NO841725L - Fremgangsmaate og stoffer til bruk ved analyse og paavisning av genetisk materiale - Google Patents

Description

Det er utviklet teknikker for analyse av genetisk materiale, slik som DNA og/eller RNA. F.eks. er det utviklet teknikker for kartlegging av gener, slik som gener i cellulære DNA-fragmenter som er blitt adskilt ved elektroforese etter oppdeling eller spalting av det cellulære DNA eller det genetiske materiale ved hjelp av restriksjons endonukleaser og andre midler, og festet til en bærer. Ved slike teknikker for identifiseringen eller analysen av det genetiske materialet, har det vært anvendt en radioaktiv sondeforbindelse, slik som en DNA-sonde som inneholder radioaktivt fosfor som en bestanddel i en eller flere av nukleotidene som utgjør sonden. Sonden tilføres det prepaarerte, genetiske materialet ved betingelser, slik at hybridisering ~v-mellom sonden og det aktuelle genetiske materialet oppstår. Deretter påvises de resulterende, fremstilte hybrider som inneholder den radioaktive, fosformerkede DNA-sonden hybridisert med det genetiske DNA-materialet eller -fragmentet av interesse, ved hjelp av vanlig kjente fremgangsmåter for påvisning av radioaktivt materiale. Bruken av radioaktive sonder for analyse av genetisk materiale, slik som DNA og/eller RNA, er uegnet av en rekke grunner. F.eks.

både utvises forsiktighet ved håndteringen av radioaktive materialer. De radioaktive materialene som vanligvis anvendes, slik som tritium eller radioaktivt fosfor, har en forholdsvis kort halveringstid, og må ofte suppleres. Som et resultat av det ovenfor nevnte, har bruken av en radioaktiv sonde ved analysen av genetisk materiale også en tendens til å være tidkrevende ettersom det, på grunn av den radioaktive strålingsstyrken som skal påvises, kreves en forlenget eksponering av strålingsfølsom film, slik som en rekke dager. Definisjonen av det genetiske materialet som inneholder den hybridiserte radioaktive sonden, har også ofte en tendens til å være uklar og lite presis.

Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret teknikk for analyse av genetiske materialer og beslektede materialer, hvor DNA- og/eller RNA-materi alet, etter egnet behandling, hybridiseres med en ikke-radioaktiv sonde.

Det er et annet formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe

en forbedret teknikk for analyse av genetiske og andre materialer under anvendelse av en sonde. Det er nok et annet formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret teknikk for analyse av genetisk materiale, slik som DNA- eller RNA-fragmenter, hvor det anvendes en sonde som er istand til å hybridisere med det genetiske materialet som skal identifiseres eller lokaliseres, og hvor tilstedeværelsen av den resulterende sonde, nå hybridisert med materialet som skal idnetifiseres, lett bringes^, for dagen og dens tilstedeværelse defineres.

Nok et annet formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en teknikk for å bekrefte tilstedeværelsen av genetisk materiale når analysen av det genetiske materialet gir et negativt resultat.

Hvordan disse og andre forhold ved foreliggende oppfinnelse oppnås, vil bli klart i lys av beskrivelsen nedenunder.

Teknikker for analyse og/eller identifisering av forskjellige materialer, slik som proteiner eller genetiske materialer, slik som DNA- og/eller RNA-fragmenter, eller gen-holdige DNA-fragmenter eller gener, forbedres ved å anvende den kjemisk merket sonde. Ved teknikker i henhold til foreliggende oppfinnelse for analyse av slike materialer hvor det anvendes en kjemisk merket sonde, denatureres materialet og festes, f.eks. festes til en bærer eller festes in situ, og deretter hybridiseres det med en kjemisk merket sonde. Til det resulterende hybrid som inneholder den kjemisk merkede sonde, er det tilføyd eller festet, slik som den kjemiske markøren eller resten av sonden, en kjemisk bestanddel slik som en enzymbestanddel, som etter kontakt med et kromogen eller lignende materiale gir, sammen med et kromogen eller lignende materiale, et farget eller synlig produkt eller uoppløselig farge-utfelling som vanligvis hurtig er lett observerbar ved hjelp av visuell inspeksjon, særlig i kontrast til bruken av radioaktivt merket sonde som krever mange timer og spesialutstyr, f.eks. film, før tilstedeværelsen eller fraværet av hybridet som inneholder den radioaktive sonde, kan identifiseres eller lokaliseres. Teknikkene som er forbedret ved anvendelse av en kjemisk merket sonde i overensstemmelse med utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, er mange og varierte. F.eks. er teknikken for analyse av genetisk materiale, slik som DNA-fragmenter, kjent som "Southern plot"-analyse, særlig anvendbar ved utøvelsene av foreliggende oppfinnelse. Teknikkene for å utøve "Southern plot"-analyse av genetisk materiale, slik som DNA-fragmenter, er beskrevet i "Journal of Molecular Biology

(1975) 98, 503-517, under tittelen "Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated by Gel Electropho-resis". En annen teknikk for genetisk analyse som er forbedret ved å anvende en kjemisk merket sonde i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, er den såkalte koloni-hybridiseringen. Kolonihybridiseringsteknikken for genetisk analyse er beskrevet i "Methods of Enzymology", red. av Ray Wu (1979), vol. 68, sidene 379-409, publisert av Academic Press, se særlig artikkelen av M. Grunstein og J. Wallis med tittelen "Colony Hybridization", og i "Proceedings of the National Academy og Science, USA, vol. 72, nr. 10, sidene 3961-3965, oktober 1975 i artikkelen av M. Grunstein ogD.S.Hogness med tittelen "Colony Hybridization; A Method for the Isolation of Cloned DNAs that Contain a Specific Gene". En annen teknikk for genetisk analyse som er forbedret ved anvendelsen av en kjemisk merket sonde i overensstemmelse med utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, er kalt cytoplasmisk punkt-hybridisering, se artikkelen av B.A. White og F.C. Brancroft med tittelen "Simple Analysis of Relative mRNA Levels in Multiple Small Cell or Tissue Samples", publisert i "The Journal of Biolo-gical Chemistry", (1982), vol. 257, Nr. 15, sidene 8569- 8572. En annen beslektet teknikk for analyse- av genetisk materiale er beskrevet i "Proceedings of the Nationla Academy og Sciences, USA, (1977), vol. 74, nr. 12, sidene 5350-5354, artikkelen av J.C. Alwine, D.J.Kemp og G.R.Stark med tittelen "Method for Detection of Specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-Paper and Hybridization with DNA Probes". Andre teknikker og anvendelser av genetiske analyser som er forbedret ved anvendelse av kjemisk merkede sonder i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i Gene, (1980) 10, sidene 63-67, artikkelen av D..Hånahan og M. Meselson med tittelen "Plasmid Screening at High Colony Density". Andre teknikker og anvendelser som omfatter analyse av genetiske materialer og som er forbedret ved å anvende en kjemisk merket sonde i overensstemmelse med utøvelsene av foreliggende oppfinnelse, er gjengitt i artikkelen av J.C.Chang et al., med tittelen "A Sensitive New Prenatal Test for Sickle-Cell Anemia", The New England Journal of Medicine", 1. juli,

1982, sidene 30-36, og artikkelen av J.T. Wilson et al.,

med tittelen "Use of Restriction Endonucleases for Mapping the Allele for Beta -Globin", i "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, vol. 79, sidene 3628-3631, juni 1982, og artikkelen av B.J.Conner et al., med tittelen "De tection of Sickle Cell Beta -Globin Allele by Hybridization with Synthesis Oligonucleotides" i "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, vol. 80, sidene 278-

282, januar 1983.

En annen teknikk som kan forbedres ved å anvende en kjemisk merket sonde i henhold til utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, er at det genetiske materialet kan festes in situ slik som in situ hybridisering til celler og/eller vev.

In situ hybridisering til celler og/eller vev, muliggjør

at man kan analysere det genetiske materialet uten å rense materialet. Dette resulterer i en hurtig analyse av det genetiske materialet. Dette er særlig fordelaktig i kliniske omgivelser, hvor det er ønskelig å analysere det gene-

tiske materialet hurtig. In situ hybridisering til celler og/eller vev muliggjør også at man kan påvise lokalisering av det genetiske målmaterialet innenfor cellene eller vevene. Teknikker for in situ hybridisering til celler og/eller

vev er beskrevet i artikkelen av Pardue med tittelen "Nucleic Acid Hybridization to the DNA of Cytological Prepara-tions" i "Methods in Cell Biology" (1975, sidene 1-16, og i artikkelen av Brahic et al., med tittelen "Detection of Viral Sequences of Low Reiteration Frequency by In Situ Hybridization" i Proe. Nati. Acad. Sei. USA., vol. 75, sidene 6125-6129desember 1978, og i artikkelen av Gerhard et al., med tittelen "Localization of a Unique Gene by Direct Hybridization In situ", i Proe. Nati. Acad. Sei.

USA, vol. 78, sidene 3755-3759, juni 1981.

Generelt forbedres de teknikkene for genetisk analyse som omfatter denaturering av genetisk materiale, slik som DNA-fragmenter, etterfulgt av fraksjonering eller separering av det genetiske materialet av interesse, slik som ved elektroforese og festing av det således behandlede genetiske materialet til en passende bærer, slik som nitrocellulosepapir, etterfulgt av hybridisering, ved å anvende som hybri-diseringssonde en kjemisk merket sonde for identifisering , som angitt ovenfor har slike teknikker blitt henvist til som "dot blots", kolonihybridisering, "plaque lifts", "Southern", "Northern" og "Western blots". Beskrivelsene i alle de ovenfor identifiserte publikasjonene, særlig med hensyn til de forskjellige teknikker som er involvert, hvor-av praktisk talt alle er anvendbare ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, innlemmes her og gjøres til en del av foreliggende beskrivelse.

Teknikkene for analyse av genetisk materiale ifølge foreliggende oppfinnelse, kan brukes til å analysere praktisk talt ethvert genetisk materiale. F.eks. kan viruser, bakterier og genetiske defekter analyseres. Ikke-begrensende eksempler på virus og bakterier er Herpes Simplex virusene

I og II, Hepatitis B, Cytomegalovirus, Epstein Barr virus, Hepatitis A, Neisseira genorrhoeae, Mycoplasma, Streptococ-cus A, Chlamydia, ampicillin-resistens, Syphillis, E.coli, Mycobacterium, Meningokokker, Haemophilis, Enterovirus, Staphylococcus, Proteus, Klebsiella aearogenes, Klebsilia pheumonia, Pseudomonas, Papilloma-virus, pheumokokk, RSV, Parainfluenza. Legionella, Camphylobacter, Salmonella, Shigella, Rotavirus og Adenovirus. Ikke-begrensende eksempler på genetiske defekter som kan analyseres er cystisk fibrose, Huntington chorea, visse former for muskulære dys-trofier, sigcelleanemi, hemophili og en rekke kreftformer og andre metabolske sykdommer.

Forskjellige typer kjemisk merkede sonder, f.eks. kjemisk merkede polynukleotider, kan anvendes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, F.eks. er en særlig anvendelig kje misk merket sonde en sonde som inneholder en eller flere biotin-merkede nukleotider, slik som det biotinylerte nukleotidet 2ædeoksyuridin trifosfat 5-allylamin-biotin. Biotin-merkede polynukleotider som kan anvendes som kjemisk merkede sonder i overensstemmelse med utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, vol. 78, nr. 11, sidene 6633-6637, november 1981, i artikkelen av P.R.Langer et al., med tittelen "Enzymatic Synthesis of Biotin-Labeled Polynucleotides; Novel Nucleic Acid Affinity Probes". Kjemisk merkede sonder er også beskrevet i US patensøknad nr. 255,233, innlevert 17. april 1981 med tittelen "Modified Nucleotides and Methods for Preparing and Using Same", og i US patentsøknad nr. 391.440, inngitt 23. juni 1982 med tittelen "Modified Nucleotides, Methods for Preparing and Utilizing and Compo-sitions Containing the Same". Beskrivelsene i den ovenfor angitte artikkel og de ovenfor angitte US patentsøknadene innlemmes her og gjøres til en del av foreliggende beskrivelse.

Med hensyn til de kjemisk merkede sondene som kan anvendes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, så har forbindelser eller nukleotider som er fremstilt for innføyelse i DNA, slik som dobbeltkjedet DNA, og som også er anvendelig til fremstillingen av kjemisk merkede sonder ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, strukturformelen

hvor B er en purin-, deazapurin- eller pyrimidin-rest som er kovalent bundet til C 1 •-stillingen i sukkerresten, forutsatt at når B er purin eller 7-deazapurin, er den bundet i N 9-stillingen i purinet eller deazapurinet, og når B er pyrimidin, er den bundet i N^-stillingen;

hvor A er en rest bestående av minst 3 karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen føyes inn i en dobbeltkjedet ribonuk-leinsyre, deoksyribonukleinsyre-dupleks eller DNA-RNA-hybrid,

hvor den prikkede linjen er en kjemisk binding som føyer

B og A sammen, forutsatt at dersom B er purin, er bindingen festet til 9-stillingen i purinet, dersom B er 7-dezazpurin, er bindingen festet til 7-stillingen i diazapurinet, og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet til 5-stillingen i pyrimidinet, og

hvor hver av x, y og z er

er vidt anvendelige som sonder i biomedisinek forskning og rekombinant DNA teknologi.

