NO844745L - Nukleinsyreproeve, proevemetode og reagenssystem for aa paavirke polynukleotidsekvens og antilegeme hertil - Google Patents

Description

Foreliggende søknad gjelder en merket nukleinsyreprøve som

er egnet for analytiske og diagnostiske formål når det gjelder genetisk sammensetning, og spesielt anvendbar i hybdi-seringsforsøk for å påvise spesifike polynukleotidsekvenser.

Vurderingen av nukleinsyrehybridiseringer gjennomføres vanligvis ved påvisning av radioaktivitet som er innført i en DNA:DNA- eller DNA:RNA-hybrid via en del av et par komplementære polynukleotider (den merkede delen betegnes som prø-ven) . Radiomerking av prøven gjennomføres ved polymeriser-ing in vivo eller in vitro av RNA eller DNA under betingel-3 14 125

ser i hvilke forløpere merkes isotopisk med H, C, I eller 3 2 P, selv om det også o er mulig å o merke polynukleotider

12 5 3 2

etter syntesen ved bruk av I eller P-ATP. Hvert slag av radiomerking har begrensninger, slik som påvisningsføl-somhet, isotop-halvtid og farer, og det er meget ønskelig å utføre prøvemerking uten å ty til radioaktivitet.

Tilgjengelige alternativer er (i) festing av haptener som f.eks. biotin, til nukleinsyreforløpere, i hvilket tilfelle det behøves en forsker for å utføre polynukleotidsynteser in vitro for å merke en prøve, så å påvise nærvær av biotiny-lert prøve i en hybrid ved anvendelse av to eller flere trinn, og (ii) festing av enzymer til oligonukleotid- eller polynukleotid-prøver, i hvilket tilfelle, hybridene påvises ved deres evne til å omdanne et substrat til et produkt som kan utskilles optisk eller kjemisk. Begge disse alternativer til radioaktivitet, omfatter moderate til betydelige forandringer i prøvenes kjemiske struktur, slik at kvali-tative og/eller kvantitative virkninger på hybridiseringen er en mulighet, om det ikke er tilfellet.

Hybridiseringsforsøk utføres som beskrevet senere i foreliggende søknad med en kjent og en ukjent nukleinsyreprøve og en nukleinsyre-holdig påvisningsprøve. Fordelaktig immobiliseres den kjente prøven, separasjonsprøven, på en fast bærer og bringes i kontakt med den ukjente og den aktuelle merkede påvisningsprøven. Kontakten gjennomføres under betingelser som er fordelaktige for hybridisering. En del av den ukjente nukleinsyren hybridiserer med den immobiliserte prøven. Dersom den ukjente også inneholder en nukleotidsekvens som er komplementær til nukleotidsekvensen i påvisningsprøven, vil det finne sted en andre eller dobbelt hybridisering, ved hvilken påvisningsprøven blir festet til den faste bæreren. Dersom den ukjente nukleinsyren mangler den spesielle komplementære nukleotidsekvensen, vil ikke påvisningsprøven hybridisere med den. Der-

for vil graden av den andre hybridiseringen, som angitt ved graden av merking, være en indikator på nærvær av den spesielle interessante nukleotidsekvensen i den ukjente.

Det blir derfor nødvendig å bestemme hvor mye av den andre hybridiseringen som har funnet sted, dvs. hvor mye av påvisningsprøven som foreligger på den immobiliserte bæreren .

Påvisningsprøven kan merkes med forskjellige merker som

kan påvises i systemer som måler spesifik bindingsaktivi-tet, fluorescens eller enzymaktivitet. Slike merker omfatter radioisotoper, fluorescerende radikaler, enzymer og haptener. Dersom det tilveiebringes for mange merker,

slik det er tilfelle med fluoroforer, kan de påvirke den andre hybridiseringen. På den annen side, er forsøket mindre følsomt dersom det er for få merker.

Det er derfor et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en påvisningsprøve (eller den prøven som bærer merkene), som kan brukes i et forsøk uten ulempene til radioaktiviteten, og uten kjemisk modifikasjon av prøvebestanddelene som kunne innvirke på hybridiseringen.

