JPH0341087A - 核酸の増幅および検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物学的被検体中での所定の核酸の精製方法
に関し、また、精製した核酸の増幅ならびに分析手段に
よるその検出方法にも関する。この発明は研究および商
業的な精製ならびに診断方法で使用することができる。

〔従来の技術〕

生化学、分子生物学、遺伝子工学および各種の診断方法
の進歩には、しばしば核酸を精製分離するための迅速で
単純な技法が必要とされる。例えば、遺伝子工学では多
種多様な核酸の複雑な混合物から純粋な核酸セグメント
を入手しうろことがしばしば必要になる。特定の感染性
疾患では、標的ＤＮＡやそれらの断片が低濃度で存在す
るので検出前に精製が必要となるかも知れない。一般Ｋ
、単一の核酸は核酸配列、分子量、大きさおよび形状に
より特徴付けられている。

試験試料中に極めて少量存在する各種の疾病、生物体ま
たは遺伝的特徴の検出について、核酸プローブ技術の有
用性を研究者が見い出すにつれ、その技術は近年急速に
進歩してきた。プローブの使用は相補性概念に基礎をお
いている。例えば、Ｄ　Ｎ　Ａは二本鎖であり、これら
の鎖は相補的ヌクレオチド（また、ヌクレオチド対とし
ても知られる）間で水素結合によって相互にパインディ
ングされる。

ＤＮＡ複合体は、一般に安定であるが、水素結合を崩壊
する条件下で分離（または変性）することができる。分
離した一本鎖は、相補的なヌクレオチド配列を有する他
の鎖とのみ再会合しろる。

このハイブリダイゼーション法は、溶液中または固体材
料上で生じつる。一般Ｋ、ＲＮＡは一本鎖である。それ
もまた、相補的なヌクレオチド配列を有する他の鎮また
はその一部分とハイブリッドしつる。

標的生物体または細胞のＤＮＡまたはＲＮＡの標的核酸
配列は、全体の鎖中で小さな部分に限られる場合がある
ので、殆どの既知の標識したプローブを使用してその存
在を検出することは非常に困難である。この課題を解決
するために行われてきた多くの研究は、プローブの感度
の改良と核酸の合成を含む。

当該技術分野の顕著な進歩は、米国特許第４、６８３．
２０２号明細書に記載された方法にみられる。

その方法に関して広範囲にわたる詳細な説明はなされて
いないが、それは、重合試薬（例えば、ボリメラーゼ）
および４種のヌクレオチド三リン酸ならびにプライマー
から形成されたエクステンション生成物の存在下で核酸
の鋳型にプライマーをハイブリッド化する増幅技術であ
る。これらの生成物は、変性されそしてそれらのその後
の検出を容易にする目的で多種多量に存在する核酸を増
幅する周期的な反応において鋳型として使用されている
。ムリス（Ｍｕｆｔｉｓ）の増幅手順は、少量の標的核
酸配列から多量の検出可能な物質を生成するためにでき
るだけ長時間かけて周期的に実施される可能性がある。

前述の増幅方法は高感度であるとはいえ、多くの場合に
生物学的被検体における目的のＤＮＡ物′物量Ｘ量めて
少量である。非特異的な核酸または細胞砕片に由来する
無視できないバックグランドがアッセイ感度を低下する
可能性がある。相当な労力や時間をかけることなくかか
る物質を除去することはいまだ可能でないかも知れず、
もしそうであればアッセイは遅くなり、そして目的の診
断および処置もまた遅くなる。

不要な細胞砕片と核酸を除去して所定の核酸の増幅およ
び検出を促進するには、プリン（Ｂｌｉｎ）ら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　３．２３０３〜２３
０８ページ（１９７６）、マル−ｒ−（Ｍａｒｍａｒ）
、　Ｊ８Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、、　３．２０８〜２１８ペ
ージ（１９６１）、ビーポイン（Ｂｉｒｎｂｏｉｎ）ら
、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、７．１５１３〜１
５２３ページ（１９７９）、ボウチル（Ｂｏｗｔｅｌｌ
）、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１６２．４６３〜
４５６ページ（１９８７）、ベジー（Ｂｅｊｉ）ら、Ａ
ｎａｌ、　８ｉｏｃｈｅｍ、　。

１６２、１８〜３２（１９８７）、ブッホネ（８ｕｆｆ
ｏｎｅ）　　ら、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、、　３１．１ｆ
３４〜１６５（１９８５＞およびその他は多すぎて列挙
できない、に記載されるものを包含する各種の既知の方
法のいずれかを使用できるかも知れない。

米国特許第４．６７２．０４０号明細書は、被検体中の
他の物質からの分子、高分子または核酸の分離に磁性粒
子の使用を記載する。

〔発明が解決しようとする課題〕

米国特許第４．６７２．０４０号の方法は、極めて精巧
な臨床的環境では使用可能であるかも知れないけれども
、診断結果の迅速性と効率性が望まれる個人病院、診療
所およびその他の状況下で核酸の分離を可能にする迅速
で単純な精製方法を手にすることは好ましいであろう。