Særlig anvendelig er forbindelser som omfattes av denne strukturformelen og som i tillegg har en eller flere av de følgende kjennetegn: A er ikke-aromatisk, A er minst Ce-, den kjemiske bindingen som føyer B og A sammen, omfatter en alfa-olefin-binding, A er biotin eller iminobiotin; og B er pyrimidin eller 7-deazapurin.

US patentsøknad nr. 255 233 åpenbarer også forbindelser med strukturformelen:

hvor hver av B, B<1>og B" er en purin, 7-deazapurin, eller pyrimidinrest kovalent bundet til C 11-stillingen i sukker-resten, forutsatt at når B, B' eller B" er purin eller 7-deazapurin, er den bundet i N9--stillingen i purinet eller 7-deazapurinet, og når B, B<1>eller B" er pyrimidin, er den

bundet i N^-stillingen;

hvor A er en rest bestående av minst 3 karbonatomer, som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen føyes inn i en dobbeltkjedet dupleks dannet med et komplementært ribonuklein- eller deoksyribo-nukleinsyremolekyl,

hvor den prikkede linjen er en kjemisk binding som føyer B og A sammen, forutsatt at dersom B er pyrin, er bindingen festet til 8-stillingen i purinet, dersom B er 7-deazapurin, er bindingen festet til 8-stillingen i deazapurinet, og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet til 5-stillingen i pyrimidinet,

hvor z er H- eller HO-; og

hvor m og n er hele tall fra 0 og opp til ca. 100 000.

Disse forbindelsene kan fremstilles ved enzymatisk polymeri-sering av en blanding av nukleotider som omfatter de modifiserte nukleotidene som er tilstede i oligo- eller polynukleotider, og kan modifiseres ved å bruke kjemiske fremgangsmåter .

De kjemisk merkede eller modifiserte nukleotidene beskrevet i den ovenfor angitte PNAS-artikkel, og i US patentsøknad nr. 255.223, har som angitt ovenfor, strukturen:

hvor B er en purin-, 7-deazapurin- eller pyrimidinrest kovalent bundet til C^-stillingen i sukkerresten, forutsatt at når B er purin eller 7-deazapurin, er den festet til

N 9 -stillingen i purinet eller 7-deazapurinet, og nå°r B er pyrimidin, er den festet i N"<*>"-stillingen;

hvor A er en rest bestående av minst 3 karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen føyes inn i en dobbeltkjedet ribonu-kleinsyre, deoksyribonukleinsyre-duplex eller DNA-RNA-hybrid;

hvor den prikkede linjen er en bindingsgruppe som knytter sammen B og A, forutsatt at dersom B er purin, er bindingen festet til 8-stillingen i purinet, dersom B er 7-deazapurin, er bindingen festet til 7-stillingen i deazapurinet og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet til 5-stil"<1->lingen i pyrimidinet; og

hvor hver av c, y og z er

Disse forbidnelsene er vidt anvendelige som sonder i bio-medisinsk forskning og rekombinant DNA teknologi.

Selv om alle forbindelsene som omfattes av denne strukturformelen i prinsippet kan fremstilles og brukes i henhold til utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, fremstilles eller brukes eller begge deler noen av forbindelsene lettere,

og foretrekkes derfor umiddelbart.

Selv om puriner, pyrimidiner og 7-deazapuriner i prinsippet er anvendelige, foretrekkes således pyrimidiner og 7-deazapuriner ettersom purin-substitusjon i 8-stillingen har en tendens til å gjøre nukleotidene uvirksomme som polymerase-substrater. Selv om modifiserte puriner er nyttige i visse henseender, er de således generelt ikke så anvendelige som pyrimidiner og 7-deazapuriner. Videre kan ikke pyrimidiner og 7-deazapuriner som er anvendelige ved foreliggende opp finnelse, være naturlig substituerte i henholdsvis 5- eller 7-stillingene. Som et resultat av dette, er visse baser, slik som tymin, 5-metylcytosin og 5-hydroksymetylcytosin, ikke anvendelige. Baser som for tiden er foretrukket er cytosin, uracil og deazaguanin.

A kan være en hvilken som helst rest som har minst 3 karbonatomer og er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når det modifiserte nukleotidet føyes inn i en dobbeltkjedet duplex som inneholder enten deoksyribo-nuklein- eller ribonuklein-syre.

A kan derfor være en hvilken som helst ligand som har disse egenskaper, inkludert haptener som er immunogene bare når de er bundet til en egnet bærer, men som ved gjensidig påvirkning med passende antistoffer er istand til å gi komplekser. Eksempler på rester som er anvendelige er:

Blandt disse er biotin og iminobiotin de foretrukne A-restene.

Ettersom aromatiske rester videre har en tendens til å gå inn i en baseparet, helisk struktur, er det foretrukket at resten A er ikke-aromatisk. Ettersom det kan skje at mindre rester ikke gir tilstrekkelig gjensidig molekylær' påvirkning med polypeptider, er det også foretrukket at A minst er C^, slik at det kan oppstå tilstrekkelig gjensidig påvirkning til at dannelsen av stabile komplekser kan skje. Biotin og iminobiotin tilfredsstiller begge disse kriteriene.

Bindingen eller gruppen som føyer resten A til basen B,

kan omfatte en hvilken som helst av velkjente bindinger, inkludert karbon-karbon enkeltbindinger, karbon-karbon-dobbeltbindinger, karbon-nitrogen enkelt-bindinger, eller karbon-oksygen enkelt-bindinger. Det er imidlertid generelt foretrukket at den kjemiske bindingen omfatter en olefin-binding i alfa-stillingen i forhold til B. Tilstedeværelsen av en slik alfa-olefin binding tjener til å holde resten A borte fra basen når basen pares med en annen i den velkjente dobbel-heliks-konfigurasjonen. Dette lar gjensidig påvirkning med polypeptid oppstå lettere, og letter derved kompleksdannelsen. Videre holder ikke enkeltbindinger med større rotasjonsfrihet bestanddig resten tilstrekkelig langt borte fra heliksen til at gjenkjenning av og kompleksdan-nelse med polypeptidet kan skje.

Det er ennå mere foretrukket at den kjemiske bindingsgruppen er avledet fra et primært amin, og har en struktur -Cf^-NH-, ettersom slike bindinger lett dannes ved å anvende en hvilken som helst av velkjente modifikasjonsreaksjoner for amin. Eksempler på foretrukkede bindinger avledet fra allylamin og allyl-(3-amino-2-hydroksy-l-propyl)-eter-grupper har henholdsvis formlene -CH=CH=CH2-NH- og

-CH=CH-CH2-0-CH2-CH-CH2-NH-.

OH

Selv om disse bindingene er foretrukket, kan andre brukes, inkludert særlig olefin-bindings grener med andre modifiserbare funksjonelle grupper, slik som tiol-, karboksylsyre-

og epoksyd-grupper.

Bindingsgruppene festes i bestemte stillinger, nemlig 5-stillingen i et diazapurin. Som tidligere angitt, gir ikke substitusjonen av 8-stillingen i et purin et modifisert nukleotid som er anvendelig ved alle fremgangsmåtene som her er omtalt. Det kan være at 7-stillingen i et purin som er opptatt av et nitrogenatom, kan være tilknytnings-punktet. De kjemiske substitusjons-fremgangsmåtene som hittil har vært anvendt, og som her er omtalt, er imidlertid ikke egnet for dette formålet.

Bokstavene x, y og z er grupper festet til 5'-, 3'- og 2'-stillingene i sukkerresten. De kan være hvilken som helst av

Selv om det er mulig, er det lite trolig at både x, y og

z samtidig vil være den samme gruppen. Mer sannsynlig er det at minst en av x, y og z er en fosfatholdig gruppe, enten mono-, di-, eller tri-fosfat, og at minst en er H0-eller H-. Som det lett vil forstås, er den mest sannsynlige identiteten til z HO- eller H-, noe som indikerer henholdsvis ribonukleotid og deoksyribonukleotid. Eksempler på slike nukleotider omfatter 5<1->ribonukleosid monofosfater,

5'-ribonukleosid difosfater, 5'-deoksyribonukleosid tri-fosfater, 5<1->ribonukleosid-3<1>p, og 5<1>p-deoksyribonukleosid, 3'p. Bestemte eksempler omfatter modifiserte nukleotider av denne type hvor A er biotin eller iminobiotin, idet den kjemiske bindingen er

og B er uracin eller cytosin.

Den generelle syntetiske fremgangsmåte som anvendes for

å innføre bindingsgrenen og sonderesten i basen, er omtalt ovenfor. (Se særlig J.L.Ruth og D.E.Bergstrom, og M.K. Ogawa. J. Amer, Chem. Soc. 100, 8106, 1978; og C.F.Bigge", P-Kalaritis, J.R.Deck og M.P-Mertes, J. Amer. Chem. Soc. 102, 2033, 1980). Olefinsubstituentene som her anvendes, har imidlertid ikke blitt brukt tidligere. For å lette tilknytning av sonderesten A, er det funnet særlig ønskelig å anvende olefiner med primære funksjonelle amingrupper, slik som allylamin som tillater sondetilknytning ved hjelp av standard modifikasjonsreaksjoner for amin, slik som

På grunn av lett fremstilling, er det funnet foretrukket

å bruke NHS-estere for sondetilknytning. Det kan imidlertid også anvendes olefin-bindingsgrener med andre modifiserbare funksjonelle grupper, slik som tioler, karboksylsyrer, epok-syder 6.1. Videre kan både bindingsgren og sonde tilsettes i et enkelt trinn dersom det anses som ønskelig.

Det å ha biotinsonden direkte festet til nukleotidderivatene som er istand til å virke som enzymsubstrater, gir betydelig allsidighet, både med hensyn til de eksperimentelle fremgangsmåtene og i påvisningsfremgangsmåtene (mikroskopisk og ikke-mikroskopisk) som kan anvendes til analyse. F.eks. kan biotin innføres i polynukleotider som er i ferd med å blit syntetisert, ved hjelp av celler eller rå celleeks-trakter, og således gjøre det mulig å påvise og/eller iso-lere naserende (voksende) polynukleotid-kjeder. En slik fremgangsmåte er umulig å utføre ved hjelp av en direkte kjemisk modifikasjonsfremgangsmåte. Videre kan det brukes enzymer som reagenser for å innføre sonder slik som biotin i høyselektive eller stedspesifike lokaliseringer i polynukleotider, den kjemiske syntese av lignende sondemodifi-serte produkter ville i beste fall være svært vanskelig å oppnå.

Videre er det i US patentsøknad nr. 391.440, inngitt 23. juni 1982, beskrevet modifiserte ikke-radioaktive, kjemisk merkede nukleotider hvor nukleotidene er modifiserte slik som i fremstillingen i pyrimidin eller i 7-stillingen i purin, forberedt for fremstilling av nukleotidsonder som er egnet for tilknytning til eller innføyelse i DNA eller andre nukleinsyrestoffer. Ved fremstillingen av slike modifiserte nukleotider, modifiseres nukleotidene, dvs. nukleinsyrene, fortrinnsvis på en ikke-nedbrytende måte, slik at de resulterende modifiserte nukleotidene kan innføyes i nukleinsyrer og når de først er innføyet i nukleinsyrer, innvirker de modifiserte nukleotidene ikke i noen betydelig grad på dannelsen eller stabiliseringen av dobbel-helixen som dannes av de resulterende nukleinsyrene som inneholder de modifiserte nukleotidene. Den ikke-nedbrytende modifika-sjonen av nukleotider og nukleinsyre som inneholder slike modifiserte nukleotider, står i kontrast til de modifika-sjonene av nukleotider som er kjennetegnet ved en nedbrytende modifikasjon i den betydning at de resulterende, nedbrutt modifiserte nukleotidene og nukleinsyrene som inneholder de samme, blokkerer for korrekt dobbelthelix-dannelse.

Ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, modifiseres nukleotidene fortrinnsvis i fremstillingen i pyrimidinet eller i 7-stillingen i purinet. Nukleotidene som er modifisert på en slik måte, er modifisert på en ikke-nedbrytende måte, og nukleinsyrene som inneholder slike nukleotider, er istand til å danne et dobbelthelix arrangement.

Ved en annen side av utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, er i alminnelighet forskjellige fremgangsmåter anvendelige for påfesting eller merking av DNA på en ikke-nedbrytende måte. F.eks. tilføyes biotin til enden av et DNA- eller RNA-molekyl. Denne addisjonen av biotin ledsages av addi-sjon av et ribonukleotid. De 3', 4' vicinale hydroksyl-gruppene oksyderes ved perjodatoksydasjon og deretter redu-seres de ved borhydrid i nærvær av biotinhydrazid. Eventuelt kan også karbodiimid brukes til å koble biotin til aldehyd-gruppen.