Det er et annet formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en måte for merking av en prøve med et stort antall lesbare merker som resulterer i relativt høy følsom-het, uten påvirkning av hybridiseringen.

Disse og andre, formål" og fordeler"gjennomføres ifølge-. foreliggende oppfinnelse ifølge hvilken det tilveiebringes en påvisningsprøve omfattende en. hybridiserbar, enkelt-strenget del av en nukleinsyre som kan hybridisere med den ukjente,-forbindes med en. ikke-hybridiserbar, enkelt-eller dobbelt-strenget nukleinsyredel, idet den ikke-hybridiserbare delen fordelaktig omfatter en gjenkjennings-eller binde-stilling for et spesielt protein. Dersom den ikke-hybridiserbare delen er dobbeltstrenget,'kan en av strengene være kontinuerlig, dvs. kovalent bundet med den hybridiserbare delen.

Den hybridiserbare delen av nukleinsyre kan være en hvilken som helst av de som er forbundet med generisk sykdom,

som f.eks. en nukleotidsekvens som er komplementær til den genomiske sekvensen som er ansvarlig for sigdcelle-anemi.

Nukleinsyren i den ikke-hybridiserbare delen kan være

en naturlig DNA-sekvens eller syntetisk oligonukleotid som inneholder en høyspesifik bindingsstilling eller -stillinger, for et protein eller proteiner. En rekke nukleinsyre-bindingsstillinger/bindingsproteinpar kan anvendes i foreliggende oppfinnelse. En klasse av nyttige bindingsproteiner er de som er kjent i biologiske systemer for å gjenkjenne spesifike polynukleotidsekvenser som f.eks. undertrykker ("repressor")-proteiner. En annen klasse er antilegemer som kan binde seg til immunogenisk forandrede nukleinsyrer.

I en foretrukken utførelsesform, kan den ikke-hybridiserbare delen være spesifik for laktose (heretter referert til som lac)-repressor-protein som binder seg til et "operator"-sted i den ikke-hybridiserbare delen, hvilken operator må være dobbeltstrenget, fortrinnsvis etter hybridisering, idet hybridisering kan splitte bindingen mellom operator og repressor. Dersom den således -immobiliserte påvisnings- prøven derfor bringes i kontakt med en løsning inneholdende lac-repressor-protein, vil dette protein selektivt bli fjernet fra løsningen og vil binde seg til lac-operatoren. Selv om konsentrasjonen av ikke-spesifik DNA i den hybridiserte prøven er i 1000 gangers overskudd, er bindingen til ikke-spesifike sekvenser neglisjerbare. I levende celler bindes repressor-proteiner til sine tilsvarende operatorsekvenser for å modulere transkripsjon av et gen. Når en operatorsekvens er kovalent bundet til andre sekvenser, er fortsatt binding av repressorproteiner spesifike for operatoren.

I en annen foretrukken utførelsesform modifiseres den ikke-hybridiserbare delen av prøven kjemisk og/eller fysisk for å danne en proteingjenkjenningsstilling, f.eks. ved innvirkning av en modifiseringsforbindelse som innfører en spesiell antigenisk determinant i den ikke-hybridiserbare delen. Slike modifiseringsforbindelser eksemplifiseres ved innskytningsmidler og platinaholdige ligander. Innskytningsmidler reagerer med dobbeltstrengede nukleinsyrer ved å bli ikke-kovalent innført mellom basepar.

En slik innføring får den tertiære strukturen til spiralen til å forandre seg ved opprulling og forlengelse langs spiralaksen. Det resulterende innskytnigskomplekset karakteriseres ved nydannede, antigene determinanter som forstås å omfatte innskytningsforbindelsen og de reorien-terte fosfodiesterase hovedkjedene i de respektive strenger i duplekset. Anvendbare innskytningsforbindelser er generelt plane, aromatiske, organiske molekyler som eksemplifiseres ved akridinfargestoffer, f.eks. akridinorange, fenantridinene, f.eks. etidium, fenazinene, furokumariner, fenotiaziner og kinoliner. I hovedsak en hvilken som helst forbindelse som vil bindes til enkelt- eller dobbelt-nukleinsyre for å indusere en immunogen forandring, kan anvendes som modifiseringsforbindelse.

