장치가 EP-A-0 308 231(1989년 3월 22일에 공개)에 기재되어 있다.

본원에 기술된 방법은 암같은 세포장해, 유전적 장해 또는 전염병과 관련된 특이적인 핵산 서열을 검사하거나 특징화하는데 사용될 수 있다. 이것은 또한 법의학적인 조사 및 DNA타이핑에 사용될 수 있다. 본 발명의 목적에 대해, 유전병으로는 겸상적혈구(sickle cell) 빈혈, 낭포성 섬유증, α-지중해빈혈, β-지중해빈혈 및 기타 당 업계의 전문가에게 명백한 것들과 같이 어느 생물체의 게놈 DNA에 있어서의 특이적인 결실이나 돌연변이가 포함된다. 여러가지 전염병은 미생물이 효모, 박테리아 또는 바이러스인 것에 상관없이 이것들을 특징짓는 소량의 특이적인 DNA 서열이 임상 샘플내에 존재하므로써 진단될 수 있다.

검사될 수 있는 이러한 박테리아로는 Salmonella, Chlamydia, Gonorrhea, Shigella 및 Listeria가 있지만 이것에 제한되지 않는다. 검사될 수 있는 바이러스로는 HTLV-1과 HIV-I 같은 레트로바이러스, 허피스, 시토메갈로바이러스, 엡스타인 바(Epstein-Barr)바이러스 및 간염이 포함되지만 이것에 제한되지 않는다. 원생동물 기생체, 효모 및 곰팡이가 또한 검사될 수 있다. 기타 검사가능한 종류가 당 업계의 숙련자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특히 테스트 샘플내 HIV-I 같은 레트로바이러스의 존재를 검사하는데 유용하다.

다음 실시예는 본 발명의 실행을 설명하지만 어느 방법으로도 본 발명을 제한하지 않는다.

[실시예 1]

정제용 시약의 제조 및 사용

표준 방법을 이용해 제조된 중합 라텍스 입자 및 사람의 백혈구항원(HLA)DNA, 2형 및 3형 부분에 상보적이고 다음 서열을 갖는 핵산 단편을 사용해 본 발명을 실행하는데 유용한 정제용 시약을 제조했다.

5'-X-CCTCTGTTCCACAGACTTAGATTTG-3'

서열중, X는 WO-A-89/02931에 기재된 바와 같이 제조된 에틸렌 글리콜 스페이서 암(spacer arm)을 통해 올리고누클레오타이드에 결합된 유리(free) 아미노 그룹임.

[재료 ]

라텍스 입자(2.9% 고체)는 폴리(스티렌-코-아크릴산)(90 : 10의 몰비율)으로 구성되었다. 메틸이미다졸 완충제(0.2몰, pH 6)는 과염소산을 부가함에 의해 pH 6으로 조절되었다. SSPE 완충용액(2%)은 1리터 물내의 43.5g 염화나트륨, 0.276g의 인산나트륨 및 0.074g의 에틸렌디아민테트라아세트산으로 구성되며 pH가 7.4로 조절되었다. 유리 증류수(glass-distilled water)(40 OD/ml)내 5'-아미노올리고누클레오타이드(200몰)의 용액을 사용했다. EDC 시약은 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카조디이미드하이드로클로라이드이다.

[과정]

라텍스 용액(1ml, 29mg 비드(bead))을 원심분리(13, 000X에서 2.5분)시켜 상등액을 제거했다. 다음에 비드를 강력한 와동에 의해 유리 증류수(1ml)에 재현탁시켰다. 혼합물을 다시 원심분리시키고 상등액을 제거했다. 비드를 메틸이미다졸 완충액(1ml)으로 한번 세척하고 완충액을 원심분리로 제거하며 비드를 동일한 완충액(0.5ml)에 재현탁시켰다. 이 비드 용액에다 5'-아미노올리고누클레오타이드 프로브(25㎕의 스톡 용액 또는 약 5000pmoles)를 부가하고 결과의 용액을 잘 혼합시켰다. 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카토디이미드 하이드로클로라이드 시약(15mg)을 상기 용액에 부가했다. 와동으로 강력히 혼합한 후에, 반응 혼합물을 최소한 2시간(보통15시간)동안 가끔씩 혼합시키면서 20-25℃에 두었다.

