JPH02503983A - 捕捉ビーズを用いる組み換えクローン化ｎａからの混入配列のアフイニテイ除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 捕捉ビーズを用いる組み換えクローン化ＮＡからの混入配列のアフイニテイ除去 分　　野 本発明はＤＮＡであるかまたはＲＮＡである所望せざる核酸（ＮＡ）を所望のＮ Ａから除去することに関する。特に本発明は組み換えクローン化ＮＡプローブか らの混入ベクター配列の除去に適用できる。

背　　景 標識されたＤＮＡおよびＲＮＡプローブ技術により臨床検体における感染性細菌 の迅速で正確な検出法ならびに実験的および臨床検体における他の標的ＮＡ配列 の検出または位置確認法が提供される。約５０〜１００以下の塩基を含有するプ ローブは通常合成により製造される。比較的大きいプローブはプローブ挿入物を 含有する組み換えＤドＡをＤＮＡクローニングベクター中にクローン化すること により通常製造される。クローン化され、標識された一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ ）プローブの製造操作には（ａ）プローブＤＮＡ挿入物を含有する組み換えＤＮ ＡをＤＮＡクローニングベクター中にクローン化し、（ｂ）ベクターをエンドヌ クレアーゼで処理することによりプローブＤＮＡを切り出しそしてゲル電気泳動 によりベクターからグローブＤＮＡを分離し、（ｃ）例えば、その少なくとも幾 つかが標識されている４種のデオキシリポヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮ ＴＰｉ　’）の存在下におけるニックトランスレーションによりプローブを標識 し、（ｄ）そのプローブおよびベクターＤＮＡを変性することが包含される。ク ローン化され、標識された一重鎖ＲＮＡ　（ｓｓＲＮＡ）グローブの製造操作に は（ａ）所望の５ｓＲＮＡプローブに相当するＤＮＡ挿入物を含有する組み換え ＤＮＡを、挿入物の上流に転写プロモーターを有するＤＮＡクローニングベクタ ー中にクローン化し、（ｂ）組み換えＤＮＡをエンドヌクレアーゼで切断してプ ロモーターおよび挿入物を含有する直線状ＤＮＡ鋳型を生成させ、（ｃ）その直 線状ＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼの存在下に、その少なくとも幾つかが標識 されている４種のりポヌクレオシドトリホスフエート（ｒＮＴＰ類）と接触させ て鋳型に上に標識された５ｓＲＮＡを合成し、そして（ｄ）　ＤＮＡおよび取り 込まれなかったｒＮＴＰ類を５ｓＲＮＡから分離することが包含される。

Ｄ　Ｎ　Ａプローブを製造する操作においては、標識されたベクター配列の混入 は、ゲル電気泳動では例え電気泳動を数回反復してもプローブＤＮＡをベクター ＤＮＡから完全に分離できないという事実から生ずる。ＲＮＡグローブを製造す る操作においては、標識されたベクター配列の混入は、組み換えＤＮＡの不完全 な直線化により転写がベクター領域中に継続することから、またはプロモーター 以外のＲＮＡポリメラーゼ開始部位がベクター中に存在することからくる不定の 転写から生ずるａ　Ｂｕｆｆｏｎｅ等、Ｃｌ１ｎ。

ＣｈｅＩ！１．３１　：　２０４３〜４　　（１９８５）。

検体中における相同の配列にベクター配列が結合することによる誤った陽性を回 避するためには標識された５ｓＮＡプローブからこれら標識された混入ベクター 配列を除去することが大切である。これは臨床検体の分析に使用することを意図 されるプローブを生産するのにｐＢＲ３２２のような細菌性プラスミドクローニ ングベクターが用いられる場合に特に重要である、何故なら体液、糞便および組 織中にはかかるベクターの配列に結合する細菌性ＤＮＡまたは関連する細菌性配 列が通常存在するからである。例えば、Ｂｕｆｆｏｎｅ等、上記引用文献Ｂａｒ ｂａｃｉｃｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２２５　：　６７０　（１９８４）、　Ｈｉｎｏ等、　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２２５　：　６７０〜１　（１９８４）、　Ｐａ１ｖａ、　ＦＥＭＳ 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２８　：　８５〜９１（１９０８ ５）、およびＤｉｅｑｕＬｉｓ等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 。

２３ニア９７〜７９９　（１９８６）を参照されたい。もし検体中に細菌性ＤＮ Ａ配列が存在する可能性があるならば、誤った陽性を回避するためには例え痕跡 のベクター混入物でもその除去が必要であろう。

ＤＮＡプローブの場合、混入するベクター配列を除去するためにゲル電気泳動お よび膜に基づくハイブリダイゼーションの組み合わせが用いられてきた。この方 法においては、ベクター５ｓＮＡを吸着させてニトロセルロースまたはナイロン 膜に固定されたベクター５ｓＮＡを捕捉する。

グローブＤＮＡは初めに電気泳動により部分的に精製され、次に標識されそして 変性される。プローブの変性後、膜および緩衝剤をプラスチックバッグ（ハイブ リダイゼーションポーチ）に入れそしてハイブリダイゼーション条件下に長期間 保持する。プローブ中に混入するベクター配列は膜に吸着されたベクター５ｓＮ Ａにより捕捉される。

この方法は電気泳動単独に比較してベクター配列の除去が改善されるが、厄介で 時間がかかる。膜上での７１イブリダイゼーシヨンはゆっくりしている。全操作 に約１６時間要する。膜から捕捉５ｓＮＡが失われるので膜を再使用できない。

その結果、この操作は大量の捕捉ベクターを必要とする。

ベクターを含有しないハイブリダイゼーションプローブのもう一つの製法はＧａ １ａｕのＧｅｎｅ、　３４　：　９３〜９８　（１９８３）に關示されている。

プラスミドＤＮＡを３２ｐで標識しモしてＤＮアーゼエの存在下にニックトラン スレーションによりフラグメント化する。プラスミドＤＮＡ　７ラグメントを変 性させそして過剰のベクターＤＮＡを用いて復元させる。

プローブＤＮＡは一重鎖のままであるが、ベクターＤＮＡは二重鎖となる。次に ５ｓＤＮＡをヒドロキシルアパタイト上でベクターｄｓＤＮＡから分離する。こ の操作は厄介で時間がかかり、そして痕跡量のベクター混入物を除去できないこ とが例証されている。