Oppfinnelsen kan anvendes på alle produkter som er dannet ved konvensjonelle hybridiserings!orsøk. Spesielt kan påvisningsprøven ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes på. produkter som er. dannet ved hybridisering i løsning og fast fase, i det sistnevnte tilfellet omfattende enten prøve eller prøve-nukleinsyre og "sandwich"-produkter. Generelt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for påvisning av en spesiell polynukleotidsekvens i et testmedium inneholdende enkelt-strengede nukleinsyrer, som erkarakterisert vedfølgende trinn: (a) Kombinasjon av testmediet med en nukleinsyre-påvisningsprøve omfattende minst en hybridiserbar enkelt-strenget grunnsekvens, som er i det vesentlige komplementær til den sekvensen som skal påvises og en ikke-hybridiserbare dobbeltstrenget del med en gjenkjenningsstilling for binding med et spesielt protein, under betingelser som er gunstige for hybridisering mellom den sekvens som skal påvises og den komplementære hybridiserbare sekvensen i prøven; (b) Separering av den faste bæreren som bærer hybridisert prøve fra uhybridisert prøve ; og (c) Tilsetning til den separerte, faste bærer som bærer hybridisert prøve av det spesielle protein som bindes til gjenkjennelsesstillingen på den ikke-hybridiserbare delen av prøven og bestemmelse av det protein som blir bundet til den faste bæreren.

I en slik undersøkelse på nærvær av en spesiell nukleinsyre nukleotidsekvens i en prøve immobiliseres enten prøven eller en separasjonsprøve på en bærer, og, med en påvisningsprøve som beskrevet ovenfor, underkastes hybridisering, hvorved den ikke-hybridiserbare delen festes til bæreren. Et protein bindes til proteingjenkjennelsesstillingen og derved til bæreren. Proteinet merkes på et hvilket som helst trinn, enten før eller etter binding,

og til slutt blir merkingen undersøkt.

Etter binding av proteinet og separering av bæreren fra resten av materialet, blir bæreren i et annet forsøk behand- let for å skille proteinet fra den hybridiserte påvisnings-prøven, og det dissosierte proteinet blir så undersøkt f.eks. ved avlesning av en merking på dette, hvilken merking er påført på et hvilket som helst tidligere trinn.

Oppfinnelsen beskrives ytterligere med henvisning til

den medfølgende tegning som er et skjematisk strømnings-diagram av en hybridisering og en undersøkelse ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ved mere spesiell henvisning til tegningen, behandles

den ukjente DNA (som skal testes) f.eks. ved fordøyelse med et innskrenkningsenzym, elektroforeseseparasjon, "southern" overføring og/eller enkel denaturering. Dersom den ikke allerede er immobilisert, absorberes DNA så på

en fast bærer (f.eks. nitrocellulosepapir) direkte eller ved hybridisering til en separasjonsprøve. Den imobiliserte DNA hybridiseres med en kjent prøve. Den kjente prøve

(P) har to regioner. Regionen ps er enkeltstrenget og komplementær til en spesifik gen som skal påvises og regionen pd er et stykke av dobbelt- eller enkelt-strenget, ikke-homolog DNA som bærer de merker ved hjelp av hvilke merkingsreaksjonen vil bli påvist. Den dobbeltstrengede DNA kan eksempelvis være lac promotor/operator-sekvensen

og så er proteinet lac repressor. pd-området kan også

være en bindingsstilling for et spesifikt antilegeme. pd-området kan også være en spesifik enkelt-strenget, immunogen polynukleotidsekvens eller poly /d(G-C)_/ som når den behandles med sterkt salt, forandrer sin struktur og blir immunogen i Z-formen. pd-delen kan også modifiseres med innskytningsmidler eller platinaholdige, DNA-bindende ligander for å gi immunogene stillinger.

Dersom pd er lac promotor/operator-sekvensen, vil pd binde lac repressor-proteinet etter hybridiseringen. Proteinet kan så påvises ved hjelp av et antistoff eller ved direkte merking. Den dobbeltstrengede pd-delen kan også modifiseres med hapten, f.eks. bi at irr. Den biotinylerte hybrider . kan så påvises på- kjent. måte. pd-delen kan også modifiseres med en r.ekke fluoroforer, og kan påvises direkte.