En annen teknikk for endemerking av nukleinsyrematerialer slik som DNA eller RNA, omfatter addisjonen av en stor mar-kør til enden av et DNA- eller RNA-molekyl. Et eksempel på denne teknikken er addisjonen av et molekyl, f.eks. lysylglycin, hvor aminogruppene er påhengt biotin. Et annet eksempel ville være å følge fremgangsmåten angitt ovenfor under anvendelse av karbodiimid som kryssbindingsmiddelet. Nok et annet eksempel på denne teknikken ville være å fremstille en biotynilert dA:dU-dobbelthelisk polymer og å binde denne polymeren til den fremstilte sonden i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse.

Nok en teknikk for endemerking av DNA på en ikke-nedbrytende måte omfatter isoleringen av dPyrTP som har et putricin eller permidin i 5-stillingen, fra PS16 eller fag-infiserte celler. Om ønsket, fremstilles dPyrTP fra fag-DNA og fosfo-ryleres til dPyrTP etterfulgt av modifikasjon av polyamin-sidekjeden ved hjelp av standard nukleofil-reagens NHS-biotin.

En annen teknikk for endemerking av DNA på en ikke-nedbrytende måte, omfatter addisjonen av glukose til 5--hydroksymetylcytosin (5 HMC) i DNA ved å bruke enzymer som glykosylerer T4 fag, etterfulgt av utsortering ved hjelp av en lektin-basert analyse.

Nok en annen fremgangsmåte for å endemerke DNA på en ikke-nedbrytende måte, omfatter 5-HMC-trifosfat, fremstilt fra hydrolyse av T4-DNA etterfulgt av fosforylering av 5HMCMP til 5 MMCTP. 5 HMCTP innføres så i DNA ved å bruke poly-merase I. Således kan et hvilket som helst DNA modifiseres slik at det får innføyet 5HMC uten nedbryting.

En fremgangsmåte for å endemerke DNA på en svakt nedbrytende måte, omfatter å omsette nukleinsyrer i den dobbel-heliske form med alkyleringsreagenser som f.eks. benzopyren diol-epoksyd eller aflatoksin. Under passende betingelser for N2 gruppen i guanin, alkyleres N4 gruppen i adenosin eller N4 gruppen i cytosin. Disse modifiserte nukleotidene kan brukes som bindingskjeder for addisjonen av et indikator-molekyl, slik som biotin.

Disse spesifikt modifiserte nukleotidene som er egnet som ikke-radioaktive kjemiske markører for DNA-sonder eller DNA-materiale slik som beskrevet i US patentsøknad nr. 391.440, kan i alminnelighet karakteriseres og beskrives som fosforsyre P-rest, en sukker eller monosakkarid S-rest, en base B-rest, et purin eller et pyrimidin og hvortil det kovalent er bundet en signaliserende kjemisk rest Sig, enten til P-, S- eller B-resten.

Av spesiell interesse er de nukleotidene som har den generelle formel

hvor P er fosforsyreresten inkludert mono-, di-, tri- eller tetrafosfat, S er sukkeret i monosakkarid-resten, B er base-resten, enten et purin eller et pyrimidin. Fosforsyreresten P er bundet i 3' og/eller 5'-stillingen i S-resten når nukleotidet er et deoksyribonukleotid og i 2', 3'- og/eller 5'-stillingen når nukleotidet er et ribonukleotid. Base-resten B er bundet i Ni- eller N9-stillingen, og i 1'-stillingen i S-resten når baserresten er henholdsvis et pyrimidin eller et purin. Sig-resten er kovalent bundet til B-resten i nukleotidet, og når den er slik bundet, er den istand til å signalisere seg selv eller gjøre seg selv-påvisende, eller sin tilstedeværelse kjent og tillater, om ønsket eller foretrukket, innføyelsen av det resulterende nukleotid P - S - B - Sig i eller til å danne et dobbelt-kjedet helisk DNA- eller RNA, eller DNA-RNA-hybrid og/eller derved bli påvisbar. Et annet spesielt nukleotid i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved den generelle formel

Slike nukleotider i henhold til oppfinnelsen, vil blikarakterisertsom ribonukleotider. Fosforsyre-resten er festet i 2'-, 3'- og/eller 5<1->stillingen i sukkerresten S og basen B er festet fra NI- eller N9-stillingen til 1'-stillingen i sukkerresten S når basen er henholdsvis pyrimidin eller purin. Den kjemiske resten Sig er kovalent bundet til sukkerresten S og er istand til å signalisere sitt nærvær eller gjøre seg selv-påvisende eller sin tilstedeværelse kjent,

og tillater fortrinnsvis innføyelsen av ribonukleotidet i sitt tilsvarende dobbeltkjedede RNA eller et DNA-RNA-hybrid.

Det er ønskelig at slie nukleotider

har den kjemiske resten Sig bundet i Ca<1->stillingen i S-resten eller C3<1->stillingen i S-resten. Ytterligere nukleotider i henhold til utøvelsen av fore--liggende oppfinnelse, omfatter nukleotidene med formelen hvor P er fosforsyreresten, S er sukkerresten og B er base-resten. I disse spesielle nukleotidene er P-resten festet til 3'- og/eller 5<1->stillingen i S-resten når nukleotidet er deoksyribonukleotid, og i 2'-, 3'- og/eller 5<1->stillingen når nukleotidet er et ribonukleotid. Basen B er enten et purin eller en pyrimidin og B-resten er bundet fra NI- eller N9-stillingen til 1'-stillingen i sukker-resten når B-resten er henholdsvis et pyrimidin eller purin. Den kjemiske resten Sig er kovalent bundet til fosforsyre-resten P via den kjemiske forbindelsen

idet Sig, når den er bundet til P-resten, er istand til å signalisere seg selv eller gjør seg selv-påvisende eller sin tilstedeværelse kjent, og det er ønskelig at nukleotidet er istand til å innføyes i et dobbelt-kjedet polynukleotid, slik som DNA, RNA eller DNA-RNA-hybrid, og at det frem-deles er selv-påvisende når det er innføyet slik.

Det skal påpekes at de spesielle nukleotidene i henhold

til utøvelsen av foreliggende oppfinnelse beskrevet eller definert ovenfor ved den generelle formelen P - S - B - Sig, også omfatter nukleotider hvor den kjemiske resten Sig er kovalent bundet til B-resten i N6- eller 6-aminogruppe-stillingen, når B-resten er adenin, eller i N2- eller 2-aminogruppe-stillingen når B-resten er guanin, eller i N4-eller 4-aminogruppe-stillingen når B-resten er cytosin.

De fremstilte nukleotider hvortil Sig-resten er bundet,

er istand til å signalisere seg selv eller gjøre seg selv-påvisende, eller sin tilstedeværelse kjent, og er påvisbare i en dobbelt-kjedet DNA, RNA eller DNA-RNA hybrid.

Som en oppsummering, slik som angitt ovenfor med hensyn -

til fremstillingen av de forskjellige spesielle nukleotidene i henhold til foreliggende oppfinnelse, kan de spesielle nukleotidene beskrives som omfattende en fosforsyrerest S og en baserest B, et purin eller pyrimidin, idet kombina-sjonen av P - S - B er velkjent for og definerer nukleotider, både deoksyribonukleotidet og ribonukleotider. Nukleotidene modifiseres så i henhold til utøvelsen av oppfinnelsen ved at de kovalent får bundet til seg, til P-resten og/eller S-resten og/eller B-resten, en kjemisk rest Sig. Den kjemiske resten Sig som slik er bundet til nukleotidet P -

S - B, er istand til å gjøre det resulterende nukleotid,

som nå omfatter P - S - B med Sig-resten bundet til en eller flere av de øvrige restene, selvpåvisende eller istand til å signalisere seg selv eller istand til å gjøre sin tilstedeværelse kjent per se, når det innføyes i et polynukleotid, særlig et dobbeltkjedet polynukleotid, slik som en dobbeltkjedet DNA, en dobbeltkjedet RNA eller et dobbelt-kjedet DNA-RNA hybrid. Det er ønskelig at Sig-resten ikke påvirker evnen hos nukleotidet til å danne et dobbelt-kjedet polynukleotid som inneholder det spesielle Sig-holdige nukleotidet i henhold til oppfinnelsen, og at, når den er innføyet, det Sig-holdige nukleotid er istand til å bli påvist, lokalisert eller observert.

Sig-resten som anvendes ved fremstillingen av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen, kan omfatte et enzym eller enzymatisk materiale, slik som alkalifosfatase, glukoseoksydase, pepperrot-peroksydase eller ribonuklease. Sig-

resten kan også inneholde en fluorecerende bestanddel, slik som fluorescein eller rhodamin eller dansyl. Om ønsket,

kan Sig-resten omfatte en magnetisk bestanddel som er for-enet eller bundet til resten, slik som et magnetisk oksyd eller magnetisk jernoksyd, som vil gjøre nukleotidet eller polynukleotidet som inneholder en slik magnetisk-holdig Sig-rest påvisbar ved hjelp av magnetiske midler. Sig.-resten kan også omfatte en elektrontett bestanddel, slik som ferritin, for å være tilgjengelig for observasjon. Sig-resten kan også omfatte en radioaktig isotop bestanddel, slik som radioaktiv kobolt, som gjør det resulterende nukleotid observerbart ved hjelp av påvisningsmidler for stråling. Sig-resten kan også omfatte en hapten-bestanddel eller per

se være istand til å danne kompleks med et antistoff som er spesifikt for resten. Nyttigst er det at Sig-resten er et polysakkarid eller oligosakkarid, eller monosakkarid, som er istand til å danne kompleks med eller bindes til et sukker-, eller polysakkarid-bindende protein,

slik som et lektin, f.eks. Concanavilain A. Sig-bestanddelen eller -resten i de spesielle nukleotidene i henhold til oppfinnelsen, kan også omfatte en kjemi-luminiserende bestanddel.

Som angitt, kan Sig-bestanddelen, i henhold til utøvelsen

av oppfinnelsen, omfatte en hvilken som helst kjemisk rest som lar seg feste enten direkte eller over en kjemisk binding eller forbindelsesgruppe til nukleotidet, slik som til base-bestanddelen B, eller til sukker-bestanddelen S, eller til fosforsyre-bestanddelen P.

Sig-bestanddelen i nukleotidene i henhold til oppfinnelsen og nukleotidene og polynukleotidene hvori nukleotidene ifølge oppfinnelsen som inneholder Sig-bestanddelen, innføyes,

er ekvivalente med og brukbare for de samme formål som

nukleotidene beskrevet i den ovenfor identifiserte US patent-søknad nr. 255.223. Nærmere bestemt er den kjemiske resten A beskrevet i US patentsøknad nr. 255.223 funksjonelt sett ekvivalenten til Sig-bestanddelen eller den kjemiske resten i de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen. Følgelig kan Sig-bestanddelen eller den kjemiske resten i nukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse bindes direkte kovalent til P-, S- eller B-restene, eller festes til disse via en kjemisk binding eller forbindelsesdel, slik som beskrevet i US patentsøknad nr. 255.223, og slik som angitt ved hjelp av den prikkede linjen som knytter B og A sammen i nukleotidene ifølge US patentsøknad nr. 255.223. De forskjellige bindingsdelene eller bindingene som er angitt i US søknad nr. 255.223, er anvendbare og nyttige ved fremstillingen av de spesielle nukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Et særlig viktig og nyttig aspekt ved de spesielle nukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse, er bruken av slike nukleotider ved fremstillingen av DNA- eller RNA-sonder. Slike sonder inneholder en nukleotidsekvens som i hovedsak passer til DNA- eller RNA-sekvensen i det genetiske materialet som skal lokaliseres og/eller identifiseres. Sonden inneholder en eller flere av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen. En sonde med en ønsket nukleotid-sekvens, slik som et en-kjedet polynukleotid, enten DNA- eller RNA-sonde, bringes så i kontakt med genetisk DNA- eller RNA-materiale som skal identifiseres. Etter lokaliseringen av sonden og dannelsen av et dobbelt-kjedet polynukleotid som inneholder sonden og det DNA- eller RNA-materialet som passer til og som skal identifiseres, vil så det dannede dobbelt-kjedede DNA- eller RNA-holdige materialet så være observerbart og bli identifisert. En sonde i henhold til foreliggende oppfinnelse kan inneholde praktisk talt ethvert antall nukleotidenheter, fra ca. 5 nukleotider opp til ca. 500 eller mer, ettersom det måtte ønskes. Det kan synes som om 12 avpassede, fortrinnsvis konsekutive, nukleotidenheter vil være tilfredsstillende for å gi en identifikasjon av de fleste DNA- eller RNA-materialer som undersøkes eller identifiseres, dersom de 12 nukleotid-sekvensene i sonden passer til en tilsvarende ko-operativ sekvens i DNA- eller RNA-materialet som skal undersøkes eller identifiseres.