本発明が有利であるのはこのような課題と特徴が考慮に
入れられる。

〔課題を解決するための手段〕

前述の課題は、核酸混合物を含有することが予測される
生物学的被検体中に存在する少なくとも１種の一本鎖標
的核酸の精製方法であって、Ａ、不溶性ハイブリッドを
形成するのに適する条件下で標的核酸の核酸配列と相補
的な核酸断片が直結した非多孔質で非磁性の粒子を含ん
でなる精製試薬と前記被検体を接触する工程、およびＢ
、その被検体の残りのものから前記ハイブリッドを分離
する工程、からなる方法によって解決される。

さらＫ、ポリメラーゼチェーン反応を使用する核酸混合
物を含有することが予測される生物学的被検体中の少な
くとも１種の一本鎖標的核酸の増幅方法であって、 Ａ、不溶性ハイブリッドを形成するのに適する条件下で
標的核酸の核酸配列に相補的な核酸断片が直結した非多
孔質で非磁性の粒子を含んでなる精製試薬と前記被検体
を接触する工程、Ｂ、その被検体の残りのものから前記
ハイブリッドを分離する工程、および Ｃ１前記不溶性のハイブリッドから変性または変性する
ことなくポリメラーゼチェーン反応を使用して目的の核
酸配列を増幅する工程、からなる方法によっても解決さ
れる。

この発明はまた、核酸混合物を含有することが予測され
る生物学的被検体中に存在する２つの相補鎖を有する標
的核酸少なくとも１つの検出方法であって、 Ａ、被検体中の前記相補鎖を変性する工程、Ｂ、不溶性
ハイブリッドを形成するのに適する条件下で標的核酸の
核酸配列に相補的な核酸断片が直結した非多孔質で非磁
性の粒子を含んでなる精製試薬と前記被検体を接触する
工程、Ｃ，Ｍ製した標的核酸を供給するためＫ、前記被
検体の残りのものから前記ハイブリッドを分離する工程
、 Ｄ、そのハイブリッドを変性して前記標的核酸から不溶
性の相補的断片を分離する工程、Ｅ、一つが目的の核酸
配列に相補的であり、もう一つが標的核酸の他の鎖と相
補的である第一および第二プライマーと前記変性した標
的核酸サンプルを接触してその第一および第二プライマ
ーと前記相補的核酸鎖のハイブリッド生成物を形成する
工程、 Ｆ、前記プライマー類の第一エクステンションと第二エ
クステンションがそれらの相補体（ｃｏｍｐｌｅ−ｍｅ
ｎｔ）から分離された場合にそれらのプライマーのエク
ステンション生成物の合成のための鋳型として役立ちう
る前記第一および第二プライマーの第一および第二エク
ステンションを前記ハイブリッド生成物中で形成する工
程、 Ｇ、鋳型上で合成された前記プライマー・エクステンシ
ョンをその鋳型から分離する工程、Ｈ２追加の第一およ
び第二プライマーを前記分離したエクステンション生成
物および標的核酸と接触して、相補的生成物を形成する
ための特異的核酸配列の増幅をもたらす工程、 Ｉ、工程Ｈで形成された相補的生成物がら前記プライマ
ー・エクステンション生成物類を分離する工程、 Ｊ、工程Ｉで分離されたプライマー・エクステンション
少なくとも１つを、検出のために標識されそれに相補的
であるオリゴヌクレオチドプローブと接触して、そのプ
ローブおよびプライマー・エクステンション生成物の相
補的生成物を形成する工程、ならびに Ｋ、被検体中の標的核酸の存在の指標として工程Ｊで形
成された相補的生成物を検出する工程、からなる方法を
も提供する。

以下、本発明をより具体的に説明する。

本発明は、試験検体中の１種以上の標的（すなわち、所
定）の核酸の精製、増幅または検出に向けられる。これ
らのサンプルとしては、細胞質物質、ウィルス体、毛、
体液または検出することのできる遺伝子ＤＮＡまたはＲ
ＮＡを含むその他の材料を挙げることができる。精製の
主目的は主にその後の診断方法に向けられるであろうが
、精製した核酸はＤＮＡまたはメツセンジャーＲＮＡの
クローニング効率を向上し、あるいは化学反応で得られ
る核酸混合物から多量の目的の核酸を得る目的にも使用
することができる。精製した標的核酸の他の用途は、当
業者にとって極めて明らかであろう。

核酸は、プラスミド、いずれかの起源（例えば、細菌、
酵母、ウィルス、植物および高等動物、ヒト）に由来す
る天然のＤＮＡまたはＲＮＡから得ることができる。こ
れらは、血液、組織材料または当該技術分野で既知の他
の起源を含む多様な組織から既知の方法を使用して抽出
することが可能である。本発明は、ウィルスまたはいず
れかの生物体細胞に見られる核酸配列、例えば、細菌Ｄ
ＮＡ１ウイルスＲＮＡまたは細菌もしくはウィルス感染
細胞に見られるＤＮＡもしくはＲＮＡの検出に特に有用
である。この発明は、ＨＩＶ−Ｉまたは他のレトロウィ
ルスが感染した細胞由来のＤＮＡの検出に特に有用であ
る。