ＤＮＡおよびＲＮＡをビーズおよび膜支持体に共有結合させそして所望のＮＡを 捕捉するためのアフイニチイ精製に使用されてきた。このことを關示する文献例 をあげれば、Ｍｏ５ｓ　等、　　　Ｊ、’　　　Ｂｉｏｌ、　　　Ｃｈｅ＋ｎ、 、　　　２５６　　二　１２６５５−８　　　（１９８１）。

びＢ［ｎｅｍａｎｎ等、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 １０　：　７１８１〜７１９６（１９８５）である。所望のＮＡおよび所望せざ るＮＡを含有する検体から所望せざるＮＡを除去するため、特に組み換えプロー ブＮＡかも混入ベクター配列を除去するだめの、ビーズに基づくハイブリダイゼ ーションは本発明以前には用いられていなかったと考えられている。

」１盟１０１桂一 本発明は水性媒体中における所望の５ｓＮＡおよび所望せざる５ｓＮＡを含有す る検体から所望せざる５ｓＮＡを除去する方法である。この方法は（ａ）所望せ ざる５ｓＮＡと相補性であり、かつ固形の水不溶性ビーズまたは特異的な結合対 の一方の構成員に共有結合した捕捉５ｓＮＡにハイブリダイゼーション条件下に 検体を接触させ、（ｂ）捕捉５ｓＮＡが特異的な結合対の一方の構成員に共有結 合されている場合は、特異的な結合対のもう一方の構成員が共有結合された固形 の水不溶性ビーズと検体とを接触させ、モして（Ｃ）ハイブリダイズされた所望 せざるＮＡを担持するビーズを水性媒体から分離することを包含する。本発明の 主要な適用においては、捕捉５ｓＮＡはＤＮＡクローニングベクターの５ｓＤＮ Ａ配列を包含し、所望の５ｓＮＡはベクター中にクローン化されたＤＮＡ挿入物 に由来する標識された５ｓＤＮＡまたは５ｓＲＮＡを包含しそして所望せざる５ ｓＮＡはベクターに由来する標識された５ｓＤＮＡまたは５ｓＲＮＡ混入配列混 入台する。

本発明にはＤＮＡクローニングベクターのＤＮＡ配列が共有結合された固形の水 不溶性捕捉ビーズ、および該ビーズならびに緩衝剤および内容物を使用するだめ の印刷された説明書を含有する、標識された組み換えクローン化ｓ　ｓ　Ｎ　Ａ グローブから混入ベクター配列を除去するためのキットが包含される。

本発明にはまた、特異的な結合対の一方の構成員に共有結合されたＤ　Ｎ　Ａク ローニングベクターの配列からなる化合物、およびかかるＤＮＡ配列、ならびに 特異的な結合対のもう一方の構成員が共有結合されＩ；固形の水不溶性捕捉ビー ズ、緩衝剤、および内容物を使用するための印刷された説明書を含有する、標識 された組み換えクローン化５ｓＮＡプローブから混入ベクター配列を除去するだ めのキットも包含される。

本発明の方法により、ＮＡプローブから混入ベクター配列を除去するための前記 した膜に基づくハイブリダイゼーション法に比較して幾つかの利点が提供される 。このハイブリダイゼーションはより速やかで、約１時間しか必要としない。捕 捉試薬は製造して後日使用するために貯蔵することができ、そしてこのハイブリ ダイゼーションはハイブリダイゼーションポーチよりむしろ微量遠心管中で容易 に実施できるのでこの操作はあまり厄介でない。捕捉ＤＮＡがビーズに直接共有 結合されている場合は、捕捉されたＤＮＡは変性により除去できそしてビーズは 何回も再使用でき、従って捕捉ＤＮＡの必要量がはるかに少ない。捕捉ＤＮＡが 特異的な結合対の一方の構成員に共存結合されている場合は、ハイブリダイゼー ションは溶液中で実施でき、それらによりさらにより速やかなノ１イブリダイゼ ーションおよび混入ベクター配列のより完全な除去も可能である。

多くの異なる種類の固形ビーズが本発明で使用できる。

このビーズは水不溶性でかつ、捕捉ＤＮＡまたは特異的な結合物質（例えばアビ ジン）を結合する間、および捕捉および所望せざるＮＡのハイブリダイゼーショ ンおよび変性の間それらがおかれる物理的および化学的条件に対して安定でなけ ればならない。また、ハイブリダイゼーションおよび変性条件に対して安定な様 式で捕捉ＮＡまたは特異的な結合物質に共有結合可能でなければならない。

これらビーズはハイブリダイゼーション条件下に核酸をあまり非特異的に吸着し ないことが望ましい。ビーズはハイブリダイゼーションに続いて水性媒体から例 えば沈降、遠心分離または磁場の適用により容易に分離できるものでなければな らない。沈降まＩ；は遠心分離による分離には１〜３００ミクロンの範囲のビー ズが適当である。

１０−１００ミクロンの範囲のビーズが好ましい。一般に、ＢＯｎｅＩｅａｎｎ 等＋’　Ｍｏ５ｓ等、　Ｌａｎｇｄａｌｅ等およびＢＱｎｅｍａｎｎ等の上記引 用文献に記載されるように、所望の核酸のハイブリダイゼーションによりこれま でアフイニテイ精製に使用されてきたビーズが本発明で使用できる。好ましい種 類のビーズは例えばＢｉｏ−Ｒａｄ社のＰ−１，００バイオゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅ ｌ）アミノニチルポリアクリルアミドビーズのような、末端アミン基を有する有 機ポリマーからなる。使用できる他のビーズにはセファデックスＧ−２５、セフ ァクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ＠　）Ｓ−５００、セファクリルＳ−１０００お よびセファロースＣＬ−２Ｂ、　　ＣＬ−４ＢおよびＣＬ−６Ｂが包含され、こ れらはすべてＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｌｌｐｓ ａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎの製品である。製造者により記載されるように、セファ デックスは選択されたデキストランフラクションをエビクロロヒドリンで架橋さ せることにより製造されたビーズ形のデキストランゲルである。セファクリルビ ーズはアリルデキストランをＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドと架橋させ ることにより形成される。セファロースＣＬビーズは２，３−ジブロモグロパノ ールと架橋したアガロースである。Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ から入手しうる乾燥セルロース末であるセレツクス（Ｃｅｌｌｅｘ■）　４１０ も使用できる。