Som angitt, kan slike sonder inneholde en eller flere av

de spesielle Sig-holdige nukleotidene i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis minst ca. et spesielt nukleotid pr. 5-10 nukleotider i sonden.

Ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, er det foretrukket å anvende biotinylerte sonder som beskrevet ovenfor, eller glykosylerte sonder. Andre kjemisk merkede sonder anvendes imidlertid på en brukbar måte ved utøvelsen av oppfinnelsen. F.eks. kan den kjemiske markøren være et antigen som så kan lokaliseres med et passende antistoff mer med biotin. De kjemisk merkede sondene må, som angitt ovenfor, være istand til å hybridisere eller danne en dobbeltkjedet dupleks med sitt komplementære eller matchende genetiske DNA- eller RNA-materiale som skal identifiseres og/eller lokaliseres. Det er ønskelig at den kjemiske mar-kør-resten, når den er innføyet i et nukleotid og nukleotidet så anvendes til "nick"-translasjon for å fremstille en klon eller en komplementær kopi av den ønskede sonde,

ikke må påvirke hybridiseringen av den således kjemisk merkede sonden med det genetiske materialet som undersøkes.

Den kjemiske markør-resten i sonden kan også, om ønsket, være ende-bundet til en ikke-merket sonde, i hvilket til-felle den kjemiske markør-resten eller det kjemisk merkede nukleotidet må være istand til å kunne brukes som et substrat for ende-merkingen av sonden, slik som et substrat for ende-transferase for binding til en polynukleotid- eller DNA-sonde. Som et annet alternativ, kan den kjemiske markør-resten være bundet til en ikke-merket sonde via et univer-selt påvisningssystem slik som beskrevet i US patentsøknad nr. 491.929, inngitt 5. mai 1983, med tittelen "Assay Method Utilizing Poiynucleotiae sequences". Denne patentsøknad beskriver en fremgangsmåte for inndirekte kjemisk merking av en sonde. En slik fremgangsmåte omfatter å tilveiebringe en polynukleotidsekvens bundet til sonden. Den kjemiske markørresten bindes til sonden ved å innføye en kjemisk markør-rest i en polynukleotid-sekvens som er istand til å hybridisere med polynukleotid-sekvensen som er bundet til sonden.

Alternativt kan polynukleotid-sonder i henhold til foreliggende oppfinnelse fremstilles ved å kjemisk modifisere eller å addere til ende-delen i sonden, slik som ved å feste til den et segment av homogene nukleotider, slik som en lengde av poly A eller en lengde med aminosyrer, slik som polylysin eller faktisk en hvilken som helst endegruppe som på en brukbar måte kan anvendes som en markør, slik som en antigen-markør, for lokalisering av den resulterende hybridiserte sonde.

Etter hybridisering av det genetiske mål-materialet eller DNA- eller RNA-fragment med den kjemisk merkede sonde, lokaliseres hybridet ved hjelp av egnet reagensmateriale som bindes eller fester seg til den kjemisk markør-resten i den kjemisk merkede sonden. I tillegg må reagensen som anvendes ved utøvelsen av oppfinnelsen for binding til eller festing til den kjemiske markør-resten i den kjemisk merkede sonden, også kunne, etter kontakt med et annet reagens,

slik som et kromogen, gi et visuelt eller synlig tegn eller indikasjon på det kjemisk merkede nukleotidet. Ved ut-øvelsen av foreliggende oppfinnelse, er det foretrukket å anvende et enzymkompleks for binding til den kjemisk merkede sonde. F.eks. når den kjemisk merkede sonde er biotinylert polynukleotid, eller når den inneholder biotin som den kjemiske markør-resten, er et enzym-kompleks som omfatter streptavidin-biotnylert enzym virksomt, ettersom det streptavidin-biotinylerte enzym-komplekset hurtig vil binde seg til biotinresten i den biotinylerte sonde via binding av streptavidinet til biotin-resten i den kjemisk markøren i den kjemisk merkede sonden. Et lektin-enzym-kompleks vil også være brukbart i tilknytning til en glykosylert

merket sonde, slik som en DNA-sonde med glykosylerte grupper bundet til seg eller glykosylerte nukleotider som utgjør sonden. Enzymer som kan brukes til påvisningen av den kjemisk merkede sonde i henhold til utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, omfatter slike enzymer som syrefosfatase, alkalifosfatase, pepperrot-peroksydase, glukose-oksydase og betagalaktosidase. Disse enzymene sammen med et egnet kromogen, er, etter binding av enzymet til den kjemiske markør-resten i den hybridiserte sonde, istand til å gi et synlig eller farget, uoppløselig produkt eller bunnfall som hurtig vil signalisere tilstedeværelsen av det dannede hybrid som inneholder den kjemiske markør-sonden og det genetiske materialet av interesse. Dessuten kan Gomori-fremgangsmåten, slik den er beskrevet i "Enzyme Histochemi-stry" av M.S. Burnstone, Academic Press, 1962, anvendes til å gi et synlig eller farget, uoppløselig produkt eller bunnfall. Gomori-fremgangsmåten anvender alkalifosfatase og dets kromogen for å tilveiebringe fritt fosfat som med kalsium utfelles som en hvit forbindelse. Denne vanskelig-heten med å synliggjøre utfelling gjøres mer synlig ved å bringe slik utfelling i kontakt med koboltklorid. Dette gir en purpurfarget utfelling. Denne utfellingen kan gjøres ennå mere synlig ved å bringe utfellingen i kontakt med ammoniumsulfid som gir en svart utfelling. I tabell I nedenunder er angitt de enzymene og tilknyttede kromogener som kan anvendes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse .

Fremstillingen av kjemiske reagenser eller enzym-komplekser for bruk i henhold til utøvelsen av foreliggende oppfinnelse for å signalisere tilstedeværelsen av de hybridiserte, kjemisk merkede sondene er beskrevet i US patentsøknad nr. 486.924, inngitt 20. april 1983 med tittelen "Complexing of Biologically Active or Functional Compounds and Methods of preparaing and Utilizing Same".

Det visuelle eller synlige tegn eller indikasjon på den kjemisk merkede sonde kan også frembringes ved å utnytte reaksjonen mellom stivelse og jod, som resulterer i dannelsen av en sterk blå/svart-farge. Stivelse/jod-systemet er svært sikkert og økonomisk. Dette systemet kan brukes ved å anvende en kjemisk bestanddel som binder seg eller fester seg til den kjemiske markør-resten i den kjemisk merkede stumpen. Slike kjemiske bestanddeler må også være istand til å gi et reaksjonsprodukt, etter å ha kommet i kontakt med et egnet reagens, som er istand til å oksydere jodid til jod. Når derfor et oppløselig jodid, slik som kaliumjodid eller natriumjodid, og stivelse tilføres et slikt system, vil reaksjonsproduktet okdysere jodidet til jod som så vil reagere med stivelsen og frembringe en sterk blå/svart-farge. Et eksempel på en kjemisk bestanddel som kan gi et slikt reaksjonsprodukt, er en kjemisk bestanddel som inneholder et hvilket som helst av oksydaseenzymene, slik som glukoseoksydase og liboksydase. Et slikt enzym kan være bundet til den kjemisk merkede sonden via et enzym-kompleks, slik som beskrevet ovenfor. Når et slikt oksydaseenzym behandles med et egnet reagens, slik som beta D-glukose for glukoseoksydase eller linoljesyre for lipoksydase, er hydrogenperoksyd et reaksjonsprodukt som er istand til å oksydere jodid til jod. Det antas at dette indirekte påvisningssystemet kan anvendes til å frembringe et reaksjonsprodukt (r^C^) som, ved gjensidig påvirkning med en andre kjemisk bestanddel (jodid), er istand til å omdanne det andre reaksjonsproduktet til en form som, ved gjensidig påvirkning med en tredje kjemisk bestanddel (stivelse), er istand til å gi et farget eller synlig produkt.

Stivelse/jod-systemet kan anvendes enten i et uoppløselig analysesystem, f.eks. for å gi en uoppløselig fargeutfelling, eller i et oppløselig analysesystem, f.eks. en ELISA-analyse. En uoppløselig fargeutfelling kan frembringes ved å anvende uoppløselig stivelse eller ved å feste oppløselig stivelse til den samme bæreren som den kjemisk merkede sonden er festet til, eller ved å utnytte en andre bærer hvortil den oppløselige stivelsen er festet; idet den andre bæreren så plasseres i intim kontakt med bæreren, hvortil den kjemisk merkede sonden er festet. Det bør legges merke til at festingen av den oppløselige stivelsen til en andre bærer, dvs. en bærer som er forskjellig fra den hvortil den kjemisk merkede sonden er festet, er en måte å omdanne et oppløse-lig analysesystem som kan danne et oppløselig eller gassformig reaksjonsprodukt, som igjen kan reagere med en annen kjemisk bestanddel som er festet til en andre bærer, til et uoppløselig analysesystem. Festingen av en kjemisk bestanddel til en andre bærer resulterer videre i at utfellingen heller frembringes på en slik bærer enn på bæreren hvortil den kjemisk merkede sonden er festet. Utfellingen dannes følgelig på avstand fra enzymet og derfor vil utfel-lingens yteevne når det gjelder å blokkere og derved hindre aktiviteten til enzymet som er festet til den kjemisk merkede sonden, elimineres. Dette resulterer i en kraftigere farge enn når den uoppløselige fargeutfellingen dannes på bæreren hvortil enzymet er festet.

Det bør legges merke til at en enkelt prøve av genetisk materiale som skal undersøkes, kan analyseres med hensyn på mer enn en polynukleotid-sekvens ved å anvende mer enn en sonde. Når denne multippel-analysen utføres, er det imidlertid vesentlig å være istand til å skille de uoppløse-lige fargeutfellingene som dannes fra hver sonde. Dette kan utføres ved å anvende enten sonder med forskjellige kjemiske markører og/eller sonder som anvender den samme kjemiske markør, men hvor en sonde er merket direkte, f.eks. biotinylert eller glykosylert, og den andre er merket indirekte. De to eller flere sondene kan utnyttes samtidig til å hybridisere med sin tilsvarende polynukleotid-sekvens.

De hybridiserte sondene kan lokaliseres samtidig dersom

det anvendes kromogener som gir forskjellige farger, eller i rekkefølge dersom kromogener som gir den samme farge anvendes, forutsatt at det gjøres en registrering av lokaliser-

ingen av den første sonde. F.eks. kan en biotinylert sonde og en glykosylert sonde anvendes samtidig for å påvise to forskjellige polynukleotidsekvenser. Etter påvisningen bringes sonden i kontakt med det passende enzymkomplekset som deretter bringes i kontakt med en passende kromogen i rekkefølge eller samtidig for å tilveiebringe henholdsvis det samme visuelle eller synlige tegn eller et annet visuelt eller synlig tegn. Alternativt kan det anvendes en biotinylert sonde, og en sonde hvortil det er festet en polynukleotidsekvens, samtidig for å påvise det deres komplementære polynukleotidsekvens. Den biotinylerte sonden kan foreligge sammen med det passende enzymkomplekset. Sonden som har polynukleotid-sekvensen festet til seg, kan så lokaliseres ved en polynukleotid-sekvens merket med biotin og som er komplementær til polynukleotid-sekvensen festet til sonden. En slik kjemisk biotinmarkør, kan så lokaliseres på den samme måte som den biotinylerte sonde. Betegnende for virk-ningsfullheten av en kjemisk merket sonde i henhold til utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, ved de ovenfor angitte teknikker fra molekylærbiologien, "dot blots", "Southern", og ny-hybridisering og lignende, er det at kjemisk merkede sonder i henhold til denne oppfinnelsen er blitt anvendt til påvisningen av enkle gener i "Southern"-overføring av genom-DNA fra E.coli. Ved denne arbeidet, ble BAM H-l E.coli genom-DNA-preparat fra en lac<+->stamme (BL 15) og fra en stamme fridd for lac (2089) adskilt på agarosegeler og over-ført til nitrocellulose-membraner. Den nitrocellulose-bundne DNA ble hybridisert til biotinylerte plasmidsonde som inneholdt 200 basepar av lac separator-promoter-området. Påvisningen ble utført ved å anvende et streptavidin-biotinylert pepperrot-peroksydase kompleks. lac-DNA-båndene kom til syne i alle feltene hvor det var gjort forsøk med så lite som 1,0 mikrogram DNA. Disse teknikker hvor det anvendes de kjemisk merkede DNA-sondene i henhold til foreliggende oppfinnelse, er blitt utvidet til påvisningen av enkle genkopier fra genomprøver av human-DNA. Ved dette forsøket, ble en biotinylert plasmidsonde med et 4,4 kg baser betaglobingen-innskudd hybridisert til prøver av BAM H-l oppkuttet DNA fra HeLa-celle. Påvisning ble også utført ved å anvende streptavidin-biotinylert pepperrot-peroksydase i feltene hvor det var gjort forsøk med så lite som 1,0 mikrogram oppkuttet genom-DNA.