I en spesiell utførelsesform omfattende et lac operator-repressor-system, omfatter den foranstående fremgangsmåten minst, følgende fire trinn: Trinn I: Dyrk bakterier og isoler lac repressor-protein ;

Trinn II: Koble påvisningsprøven kovalent til

lac operator-DNA og klon adduktet slik at det oppnås en stor mengde prøve: Trinn III: Fremstill lac repressor - FITC eller lac repressor-ø-galaktosidase-addukt eller anti- lac repressor antistoff: Trinn IV: Hybridisering og påvisning av lac operator ved hjelp av merke på lac repressoren.

Deretter kan mengden av bundet lac repressor-protein påvises på forskjellige måter. F.eks. kan antistoffer dertil bringes i kontakt med den bundne lac repressor, og protein A konjugert med et enzym kan bindes til antistoffene. Mengden av bundet enzym kan så bestemmes ved hjelp av enzymets katalytiske reaksjon med dets substrat på konvensjonell måte.

Mengden enzym indikerer mengden av lac repressor som i

sin tur indikerer mengden av hybridisering om forekom tidligere. Alternativt kan lac repressor-proteinet merkes med fluorescerende stoffer eller merkes med enzymer og avleses på konvensjonell måte.

Det dobbeltstrengede området av påvisningsprøven kan også være spesifik for galaktose-repressor-proteiner, lambda-repressor-proteiner, catobolitt gen-aktivator-protiner,

CAP, Cro-protiner o.l. Den foranstående beskrivelse

for påvisning av bundet lac repressor-protein gjelder

likeledes for påvisning av nærvær av disse proteiner.

Slike proteiner kan renses fra stammer av Escherichia

coli. De DNA-sekvenser som disse proteiner bindes til,

er identifisert og isolert ved bruk av rekombinant DNA-teknologi. Det segment av E.coli DNA som inneholder lac repressor-bindingsstillingen ( lac promotor-operator-området) overføres til rekombinante plasmider som innbefatter segmenter av human DNA, som f.eks. deler av det gen som innkoder hemoglobin. Disse kan anvendes uten ytterligere genetisk behandling for å teste en rekke hemoglobinopatier, som f.eks. noen talassemier og sigdcelle hemoglobinemi. I

det dobbelte hybridiseringsskjemaet anvendes to plasmider alternativt for å bestemme om en prøve av DNA fra et menneske inneholder den genetiske tilstand som er ansvarlig for sigdcelle hemoglobinemi. Et plasmid er betegnet som separasjonsprøve. Det inneholder DNA som er den ene flanken av spaltningsstillingen i det dimorfe innskrenk-ningsenzymet. Det immobiliseres som enkeltstrengede molekyler på en fast bærer, og det er umerket. Det andre plasmidet betegnes som påvisningsprøven. Det inneholder DNA som er den andre flanken i den dimorfe innskrenknings-stillingen, og er også fremstilt slik at det inneholder et segment av E. coli DNA som inneholder lac promotor/operator-området. Ved bruk av passende enzymer, gjøres detektorplasmidet delvis enkeltstrenget til den grad at 6-glodin-gen-sekvenser er tilgjengelige for hybridisering mens lac repressor-gjenkjenningsstillinger forblir dobbeltstrengede og tilgjengelige for proteinbinding.

Avlesning omfattende lac repressor-protein tilveiebringer •sterkt spesifik gjenkjennelse av nærværet av påvisnings-prøven. Det gir også nye muligheter for avlesning av løsningsfasen, fordi det er mulig å frigjøre repressor-antistoff-kompleksene fra operator DNA ved tilsetning av et 8-galaktosid, som f.eks. isopropyltio-galaktosid. Dette muliggjør automatisert sats- eller strømningssystem-behandling. -I den foranstående beskrivelse inneholdt den dobbeltstrengede nukleinsyresekvensen en proteingjenkjennelsesstilling fra starten. Dersom den imidlertid ikke inneholdt en slik stilling opprinnelig, er det mulig å modifisere DNA for å danne protein- eller antistoff-gjenkjennelses-stillinger for å lette reaksjonen og påvisningen.