Ｈｅｒｓｈの米国特許第３．９３３．９９７号、Ｉｔｈａｋｉｓｓｉｏｓの米国 特許第４．１１５，５３４号、Ｆｏｒｒｅｓｔ等の米国特許第４，１４１，６８ ７号、ＭａｎｓｆｉｅＪｄ等の米国特許第４．１９７．３３７号およびＣｈａｇ ｎｏｎのデンマーク特許出願第ＤＫ　２３７４／８４に記載される粒子のような 磁気ビーズも使用できる。後者はＡｄｖａｎｃｅｄＭａｇｎｅｔｊｃｓ社からＢ ｉｏｍａｇなる商標の下に商業的に入手しうる。好ましい磁気ビーズは１９８６ 年ｌＯ月３日特許されたＬａｕの米国特許出願Ｓ、Ｎ、　　０６／８４１．１０ ７記載の被覆されたＣｒ　Ｏ２粒子である。例えば３−アミノプロピル−トリエ トキシシランのような、官能基を有するシラン化合物の外層を有する磁気粒子が 前記引用文献に数示されるように、直接にかまたは直線状化合物を介してＤＮＡ または特異的な結合物質の共有結合に利用されうる。

特異的な結合対 好ましい特異的な結合対はビオチンおよびアビジンもしくはストレプトアビジン である。使用できる他の対には抗体とその抗ヌもしくはハプテン、内因子とビタ ミンＢＩ！、葉酸塩結合性タンパク質と葉酸、チロキシン結合性グロブリンとチ ロキシン、およびその他の多くのものが包含される。

共有結合 捕捉ＮＡまたは特異的な結合物質をビーズに共有結合させるのに種々の慣用の化 学的方法が利用できる。選択される化学的方法はビーズ表面上および／または特 異的な結合物質上で利用できる官能基の如何による。末端アミン基を含有するか または３−アミノプロピル−トリエトキシシランのような遊離アミン基を有する 化合物で被覆された有機ポリマーからなるビーズへの捕捉ＮＡの共有結合は、２ −モルホリノニタンスルホンＫｍ　（ＭＥＳ）中の水溶性カルボジイミドである ｌ−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルポジイミド（ＥＤＡＣ）を用 いてＮＡの５′−ホスフエートをビーズのアミンと縮合させることにより１１　 ：　６５１．３〜６５２９　（１９８３）の「保護されてないポリヌクレオチド の誘導体形成」に記載されている。アミン基を含デヒドのような二官能性リンカ −の使用により遊離の表面アミン基を有するかかるビーズに結合されうる。

捕捉ＮＡはＢｔｉｎｅ＋ｎａｎｎ等およびＢｉｉｎｅｍａｎｎの上記引用文献に 数示されるように、ジアゾ化によりセファデックスＧ−２５、セロツクス４１０ およびセファクリルＳ−５００のようなビーズに結合されうるし、または臭化シ アンによる活性化を介してセファデックスＧ−２５，セファロースＣＬ−２Ｂ８ よびＣＬ−６ＢおよびセファクリルＳ−５００およびＳ−１０００のようなビー ズに結合されうる。核酸はＭｏ５ｓ等の上記引用文献に教示されるようにエポキ シ活性化を介してセレツクス４１０に結合されうる。

捕捉Ｎ／１．はビーズのアミン基にＮＡを結合させるのに用いられると同じ化学 的方法、例えば前記したようにＭＥＳ中のＥＤＡＣを用いＮＡ５’−ホスフェー ト基をアミン基と縮合させることにより特異的な結合物質のアミン基を共有結合 させることができる。捕捉ＤＮＡはＣｈａｎ等のＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ、　１３　：　８０８３−８９０１（１９８５）およびそこに引用 される文献に記載されるように、ニックトランスレーション、末端充填またはビ オチニル化デオキシウリジル基を用いる末端標識化によりビオチンに共有結合さ れ３４３５〜３４４４　（１９８５）に記載される方法によりタンパク質に結合 できそしてそのタンパク質に対する抗体に共有結合されたビーズと共に用いられ うる。

捕捉ＮＡ 本発明は任意の検体から望ましからぬ混入ＮＡを除去するのに用いることができ る。従って、混入ＮＡとハイブリダイズするであろう任意のＮＡが捕捉ＮＡとし て使用できる。

多数のＤＮＡクローニングベクターが標識ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの製造に 使用できそしてこれらベクターのすべてが本発明において使用するための捕捉Ｄ ＮＡを提供するのに使用されうる。本発明は特に細菌起源のＤＮＡベクター例え ばｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２２の全部または一部を含有するベクター例えば ｐＢＲ３２５およびｐｓｐ　６４の配列を含有するＤＮＡを捕捉するのに適用で きる。この後者はＭｅｌｔｏｎ等のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　１２　：　７０３５−７０５６（１９８４）に記載されている。

捕捉ＤＮＡとして完全に直線状となったベクターを用いることもできるが、ベク ターを１種またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて約１００〜１００ ０塩基対のフラグメントに切断しそしてこれらフラグメントをビーズまたは特異 的な結合物質に結合させることが好ましい。

比較的大きいＮＡ動物質用いることもできるが、しかしそれらは使用期間中に分 解をより受は易いので好ましくない。捕捉ＤＮＡはビーズもしくは特異的な結合 物質への結合前または結合後のいずれかで変性して５ｓＤＮＡとなすことができ る。従って本発明の生成物中における捕捉ＤＮＡはｃｌｓＤＮＡまたは５ｓＤＮ Ａであることができる。

プローブの調製 本発明のＤＮＡおよびＲＮＡプローブ出発物質は本明細書の背景の部に概説した 慣用の操作により調製できる。組み換えＤＮＡの合成およびクローニングはＭａ ｎｉａｔｉｓ等のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ−ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載されている。組み換えクローン化ＤＮＡからの 標識されたＲＮＡグローブの合成はＭｏ１ｔｏｎ等の上記引用文献に記載されて いる。ニックトランスレーションによる組み換えクローン化ＤＮＡの３！Ｐでの 標識化はＭａｎｉａｔｉｓ等の上記引用文献第１０９〜１１２頁に記載されてい る。ＤＮＡのニックトランスレーションＳ識化または標識ＲＮＡの合成に使用さ れうる他の同位元素は３ｓＳ。