Som nevnt ovenfor, var kjemisk merkede sonder i henhold

til foreliggende oppfinnelse blitt anvendt i fremgangsmåter med kolonihybridisering basert på fremgangsmåten til Grunstein-Hogness, se også den her nevnte artikkelen med tittelen "Colony ftybridization" . Påvisning ble utført ved å anvende streptavidin-biotinylert pepperrot-peroksydase. Bakgrunnsstøyen var svært lav, noe som ga lett identifisering av "positive kolonier". Teknikkene for analyse av genetisk materiale hvor det anvendes de kjemisk merkede sondene i henhold til foreliggende oppfinnelse, gir bedre oppløsning enn hva som lar seg oppnå med radioaktive, fosformerkede sonder, slik at positive kolonier lett kan identifiseres selv på overfylte plater.

Dersom det ikke lokaliseres noe hybridisert genetisk materiale ved hjelp av et egnet reagens, så kan det negative resultatet, etter fritt valg ved utøvelsen av oppfinnelsen, bekreftes. Dersom teknikkene for analyse av genetisk materiale, f.eks. kolonihybridisering, "Southern", "Northern"

og "Western blots", "dot blots", økning i antall plaques, hvor det anvendes den kjemisk merkede sonde, ikke gir et visuelt eller synlig tegn eller indikasjon på det kjemisk merkede genetiske materialet, så skyldes dette heller det faktum at ikke noe genetisk materiale ble festet til bæreren, heller enn fravær av det genetiske målmaterialet. Dette kan verifiseres, dvs. det negative resultatet kan bekreftes, ved påvisning for å verifisere tilstedeværelsen av det genetiske materialet.

Påvisning for å verifisere tilstedeværelsen av det genetiske materialet kan utføres ved hjelp av hvilke som helst midler som anvendes innen teknikken til et slikt formål. Ikke-begrensende eksempler omfatter kjemisk kontrafarging, anvendelse av antistoffer mot det genetiske materialet og kjemiske reaksjoner som påviser genetisk materiale. Egnet kjemisk farge for kontrafarging av det genetiske materialet omfatter etidiumbromid, acridinorgane, Feulgens kjernereak-sjon for DNA som er beskrevet i Feulgen, R. og Rossenbeck, H., Zeitschrift Physiology Chemistry, 135, 203 og Feulgens fremgangsmåte med naftensyre og hydrazid for DNA slik den er beskrevet i Pearse, A.G.E., Quarterly Journal of Micro-scopical Science, 92, 202, 1951), idet etidiumbromid er foretrukket. Fremgangsmåten for anvendelse av antistoffer mot genetisk materiale er beskrevet iNadrezeiewski, C. et a., J. Immunol. 126, 26-231 (1981) og Lipps, H.J., Cell,

32, 435-441. Egnede kjemiske reaksjoner omfatter Burton-metoden slik den er beskrevet i Burton, Biochem, J., 62;

315-325 (1957) og Giles, K.W., og A. Meyers, Natur (London) 206, 93.

Det bør legges merke til at påvisningen for å verifisere tilstedeværelsen av det genetiske materialet kan utføres på et hvilket som helst trinn, eller selv ved flere enn ett trinn, i teknikkene i utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. Det er imidlertid foretrukket å påvise for å verifisere tilstedeværelsen av genetisk materiale etter kontakten med den kjemisk merkede sonde for å forhindre muligheten for forstyrrelse ved hybridisering. Det er mest foretrukket å utføres slik påvisning etter å ha forsøkt å lokalisere det hybridiserte genetiske materialet ved hjelp av et egnet reagens. Dette på grunn av at det ikke er noen grunn til å utføre slik påvisning når det foreligger et positivt resultat. D.v.s. at den kjemisk merkede sonden gir et visuelt eller synlig tegn eller indikasjon på det kjemisk merkede genetiske materiale, og å forhindre muligheten for forstyrrelse ved lokalisering av det hybridiserte genetiske materialet. Det bør også legges merke til at slik påvisning er anvendbar ved protein- og peptid-analyse. Dette oppnås ved hjelp av en hvilken som helst fremgangsmåte anvendt innen teknikken for å påvise slikt materiale.

Selv om det med hensyn til utøvelsen av foreliggende oppfinnelse har vært lagt vekt på analysen av genetisk materiale, slik som DNA eller RNA, er utøvelsen av foreliggende oppfinnelse som allerede angitt også anvendbar på protein-eller peptid-analyse, slik som ved hjelp av de allerede nevnte "Western blots"-teknikker. Ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse hvor "Western blots"-teknikken anvendes til protein- eller peptidanalyse, oppløseliggjøres materialet som skal analyseres, slik som protein, f.eks. vevpro-tein eller cellulært protein, ved hjelp av standard metoder, deretter overføres det til en gel og fraksjoneres, slik som ved gel-elektroforese. Det resulterende fraksjonerte proteinmaterialet eller peptid-materialet overføres så til en egnet bærer, f.eks. nitrocellulosepapir eller "Pall"-membran, og festes til dette. Det festede, fraksjonerte proteinmaterialet behandles så i overensstemmelse med utøv-elsen av foreliggende oppfinnelse for påvisning av proteinet eller peptidet av interesse. F.eks. fremstilles et biotinylert antistoff til proteinet eller peptidet av interesse og tilføres det festede, fraksjonerte protein- eller peptid-materiale på bæreren. Deretter tilføres et enzymkompleks som er fremstilt av streptavidin-biotinylert enzym, slik som et kompleks som omfatter streptavidin-biotinylert alkalifosfatase, til det biotinylerte antistoffet som nå er festet eller bundet til proteinet eller peptidet av interesse,

med resulterende festing av enzymkomplekset til det biotinylerte antistoffet. Proteinet av interesse vil så bli lokalisert eller definert ved anvendelse av et kromogen i henhold til utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, alt slik som beskrevet ovenfor.

Selv om bindingen mellom biotin og avidin er sterk, er det foretrukket å anvende streptavidin ved fremstillingen av enzymkomplekset ifølge utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. Streptavidin, et biotinbindende protein, fremstilles av Streptomyces avidinii og tilsvarer eggehvite-avidin. Streptavidin bindes imidlertid ikke-spesifikt til DNA. Ved utøv-elsen av foreliggende oppfinnelse, kan, som angitt ovenfor, enzymkomplekset eller det streptavidin-biotinylerte enzym-komplekset brukes enten for in situ påvisning eller visuali-sering på en egnet bærer, slik som nitrocellulosepapir eller en nylonmembran, fortrinnsvis en nylonmembran som er kjemisk derivatisert, slik som Pall-membran.

Foreliggende oppfinnelse lar seg lett bruke til fremstilling av utstyr som omfatter et eller flere av de nødvendige ele-mementene for å utføre fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Et utstyrsett kan således omfatte en bærer som er oppdelt

i seksjoner for å motta i tett inneslutning, en eller flere beholdere eller serier av beholdere, slik som prøverør, ampuller, glass, flasker, sprøyter eller lignende. En første slik beholder inneholder et kjemisk merket nukleotid. Den andre beholderen kan inneholde et enzymkompleks som omfatter et enzym som, etter kontakt med et kromogen, gir en uoppløselig fargeutfelling. En tredje beholder kan inneholde et kromogen som etter kontakt med enzymkomplekset,

gir en uoppløselig fargeutfelling. Den fjerde beholderen kan inneholde enzymer for endemerking av en enkelkjedet polynukleotidsonde med det kjemisk merkede nukleotidet eller for innføyelsen av det kjemisk merkede nukleotidet, slik som ved "nick"-translasjon, for å fremstille den kjemisk merkede polynukleotidsonden. Slikt utstyr kan brukes til kjemisk å merke en polynukleotidsonde og deretter til å påvise en slik sonde. Det kan også fremstilles et utstyr som inneholder selve den kjemisk merkede sonden, f.eks.

en kjemisk merket polynukleotidsonde eller en kjemisk merket protein- eller polypeptidsonde. Dette utstyret kan inneholde i den første beholder en kjemisk merket sonde, i den andre beholderen et enzymkompleks som omfatter et enzym som etter kontakt med et kromogen, gir en uoppløselig farge-utfelling, og en tredje beholder som inneholder et kromogen

som etter kontakt med enzymet i enzymkomplekset, gir en uoppløselig fargeutfelling. Hver av de ovenfor nevnte utstyrssett, kan videre inneholde en bærer eller grunnmasse hvortil sonden festes. F.eks. kan bæreren være nitrocellulosepapir eller nylonmembran eller et objektglass. Hver av de ovenfor nevnte utstyrssett kan dessuten videre omfatte en beholder som inneholder en hybridiseringsoppløsning for den merkede sonde, en beholder som inneholder en bufferopp-løsning for enzymet i en zymkomplekset, og en beholder som inneholder en bufferoppløsning for kromogenet. Det bør legges merke til at avhengig av enzymet og kromogenet som anvendes, kan den samme bufferoppløsning anvendes for enzymet og kromogenet.

Det følgende eksempler er illustrerende for utøvelsen av foreliggende oppfinnelse:

Eksempel 1.

Fremstilling av DNA.

DNA med høy molekylvekt ble isolert fra HeLa-celler (5x10<g>cleler) ved en modifikasjon av fremgangsmåten til Blin og Stafford (Nuc. Acid Res. 3, 2303-2308 (1976). I korthet

ble et volum som var like stort som det opprinnelige prøve-volumet av lyseoppløsning (0,1 M NaCL/0,05 M Tris-JCl, pH 7,5/0,01 M EDTA/0,5% SDS), tilsatt og cellene ble inkubert ved 37°C i 10 minutter. Proteinase K (100 fig pr. ml lyse-oppløsning) ble så tilsatt og de lyserte cellene ble inkubert over natten ved 37°C. Oppløsningen ble så deproteinisert ved gjentatte ekstraksjoner med fenol/kloroform (1:1) og supernatanten ble dialysert mot 50 mM Tris-HCl pH 8,0/10 mM EDTA/10 mM NaCl over natten ved 4°C. Nukleinsyren ble utfelt ved tilsetning av 2,5 volumdeler 95% etanol +0,1 volumdel 3M Na-acetat, inkubert ved -70°C i 30 minutter og samlet opp ved sentrifugering ved 11000 x g i 30 minutter.Pelleten ble resuspendert i 10 ml 10 mMTris-HCl pH 7,5/ 1 mM EDTA. RNA ble kuttet opp ved tilsetning av 50 |ig/ml varmebehandlet RNase (RNase A, Sigma), etterfulgt av inkubering ved 37°C i 45 minutter, etterfulgt av fenol/ kloroform-ekstraksjon. DNA ble pelletisert ved etanolutfel-ling etterfulgt av sentrifugering og på nytt oppløst steril 0,5 mM Tris-HCl ved en konsentrasjon på 0,2 mg/ml.

Merking av DNA med biotin.

En pBR322-klon som inneholdt et 4,4 Kb PST I fragment av beta-globin genet fra mennesket og tilgrensende sekvenser ble brukt som sonde. Denne sonden ble kort kupert med DNase I og deretter "halepåhengt" ved hjelp av ende-transferase

i nærvær av biotinylert-dUTP, eller malto-triose-dUTP.

Behandling med restriksjonsenzym, elektroforse og overføring til membraner.

10-25 ug genom-DNA ble kuttet opp med et 4-gangers overskudd av restriksjons endonuklease Barn HI under anbefalte betingelser. Oppkuttede prøver ble adskilt på 1% agarosegeler i Tris-acetat buffer (pH 6,5). DNA ble så overført til nitrocellulose (S+S, BA85) slik som beskrevet i Southern, E.M.., JMB 98, 503-517 (1975). Denne "Southern Blot" ble tørket i en vakuumovn ved 70°C i 2 timer.

Hybridisering:

Den tørkede nitrocellulose ble fuktet i 2 x SSC og deretter senket ned i blokkeringsoppløsning (5 x Denhardt<1>s oppløs-ning/5 x SSC/45% formamid/50 mM fosfatbuffer pH 6,5/1% glycin/0,1% SDS/l mg/ml lysbølgebehandlet, denaturert DNA fra laksesperm) og inkubert ved 42°C i minst 1 time. Den preparerte nitrcellulose ble så overført til hybridiserings-oppløsning (1 x Denhardts oppløsninger/5 x SSC/45% formamid/ 20 mM fosfatbuffer, pH 6,5/0,1% Dextran sulfat/l mg/ml lyd-bølgebehandlet denaturert DNA fra laksesperm) som inneholdt fra 20 ng til 1 |ig biotinylert- eller malto-triose-merket sonde. Den preparerte nitrocellulose ble inkubert ved 42°C over natten, og deretter vasket 2 ganger i 2 x SSC, 0,1% SDS ved værelsestemperatur (15 minutter hver), deretter vasket 2 ganger (15 minutter hver) i den samme oppløsningen ved 68°C, deretter til slutt vasket 2 ganger (i 15 minutter hver) i 2 x SSC uten noe SDS.

Påvisning.