好ましい態様では、精製した核酸を関連する反応段階の
数に指数的な量で比例するように少なくとも１種の特異
的な核酸を生産するチェーン反応で使用することが望ま
しい。この生成物は、使用される特異的プライマーの末
端に対応する複数の末端を有する個別的な核酸複製物で
あろう。それを提供する出発原料としてどのような核酸
源も使用することができ、検出のための標的となる特異
的核酸を含むかまたは含有することが予測される。

精製されそして複製される「核酸」とは、断片または完
全な核酸を意味する。さらＫ、１種以上の核酸は、各標
的核酸に対して特異的な一組の精製試薬、プライマーお
よび標識したプローブ（後述する）を使用することによ
り同時に精製し増幅することができる。

検出されるプライマー、プローブまたは核酸断片に関し
て本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」の語は、
２個以上の、好ましくは３個より多くのデオキシリボヌ
クレオチドまたはりボヌクレオチドをいう。限定される
ものでないが、正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの
最終的な用途または機能を含む多くの因子により左右さ
れる。

オリゴヌクレオチドは、合成的にまたはクローニングに
よって誘導されうる。

「プライマー」の語は、核酸鎖が相補的なプライマー・
エクステンション生成物の台底を誘発する条件下におか
れたとき、合成開始点として機能することができる天然
または合成的に生成されたオリゴヌクレオチドをいう。

かかる条件には、ヌクレオチド（例えば、４種の標準的
なデオキシリボヌクレオシド三リン酸）およびＤＮＡポ
リメラーゼのような重合試薬ならびに適当な温度および
ｐＨが含まれる。

この発明の実施に際して、プライマー、プローブおよび
断片は、標的核酸の特異的核酸配列に実質的に相補的で
ある。「実質的に相補的」とは、相補的材料上にハイブ
リダイゼーションが起こりうるようにマツチする十分な
数の塩基が存在することを意味する。しかしながら、す
べての塩基対がマツチすることを意味しない。

この発明で有用な精製試薬は、標的核酸の核酸配列少な
くとも１つに実質的に相補的である核酸断片を含んでな
る。この断片は、標的と適当な相補性およびハイブリダ
イゼーションを供給しろるいずれかの適当な長さを有す
ることができる。−般的Ｋ、断片の長さは少なくともＩ
Ｏ塩基、好ましくは１５〜５０塩基である。これらの断
片は標的核酸の少なくとも一つの配列に適合する。また
、各試薬が特殊な断片を有する精製試薬の混合物を有す
ることも可能であるが、混合状態にある各断片は同一ま
たは相違する標的核酸がハイブリダイズしうるものであ
る。有用な断片は、プライマーの調製について後述する
ような既知の技術および装置を使用して各種の起源から
得るかまたは調製することができる。

ここに記載した核酸断片はポリマー粒子（後述）に適当
な手段で直接結合される。結合は化学的または物理的手
段（すなわち、吸着または共有結合）で形成され、ヌク
レオチドから支持体へと直接的である。すなわち、粒子
と断片との間には全く中間的な連結材料が存在しない。

−の態様では、ポリマー粒子表面に核酸が吸着されてい
る。しかしながら、固体支持体上の対応する反応性基と
共有結合する反応性基を供給するために核酸断片を化学
的に変性することが好ましい。このような方法の多くは
当該技術分野で知られており、国際公開ＷＯ−＾−８９
１０２９３１号公報に記載されるものが挙げられる。こ
の方法についてより詳しくは、下記の例１で示される。

精製試薬を調製するのに有用な粒子は、セルロース系材
料、ガラス、セラミック、天然ポリマー合成ポリマー、
金属および当業者に容易に明らかとなる他の材料を包含
するいずれかの適当な材料で調製することができる。し
かしながら、これらはポリメラーゼ活性を阻害するかも
知れないがら磁気または磁化しうるものでない。これら
は、球体、楕円体、立方体、不定形体、平面形を包含す
る形状および平均サイズ０．３〜３力を有する大きさの
いずれであってもよい。

精製試薬を調製するに際して有利に使用される共有結合
にとって好ましいポリマー粒子は、断片（変性または未
変性）が反応しろる反応性表面基を有する。一般的な反
応性基としては、カルボキシ、アミノ、スルフヒドリル
、アルデヒド、活性化２−置換エチルスルホニル、ビニ
ルスルホニル、活性ハロゲン原子、ニドロアリール、エ
ステルおよび当業者に自明の他の基が挙げられる。特に
有用な基としては、ヨーロッパ特許公開第０３０２７１
５号公報に詳細に記載されたエチレン系不飽和ポリメリ
ゼーション可能なモノマーの一部のようなカルボキシ、
エステル、活性ハロゲン原子、ビニルスルホニルおよび
活性化２−置換エチルスルホニルが挙げられる。