우선 원심분리로 상등액을 제거하고 연속해서 비드를 원심분리에 의해 다음 완충용액으로 세척하며 용액들간의 상등액을 피펫으로 제거했다.

a.1ml 유리 증류수로 한번,

b.SSPE 완충용액으로 한번,

c.인산염 완충 염류 용액으로 한번, 및

d.유리 증류수로 두번.

마지막 처리후에, 비드를 920㎕의 최종 부피가 되도록 유리 증류수에 재현탁시켜 3% 비드 현탁액을 만들고 4℃로 유지 시켰다.

[실시예 2]

[HLA DNA의 증폭 및 검사 방법]

본 실시예는 정제된 타겟 HLA DNA의 증폭 및 검사를 설명한다.

크루드 완전혈액 샘플(100㎕)을 비등시키고 원심분리시키며 상등액을 제거하여 크루드 완전혈액 용해질을 제조하였다. 크루드 용해질의 부분(5㎕)를 95℃에서 5분간 각각 열변성시킨 다음 Triton^TMX-100 비이온성 계면활성제(0.02중량%) 및 완충용액의 샘플(40㎕)에 부가하여 테스트 샘플을 얻었다.

[정제과정]

실시예 1에서 사용한 정제용 시약(물내 2중량%로 2㎕)을 상기 기술된 테스트 샘플에 부가하고 결과의 혼합물을 교반하면서 55℃에서 30분간 인큐베이트시켰다. 다음에 혼합물을 14000rpm에서 1분간 원심분리시키고 상등액을 제거했다. 결과의 펠릿(pellet)을 SSPE 완충용액과 Triton^TMX-100 비이온성 계면활성제(0.02중량%)의 용액(50㎕)에 재현탁시키고 55℃까지 가열시키며 다시 원심분리시켰다. 이러한 과정을 두 번이상 반복하여 정제시약과 혼성화될 정제된 핵산을 얻었다.

다음에 결과의 펠릿을 염화칼륨(50mmole), 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄 완충제(10mmole, pH 8), 젤라틴(0.1mg/ml), 염화마그네슘(2.5mmole), HLA 프라이머(- 및 +, 각각 0.2μmole) 및 dNTP's(각각 0.67mmole)로 된 용액(100㎕)에 현탁시켰다.

HLA DNA 프라이머는 다음 서열을 가졌다.

(+) 5'-X-GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG-3'

(-) 5＂-X-CGGATCCGGTAGCAGCGGTYAGAGTTG-3'

서열중, X는 WO-A-89/02931에 기술되어 있는 방법에 의해 프라이머에 결합되어 제조된 비오틴테트라에틸렌글리콜 린커(linker)이다.

5분간 95℃까지 가열한 다음 빠르게 원심분리시키고 상등액을 수집함에 의해 미리 알고 있는 핵산을 정제시약으로 부터 탈혼성화시켰다.

[타겟 핵산의 증폭]

상기 상등액을 통상적으로 입수가능한 Thermus aquaticrs로 부터 분리한 DNA 중합효소(4 I.U./㎕를 함유하는 약 1㎕)와 혼합시키고 다음과 같은 연속적, 싸이클을 30번 행하여 증폭시켰다.

[표 1]

증폭후에, 탈혼성화된 생성물을 4% 아가로스를 이용한 겔전기영동법 다음에 에타듐 브로마이드 염색법에 의해 관찰하였다. 결과로서 미리 알고 있는 핵산이 정제시약을 이용해 특이적으로 정제되고 크루드 용해질로 부터 제거되며 증폭이 성공적으로 행해졌음을 알았다.