Påvisningen ble utført på "Southern Blot"-nitrocellulosen på følgende måte: Filteret inneholder på dette tidspunkt biotinylert eller malto-triosemerket DNA hybridisert til den ikke-merkede genom-DNA på filteret. Dette filtret blok-keres ved nedsenking i PBS som inneholder 2% okseserumalbumin (BSA) og 0,1 x -100 og inkuberes ved 37°C i 1/2 time.

Påvisninger av biotinylert DNA utføres ved tilsetninger

av en blanding av biotinylert pepperrot peroksydase og streptavidin i 1% BSA (i 1 x PBS) direkte til filteret.

Den minimale nødvendige mengde der 0,018 ml pr. cm 2. Dette trinnet kan utføres i en forseglet beholder eller i en petriskål av plast. Etter 30 minutters inkubering ved 37°C, vaskes det overskytende kompleks av filteret på følgende måte: 3 ganger, 5 minutter hver i buffer med høyt saltinnhold (0,5 M NaCl/10 mM fosfatbuffer pH 6,5/0,1% BSA/0,05% Tween 20) og deretter to ganger, 5 minutter hver i 2 x SSC-0,1% BSA/0,05% Tween 20.

Overalt hvor biotinylert DNA ble hybridisert, bindes nå pepperrotperoksydase. Dette enzymet kan lokaliseres ved tilsetningen av et fargeutviklende substrat som faller ut på reaksjonsstedet. Et slikt substrat er DAB (diaminobenzidin). 5 mg DAB oppløses i 10 ml 10 mM Tris pH 7,5.

200 |al 1% kobolt klorid tilsettes til DAB oppløsningen, blandes og hensette på is i 10 minutter på et mørkt sted. Like før bruk tilsettes 70 |il 30% H202til DAB/kobolt-opp-løsningen. Dette substratet pipetteres over på overflaten av filteret. Farge oppstår i løpet av 10 sekunder til 10 minutter, avhengig av mengde DNA på filteret.

Følsomhet.

Eksperimenter med klonet DNA,E.coli genom-DNA, og human genom-DNA har vist at påvisning med dette systemet avslører klare signaler med så lite som 1 picogram DNA. Forsøk på

å øke følsomheten ennå mere pågår nå. Denne følsomheten er tilstrekkelig til å påvise et enkelt kopigen i human-DNA. Ettersom vi kan se enkle kopibånd, selv med så lite som 1 mikrogram oppkuttet human genom-DNA, er verdien av denne fremgangsmåte til pre- og post-natal genetisk under-søkelse klar.

Ander eksperimenter.

Våre data viser at denne teknikken er anvendbar også til andre typer "blots" ("Northern" og "Western"), såvel som til "dot blots", "plaque lifts" og kolonihybridisering ved å justere hybridiseringstider og sondekonsentrasjoner. Påvisningsaspektet forblir uendret over hele spektret av teknikker.

Også andre sonder er blitt prøvd, også disse med hell.

I tillegg til terminal-transferase, kan biotinylert dUTP innføyes i sonde-DNA ved "nick"-translasjon, "Rigby, P.W.,

et a., JMB 113, 237 (1977)). En-kjedede sonder frembragt fra M13-kloner med Klenow-enzymet og biotinylerte nukleotider er også brukt med hell.

Eksempel II.

PÅVISNING AV EPSTEIN- BARR DNA PÅ " SOUTHERN BLOTS".

Materialer og metoder.

Klonet kosmid og -plasmid DNA som bærer deler av genomet

fra Epstein-Barr viruset (EBV) ble fremstilt i henhold til de vanlige fremgangsmåtene. Plasmidklonen (pDK14) inneholder det gjentatte Barn V området til EBV i pBR322. To kosmidkloner, begge iMUA3, ble brukt; en (CNT126) inneholder EcoRl AS fragmentet. Begge kosmidklonene inneholder DNA

som er komplementært til Bam HI V området. Alle DNA prøvene ble kuttet opp med Bam HI og gjort til gjenstand for elektroforese på en 1% 1,5 mm agarosegel i Tris-acetat buffer,

vs en oppkutting ved lambda-Hind III som en størrelsesmarkør.

Etter elektroforse ble gelen farget med etidiumbromid og fotografert under UV lys. DNA ble avpurinert in situ i 15 minutter i 0,25 N HC1, denataurert i 2 x 15 minutter i 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, og nøytralisert i 2 x 15 minutter i

0,5 M Tris-Cl (pH 7,5), 1,5 M NaCl. Etter kort nedsenkning i 20 x SSC, ble DNA overført til nitrocellulose slik som beskrevet av Southern. Filteret ble tørket under vakuum i 2 timer ved 80°C.

Plasmid (pDK14) DNA ble "nick"-translatert med<32>p-dATP (Amersham) og biqtinylerings-dUTP. Sonden ble renset fra ikke-innlemmede nukleotider ved hjelp av gel-filtrering på Sephadex G50, utfelt i etanol, vasket med 70% etanol, tørket og oppløst i vann. Graden av substituering med bio-dUTP var 16,4% (av alle tilgjengelige T-restene) og den spesifike aktiviteten til DNA var 3000 dpm/ng. Sondestør-relse var mellom 200 og 700 basepar i lengde.

De oppsugde materialene på nitrocellulosen ble prehybridi-sert ved 42°C i 2 timer i tette beholdere med 50% deionisert formamid, 5 x SSC, 10% dekstransulfat, 10 x Denhardts opp-løsning og 18 [ iq/ ml deproteinisert, lysbølgebehandlet DNA fra laksesperm. Hybridisering ble utført i 30% formamid, 25mM Na-fosfat (pH 7,0), 10 x Denhardts oppløsning, 10% Dextransulfat, 18 (ig/ml DNA-bærer fra laksesperm, og 500 ng/ml denaturert pDK14-sonde. Filteret ble inkubert ved 42°C i 20 timer, vasket i 2 x SSC i 2 x 30 minutter ved 37°C og i 2 x SSC i 2 x 30 minutter ved værelsestemperatur. Filteret ble så lufttørket og røntgenfotografert med av askjerming ved -70°C på Kodak XR-2 film.

Påvisning ble utført på følgende måte: Filtrene ble fuktet i 1 x PBS, og inkubert i 30 minutter ved 37°C i blokkerings-oppløsning (2% syrebehandlet BSA, 1 x PBS og 0,1% Trition X-100). Et kompleks ble dannet mellom biotinylert pepperrotperoksydase (HRP) og streptavidin (SA) ved å iblande 1 x PBS med 1% BSA og inkubere i 10 minutter ved værelses temperatur. 2 ml av dette komplekset ble så spredt ut på det blokkerte filtret (DNA-siden opp) og det ble inkubert ved 37° i 30 minutter. Filtret ble så vasket 3x5 minutter i vaskeoppløsningen med høyt saltinnhold (0,5 M NaCl, 10

mM Na fosfat (pH 6,5), 0,1% BSA og 0,5% Tween), og 2 x 5 minutter i en 2 x SSC vaskeoppløsning som inneholdt 0,1%

BSA og 0,0% Tween. 5 mg av substratet (diaminobenzidin, DAB) ble oppløst i 10 ml 10 mM Tris-Cl (pH 8,0); det ble tilsatt 5 (il 30% ^ 2^ 2 0<^ blandingen ble øyeblikkelig til-ført filteret. Et synlig produkt ble dannet i løpet av mindre enn 5 minutter.

Eksempel III.

Kolonihybridisering - foreløbige fremgangsmåter.

Dette eksmplet er illustrerende for praktiseringen av foreliggende oppfinnelse på kolonihybridisering. Fremgangsmåtene som ble fulgt i dette eksemplet er: 1. Kliniske prøver av N.gonococcus dyrkes på nitrocellulose over L. agar ved 37°C. 2. Fjern nitrocellulosepapiret fra petriskålen og la det lufttørke i kort tid. 3. Lett nitrocellulosepapiret på en ren petriskål og behandle med lysozym (1 mg/ml i 10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) i 15 minutter ved værelsestemperatur. Drypp-lysosym oppløsningen på overflaten av koloniene. 4. Legg nitrocellulosepapiret på 2 stykker med Whatman nr. 3 papir mettet med 0,25 M EDTA, pH 8,0, i 5 minutter. 5. Legg nitrocellulosepapiret i en Buchner-trakt med et stykke Whatman 1 filter som bærer og påsett sug i 1

til 2 minutter for å fjerne overskytende væske og stabi-lisere koloni.

6. Legg filterpapir over som er mettet med:

a. 0,5 M NaOH i 5 minutter, sugetørk deretter på

Buchner-trakt.

b. 0,5 M Tris-Cl, pH 7,5, i 5 minutter, sugetørk der-

etter på Buchner-trakt.

c. 0,5 M Tris-Cl, 1,5 M NaCl i 5 minutter, sugetørk deretter på Buchner-trakt.

7. Behandle med pronase (1 mg/ml i 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, selv-oppkuttet) i 5 minutter. Tilsett pronase dråpevis

til overflaten av koloniene.

8. Legg nitrocellulosepapiret i en trakt med Whatman papir som bærer og skyll med kloroform 5 ganger (1 minutts

behandling hver gang).

9. Senk ned i 3% f^C^i 5 minutter for å inaktivere endogen

HRP-aktivitet.

10. Skyll nitrocellulosepapiret med 0,3 N NaCl i en petriskål. 11. Lufttørk ved værelsestemperatur eller 37°C i 5-10 minutter .

12. Tørk i 2 timer ved 70°C under vakuum.

13. Dette papir kan lagres i en lukket plastbeholder ved værelsestemperatur i flere uker. 14. Prehybridiser med 6 x SSC + 1 x Denhardt oppløsning + 50 ug/ml varme-denaturert DNA fra kalvebrissel ved

65°C i 1-3 timer.

15. Skrap av overskytende celle-rester fra nitrocellulose-papiret . 16. Hybridiser ved 65°C med 6 x SSC, 1 x Denhardt oppløsning med varmedenaturert sonde ved 65°C over natten. (DNA sonde for påvisning av Amp<r>fremstilles fra E.coli-stamme E.coli som bærer et Col EI Tn 3 plasmid og mer-kes med biotin ved nick-translasjon).

17. Vask 3 ganger med 2 x SSC, 0,5% SDS ved 65°C i omtrent

1 time hver gang.

Påvisning av hybridisert kjemisk merket sonde.

1. Vask 2 ganger med 10 mMTris-Cl, pH 7,5, i 10 minutter. 2. Omsett med HRP-SA-kompleks i 30 minutter til 1 time ved 37°C i petriskål.

3. Vask med den følgende oppløsning med høyt saltinnhold

(3 ganger, 25 ml hver gang i et bgerglass med forsiktig

omrøring):

4. Vasking med lavt saltinnhold (2 ganger, 25 ml hver gang, med forsiktig omrøring): 5. Omsett med DAB (nyfremstilt diaminobenzidin):

Oppbevares ca. 10 minutter på is i mørke ved innpakking i aluminiumsfolie.

Merk: 1. Høye ^ 2°2 konsentrasj°n brukes her for å minke papir (ikke-spesifik) bakgrunnen. 2. Drypp forsiktig, vent på reaksjon. Det tar 1-10 minutter ved værelsestemperatur. 6. Bløt i 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, for å stanse reaksjonen.

Bekreftelse av et negativt resultat.

1. Plasser nitrocellulosepapiret i en oppløsning av etidiumbromid i 1 minutt. 2. Plasser nitrocellulosepapiret under ultrafiolett lys. 3. For å oppbevare nitrocellulose-papiret, lukk det inne i en plastbeholder med Tris-buffer ved værelsestemperatur .

Eksempel IV.

RNA-" DOT BLOTS".

Nitrocellulosepapir

Fremstilling av nitrocellulosepapir.

1. Fukt nitrocellulosepapir i vann. Bløtlegg i 10 minutter i 20 x SSC. Lufttørk. 2. Glyoksylering av RNA: RNA opp til 20[ig inkuberes ved 50°C i 60 minutter i 5 mM Na fosfatase, pH 7,1, 1 M glyoksal. Avkjøl til 20°C på is.

3. Seriefortynninger av RNA gjøres i 5 mM Na fosfatase,

pH 7,1, 1 M glyoksal og 1 mikroliter store alikvoter dryppet ut på nitrocellulosepapiret. Lufttørk.

4. Tørk ved 80°C under vakuum i 2-4 timer.

5. Skyll strimler i stort volum av 2 x SSC ved 65°C i 60 minutter hver, 3 ganger, 20 minutter hver, i 2 x SSC ved værelsestemperatur.

Lufttørk. Lagres i en tett beholder opp til 4-8 uker.

Hybridisering av RNA-" Dot Blots".

Fremstilling av biotinylert "nick"-translatert eller termi-naltransferasebehandlet DNA sonde: Ribosomal DNA-klon i bakteriofag lambda ble biotinylert enten ved nick-translasjon eller terminalt merket med bio tinylert nukleotider under anvendelse av terminal transferase ved etablerte fremgangsmåter. Utstrekningen av inkorpo-reringen ble overvåket ved å bruke 3 2 p-dATP.