本明細書で記載される精製試薬は、標的核酸とのハイブ
リッド化に使用され、こうして核酸を不溶化し、被検体
の残りのものから分離可能となる。

この被検体と試薬の接触は、当該技術分野で周知のハイ
ブリダイゼーション条件下で行われ、一般Ｋ、少なくと
も１分、緩和な撹拌、ｐＨ範囲５〜９および０〜７５℃
の温度を必要とする。当業者は、最適ハイブリダイゼー
ションのための条件を調整することができる。代表的な
手順は、下記例１に記載される。

ハイブリダイゼーション後、一般Ｋ、適当な分離手段、
例えば遠心、濾過、不溶性マトリックスへの選択的吸着
、沈降または結合種の洗浄により被検体から不溶化標的
核酸を分離することが望ましい。遠心または濾過が好ま
しい。

この発明の増幅および検出方法で有用なプライマーは、
数多くの供給先から入手するかあるいは、例えばＡ８１
　［ＩＮＡシンセサイザー（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）
（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能
）またはバイオサーチ（Ｂ　１ｏｓｅａｒｃｈ）　８６
００　シリーズもしくは８８００シリーズ・シンセサイ
ザー（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ。

Ｉｎｃ、より入手可能〉およびこれらを使用するための
既知の方法、を包含する既知の方法および装置を使用し
て調製することができる。生物起源から単離された天然
産のプライマー（制限エンドヌクレアーゼ消化物〉もま
た利用可能である。

ある態様では、検出に使用されるプライマー類（または
それらのセット）の少なくとも１つは、特異的パインデ
イングリガントによって標識される。「標識した（され
る）」の語は、簡単に脱離しないような状態でリガンド
が前記プライマーに結合されていることを意味する。特
異的パインデイングリガントとしては、ビオチンもしく
はその誘導体、アビジン、ストレプトアビジンもしくは
その誘導体、レクチン、糖、蛋白質、ハブテン、薬剤ま
たは免疫学釣橋（例えば、抗体もしくは抗原物質〉を挙
げることができる。

本発明は、２つの相補的な鎖を有する標的精製核酸の増
幅および検出に利用できる。既に興味を喚起した殆どの
核酸配列が、ＤＮＡに見られるように二本鎖である。し
かしながら、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸配列も、同様
に増幅および検出することができる。

特定の核酸配列は、鋳型としてその配列を含有する核酸
を使用して調製される。その酸が２つの鎖を含む場合に
は、プライマー・エクステンション生成物の形成と別の
段階かまたは同時にその鎖を分離すること（いわゆる、
脱ハイブリダイゼーションまたは変性）が必要である。

変性は、従来技術文献に記載されているような、いずれ
かの適当な物理的、化学的または酵素的手段を使用して
行うことができる。適当な温度に加熱することが好まし
い方法である。

使用目的の分離した鎖が入手可能になったならば、追加
の核酸鎖の合或はｐＨ７〜９に緩衝化した水性溶液中で
２種以上のプライマー（少なくとも１つは前述のように
標識されている）を使用して実施することができる。好
ましくは２種のプライマーの過剰モル量が緩衝液に添加
され、具体的な量は従来技術文献に示されている。また
、適当量のデオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ
　、　ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰが合成混合物に添加され、得ｅ
れた溶液は、１０分未満、好ましくは１〜４分間９０〜
１００℃に加熱される。酵素補因子、例えばマグネシウ
ムまたはマンガンイオンを前記三リン酸に対して過剰モ
ル量存在させることが好ましい。この加熱後、前記溶液
は、好ましくは室温まで冷却され、次いでプライマー・
エクステンション生成物の形成を誘導（または促進）す
るための適当な試薬が導入される。これに含まれる誘導
試薬は、当該技術分野で重合試薬として一般に知れてい
る。

これらの生成物を調製するための反応は、既知の条件下
（一般Ｋ、室温からもはや重合が起こらなくなる温度ま
での間）で行われる。

重合試薬は、プライマー・エクステンション生成物の合
成を達成する機能を有するいずれかの化合物または試薬
類の組み合わせであってよく、酵素（例えば、大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼ１１Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、フレ
ノウポリメラーゼ、逆転写酵素および当該技術分野で既
知の他のもの）が含まれる。特に有用な酵素としては、
クローンまたは天然源の熱安定性酵素、例えば、各種サ
ーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌に由来するものが挙げ
られる。他の重合試薬は、米国特許第４．６８３．２０
２号明細帯に記載されている。

好ましい熱安定性酵素としては、ヨーロッパ特許公開第
２５８０１７号公報に記載されるようなサーマス・アク
アティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）に
由来するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。他の利用可
能な酵素は、Ｒｏｓｓｉ　　らの５ｙｓｔ、　Ａｐｐｌ
、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

７（２〜３）、　３３７〜３４１ページ、１９８６に公
表されている。数多くの利用可能な酵素が市販されてい
る。一般Ｋ、エクステンション生成物の合或は、各プラ
イマーの３′末端で開始し、合成が停止するまで鋳型に
沿って５’−３’方向に進められる。

いくつかの重合試薬（例えば、逆転写酵素）は、鋳型に
沿って３′から５′の方向に進めるであろう。

新たに合成した鎖とそれらの個々のプライマー類を含む
新たに形成したプライマー・エクステンション生成物は
、その方法の次の工程で使用される最初の標的鎮を有す
る二本鎖分子を形成する。