３Ｈおよび目５１である。Ｃｈａｎ等の上記引用文献記載のＤＮＡのビオチニル 化、およびＲｅｎｚ等の上記引用文献記載のレポーター酵素の共有結合を含む幾 種かの非放射測定標識法も用いられうる。

に記載されるようにして、クローン化プローブ挿入物をエンドヌクレアーゼ消化 によりベクターから切り出し、次に通常プローブＤＮＡをゲル電気泳動によりベ クターＤＮＡから分離しそしてゲルから溶離する。本発明の方法はいくつかの場 合には！気泳動工程を省略できることが考えられるが本発明によるベクター配列 のアフィニチイ除去に元立ちかかるゲル電気泳動の少くとも１種を実施すること が現在のところ好ましい。

ニックトランスレーションによＱｄ５ＤＮＡおよび混入ベクターを標識したのち 、慣用の手段、例えば９０〜ｌ　ＯＯ’Ｃ！で数分間加熱するかまたはｐＨ約ｌ Ｏまｔ；はそれ以上の希水酸化ナトリウムと混合することによりＤＮＡを変性し てソコテコノ５ｓＤＮＡは本発明によるアフィニティｓｉにｔぐ使用できる。

プローブＤＮＡをニックトランスレーション以外の手段、例えばＲｅｒ＋ｚ等の 上記引用文献記載の方法により標識する場合は、標識化工程は変性工程後に実施 でき、そして本発明の７フイニテイ精製工程後に行うことすらできる。

Ｍｅｌｔｏｎ等の前記引用文献記載の方法により、標識化ＲＮＡ　１合成しそし てＤＮＡ鋳型およびとり込まれなかったｒＮＴＰ類からＲＮＡを分離したのち、 そのＲＮＡは本発明のアフイニテイ精製法による混入ベクター配列の除去にすぐ 使用できる。

アフイニチイ精製 ベクター関連のまたはその他の望ましからぬＮＡ配列の除去は、ＮＡグローブへ の捕捉ＮＡ　（ベクター配列に対して相同）の添加により行われ、その場合捕捉 ＮＡはビーズ支持体に結合されるかまたは特異的な結合対の一方の構成員に結合 されている。捕捉ＮＡおよびプローブＮＡの両方共、捕捉ＮＡと望ましからぬプ ローブＮＡとの間に効率的なハイブリダイゼーションを起こさせるために一重鎮 形でなければならない、望ましからぬＮＡ配列を捕捉ＤＮＡにハイブリダイズせ しめるハイブリダイゼーション条件が選択される。好ましいハイブリダイゼーシ ョン条件には以下に示されるように水性媒体、高い塩緩衝剤温度６５°Ｃおよび 反応時間１時間またはそれ以上が包含される。例えば米国特許第４．３５８．５ ３５号、第５欄およびＭａｎｉａｔｉｓ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｉｌａ ｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　 １９８２．　２０８−２０９．３２４〜３３３および３８７〜３８９頁に開示さ れる条件のような他のハイブリダイゼーション条件も使用できる。一般に、ハイ ブリダイゼーションはホルムアミドのような極性有機溶媒０〜６０容量％を含有 する水性緩衝媒体中で、約３０〜８０℃、通常は４０〜７０°Ｃで約１５分〜５ 時間、好ましくは１〜２時間実施されよう。ハイブリダイゼーションはエンベン ドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管のような微量遠心管中で実施されるのが好まし いが、プラスチックバッグまたは他の適当な容器中でも実施できる。溶液からの 望ましからぬＮＡ配列の除去はハイブリダイズされた望ましがらぬＮＡ配列を有 する捕捉ＮＡを適当な方法で除去することにより達成される。

ビーズ支持体に捕捉ＮＡが直接結合されている場合は、その支持体を遠心分離に よりベレット化するがまたはビーズが磁性である場合は磁場の存在により除去で きる。

特異的結合対決の場合、捕捉ＮＡの除去は支持体に結合された特異的な結合対の もう一方の一員の添加により達成され、捕捉ＮＡにハイブリダイズされた望まし からぬＮＡの分離は結合対の会合に続く捕捉用支持体の除去によりなされる。

捕捉５ｓＤＮＡが直接ビーズに共有結合されている場合、捕捉ビーズを変性させ てハイブリダイズされたベクター５ｓＮＡをとり外して再循環させることができ る。この方法はビーズの破壊を伴うことなくもしくはＤＮＡをビーズに交叉結合 させることなくベクターＮＡを除去するに充分に厳密でなければならない。熱、 希アルカリまたは有機溶媒によるビーズの処理によりこの再循環が行われうる。

キット 本発明には試薬および本発明方法を実施するための説明書を含有するキットが包 含される。

ある種類のキットは、ＤＮＡクローニングベクターの配列が共有結合された固形 の水溶性ビーズ：ハイブリダイゼーション緩衝剤；および説明書を含有しよう。

第２の種類のキットは特異的な結合対の一員が共有結合された固形の水不溶性ビ ーズ；特異的な結合対のもう一方の一員が共有結合された捕捉５ｓＮＡ　；ハイ ブリダイゼーション緩衝剤；および説明書を含有しよう。第１の種類の好ましい キットにはｐＢＲ３２２の５ｓＤＮＡ配列の約３０μ９が共有結合された、アミ ノシラン被覆ＣｒＯ２ビーズ約２０ｍ９および貯蔵Ｍ衝液（０，］Ｍ　トリス・ ＨＣＱ、　ｐＨ７，５，０，５％５ＤＳ）約１ｍ（ｌを含有するバイアル；付加 的な貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液５０ｖｒＱを含有する第２のバイアル ；再循環緩衝液（９９％ホルムアミドＩＩ　ＴＥ）約５０ｍ１２を含有する第３ のバイアル；および下記説明書が包含される。