Sonden ble renset fri for ikke-inkorporerte nukleotider

og enzymer og holdt nedfrosset ved -20°C.

1. Prehybridisering av nitrocellulose-strimler med RNA-blots ble utført ved 42°C i 8-20 timer i 50% formamid/5

x SSX/50 mM Na fosfat, pH 6,5/250 ug/ml denaturert laksesperm-DNA/0,02% BSA-PVP/Ficoll. 2. Hybridiseringen ble utført ved 42°C i 20 timer i 4 deler prehybridiseringsbuffer/l del 50% Dextransulfat/100 ng/ml denaturert sonde.

3. Filtrene skylles ved værelsestemperatur 4 ganger i 2

x SSC + 0,1% SDS i 5 minutter hver/50°C 2 ganger i 0,1 x SSC + 0,1% DS i 15 minutter hver." Lufttørk.

Påvisning.

1. Fukt strimler i 1 x PBS.

2. Blokker strimler i 2% surgjort BDA/1 PBS/0,1% Trition X-100 ved 37°C i 30 minutter.

Hell av blokkeringsoppløsningen.

3. Tilfør streptavidin-biotinylert pepperrotperoksydase i 1% BSA/1 x PBS/0,018 ml/cm<2>.

Inkuber ved 37°C i 30-60 minutter.

4. Skyll strimler 3 ganger, 5 minutter hver, i 0,5 M NaCl/ 0,1% BSA/0,05% Tween 20/10 mM kaliumfosfat, pH 6,5,

og 2 ganger, 5 minutter hver, i 2 x SSC/0,1% BSA/0,05%

Tween 20.

5. Tilfør substrat i mørke.

Eksempel V.

PÅVISNING RNA- DNA HYBRIDISERING " NORTHERN BLOTS".

Glyoksylering av RNA.

Sluttkonsentrasjon

Inkuber ved 50°C i 60 minutter. Avkjøl til 20°C.

Tilsett 4 ul steril buffer til etterfylling (50% glycerol/ 10 M NaP04, pH 7,0/0,4% bromfenyl blått).

Gel elektroforese.

Tilfør umiddelbart til 1,4% agarosegel i 10 mM NaPO^, prøven drives inn i gelen ved 20 volt, elektroforesen utføres ved 100 volt i 2 timer med resirkulering av bufferen.

Farging.

Farg ikke gelen dersom den skal brukes til overføring.

Farg gelen i 0,05% ug/ml etidiumbromid i L i 20 minutter

i mørke. Vask fri for etidiumbromid.

" Northern blot" - overføring.

1. RNA fra gelen overføres til nitrocellulosepapir i 20

x SSC ved værelsestemperatur i 20-24 timer.

2. Tørk nitrocellulosepapir under varmelampe i 15 minutter.

3. Tørk i vakuumovn ved 80°C i 2 timer.

Lagre i lukket beholder.

4. Prehybridiser ved 42°C i 8-20 timer i 50% formamid/

5 x DNA/5 x SSC.

5. Hybridiser ved 42°C i 20 timer i 50% formamid/10% Dextransulfat/0,1% SDS/5 x SSC/1-2 x Denhardt oppløsning/ 100-200fig/ml denaturert bærer-DNA denaturert sonde. 6. Skyll 2 ganger, 10 minutter hver, i 2 x SSC pluss 0,1% SDS. 2 ganger, 10 minutter hver, 9 0,1 x SSC + 0,1% SDS ved 50°C.

Lufttørk.

Påvisning.

1. Fukt filteret i 1 x PBS.

2. Blokker filtret i 2% BSA/0,1% Triton X-100/1 x PBS ved 37°C i 30 minutter.

3. Fjern blokkeringsoppløsningen. Vask ikke.

4. Tilfør streptavidin-biotinylert pepperrot peroksydase i 1% BSA + 1 x PBS ved 37°C i 30-60 minutter. 5. Skyll filtret 3 ganger, 5 minutter hver i 0,5 M NaCl/ 0,1% BSA/0,5% Tween/10 mM KP04, pH 6,5, og 2 ganger, 5 minutter hver, i 2 x SSC/0,1% BSA/0,05% Tween 20.

Eksempel VI.

Påvisning av DNA ved " Southern Blot"- teknikk på nitrocellulose og nylon membraner.

I eksperimentene ble genom-DNA fra Herpes (HSV-1) stamme

F kuttet opp med Bam Hl og utsatt for elektroforese på 1% agarosegel i Tris-borat buffer (pH 8,3). Mengde DNA pr. felt som ble utsatt for elektroforese, varierte fra 1 \ iq til 100 pg. Etter fullførelse av fraksjoneringen av DNA materialet ved elektroforese, ble gelen oppbløtt i 2,5 M NaCl og 0,5 M NaOH i 30 minutter og deretter overført til 3 M Na acetat (pH 5,5) i 30 minutter. Overføringen fra gel til membranene, en nylon membran ("Pall Blodyne A"-membran) og et nitrocelluloseark eller -membran ble utført i overensstemmelse med teknikken beskrevet av Southern.Bærerne eller filtrene eller membranene ble tørket og opp- varmet i en vakuumovn ved 7 0°C i 2 timer, blokkert i 5 x Denhardts, 5 x SSC, 50% deionisert formamid, 50 mM Na fosfat (pH 6,8), 1% glycin, 1 mg/ml lysbølgebehandlet, denaturert DNA fra kalvebrissel og 0,1% SDS i 2 timer ved 42°C, og deretter overført til hybridiseringsoppløsningen. Hybridi-seringsoppløsningen inneholdt 1 x Denhardts, 2 x SSC, 50% deionisert formamid, 20 mM Na fosfat (pH 6,8), 0,1% SDS,

10% dextransulfat, 1 mg/ml lydbølgebehandlet, denaturert DNA fra kalvebrissel og 800 mg/5 ml nick-translatert HSV

som var 48% substituert med diotinylert dUPT. Hybridisering ble utført over natten ved 42°C og filtrene eller membranene vasket i 5 mM NaH2PC>4 , ImM EDTA, 0,2 % SDS, 2 x 15 minutter ved værelsestemperatur, deretter 2 x 15 minutter ved 68°C og tilslutt 1 x 15 minutt ved værelsestemperatur. Membranene eller filtrene ble så blokkert og påvist med streptavidin-biotinylert pepperrot peroksydase. Det ble lagt merke til at nylon membranen, "Pall Biodyne A"-membranen hadde mindre bakgrunnsforstyrrelse, bedre båndoppløsning og omtrent en 2 gangers økning i følsomhet i forhold til nitrocellulosesubstratet eller -membranen.

Eksempel VII.

Påvisning av DNA under anvendelse av kolonihybridisering.

E. coli plasmid DNA som innehodlt Tn3 (amp ) gen ble isolert og merket ved hjelp av terminal transferase og biotinylert dUTP. Kliniske kulturer amp r og amp sav Neisseria genorroeae (GC) ble dyrket på en overføringsmembran av nylon, "Pall biodyne" overføringsmembran, (1-2 ug BNNG 8225) og bearbei-det ved hjelp av kolonihybridiseringsteknikken beskrevet ovenfor. Den biotynilserte DNA sonde ble, etter fjerning av substratene på en G-50-kolonne, brukt til hybridisering med kolonien. De amp r og amp s GC ga de forventede resultat-ene ved påvisning med streptavidin biotinylert pepperrot-peroksydase og et kromogen. amp<r->kolonien ga en brunfarge eller respons, og de følsomme koloniene var fargeløse eller ga en fargeløs respons.

Eksempel VIII.

In situ påvisning av Herpes Simplex virus I og/ eller II.

Vero-celler ble plasser på et objektglass og ble så infisert med Herpes Simplex virus I og/eller II (HSV I og/eller II) ved et infeksjonsforhold på 20 til 1 i 14 timer med infiser-ing. Vero cellene ble vasket og festet i Carnoy's B fiks-eringsoppløsning i 5 minutter ved værelsestemperatur og deretter lufttørket. (Carnoy's B fikseringsoppløsning omfatter 60% etanol, 30% kloroform og 10 % eddiksyre).

Det ble fremstilt 3 kloner som bar deler av HSV I og/eller

II genomet i pBR322, ved Bam HI-området i henhold til den vanlige fremgangsmåten. Innskuddene var 5,2 kb, 1,9 Kb og 13,5 Kb. De 3 klonene ble så merket ved nick-translasjon i nærvær av biotinylert dUTP. Substitusjonsomfangen med biotinylert dUTP var ca. 25% av alle tilgjengelige T-rester. Sondestørrelser var mellom 200 og 1150 basepar i lengde.

Det ble fremstilt en bærerblanding som omfattet 50 ug/ml sonde og 10 mg bærer DNA, som var lydbølgebehandlet DNA

fra kalvebrissel. Hybridiseringsblandingen ble så fremstilt og omfattet 12 ng/mikroliter sonde, 2 mg/ml bærer DNA, 10% dextransulfat, 2 x SSC og 50% formamid. Hybridiseringsblandingen ble blandet godt og deretter ble 20 |_il tilført objektglasset. Et dekkglass ble lagt over objektglasset og deretter ble objektglasset forseglet med tape.

Sonden ble så denaturert ved hjelp av den følgende fremgangsmåte: Et underlag ble plassert i et vannbad, slik at overflaten på underlaget var over vannflaten. En petriskål med vått filterpapir på overflaten ble'plassert på overflaten av underlaget. Objektglasset ble så plassert på overflaten av filterpapiret. Vannet ble varmet opp slik at temperaturen umiddelbart over overflaten av vannet var 80°C. Petri skålen som inneholdt objektglasset ble fjernet etter

10 minutter.

Hybridisering ble utført på følgende måte:

Petri skålen med objektglass på plass ble fjernet fra vann-badet og inkubert ved 37°C i 60 minutter.

Den delen av sonden som ikke hybridiserte, ble fjernet på følgende måte: Tapen på dekkglasset ble fjernet og dekkglasset ble fjernet ved nedsenking av objektglasset i 2 x SSC. Objektglasset ble så vasket 5 ganger. Den første vaskingen varte i 5 minutter ved værelsestemperatur i 2 x SSC. De tre neste vaskingene varte i 5 minutter, hver ved 65°C i 0,1 x SSC. Den femte vaskingen varte i 5 minutter ved værelsestemperatur i 2 x SSC. Objektglasset ble så senket ned i 0,1% Triton X100 i fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) i 2 minutter. Objektglasset ble skylt i PBS i 5 minutter og deretter ble overskuddsvæsken ristet av.

Biotinylert pepperrot peroksydase-streptavidin-kompleks

ble tilsatt på følgende måte: Komplekset ble tilsatt til en fortynnet buffer som omfattet PBS og okseserumalbumin (BSA) med en sluttkonsentrasjon på 2 ul/0,5 ml av komplekset. Ca. 100 |il av en slik buffer ble tilsatt til obj ektglasset. Objektglasset ble så inkubert ved 37°C i 30 minutter. Objektglasset ble så vasket for å fjerne den delen av komplekset som ikke dannet kompleks med den biotinylerte sonde. Dette ble utført på følgende måte: Objektglasset ble vasket i 2 minutter med 2 x SSC og deretter i 2 minutter med 0,1% Triton X100, og så i 5 minutter med PBS. Overskuddsvæsken ble så ristet av.

Peroksydaseanalysen ble utført på følgende måte: En oppløs-ning som omfattet 2,5 mg diaminobenzidin tetrahydroklorid og 5 ml PBS, ble fremstilt. 100 |il 1% H202ble tilsatt til en slik oppløsning. 100 |il av oppløsningen ble tilsatt til objektglasset. Etter ca. 15 minutter ble reaksjonen stanset ved å dyppe objektglasset i vann. Objektglasset ble så iakttatt under et mikroskop og det ble observert farge som indikerte tilstedeværelsen av HSV I og/eller II.

Eksempel IX.

In situ påvisning av Epstein Barr virus.

Celler fra kloape som vedvarende var blitt infisert med Epstein Barr virus (EBV) stamme B 95-8 ble fremstilt. De infiserte marmoset cellene inneholdt ca. 200 kopier av EBV genomet pr. celle. Cellene ble overført på objektglass belagt med polylysin og fikk feste seg. Cellene ble så vasket og fiksert i Carnoy's B fikseringsvæske i 5 minutter ved værelsestemperatur og deretter lufttørket.

Det ble fremstilt en klon som bar en del av EBV genomet

i pBR322, ved Bam V området ifølge den vanlige fremgangsmåten. Innskuddet var 3,071 Kb. Sonden ble så merket ved nick transplantasjon i nærvær av biotinylert dUTP. Utstrekningen av substitusjonen med biotinylert dUTP var ca. 50% av alle tilgjengelige T-rester. Sondestørrelser var mellom 200 og 2000 basepar i lengde.