[실시예 3]

[사람의 β-글로빈 검사방법]

본 실시예는 실시예 2와 유사하지만 사람의 β-글로빈 DNA를 정제하고 검사하기 위한 본 발명의 실행을 설명한다. 크루드 완전혈액 용해질을 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조했다.

표면 알데하이드 그룹을 갖는 중합입자를 이용해 정제용 시약을 제조했다. 다음 단계들을 이용해 상기 입자를 제조할 수 있다. 2-니트로프로판(12.5ml), 폴리(스티렌-코-비닐벤질클로라이드)(70 : 30의 몰비율)의 수성 현탁액(3.5% 고체) 및 메탄올내 0.5몰 소듐 메톡사이드 250ml의 혼합물을 2시간 동안 환류시킨 다음 여과시켰다. 여과기상의 입자를 메탄올로 세척하고 건조시키며 최소 부피의 피리딘으로 재팽창시켜 물에 재현탁하였다.

사람의 타겟 β-글로빈 DNA에 상보적이고 다음 서열을 갖는 핵산 단편을 사용했다.

5'-X-CTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3'

서열중, X는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 에틸렌글리콜 스페이서 암을 통해 결합된 유리 아미노 그룹이다.

입자상의 알데하이드 그룹과 아미노올리고누클레오타이드를 US-A-4, 587, 046(Goodman과 그의 동료에 의한 1986년 5월 6일자 출원)에 기재되어 있는 방법을 이용해 결합시켰다.

사람의 β-글로빈 DNA 프라이머 두개를 사용하는 것외에, 실시예 2의 두개의 HLA DNA 프라이머(0.2μmole)을 대조물로서 부가했던 것을 제외하고 실시예 2의 정제방법과 증폭방법을 행하였다.

사람의 β-글로빈 DNA 프라이머는 다음 서열을 가졌다.

(+) 5'-X-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3'

(-) 5'-X-CAACTTCATCCACGTTGACC-3'

서열중, X는 WO-A-89/02931(상기됨)에 기재된 바와 같이 결합되어 제조된 비오틴테트라에틸렌 글리콜스페이서 암임

결과로써 사람의 β-글로빈 DNA 타겟이 성공적으로 크루드 용해질로 부터 제거되고 증폭되며 에타듐 브로마이드를 이용해 검사되었음을 알았다. HLA DNA는 본 실시예에서 증폭되지 않거나 검사되지 않았다. 본 발명은 바람직한 구체예에 관한 특별한 언급과 함께 상세히 기술되었지만 여러 변형이 본 발명의 범위내에서 실행될 수 있음이 이해될 것이다.