捕捉ビーズを用いるベクター吸着 ■、試薬および装置 Ａ）貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液−１，０ｍＴｒｉｓ−ＨＣｌ２　ｐ） １７．５０．５％５ＤＳＢ）再循環緩衝液−９９％ホルムアミド［ＴＥＣ）振盪 水浴（オーブン中６５°Ｃで実験室での振盪）■、ニックトランスレーションさ れたプローブからの痕跡のベクター混入物の吸着 Ａ）ビーズを微量遠心基中２分間回転させそしてビーズが乱れないように注意深 く貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液を除去する。ビーズの頂部に５０〜１０ ０μΩが残ろう、緩衝液は捨てる。

Ｂ）貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液１ｒＱヲ加え、短時間撹拌し、ビーズ を微量遠心管中約２分間回転させそして上溝を注意深く除去する。緩衝液を捨て る。

Ｃ）ビーズに貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液４００μｇを加える。

Ｄ）プローブを５〜１０分間煮沸する。１μ９までのプローブが１回で吸着され うる。プローブ容量は≦ｌＯ０μｇでなければならない。必要量より２０％多い ＣＰＭ類を加える（吸着による損失ゆえ）。

Ｅ）変性されたプローブを直ちにビーズに加えて撹拌を開始する。６５°Ｃで少 くとも１時間インキュベーションする。より長くインキュベーションしても有害 ではない。

Ｆ）プローブを吸着させたのち、微量遠心基中で約２分間回転させそして上溝を 注意深くとり除く。この時点でビーズを除去しないように注意。ビーズがかき乱 された場合は容易に再遠心できる。

Ｃ）貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液５００μｇをビーズｌ：加え、短時間 撹拌し、ビーズを遠心分離し、ビーズはとり出さないように注意して上溝を注意 深く除去し、そして先の部分に加える。

Ｈ）　　ｇ、看されたグローブをこの時点で１０分間煮沸できる。しかしながら 、あったとしても感度に最小限の改良を生ずるだけであることが示されている。

Ｉ）予め吸着されたプローブをハイブリダイゼーションバックに加える。ハイブ リダイゼーション緩衝液とプレミツクスするかまたは直接バッグに加える。

ＣＰＭ類を検査して回収を判定してもよい。

■、ビーズの再循環 Ａ）再循環緩衝液１＋ｎＩ２を加え、７０℃で５分間インキュベーションする。

ビーズを遠心分離し上溝を除去する。

Ｂ）　　Ａを反復する。

直ちに再使用するには、 Ａ）貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液ｉｎΩを加え、ビーズを遠心分離する 。上溝を除去して捨てる。

Ｂ）ビーズに貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液４００μＱを加える。ここで ビーズはプローブ添加にすぐ使用できる。

貯蔵するには、 Ａ）貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液１　ｒｎＱヲ用イて■を洗う。ビーズ を遠心しそして緩衝液を捨てる。

Ｂ）貯蔵／ハイブリダイゼーション緩衝液１　ｔｎＱヲ２１１１１　、する。ビ ーズを必要時まで４℃の冷蔵庫に入れておく。

前記トリス−Ｈｏｆｆとはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩を意 味する。ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムを表わし、モして［ＴＥは１０ｍＭ　 トリスおよび１＋ｎＭＥＤＴＡ、　ｐ）！７．５を表わす。

本願で引用されるすべての特許、特許出願、雑誌論文および本はそのままここに とり込まれるものとする。

下記実施例により本発明をさらに説明する。

Ｐ−１００アミノニチルポリアクリルアミドビーズ３．５０＋＋＋９を秤りとり そして１５π０のコーニングポリプロピレン遠心管に移しｔ；。０．２Ｍモルホ リノニタンスルホン酸（ＭＥＳ）　ｐＨ５，８８ｍＩ２を前記Ｐ−１００ビーズ に加えて室温で２時間水和せしめた。

ＭＳＰ　Ｉ消化ｐＢＲ３２２１−２ｍ９および３２ｐで５′末端標識されたＭＳ ＰＩｍ化ｐＢＲ３２２の２０００００ｃｐｍを合しテｓ　タ／　−Ａｙ沈殿させ た。ベレットを１００％エタノールで１回すすぎそして乾燥した。このＤＮＡベ レットを０．２Ｍ　ＭＥＳ、　ｐＨ５，８，１所Ω中に、溶解させた。次にこの ＤＮＡ溶液をビーズ懸濁液中に移しそして全量を１０ｍ＜２１：調整した。

結合剤ｌ−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルポジイミド（ＥＤＡＣ ）を秤量した。ＥＤＡＣの２００ｍｇをビーズ、ＤＮＡ混合物に加えた。結合反 応は撹拌しながら室温で一夜進行せしめた。

結合反応ののち、未結合ＤＮＡを除去しそして支持体Ｉこ結合したＤＮＡは、初 め反応緩衝液を除去し次にビーズを１回の洗浄当り５＋＋ｆｆずつの０．ＩＮ　 　ＮａＯＨＯ−１％ＳＤＳを用いて４回洗うことにより変性させた。洗？！！！ および反応緩衝液は結合効率を数量化するために省いた。ｐＢＲ３２２の８４％ がビーズに結合された。

０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　ｐ）１５．０の５ｍｆｆをビーズに加えて洗浄緩衝液を 中和した。次に貯蔵のためにｐＢＲビーズをＯ，１ＭＮａ−ホスフェートｐＨ７ ，５０，１％ＳＤＳ中に懸濁させた。

ベクター吸着 ゲル単離されたＤＮＡプローブからｐＢＲベクターを除去する場合のｐＢＲビー ズの有効性を示すために、吸着処理プローブと未処理プローブとの比較を行った 。用いられた系はｉ＋、：固定化されりＣＭＶ　ＤＮＡとｐＢＲ３２２ＤＮＡ（ ７）ＳＴＤカーブ（種々の濃度）にハイブリダイズされた３２ｐ標識ニツクトラ ンスレーシヨンされたＤＮＡプローブとしてのヒトＣＭＶの旧ＮＤ　ｍ　Ｔ　７ ラグメントであっツニ（Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ、　Ｂ、、Ｉ。