次Ｋ、これらの鎖は前述のような変性によって分離され
て一本鎖分子とされ、その上で前述のように新たな核酸
が合成される。この増幅手順の進行を維持するために追
加の試薬類を必要とする場合もあり、その後、これらの
エクステンション生成物の殆どは２種のプライマー（す
なわち、相補的な生成物）によってパインディングされ
た特定の核酸配列から構成されるであろう。

鎖の分離およびエクステンション生成物合成工程は必要
に応じて繰り返えされ、用途、例えば検出に必要な目的
量の特定の核酸を生成する。一般Ｋ、一連の工程は最低
１回、そして好ましくは最低ｌ０〜３０回繰り返えされ
る。

１種より多くの標的精製核酸を生成する必要がある場合
には、適当数のプライマーセットが前記−船釣な手順に
より使用される。

プライマー・エクステンション生成物少なくとも１種が
生じた後、この発明の方法におけるいずれかの時点で、
その生成物は検出可能に標識したプローブ（後述する〉
とバイプツト化することができる。

検出可能なハイブリッドの存在を測定するには、サザー
ンプロット、ゲル電気泳動、染色および当該技術分野で
既知の他の方法を包含する各種検出手段を使用すること
ができる。

一般Ｋ、所定量の目的核酸配列が生じたならば、その最
後にプライマー・エクステンション生成物が分離され、
第一プライマー・エクステンション生成物は、検出のた
めに標識されそしてそれに相補的であるオリゴヌクレオ
チドプローブと接触され、生成物を形成する。このプロ
ーブは、標的核酸配列に相補的な核酸配列である。これ
らのプローブは、いずれか適当な核酸の鎖長を有してよ
いが、好ましくは１５〜４０個の核酸である。それは、
特異的パインデイングリガントとその受容体の複合体化
を妨げないいずれか適当で検出可能な物質により標識さ
れる（通常、５′末端）。

標識を結合させる方法およびプローブを調製する方法は
、例えば、ＡｇｒａｗａｌらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄＲｅｓ、、　１４．６２２７〜６２４５ページ（１９
８６）およびプライマーに特異的パインデイングリガン
トを結合することに関する前記文献に記載されるような
従来技術で周知である。利用可能な標識としては、ラジ
オアイソトープ、電子密度の高い試薬、発色体、蛍光体
、リン光成分、フェリチンおよび他の磁性粒子、化学発
光成分ならびに酵素（これが好ましい〉が挙げられる。

利用可能な酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリホスファターゼ
および当該技術分野で既知の他のも、のが挙げられる。

このような酵素に対する基質および色素生成組成物は周
知である。

特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであり
、アッセイのある時点で、過酸化水素および適当な色素
生成組成物が添加され、検出可能な色素が提供される。

例えば、利用可能な色素供給性試薬類としては、トリア
リールイミダゾールロイコ染料（米国特許第４．０８９
．７４７号明細書に記載されるような）またはペルオキ
シダーゼおよび過酸化水素の存在下で反応して色素を提
供する他の化合物のような、テトラメチルベンジジンお
よびその誘導体ならびにロイコ染料が挙げられる。

相補的生成物におけるプローブの存在の検出は、適切な
既知の検出装置および方法を使用して遂行することがで
きる。ある種のプローブは、検出装置を使用することな
く肉眼で観察しうるであろう。

本発明の方法にとって、適当な容器中で実施することも
また有用である。殆ど加工されていない容器としては試
験管、フラスコまたはビーカーが挙げられるが、より精
巧な容器は前記方法を実行するについて自動化手順を容
易にするために仕上げられる。例えば、この方法を実施
する間中一定の温度特性を提供するように組み立てられ
たキュベツトは、特開平１−１６８２７２号および同１
−２６６８５８号公報に記載されそして特許請求されて
いる。他の有用な容器は、この発明の方法の自動化また
は使い捨て用として適当に加工されうる。

相補的な生成物中のプローブを検出するには、相補的な
生成物の反応媒体中の他の物質から分離することがしば
しば重要になる。これは、適当な不溶化手段、例えば、
前述のある時点で固体材料に結合するか結合を起こすプ
ライマーまたはプローブを使用することで行うことがで
きる。得られる不溶化複合体生成物は、濾過、遠心また
は他の適当な分離手段によって複合化していない物質か
ら分離することができる。

特に有用な分離手段としては、ポリアミド膜（例えば、
商品名ＬｏＰｒｏｄｙｎｅまたはＢｔｏｄｙｎｅ膜）の
ような微孔質濾過膜が挙げられる。それらは塗布しない
で使用するか、または界面活性剤もしくは分析手順を容
易にする他の物質を塗布して使用することができる。−
の態様では、膜それ自体が第一プライマー・エクステン
ション生成物を捕捉するためにそれに結合したく吸収ま
たは共有結合によって〉受容体分子を有する。