Claims

A.불용성 하이브리드(hybrid)를 형성시키기에 적당한 조건하에서 샘플을타겟 핵산 서열에 상보적인 핵산 단편이 직접 부착되어있는 비다공성이고 비자기성인 입자로 구성된 정제시약과 접촉시키고, B.하이브리드를 남아있는 샘플로 터 분리하는 것으로 구성되는, 핵산의 혼합물을 함유하고 있는 생물학적 샘플내에 존재하는 최소한 하나의 일본쇄 타겟 핵산을 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플이 완전혈액 용해질인 방법.
제1항에 있어서, 증폭을 위해 하나 이상의 일본쇄 타겟 핵산을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 프로바이러스 DNA인 방법.
제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 HIV-I 프로바이러스 DNA인 방법.
제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 사람의 백혈구항원(HLA) DNA인 방법.
제1항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 사람의 β-글로빈 DNA인 방법.
제7항에 있어서, 상기 분리하는 것이 여과에 의해 행해지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 불용성 하이브리드를 변성시키고, 상기 정제시약을 상기 타겟 핵산으로 부터 분리하는 단계로 더 구성되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 접촉단계 A전에, 상기 샘플내 어느 세포를 용해시키고 상보적인 핵산 사슬을 변성시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정제시약이 상기 핵산 단편과 공유결합될 복시, 활성인 할로겐원자, 비닐설포닐, 또는 활성화된 2-치환 에틸설포닐 그룹을 갖는 중합입자로 부터 제조되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산 단편이 상기 입자에 흡착되는 방법.
A.불용성 하이브리드를 형성시키기에 적당한 조건하에서 샘플을 타겟 핵산 서열에 상보적인 핵산 단편이 직접 부착되어 있는 비다공성이고 비자기성인 입자로 구성된 정제시약과 접촉시키고, B.상기 하이브리드를 나머지 샘플로 부터 분리하며, C.상기 불용성 하이브리드의 변성이 일어나거나 일어남 없이 중합효소 연결반응을 이용해 상기 핵산 서열을 증폭시키는 것으로 구성되는, 중합효소 연결반응을 이용하여 핵산의 혼합물을 함유하고 있는 생물학적 샘플내 최소한 하나의 일본쇄 타겟 핵산을 증폭시키는 방법.
제13항에 있어서, 상기 불용성 하이브리드가 변성되고 상기 정제시약이 단계 C전에 상기 타겟 핵산으로 부터 분리되는 방법.
제13항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 완전혈액 용해질인 방법.
제13항에 있어서, 접촉단계 A전에 상기 샘플내 어느 세포가 용해되고 상보적인 핵산 사슬이 변성되는 방법.
제13항에 있어서, 상기 정제시약이 상기 핵산 단편과 공유결합될 카복시, 활성인 할로겐원자, 비닐설포닐 또는 활성화된 2-치환 에틸설포닐 그룹을 갖는 중합입자로 부터 제조되는 방법.
A.샘플내의 상보적인 사슬을 변성시키고, B.불용성 하이브리드를 형성시키기에 적당한 조건하에서 상기 샘플을 타겟 핵산 서열에 상보적인 핵산 단편이 직접 부착되어 있는 비다공성이고 비자기성인 입자로 구성된 정제시약과 접촉시키며, C.상기 하이브리드를 나머지 샘플로 부터 분리하여 정제된 타겟 핵산을 얻고, D.상기 하이브리드를 변성시켜 상기 타겟 핵산으로 부터 상기 상보적인 불용성 단편을 분리하며, E.하나의 프라이머가 상기 문제의 핵산 서열에 상보적이고 다른 하나가 타겟 핵산의 다른 사슬에 상보적인 제1 및 제2프라이머를 상기 변성된 타겟 핵산의 샘플과 접촉시켜 제1 및 제2프라이머와 상기 상보적인 핵산 사슬의 혼성화 생성물을 형성시키며, F.상보체와 분리될 때 상기 프라이머의 증대 생성물 합성에서 주형으로 작용할 수 있는, 상기 혼성화 생성물내 상기 프라이머의 제1 및 제2증대 생성물을 형성시키고, G.상기 프라이머 증대 생성물이 합성된 주형으로 부터 프라이머 증대 생성물을 분리하며, H.분리된 증대 생성물과 타겟 핵산을 부가적인 제1 및 제2프라이머와 접촉시킴으로써 상기 특이적인 핵산 서열을 증폭시켜 상보적인 생성물을 형성시키고, I.프라이머 증대 생성물을 단계 H에서 형성된 상보적인 생성물로 부터 분리시키며, J.단계 I에서 분리한 최소한 하나의 프라이머 증대 생성물을 이것에 상보적이고 검사를 위해 라벨된 올리고누클레오타이드프로브와 접촉시켜 상기 프라이머 증대 생성물과 프로브의 상보적인 생성물을 형성시키고, K.샘플내 타겟 핵산의 존재 표시로서 단계J에서 형성된 상보적인 생성물을 검사하는 것으로 구성되는, 핵산의 혼합물을 함유하고 있는 생물학적 샘플내에 존재하는 두개의 상보적인 사슬을 갖는 최소한 하나의 타겟 핵산을 검사하는 방법.
제18항에 있어서, 완전혈액이나 혈청을 함유하고 있는 생물학적 샘플내의 HIV-I 프로바이러스 DNA를 검사하는 방법.
제18항에 있어서, 단계 H와 I가 최소한 한번 반복되는 방법.