Ｍｕｌｌｅｒ　＆　Ｊ、　Ｃｏ１１ｉｎｓ　１９８２　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　 ｔｈｅ　ＣｏｍｐｌｅｔｅＨｕｍａｎ　Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｕｉｒｕｓ　Ｇｅ ｎｏｍｅ　ｉｎ　Ｃｏ５ｍ１ｄｓ、　Ｇｅｎｅ　１８　：３９−４６）。ＣＭＶ 　ＤＮＡのＳＴＤカーブは旧ＮＤ　ＩＩＩ　　Ｔ　ＤＮＡプローブのその標的へ のハイブリダイズ能力を示すのに用いられ、そしてｐＢＲ３２２ＤＮＡ　　ＳＴ Ｄカーブは旧ＮＤ　Ｉ　　Ｔ　　プローブのｐＢＲ３２２株配列への交配列応性 の減少を示すのに用いられた。

ＣＭＶ　ＤＮＡを］０’、　１０’、１０６．１０６コピー（分子）／ウニルの 濃度範囲でニトロセルロース膜ｌ；固定化した。ｐＢＲ３２２も同じ方法で１０ ９．１０′−１１０’、１０６コビー／ウエルの濃度範囲で固定化させた。

ＨＩＮＤ　　ｍ　　Ｔ　ＣＭＶ　ＤＮＡグローブはｐＢＲ３２２にクローン化さ れ、形質転換されモしてＥ、　　ｃｏｌｉ細胞系中で増殖させたＨＩＮＤ　ｍ　 Ｔ　ＣＭＶ７ラグメントから調製されｆニー、　ＨＩＮＤ　ＩＩ［Ｔプラスミド を増殖物から単離し、）ＩＩＮＤ　Ｉｆｆ制限酵素で消化しそしてアガロースゲ ル上で単離した。ゲル単離されブニＨＩＮＤ　　ｍ　　Ｔ　ＤＮＡ７ラグメント をＲｉｇｈｙ等ノ（１９７７）　　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　　１１３．　２３７−２５１の改良法を用いて比活性３ ．ＩＸｌ、０’ｃｐｍ／μ９となるよう３２ｐニツクトランスレーションした。

ベクター配列のビーズ吸着はニックトランスレーションされた旧ＮＤＩＩ［Ｔの 一部分上で行われた。これはＩＭＮａＰＨＯＳ　ｐＨ７，５１％ＳＤＳの０．５ ｍＩ２中のベクター吸着ビーズ約１５１１１ｇにグローブ５　Ｘ　ｌＯ’ｃｐ！ １を加えることにより行われｔ；。次にこの反応物を撹拌下に６５℃で１時間イ ンキニベーションした。

吸着ビーズを遠心分離沈殿させそしてプローブを含有する上溝をとり出すことに よりビーズからプローブをとり出した。このビーズに１．ＯＭ　ＮａＰＨ０５ｐ Ｈ７，５１％の０．５ｍΩを加えた。このビーズを再懸濁させそして再び遠心分 離して上溝を初回にとり出したプローブに加えた。

ＣＭＶおよびｐＢＲ３２２ＳＴＤカーブを含有する膜セツト２組を５Ｘ　５ＳＰ Ｅ、　０．５％ＳＤＳ、　　５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　１００＋ｎｙ／ ＋＋ｆｆのサケ精子ＤＮＡ中６５°Ｃで２時間予めハイブリダイズさせた。未吸 着のおよび吸着されたＨＩＮＤ　Ｔ　　プローブを５分間煮沸してプローブを変 性させた。このプローブを１×１０’ｃｐｍ／ｍΩの濃度で別のハイブリダイゼ ーションポーチに加えて６５℃で一夜インキユベーションした。

ハイブリダイゼーション後、膜を洗浄して未ハイブリダイズグローブを除去した 。これは（１）０．ＩＸ　５ＳＰＥ、　０．１％ＳＤＳ中室温で１０分間洗浄、 （２）０．ＩＸ　５ＳＰＥ、　０．１％ＳＤＳ中６０℃で３０分間洗浄、（３） ０．１％５ＳＰＥ、　０．１％ＳＤＳ中室温で１０分間洗浄することにより行わ れた。膜を乾燥して一７０℃でオートラジオグラフィーした。

この比較ではベクターを吸着したｐＢＲ３２２シグナルが５０〜１００分の−に 減少したがＨＩＮＤ　　Ｉ［Ｉ　　Ｔ　　プローブの感度は何ら減少しないこと が示される。

寅旅例　２ ｐＢＲ３２２ベクター混入物はまた、ＮＡ検体と特異的な結合対の一方の構成員 （例えばビオチン）を含有する相補性ｐＢＲ３２２ＤＮＡとの溶液ハイブリダイ ゼーションを用い、続いて固相支持体に共有結合された特異的な結合対の第２の 構成！（＃えばストレプトアビジン）とハイブリダイズしたｐＢＲ３２２配列を 選択的に除去することにより組み換えＮＡから除去することもできる。

プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡをＢ　ｉｏ−１１−ｄＬＩＴＰを用いてニックト ランスレーションすることによりビオチニル化し、フェノール／クロロホルム抽 出により精製しそしてエタノール沈澱させた。ストレプトアビジンはグルタルア ルデヒドを用いる標準的架橋化により、アミノシラン被覆Ｃｒｙ、磁気粒子に共 有結合させた。ＨＩＮＤ　Ｉ［ｌ　Ｌ　ＣＭＶ　ＤＮＡプローブは、ｐＢＲ３２ ２中にクローン化され、形質転換されそしてＥ、　　ｃｏｌｉ細胞系中で増殖さ れたＣＭＶ　ＤＮＡのＨＩＮＤ　　Ｉ［ｌ　　Ｌフラグメントから調製された。

ＨＩＮＤ　Ｉｆｆ　Ｌプラスミドを増殖物から単離し、ＨＩＮＤ　　ＩＩＩ制限 酵素で消化しそしてアガロースゲル上で単離した。ゲル単離された）ＩＩＮＤ　 　ＩＩＩ　　ＬフラグメントをＲｉｇｂｙ等の（１９７７）　Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、　　１１３゜２３７〜２５〕の改良法を用いて比活性３　ｘ　１０” ｃｐｍ／μ９となるよう３２ｐ二ンクトランスレーシヨンした。