En slik modifikasjon kan gjennomføres ved kontakt med innskytningsmidler, som f.eks. furocoumariner, f.eks. angeliciner, psoralener osv., som mere fullstendig beskrevet i EU-søknad nr. 84107624.3.

Platina-holdige ligander kan likeledes anvendes.

Reagensene gjør den ikke-hybridiserbare nukleinsyredelen gjenkjennbar med protein.

Dersom den ikke-hybridiserbare delen gjøres immunogen,

kan et slikt protein være et antistoff, dvs. et immuno-golbulin, f.eks. et monoklonat antistoff. Antistoffet kan være bundet til den ikke-hybridiserbare delen i en mengde som tilsvarer mengden av furocoumarin som danner proteingj enkj ennelsesstUlingene. Antistoff-gjenkj ennelses-stillinger kan også dannes når pd inneholder poly /d(G-C )_/-sekvenser, og prøven eksponeres for høy saltkonsentra-s j on.

I det tilfellet av at modifiseringsforbindelsen er et innskytningsmiddel, er en slik forbindelse fortrinnsvis en plan, vanligvis aromatisk forbindelse med lav molekyl-vekt, men noen ganger polycyklisk molekyl som er istand til å bindes til dobbeltstrengede nukleinsyrer, f.eks.DNA/DNA, DNA/RNA eller RNA/RNA-duplekser, vanligvis ved innføring mellom grunnpar. Den primære bindingsmekanismen vil vanligvis være ikke-kovalent, idet kovalent binding opptrer som et andre trinn når innskytningsmidlet har reaktive eller aktiverbare, kjemiske grupper som vil danne kovalente bindinger med kjemisk nabogrupper på en eller begge av de innskutte duplekse strengene. Resultatet av innskytningen er spredningen av nærliggende grunnpar til ca. 2 ganger den normale avstand mellom dem, hvilket fører til en økning i molekyllengde for duplekset. Videre må det foregå en oppvinding av den dobbelte spiralen med ca. 12-36° for å tilpasses til innskytningsmidlet. Generelle oversikter og ytterligere informasjon kan oppnås fra Lerman, J., Mol. Bio. 3:18(1961), Bloomfield et al., "Physical Chemistry of Nucleic Acids", kapittel 7, sidene 429-476, Harper og Rowe, NY(1974), Waring, Nature 219: 1320(1968), Hartmann et al., Angew. Chem. eng. utg. 7:693(1968), Lippard, Accts. Chem. Res 11:211(1978), Wilson, Intefcalation Chemistry (1982), 445 og Berman et al.,

Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10:87(1981).

En lang rekke innskytningsmidler kan anvendes i foreliggende oppfinnelse. Noen klasser av disse midler og eksempler på spesielle forbindelser er angitt i følgende tabell:

Innskytningsmiddelklasser

Der hvor det er ønskelig eller spesielt fordelaktig, kan innskytningsmidlet være kjemisk bundet, f.eks.ved kovalente bindinger, til en eller begge av de komplementære strengene i innskytningskomplekset. I hovedsak en hvilken som helst tilgjengelig fremgangsmåte kan anvendes for å gjennomføre en slik binding. Bindingen dannes fortrinnsvis ved å utføre innskytning med et fotoreaktivt innskytningsmiddel, fulgt av den fotokjemiske bindingsreaksjonen. En spesielt anvendbar fremgangsmåte omfatter bruken av azido-innskyt-mingsmidler. De reaktive nitrenene dannes lett ved ultra-fiolett lys med lang bølgelengde eller synlig lys og nitrenene av arylazider foretrekker innføringsreaksjoner via deres omarrangementsprodukter (se White et al, Methods in Enzymol. 46:644(1977). Representative azidoinnskytnings-midler er 3-azidoaktridin, 9-azidoakridin, etidium-monoazid, etidium-diazid, etidium-dimerazid (Mitchell et al., JACS 104:4265(1982)), 4-azido-7-klor-kinolin og 2-azidofluoren. Andre anvendbare fotoreagerbare innskytningsmidler er furocoumarinene som danner (2+2) cykloaddukter med pyri-midinrester. Alkyleringsmidler kan også anvendes som f.eks. bis-kloretylaminer og epoksyder eller aziridiner, f.eks. aflatoksiner, polycykliske hydrokarbonepoksyder, mitomycin og norfillin A.