Fremgangsmåten for påvisning av EBV ble utført som beskrevet i eksempel VIII. Objektglasset ble så iakttatt under et mikroskop og det ble observert en rustbrun farge som indikerer tilstedeværelsen av EBV.

I lys av beskrivelsen ovenfor, vil det være åpenbart for fagfolk innen teknikken at mange substitusjoner, endringer og modifikasjoner er mulige ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse uten at man fjerner seg fra dens ånd eller omfang.

Eksempel X.

Lambda DNA ble kuttet opp med Hind III og gjort til gjenstand for elektroforese på en 1% agarosegel i Tris-borat-EDTA (pH 8,3). Gelen ble ladet slik at hvert felt inneholdt enten 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg eller 10 pg med oppkuttet DNA. Når gelen var kjørt i 2,5 time ved 100 rna., ble elektroforesen stanset. Gelen ble så senket med i 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCL, i 30 minutter. Gelen ble så overført

til 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl, 3 skiftinger hver gang etter 15 minutter. DNA ble så overført til nitrocellulose med 20 x SSC ved å brukt standard fremgangsmåter.

Når overføringen var fullstendig, ble nitrocellulosepapiret skylt i 2 x SSC og tørket under vakuum i 2 timer ved 80°C.

Nitrocellulosepapiret ble oppbløtt i 2 x SSC og inkubert med 5 x SSC, 5 x Denharts oppløsning, 0,1% SDS og 100 |il/ml lydbølgebehandlet, denaturert laksesperm-DNA i 2 timer ved 65°C. Nitrocellulosepapiret ble så overført til en oppløs-ning som inneholdt 5 x SSC, 1 gang Denharts oppløsninger, 0,1% SDS, 100 ug/ml lydbølgebehandlet, denaturert laksesperm-DNA og 200 ng/ml Lambda DNA nick translatert med biotin dUTP ifølge standard fremgangsmåter i 17 timer ved 65°C. Ca. 36% av T'ene i sonden ble erstattet med biotin-dUTP .

Overskudd ikke hybridisert sonder ble vasket bort ved å senke ned nitrocellulosepapiret i 2 x SSC, 0,1% SDS ved 65°C i 15 minutter. Dette ble gjentatt 3 ganger. Papiret ble overført til en oppløsning med 2% okseserumalbumin,

1 x fosfatbufret saltvannsoppløsning, 0,05% Triton-X-100

i 30 minutter ved 37°C. Denne oppløsningen ble pipettert fra og enzymoppløsninger tilsatt. Denne oppløsningen inneholdt 1 |ig/ml glukoseoksydase som var blitt koblet til biotin (ved å bruke biotin-C7-NHS esteren ved pH 8) i et molart forhold på 10 biotinenheter pr. 1 enzym. Det biotinylerte enzymet ble omdannet til kompleks med streptavidin ved et forhold på 4:1 (vekt:vekt). Dette komplekset ble inkubert med dehybridiserte nitrocellulose opptrekket ved 37°C i 30 minutter.

Overskudd (ubundet) kompleks ble så vasket bort ved 5 på hverandre følgende skyllinger i 0,5 M NaCl, 10 ml Tris-HCl (pH 7,5) hver i 10 minutter.

Det ble deretter oppnådd et bilde av nitrocellulose-opptrekket ved å plassere det på et stykke Whatman 3 MM trekkpapir mettet med en oppløsning av 1 M KC1 og 1 M B-D-glukose. Et stykke Pall Biodyne A membran (på forhånd dyppet i en mettet oppløsning av oppløselig stivelse og tørket), ble så plassert på nitrocellulosepapiret som er på Whatman papiret. Hele laminatet ble så inkubert ved 37°C i 1 time. Lagene i laminatet ble så forsiktig adskilt. Alle 3 lagene hadde et klart bilde av lambda-båndene ned til 41 pg båndet. Nitrocellulosepapiret ble tørket og lag-ret i plastbeholdere.

Eksempel XI.

Den samme fremgangsmåte som i eksempel X ble anvendt, men lipoksydase ble brukt istedet for glukoseoksydase, og linoljesyre erstattet glukose. Det samme resultat som i eksempel X ble observert.

I lys av beskrivelsen ovenfor vil det være åpenbart for fagfolk innen teknikken at mange substitusjoner, endringer og modifikasjoner er mulige ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse uten at man fjerner seg fra dens ånd eller omfang .

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for analyse av genetisk materiale, slik som DNA og/eller RNA, hvor det genetiske materialet er denaturert, festet til en bærer og hybridisert med en sondeforbindelse, karakterisert ved at som sonde og anvende en kjemisk merket sonde, idet det til den kjemisk merkede sonden er festet en kjemisk bestanddel som etter kontakt med et kromogen gir en uoppløselig farge-utfelling.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bestanddelen er festet til den kjemisk markøren etter at sonden er blitt hybridisert med det genetiske materialet som er festet til bæreren.

3. Et sett for bruk ved analyse av genetisk materiale, karakterisert ved at det omfatter et kjemisk merket nukleotid, et enzymkompleks som omfatter et enzym som etter kontakt med et kromogen gir en uoppløselig fargeutfelling, et kromogen som etter kontakt med enzymet i enzymkomplekset, gir en uoppløselig fargeutfelling, og enzymatiske hjelpemidler for å merke en enkeltkjedet polynukleotidsonde i endene med det kjemisk merkede nukleotidet eller for inkorporering av det kjemisk merkede nukleotidet, slik som ved nick-translasjon, for fremstilling av sonden.

4. Fremgangsmåte for analyse av genetisk materiale, slik som DNA eller RNA, hvor det genetiske materialet denatureres, festes in situ eller til en bærer og hybridiseres med en sondeforbindelse, karakterisert ved som sonde å anvende en kjemisk merket sonde, idet det til den kjemisk merkede sonde er bundet en kjemisk bestanddel som etter kontakt eller reaksjon med et kromogen, gir et farget eller synlig produkt eller en uoppløselig fargeutfelling.

5. Fremgangsmåte for analyse av protein, protein-lignende eller peptid-materiale, karakterisert ved å oppløseliggjøre materialet, utsette det oppløseliggjorte materialet for fraksjonering, bringe det fraksjonerte materialet i kontakt med et kompleks, idet komplekset omfatter et antistoff for en utvalgt bestanddel av det fraksjonerte materiale, og at komplekset har festet til antistoffet et første reaktantmateriale, og festing av komplekset via antistoffet til den utvalgte bestanddelen, deretter bringe det resulterende komplekserte, fraksjonerte materiale i kontakt med et kjemisk reagens som omfatter et andre reagensmateriale, idet det andre reagensmaterialet er istand til å danne kompleks med eller feste seg til det første reaktantmaterialet, og idet det kjemiske reagenset også omfatter et tredje reaktantmateriale som etter kontakt eller reaksjon med et kromogen, gir et farget eller synlig produkt eller bringer kromogenet i kontakt med det kjemiske reagenset hvorved det fargede eller synlige produktet eller den uoppløselige fargeutfellingen fremstilles, og derved bringer for dagen eller identifiserer tilstedeværelsen av den utvalgte bestanddelen i det fraksjonerte materialet .

6. Fremgangsmåte for analyse eller påvisning av et utvalgt biologisk materiale, slik som DNA, protein eller et polypeptid, karakterisert ved at det biologiske materialet fraksjoneres, festes til en bærer og påvises ved hjelp av en sonde som fester seg til det utvalgte biologiske materialet som skal bestemmes, eller ved en forbedring som omfatter å anvende som sonde en sonde som fester seg til det utvalgte biologiske materialet, idet sonden er forsynt med en kjemisk markør-rest som er påvisbar ved kontakt med en kjemisk bestanddel som fester seg til den kjemiske markør-resten i sonden, og som etter kontakt med et kromogen gir et farget eller synlig produkt, eller en uoppløselige fargeutfelling.

7. Sett for analyse av genetisk materiale, karakterisert ved at det omfatter termianl-transferase, et biotinylert eller glykosylert nukleotid som en bærer for terminaltransferasen, et enzymkompleks for festing til det biotinylerte eller glykosylerte nukleotidet og et membran- eller filterbærermateriale valgt fra nitrocellulosepapir eller nylonmembran.

8. Sett for analyse av genetisk materiale, karakterisert ved at det omfatter: A) En kjemisk merket sondeforbindelse som er istand til å hybridisere med minst en del av det genetiske materialet , B) et enzymkompleks som lar seg feste til den kjemiske markøren, idet enzymkomplekset omfatter et enzym som etter kontakt med et kromogen, gir en uoppløselig farge-utfelling, C) et kromogen som etter kontakt med enzymet i enzymkomplekset, gir en uoppløselig fargeutfelling.

9. Sett for identifisering av proteiner eller pep-tider, karakterisert ved at det omfatter: A) en kjemisk merket protein- eller peptidsonde; B) et enzymkompleks som lar seg feste til den kjemiske markøren, idet enzymkomplekset omfatter et enzym som etter kontakt med et kromogen, gir en uoppløselig farge-utfelling; C) et kromogen som etter kontakt med enzymet i enzymkomplekset, gir en uoppløselig fargeutfelling.

10. Fremgangsmåte for analyse eller påvisning av et utvalgt biologisk materiale slik som DNA, protein eller et polypeptid, karakterisert ved å: a) feste det biologiske materialet til en bærer; b) påvise det biologiske materialet ved en kjemisk merket sondeforbindelse; c) bringe den kjemisk merkede sonden i kontakt med en kjemisk bestanddel som fester seg til den kjemisk mar-kør-resten i sonden og som, etter kontakt med et reagens, gir et reaksjonsprodukt som er istand til å oksydere oppløselig jodid til jod; d) bringe den kjemiske bestanddelen i kontakt med reagens-produktet som er istand til å oksydere jodid til jod, og e) bringe reaksjonsproduktet i kontakt med et oppløselig jodid og stivelse for å gi et farget eller synlig produkt.

11. Fremgangsmåte for påvisning av en kjemisk merket sonde, karakterisert ved å: a) bringe den kjemisk merkede sonden i kontakt med en kjemisk bestanddel som fester seg til sonden og som etter kontakt med et reagens, gir et reaksjonsprodukt som er istand til å oksydere oppløselig jodid til jod; b) bringe den kjemiske bestanddelen i kontakt med reagenset hvorved reaksjonsproduktet fremstilles, og c) bringe reaksjonsproduktet i kontakt med et oppløselig jodid og stivelse for å fremstille et farget eller synlig produkt.

12. Fremgangsmåte for omdannelse av et oppløselig analysesystem for analyse eller påvisning av et biologisk materiale med en kjemisk merket sondeforbindelse til et uoppløselig analysesystem, karakterisert ved å: a) tilveiebringe et kjemisk reaktivt stoff festet til en bærer, b) bringe den kjemisk merkede sondeforbindelsen i kontakt med en kjemisk bestanddel som fester seg til den kjemiske markørresten i sonden og som, etter kontakt med et reagens, gir et gassformig reaksjonsprodukt som er istand til å omsettes med det kjemisk reaktive stoffet hvorved det fremstilles en uoppløselig fargeutfelling, c) bringe den kjemiske bestanddel i kontakt med reagenset, hvorved det oppløselige reaksjonsproduktet fremstilles, og d) bringe bæreren i kontakt med det oppløselige reaksjonsproduktet hvorved den uoppløselige fargeutfellingen fremstilles.

13. Fremgangsmåte for multippelanalyse av genetisk materiale, karakterisert ved å: a) denaturere det genetiske materialet, b) feste det genetiske materialet til en bærer, c) hybridisere med mer enn en sondeforbindelse, hvor hver av sondene er kjemisk merket enten direkte eller indirekte, d) bringe sondene i kontakt med en kjemisk bestanddel som fester seg til den kjemiske markørresten og som, etter kontakt med et kromogen, gir en uoppløselig fargeutfelling, og e) bringe hver av de kjemiske bestanddelene i kontakt med et kromogen, hvorved det fremstilles en uoppløselig fargeutfelling, hvor den enkelte uoppløselige fargeutfelling fra hver sonde kan sjeldnes fra hverandre.

14 . Fremgangsmåte for analyse eller påvisning av et utvalgt biologisk materiale, slik som DNA, protein eller et polypeptid, karakterisert ved å: a) feste det biologiske materialet til en bærer, b) påvise det biologiske materialet med en kjemisk merket sondeforbindelse, c) bringe den kjemisk merkede sonden i kontakt med den første kjemiske bestanddelen som fester seg til den kjemiske markør-resten i sonden, og som, etter kontakt med et reagens, gir et reaksjonsprodukt som, ved gjensidig påvirkning med en andre kjemisk bestanddel, er istand til å omdanne den andre kjemiske bestanddelen til en form som, ved gjensidig påvirkning med en 3. kjemisk bestanddel, er istand til å danne et farget eller synlig produkt, d) bringe den første kjemiske bestanddelen i kontakt med reagenset hvorved reaksjonsproduktet fremstilles, og e) bringe reaksjonsprodukte i kontakt med den andre og den tredje kjemiske bestanddelen, hvorved det fargede eller synlige produktet fremstilles.