これらの膜は、アッセイの他の段階を実施するのに適す
る容器を有する別の支持体として使用することができる
。しかしながら、試験装置の一部として固定されるのが
好ましい。

各種の試験装置は、米国特許第３．８２５．４１０号、
同３．８８８．６２９号、同３．９７０．４２９号およ
び同４．４４６．２３２号明細書に記載されるものを包
含する当該技術分野で既知である。

本明細書に記載される方法は、感染性疾患、遺伝病また
はガンのような細胞性疾患に関連する特定の核酸配列の
検出法または特性決定法を提供するために使用すること
ができる。それはまた、法医学的調査およびＤＮＡタイ
ピングで使用することも可能であろう。この発明の目的
とする遺伝病には、いずれかの生物体に由来するゲノム
ＤＮＡ中の特殊な欠失または突然変異、例えば、鋳状赤
血球貧血、嚢胞性繊維症、α−サラセミア、βサラセミ
アおよび当業者に容易に明らかな他の疾患が含まれる。

各種の感染症は、生物体くそれが酵母、細菌またはウィ
ルスであるかどうか）を特徴付ける臨床試料中に少量で
存在する特定のＤＮＡ配列によって診断することができ
る。限定されるものでないが、検出することができるそ
れらの細菌としては、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）　、淋菌（Ｇ
ｏｎｏｒｒｈｅａ）　、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）お
よびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属に属する菌が挙
げられる。限定されるものでないが、検出可能なウィル
スとしては、ヘルペスウィルス、シトメガロウイルス、
エプスタイン・バールウィルス、肝炎ウィルスならびに
ＨＴＬＶ−Ｉおよび旧Ｖ−■のようなレトロウィルスが
挙げられる。原生動物の寄生体、酵母およびカビもまた
検出可能である。他の検出可能な種は当業者にとって容
易に明らかであろう。本発明は、試験試料中の旧Ｖ−■
のようなレトロウィルスの存在の検出に有用である。

〔実施例〕

以下の例は、この発明の実施を具体的に説明するために
含めるものであるが、この発明がいずれかの態様に限定
されることを意味しない。

例　ｌ　精製試薬の調製と使用 この発明の実施に際して使用される精製試薬は、標準的
な方法を用いて製造されるポリマーラテックス粒子と、
次の配列 ５’　　−Ｘ−ＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＴ
八ＧＡＴＴＴＧ−３’（配列中、Ｘはへ国際公開８９１
０２９３１号公報に記載されるように調製されたエチレ
ングリコール・スペーサー・アームを介してそのオリゴ
ヌクレオチドに結合したフリーのアミノ基である）を有
するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）　タイプ２およびタイプ
３と相補的な核酸断片とを使用して調製した。

材料 ラテックス粒子（２，９％固体）は、ポリ　（スチレン
ーコーアクリル酸）　＜９０　：　１０、モル比）から
構成されていた。

メチルイミダゾール緩衝液（０，２モル濃度、ｐＨ６）
は、過塩素酸を添加することでＩ）Ｈ６に調整した。

５ＳＰＥ緩衝液（２％）は、水ｉｆ中、塩化す）　ＩＪ
ウム４３．５　ｇ　、リン酸ナトリウム０．２７６　ｇ
およびエチレンジアミン四酢酸０．０７４　ｇからなり
、ｐＨ７，４に調整した。

ガラス蒸留水（４０００／ｒｄ）中５′−アミノオリゴ
ヌクレオチド（２００ミリモル）溶液を使用した。

ＥＤＣ試薬は、１−（３−ジメチルアミノプロピル〉−
３−エチルカルボジイミド塩酸塩である。

手順 ラテックス溶液（１ｍｌ、２９ｍｇビーズ）を遠心（１
３，０００ｘにて２．５分）して上澄を除去した。次Ｋ
、激しく撹拌しながらガラス−蒸留水（１−〉にビーズ
を懸濁させた。混合物を再度遠心して上澄を廃棄した。

ビーズをメチルイミダゾール緩衝液（ｌｄ）で１度洗浄
し、遠心によりこの緩衝液を廃棄し、次いで同じ緩衝液
（０，５−）にビーズを再懸濁させた。

このビーズ液Ｋ、５′−アミノオリゴヌクレオチドプロ
ーブ（原液２５ｐ！または約５０００ピコモル〉を加え
、得られた溶液をよく混合した。この溶液Ｋ、１−（３
−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミ
ド塩酸塩試薬（１５ｍｇ）　ヲ加工た。渦巻混合した後
、この反応混合物を時々混合しながら少なくとも２時間
（通常１５時間）２０〜２５℃に置いた。

まず最初Ｋ、遠心により上澄を除去した後、遠心しそし
て溶液間の上澄をピペット除去することで下記緩衝液に
よりビーズを連続して洗浄した：ａ、ガラスー蒸留水１
＋ｎｊ！で１度、ｂ、　５ＳＰＢ緩衝液で１度、 （、ＩＪン酸緩衝溶液で１度、次いで ｄ、ガラス−蒸留水で２度。