Alternativt kan proteingjenkjennelsesstillingen være på

et segment av den ikke-hybridiserbare delen, annet enn selve nukleinsyren. F.eks. kan nukleinsyren i den ikke-hybridiserbare delen være bundet til et lett som f.eks. furocoumarin til en kjemisk gruppe som f.eks. biotin,

idet biotinet utgjør proteingjenkjennelsesstillingen.

Biotinet kan påvises på konvensjonell måte, f.eks. med avidin eller et anti-hapten antistoff. Furocoumarinet kan være bundet til en fluorofor, idet fluoroforen deretter kan påvises ved fluorescens.

Merking med de foran nevnte proteiner kan utføres enten

før eller etter modifikasjon av den dobbeltstrengede nukleinsyren, fortrinnsvis etter.

Salter kan også anvendes som et middel for modifisering

av den ikke-hybridiserbare delen for å gjøre den protein-

— — —mc* — gjenkjennbar (f.eks. poly /d(G-C)/ eller poly /d(G- C_)/ endres til Z-form). Egnede salter omfatter natriumklorid, andre løselige alkali- og jordalkali-metallsalter av mineralsyre, spermin eller spermidiner, fordelaktig i konsentrasjoner på minst ca. 1 vekt-%. Fordelaktig er løsningsmidlet vann. Både den salt-modifiserte nukleinsyren og den furocoumarin-modifiserte nukleinsyren vil være antigen, og vil eksempelvis være istand til å binde et spesifikt antistoff som kan påvises på konvensjonell måte. F.eks. kan protein A som ovenfor nevnt, konjugeres med et enzym som fungerer som merke i det etterfølgende forsøk.

Prøven vil omfatte minst en enkeltstrenget grunnsekvens

som er i det vesentlige komplementær til eller homolog med den sekvensen som skal påvises. Slike grunnsekvenser behøver imidlertid ikke være et enkelt, kontinuerlig poly-nukleotidsegment, men kan bestå av to eller flere enkelte segmenter avbrutt av ikke-homologe sekvenser. Disse ikke-homologe sekvenser kan være lineære, eller de kan være selv-komplimentære og danne hårnålssløyfer. I tillegg kan det homologe området av prøven være flankert i 3'-

og 5<1->avslutningene med ikkehomologe sekvnser, som f.eks.

de som omfatter DNA og RNA av en vektor i hvilken den homologe sekvensen er innført for formering. I begge tilfeller vil prøven, slik den presenteres som et analytisk reagens, oppvise påvisbar hybridisering på et eller flere punkter som opptar interessante nukleinsyrer. Lineære eller sirkulære enkeltstrengede polynukleotider kan anvendes som prøveelement, idet hoved- eller mindre deler blir fordoblet med en komplementær polynukleotid-streng eller -strenger, forutsatt at det kritiske, homologe segmentet