ｐＢＲ３２２混入物を除去するだめの特異的な結合対相互作用７７）有ｍ性１［ １定化すレタＣＭＶ−Ｌ　ＤＮＡ　（１０’、１０７．１０６．１０’コピー／ ウユル）およびｐＢＲ３２２ＤＮＡ　（Ｉ　Ｘ　１０’、２Ｘ１０’、ｌＸｌ０ ’、５Ｘ１０’、２　Ｘ　１０’コピー／ウエル）を含有する同一のナイロン膜 とハイブリダイゼーションさせた後の処理および未処理ＣＭＩＬプローブ溶液を 比較することにより評価された。

ＣＭＶ−Ｌプローブ（２０％エタノール２ｄｐＯ中１−２Ｘ　１０’ｃｐｍ）を １．、ＯＭ　Ｎａ２ＨＰＯ＊−ｐＨ−７−５，０，５％ＳＤ５４００μΩ中のビ オチニル化されたｐＢＲ３２２ＤＮＡ　（２μｇ）に加え、全溶液を沸騰水浴中 ７分間変性させ、氷中で速やかに冷却しそして水浴中１時間６５℃に加熱した。

このハイブリダイゼーション溶液にストレプトアビジン−Ｃｒｙ、粒子の懸濁液 （５０μΩ中１２５μｇ）を加え、生成する懸濁液を室温で３０分間続いて３７ ℃で３０分間インキュベーションした。ビオチニル化されたハイブリッドを担持 するストレプトアビジン−Ｃｒ０２粒子を遠心分離により取り出し、処理された プローブ上清をＬＯＭ　Ｎａ２ＰＯ＊　、ｐＨ＝　７．５．０．５％ＳＤＳを用 いて１＋ＩｌΩまで希釈しそしてＩＯＸ　　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　　Ｉ　Ｍ　 ＮａＣＱ、　１％ＳＤＳ　。

０．０５Ｍ丁ＲｒＳ、ＨＣｎ　ｐＨ畔７．５．０．１％ピロ燐酸ナトリウム、１ ０％硫酸デキストランおよび１００μｇ／！＋ＩΩの変性サケ精子ＤＮＡの９１ Ｉｒｌ中で予めハイブリダイズさせた標的ＤＮＡが固定化されているナイロン膜 に加えた。

未処理ＣＭＶ−Ｌ　ＤＮＡプローブ（２０％エタノール２４μΩ中１．２Ｘ　１ ０’ｃｐｍ）を１．０Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ＜　、ｐＨ−７，５，０，５％ＳＤＳを 用いて１πｇまで希釈し、沸騰水浴中７分間加熱することにより変性させ、氷中 で冷却しそしてＩＯＸ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｌ　ＭＮａＯｆｆ、　１％ＳＤ Ｓ、　０．０５Ｍ　ＴＲｌ５．ＨＣＱ　ｐＨ−７，５，０，１％ピロ燐酸ナトリ ウム、１０％硫酸デキストランおよび１００μｇ　／　ｍ　Ｑの変性サケ精子Ｄ ＮＡの９ｒｎＱ中で予めハイブリダイズさせた標的ＤＮＡが固定化されているナ イロン膜に加えた。

適当な対照はナイロン膜上での標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションに関しビ オチニル化ｐＢＲ３２２（前記）について記載されたと同じ方法で混入ＣＭＩＬ 　ＤＮＡプローブをｐＢＲ３２２（非ビオチニル化）２μ９で処理することであ ろう。

６８°Ｃで１６時間ハイブリダイズさせたのち、ナイロン膜を２ＸＳＳＣを用５ １”ｉ（室温テ１０分間２回、２　Ｘ　　ＳＳＣ，１％ＳＤＳを用いて６８℃で ３０分間２回、そして０．２Ｘ　ＳＳＣを用いて室温で１０分間２回洗浄した。

洗浄した膜を乾燥して一７０°Ｃで１５時間オートラジオグラフィーし、そして 処理および未処理プローブを比較すると処理されたプローブでｐＢＲ３２２交差 反応性が１７５に減少しモしてＣＭＶ−Ｌ標的ＤＮＡの検出に関しては同じ感度 であったことを示している。