最後の処理後、ビーズをガラス−蒸留水に懸濁して最終
容量９２０ｐ１とし、３％ビーズ懸濁液を調製して４℃
で保存した。

例　２　　ＨＬＡ　ＤＮＡの増幅および検出方法この例
は、精製した標的ＨＬＡ　ＤＮＡの増幅および検出を具
体的に説明する。

煮沸、遠心および上澄の廃棄により粗金点サンプル（１
００ｐ１’）から粗金点溶解物を調製した。この粗溶解
物の分画（それぞれ５ｄ）を、それぞれ５分間９５℃で
加熱変性し、次いで５ＳＰＩｌｉ緩衝液とトリトン（Ｔ
ｒ＋ｔｏｎ、商品名’）　Ｘ−１００非イオン界面活性
剤（０，０２重量％）のサンプル（４０Ｊ）に添加して
試験検体を提供した。

精製手順 前記試験検体に例１で使用した精製試薬（水中２重量％
で２ｐ１）を加え、得られた混合物を撹拌しながら３０
分間５５℃でインキュベーションした。

次Ｋ、混合物を１４．　ＯＯＯｒｐｍで１分間遠心し、
次いで上澄を廃棄した。得られたペレットを、ＳＳＰε
緩衝液とトリトンＸ−１ｏｏ非イオン界面活性剤（０，
０２重量％）の溶液（５０Ａり中に再懸濁し、５５℃に
加熱した後、再度遠心した。この操作を２回以上繰り返
して、精製試薬にハイブリッド化した精製核酸を提供し
た。

次・Ｋ、得られたペレットを次の溶液＜１００−’）中
で懸濁した：塩化カリウム（５０ミＩＪモル濃度）、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンｆｆｌ　ｔｋ液
（１０ミリモル濃度、ｐ）１８）、ゼラチン（０，１■
／Ｉｎ１）　、塩化マグネシウム（２，５ミ！Ｊモル濃
度）、ＨＬＡプライマー（−および＋、各０，２マイク
ロモル濃度）およびｄＮＴＰ　（各０、ロアミリモル濃
度）。

）ＩＬＡ　ＤＮＡは次の配列を有していた：（＋）　　
５’　−Ｘ−ＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴ
ＧＴＡＣＣＡＧ−３’（−）　　　５”−Ｘ−ＣＧＧＡ
ＴＣＣＧＧＴＡＧＣ八ＧＣＧＧＴＡＧＡＧＴＴへ−３’
配列中のＸは、国際公開８９１０２９３１号公報に記載
された手順で調製しそしてプライマーに結合させたビオ
チンテトラエチレングリコールリンカ−を表す。

次Ｋ、所定の核酸を５分間９５℃に加熱することにより
精製試薬から脱ノ＼イブリダイズド化し、次いですぐさ
ま遠心して上澄を集めた。

標的核酸の増幅 前記の上澄を、市販のサーマス・アクアティカス（Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離したＤＮＡ
ポリメラーゼ（４１，Ｕ、　／ｐｌ含有、約１ｐＩ）と
混合し、次のような逐次的な３０サイクルで増幅を行っ
た＝７０℃を９４℃まで昇温　１分 ９４℃　　　　　　　　０．５分（変性）９４℃を５０
℃まで降温　１．２５分 ５０℃　　　　　　　　　　０．５分（）＼イブリッド
化）５０℃を７０℃まで昇温　０．７５分 ７０℃　　　　　　　　１分（伸長） 増幅後、脱ハイプツト化した生を物を４％アガロースを
用いるゲル電気泳動、次いでエチジウムブロマイド染色
により評価した。結果は、本発明の精製試薬を使用して
粗溶解物から所定の核酸が特異的に精製されそして分離
され、増幅が成功裏に行われたことを示した。

例　３　ヒトβ−グロビンの検出方法 この例は例２と類似であるが、ヒトβ−グロビンＤＮＡ
の精製および検出に関する本発明の詳細な説明する。

例２に記載したように粗金血溶解物を得た。

精製試薬は、表面にアルデヒド基を有するポリマー粒子
を使用して調製した。これらの粒子は次の工程で調製し
た二０．５モル濃度のメタノール中ナトリウムメトキシ
ド２５０−１２−二トロプロパン（１２，５ｍｆ）およ
びポリ　（スチレン−三−ビニルベンジルクロライド）
（７０：３０モル比）の水性懸濁液（３，５％、固体〉
の混合物を２時間還流し、次いで濾過した。フィルター
上の粒子をメタノール洗浄、乾燥、最少量のピリジンで
膨潤し、次いで水に再懸濁した。

標的ヒトβ−グロビンＤＮＡに相補的な核酸断片は次の
配列を使用した： ５’　−Ｘ−ＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣ
−３’配列中、Ｘは例１で記載したように調製したエチ
レングリコール・スペーサー・アームヲ介シて結合した
フリーアミノ基である。

粒子上のアルデヒド基とアミノオリゴヌクレオチドを米
国特許第４．５８７．０４６号明細書に記載された方法
を用いて連結した。

本例では、２種のヒトβ−グロビンＤＮＡプライマーを
使用し、さらに対照として２種の例２のＨＬＡ　ＤＮＡ
プライマーを添加した以外は例２の精製方法と増幅方法
に従った。