eller-de kritiske homologe segmentene er i enkeltstrenget form og tilgjengelig for hybridisering med prøve-DNA eller -RNA. Spesielt foretrukne vil være lineære eller sirkulære prøver hvori den homologe prøvesekvensen foreligger i i det vesentlige.bare enkeltstrenget form (se spesielt Hu og Messing, Gene 17:271-277(1982)). Bindingen av det spesielle proteinreagenset til hybridiser-ingsproduktet i foreliggende fremgangsmåte, kan påvises ved hjelp av en hvilken som helst passende teknikk. Fordelaktig vil bindeproteinet i seg selv være merket med en påvisbar kjemisk gruppe. En slik påvisbar kjemisk gruppe kan være et hvilket som helst materiale som har en påvisbar fysisk eller kjemisk egenskap. Slike materialer er vel utviklet på området immunoforsøk og generelt kan for det meste hvilket som helst merke som er anvendbart i slike fremgangsmåter anvendes i foreliggende oppfinnelse. Spesielt anvendbare er enzymatisk aktive grupper, som f.eks. enzymer (se Clin. Chem. (1976) 22:1243), enzymsubstrater (se GB patent 1.548.741), koenzymer (se US patenter 4.230.797 og 4.238.565), og enzym inhibitorer (se US patent 4.134.792); fluorescerende midler (se Clin. Chem. (1979) 25:353); kromoforer, luminescerende midler som f.eks. kjemiluminescerende midler og bioluminiscerende midler (se Clin. Chem. (1979) 25:512, og samme sted, 1531); spesifikt bindbare ligander og radioisotoper som f.eks. 3 35 32 125 14 -H. S, -P, I, og C. Slike merker og merkepar påvises på basis av deres egne fysiske egenskaper, (f.eks. fluorescerende midelr, kromoforer og radioisotoper), eller deres reaktive eller binde-egenskaper (f.eks. enzymer, substrater, koenzymer og inhibitorer). Et kofaktor-merket bindeprotein kan eksempelvis påvises ved tilsetning av det enzym for hvilket merket er en kofaktor og et substrat for enzymet. Et hapten- eller ligand- (f.eks. biotin) merket bindeprotein, kan påvises ved tilsetning av et antistoff til haptenet, eller et protein (f.eks. avidin) som binder liganden, merket med et påvisbart molekyl.

Et slikt påvisbart molekyl kan være et molekyl med en målbar fysisk egenskap (f.eks. fluorescens eller absorbsjon) eller en deltager i en enzymreaksjon (f.eks. se ovenstående liste). Det kan eksempelvis anvendes et enzym som virker på et substrat for å gi et produkt med en målbar fysisk egenskap. Eksempler på det sistnevnte omfatter, men er ikke begrenset til, g-galaktosidase, alkalisk fosfatase og peroksydase. For in situ hybridiseringsundersøkelser er sluttproduktet ideelt uløselig i vann. Andre merkings-skjemaer vil være selvsagte for fagmannen.

Alternativt kan bindeproteinet påvises basert på en inne-boende egenskap som f.eks. dets eget antigenitet. Et merket anti-(bindeprotein)antistoff vil bindes til det primære proteinreagens der merket for antistoffet er et hvilket som helst konvensjonelt merke som ovenfor nevnt. Når bindeproteinet er et antistoff, kan det videre påvises ved komplementfiksering eller bruken av merket protein A, såvel som andre kjente teknikker på fagområdet for påvisning av antistoffer.

Merket vil være bundet til bindeproteinet ved direkte kjemisk binding som f.eks. omfatter kovalente bindinger, eller ved indirekte binding som f.eks. ved innføring av merke i en mikrokapsel eller liposom som i sin tur er bundet til bindeproteinet. Merketeknikker er velkjente på fagområdet og en hvilken som helst egnet fremgangsmåte kan anvendes i foreliggende oppfinnelse.

Når bindeproteinet er et antistoff, kan et slikt reagens bestå av hele antistoffer, antistoff-fragmenter, polyfunk-sjonelle antistoff-aggregater eller generelt en hvilken som helst substans som omfatter en eller flere spesifike bindingsstillinger fra et antistoff. Når det foreligger i form av et helt antistoff, kan det tilhøre en hvilken som helst av klassene og underklassene av kjente immunoglobuliner, f.eks. IgG, IgM, osv. Et hvilket som helst fragment av et hvilket som helst slikt antistoff som bibeholder spesifik bindeaffinitet for prøvegjenkjennelsesstillingen kan også anvendes, f.eks. fragmentene av IgG konvensjonelt kjent som Fab, F(ab') og F(ab 1). I tillegg kan aggregater, polymerer og konjugater av immunoglobuliner eller deres fragmenter anvendes der det passer.

Immunoglobulinkilden for antistoffreagenset kan oppnås

på en hvilken som helst tilgjengelig måte som f.eks. konvensjonelle anti-serum- og monoklonale teknikker. Anti-

serum kan oppnås ved hjelp av vel kjente teknikker omfattende immunisering av et dyr, som f.eks. en mus, kanin, marsvin eller gjeit, med et passende immunogen. Immuno-genet vil vanligvis omfatte et ionisk kompleks mellom et kataionisk protein eller proteinderivat (f.eks. metylert okseserumalbumin) og den modifiserte nukleinsyren. Alternativt kan den modifiserte nukleinsyren være kovalent koblet til et bærerprotein. Immunoglobulinene kan også oppnås ved somatisk cellehybridiseringsteknikk, hvilket resulterer i det som vanligvis refereres fil som monoklonale antistoffer. Det immunogen som anvendes for primære injeksjoner og fører til hybridomdannelse vil være som beskrevet ovnefor.