国際調査報告 １１１１＋＋ｌ１ＩＩ酊’　ａｅｅ１ζ”−”’　　ＰＣＴｌｒ’；Ｍ１０２ｏ ６”ＰＣＴ／υ５８８１０２０６５

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．水性媒体中における所望のｓｓＮＡおよび所望せざるＳｓＮＡ包含する検体 から所望せざるｓｓＮＡを除去するにあたり、（２）望ましからぬｓｓＮＡと相 補性であり、かつ固形の水不溶性ビーズにまたは特異的な結合対の一方の構成員 に共有結合した捕捉ｓｓＮＡにハイブリダイゼーション条件下に検体を接触させ 、（ｂ）捕捉ｓｓＮＡが特異的な結合対の一方の構成員に共有結合されている場 合は、特異的な結合対のもう一方の構成員が共有結合された固形の水不溶性ビー ズと検体とを接触させ、そして（ｃ）ハイプリダイズされた望ましからぬＮＡを 担持するビーズを液体媒体から分離することからなる方法。
2. ２．所望せざるｓｓＮＡがＤＮＡクローニングベクター由来の標識されたｓｓＤ ＮＡまたはｓｓＲＮＡ混入配列を包含し、所望のｓｓＮＡがベクター中にクロー ン化されたＤＮＡ挿入物に由来する標識されたｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡを包 含し、そして捕捉ｓｓＮＡはクローニングベクターのｓｓＤＮＡ配列を包含する 請求項１記載の方法。
3. ３．ベクターが細菌性もしくはウイルス性起源のものである請求項２記載の方法 。
4. ４．ＤＮＡ挿入物が感染性病原体に由来するものである請求項３記載の方法。
5. ５．捕捉ｓｓＮＡが固形の水不溶性ビーズに共有結合されている請求項１〜４の いずれかに記載の方法。
6. ６．捕捉ｓｓＮＡが特異的な結合対の一方の構成員に共有結合されている請求項 １〜４のいずれかに記載の方法。
7. ７．捕捉ｓｓＮＡがビオチンに共有結合されておりそして固形の水不溶性ビーズ がアビジンまたはストレプトアビジンに共有結合されている請求項６記載の方法 。
8. ８．（ａ）プローブＤＮＡ挿入物を含有する組み換えＤＮＡをＤＮＡクローニン グベクター中にクローニングし、（ｂ）エンドヌクレアーゼで処理することによ り前記クローニングベクターからプローブＤＮＡを切り出し、（ｃ）プローブＤ ＮＡを標識し、そして（ｄ）プローブおよびベクターＤＮＡを変性させる、こと からなる標識されたｓｓＤＮＡプローブの製法において、（ｅ）変性されたプロ ーブおよびベクターＤＮＡをハイブリダイゼーション条件下に水性媒体中で、固 形の水不溶性ビーズまたは特異的な結合対の一方の構成員に共有結合されたクロ ーニングベクター捕捉ｓｓＤＮＡ配列と接触させ、（ｆ）捕捉ｓｓＤＮＡが特異 的な結合対の一方の構成員に共有結合されている場合は、後者を特異的な結合対 のもう一方の構成員が共有結合された固形の水不溶性ビーズと接触させ、そして （ｇ）ハイプリダイズされたベクターＤＮＡを担持するビーズを水性媒体から分 離することからなる改良。
9. ９．標識化および変性工程（ｃ）および（ｄ）に先立ちプローブおよびベクター ＤＮＡをゲル電気泳動にかけてプローブＤＮＡから大部分のベクターＤＮＡを除 去する請求項８記載の方法。
10. １０．標識化工程（ｃ）が変性工程（ｄ）の前に行われそしてプローブおよびベ クターＤＮＡが放射性標識されたかまたはビオチン標議されたｄＮＴＰ類を用い るニツクトランスレーシヨンにより標識される請求項９記載の方法。
11. １１．クローニングベクターが細菌起源のベクターでありそしてプローブが感染 性病原体のｓｓＤＮＡ配列を包含する請求項１０記載の方法。
12. １２．（ａ）所望のｓｓＲＮＡプローブに相当するＤＮＡ挿入物を含有する組み 換えＤＮＡを該挿入物の上流に転写プロモーターを有するＤＮＡクローニングベ クター中にクローニングし、 （ｂ）このクローニング化されたＤＮＡをエンドヌクレアーゼで切断して直線状 クローン化ＤＮＡを生成させ、 （ｃ）直線状クローン化ＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼの存在下に標識ｒＮＴＰ類 と接触させて標識されたｓｓＲＮＡプローブを合成し、そして （ｄ）ＲＮＡからＤＮＡおよび取り込まれなかったｒＮＴＰ類を分離する、 ことからなる標識されたｓｓＲＮＡプローブの製法において、（ｅ）ＲＮＡをハ イブリダイゼーション条件下に水性媒体中で、固形の水不溶性ビーズにまたは特 異的な結合対の一方の構成員に共有結合されたクローニングペクターの捕捉ｓｓ ＤＮＡと接触させ、（ｆ）捕捉ｓｓＤＮＡが特異的な結合対の一方の構成員に共 有結合されている場合は、後者を特異的な結合対のもう一方の構成員が共有綜合 された固形の水不溶性ビーズと接触させ、そして（ｇ）ハイブリダイズされたベ クター由来ＲＮＡを担持するビーズを水性媒体から分離することカらなる改良。
13. １３．クローニングベクターが細菌起源のベクターでありそしてプローブが感染 性病原体のＤＮＡから転写されたｓｓＲＮＡ配列を包含する請求項１２記載の方 法。
14. １４．捕捉ｓｓＤＮＡ配列がビーズに共有結合されている請求項１１または１３ 記載の方法。
15. １５．ビーズが磁性である請求項１４記載の方法。
16. １６．ビーズがシラン被覆されたＣｒ０２ビーズである請求項１５記載の方法。
17. １７．捕捉ｓｓＤＮＡ配列が特異的な結合対の一方に結合されている請求項１１ または１３記載の方法。
18. １８．捕捉ｓｓＤＮＡ配列がビオチンに結合されておりそして固形の水不溶性ビ ーズがアビジンまたはストレプトアビジンに結合されている請求項１７記載の方 法。
19. １９．ＤＮＡクローニングベクターの配列が共有結合されている固形の水不溶性 ビーズ。
20. ２０．配列がＤＮＡクローニングベクターのいずれかのストランドに相補性であ るｓｓＤＮＡ配列である請求項１９記載のビーズ。
21. ２１．配列が細菌起源のベクターの配列である請求項２０記載のビーズ。
22. ２２．ＮＡ配列がｐＢＲ３２２の配列である請求項２１記載のビーズ。
23. ２３．強磁性物質からなる請求項１９、２０、２１または２２記載のビーズ。
24. ２４．シラン被覆されたＳｉＯ２からなる請求項２３記載のビーズ。
25. ２５．標識された組み換えクローン化ｓｓＮＡプローブから混入ベクター配列を 除去するための、請求項１９記載のビーズ、緩衝剤、および内容物を使用するた めの印刷された説明書を含有するキット。
26. ２６．特異的な結合対の一方の構成員に共有結合されたＤＮＡクローニングベク ターの配列からなる化合物。
27. ２７．ＤＮＡ配列がｓｓＤＮＡ配列である請求項２５記載の化合物。
28. ２８．ｓｓＤＮＡ配列がピオチンに共有結合されている請求項２６記載の化合物 。
29. ２９．ｓｓＤＮＡ配列が細菌起源のベクターの配列である請求項２７記載の化合 物。
30. ３０．ｓｓＤＮＡ配列がｐＢＲ３２２の配列である請求項２８記載の化合物。
31. ３１．標識された組み換えＮＡプローブから混入ベクター配列を除去するための 、請求項２６記載の化合物、特異的な結合対のもう一方の構成員が共有結合され た固形の水不溶性ビーズ、緩衝剤、および内容物を使用するための印刷された説 明書を含有するキット。
32. ３２．放射性標識された組み換えクローン化ｓｓＮＡプローブから混入ベクター 配列を除去するための、請求項２９記載の化合物、アビジンまたはストレプトア ビジンが共有結合された固形の水不溶性ビーズ、緩衝剤、および内容物を使用す るための印刷された説明書を含有するキット。