ヒトβ−グロビンＤＮＡプライマーは次の配列を有して
いた： （＋）　　５’　−Ｘ−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣ
ＡＣＴＡＧＣ−３’（−）　　５’　−Ｘ−ＣＡＡＣＴ
ＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣ−３’配列中、Ｘは、
国際公開８９１０２９３１号公報（前記）に記載された
ように調製し、結合したビオチンテトラエチレングリコ
ール・スペーサー・アームを表す。

結果は、ヒトβ−グロビンＤＮＡ標的が粗溶解物から成
功裏に採取、増幅されそしてエチジウムブロマイドを使
用して検出されることを示した。

この例では、ＨＬＡ　ＤＮＡは増幅または検出されなか
った。

〔発明の効果〕

この発明は、従来技術が教示するような多孔質または磁
性粒子あるいは精巧な装置または試薬類を使用すること
なく、核酸混合物中の目的の核酸を精製するための有利
な手段を提供する。アフィニティー分離は核酸について
知られているが、それをポリメラーゼ・チェーン反応を
用い極めて少量の標的核酸の増幅を改良するために使用
したものはかつて存在しなかった。従って、既に大いに
利用されている方法が本発明によってより一層望ましく
高感度になった。これらの望ましい結果は、適当な形状
と大きさの非多孔質で非磁性粒子に直接ある相補的核酸
断片を結合させてなる精製試薬を使用することで達成さ
れる。

ニーヨーク　１４５１９．オンタリオ、ス５９６１ リフオルニア　９４５３０．エル　セリストリート　９
３６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核酸混合物を含有することが予測される生物学的被
   検体中に存在する少なくとも１種の一本鎖標的核酸の精
   製方法であって、 Ａ、不溶性ハイブリッドを形成するのに適する条件下で
   標的核酸の核酸配列と相補的な核酸断片が直結した非多
   孔質で非磁性の粒子を含んでなる精製試薬と前記被検体
   を接触する工程、 およびＢ、その被検体の残りのものから前記ハイブリッ
   ドを分離する工程、からなる方法。 ２、ポリメラーゼチェーン反応を使用する核酸混合物を
   含有することが予測される生物学的被検体中の少なくと
   も１種の一本鎖標的核酸の増幅方法であって、 Ａ、不溶性ハイブリッドを形成するのに適する条件下で
   標的核酸の核酸配列に相補的な核酸断片が直結した非多
   孔質で非磁性の粒子を含んでなる精製試薬と前記被検体
   を接触する工程、 Ｂ、その被検体の残りのものから前記ハイブリッドを分
   離する工程、および Ｃ、前記不溶性のハイブリッドから変性または変性する
   ことなくポリメラーゼチェーン反応を使用して目的の核
   酸配列を増幅する工程、からなる方法。 ３、核酸混合物を含有することが予測される生物学的被
   検体中に存在する２つの相補鎖を有する標的核酸少なく
   とも１つの検出方法であって、 Ａ、被検体中の前記相補鎖を変性する工程、 Ｂ、不溶性ハイブリッドを形成するのに適する条件下で
   標的核酸の核酸配列に相補的な核酸断片が直結した非多
   孔質で非磁性の粒子を含んでなる精製試薬と前記被検体
   を接触する工程、 Ｃ、精製した標的核酸を供給するために、前記被検体の
   残りのものから前記ハイブリッドを分離する工程、 Ｄ、そのハイブリッドを変性して前記標的核酸から不溶
   性の相補的断片を分離する工程、Ｅ、一つが目的の核酸
   配列に相補的であり、もう一つが標的核酸の他の鎖と相
   補的である第一および第二プライマーと前記変性した標
   的核酸サンプルを接触してその第一および第二プライマ
   ーと前記相補的核酸鎖のハイブリッド生成物を形成する
   工程、 Ｆ、前記プライマー類の第一エクステンションと第二エ
   クステンションがそれらの相補体から分離された場合に
   それらのプライマーのエクステンション生成物の合成の
   ための鋳型として役立ちうる前記第一および第二プライ
   マーの第一および第二エクステンションを前記ハイブリ
   ッド生成物中で形成する工程、 Ｇ、鋳型上で合成された前記プライマー・エクステンシ
   ョンをその鋳型から分離する工程、 Ｈ、追加の第一および第二プライマーを前記分離したエ
   クステンション生成物および標的核酸と接触して、相補
   的生成物を形成するための特異的核酸配列の増幅をもた
   らす工程、Ｉ、工程Ｈで形成された相補的生成物から前
   記プライマー・エクステンション生成物類を分離する工
   程、 Ｊ、工程Ｉで分離されたプライマー・エクステンション
   少なくとも１つを、検出のために標識されそれに相補的
   であるオリゴヌクレオチドプローブと接触して、そのプ
   ローブおよびプライマー・エクステンション生成物の相
   補的生成物を形成する工程、ならびに Ｋ、被検体中の標的核酸の存在の指標として工程Ｊで形
   成された相補的生成物を検出する工程、からなる方法。