Den prøve som skal undersøkes kan være ethvert medium

av interesse, og vil vanligvis være en væskeprøve av medi-sinsk, veterinær, miljømessig, ernøringsmessig eller indus-triell betydning. Humane og dyrepreparater og kroppsvæsker kan spesielt undersøkes ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte, inkludert urin, blod (serum eller plasma), melk, ryggmargsvæske, spytt, avføringsstoffer, lungeaspirater, halsutstryk, utstryk og eksudater fra genitaliene, rektal-utstryk og aspirater fra nese og svelg. Når prøven som oppnås fra pasienten eller en annen kilde som skal testes inneholder i hovedsak dobbeltstrengede nukleinsyrer, som f.eks. inneholdes i celler, vil prøven behandles for denaturere nukleinsyren, og om nødvendig, først å frigjøre nuklein-syrene fra cellene. Denaturering av nukleinsyrer foretas fortrinnsvis ved oppvarming i kokende vann eller alkalibehandling (f.eks. 0,IN natriumhydroksyd), som om ønsket,

samtidig kan anvendes for å lyse celler. Frigjøring av nukleinsyrer kan også eksempelvis oppnås ved mekanisk ødeleggelse (frysing/tining, avskrapning, lydbehandling), fysisk/kjemisk ødeleggelse (detergenter som f.eks. "Triton", "Tween", natriumdodecylsulfat, alkalibehandling, ostmotisk sjokk eller varme), eller enzymatisk lyse (lysozym, protein-ase K, pepsin). Det resulterende testmedium vil inneholde nukleinsyrer i enkeltstrenget form som så kan undersøkes ifølge foreliggende hybridiseringsfremgangsmåte.

Som kjent på fagområdet, kan forskjellige hybridiseringsbetingelser anvendes i undersøkelsen. Typisk vil hybridiseringen foregå ved svakt forhøyede temperaturer, f.eks. mellom ca. 35 og 70°C, og vanligvis rundt 65°C, i en løsning omfattende en buffer ved pH mellom ca. 6 og 8, og med passende ionestyrke (f.eks. 2XSSC hvor 1XSSC = 0,IM natriumklorid og 0,015M natriumsitrat, pH 7,0), protein som f.eks. okseserumalbumin "Ficoll" (et varemerke som identifiserer en kopolymer av sukrose og epiklorhydrin solgt av Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NH), polyvinylpyrrolidon,

og et denaturert fremmed DNA som f.eks. fra kalvetymus eller laksesæd. Graden av komplementaritet mellom prøven og prøvestrengene som kreves for at hybridiseringen skal foregå, avhenger av hvor strengt betingelsene overholdes. Graden og spesifisiteten for hybridiseringen påvirkes

av følgende hovedbetingelser:

1. Renheten av nukleinsyrepreparatet.

2. Grunnsammensetningen av prøven - G-C grunnpar vil oppvise større varmestabilitet enn A-T-grunnpar.

Således vil hybridiseringer omfattende høyere G-C-innhold være stabile ved høyere temperaturer.

3. Lengden av den homologe grunnsekvensen.

En hvilken som helst kort sekvens av baser (f.eks. mindre enn 6 baser), har en høy grad av sannsynlighet for å være tilstede i mange nukleinsyrer. Således kan det oppnås liten eller ingen spesifisitet i hybridiseringer som omfatter slike korte sekvenser. De- foreliggende homologe prøvese-kvensene vil være-minst 10 baser, vanligvis 20 baser eller mer, og fortrinnsvis større enn 100 baser. Fra et praktisk synspunkt, vil de homologe prøvesekvensene ofte være mellom 300 og 1000 nukleotider. 4. Ionestyrke. Graden av gjenherding øker når ionestyrken til inkuberingsløsningen øker. Hybridenes varmestabilitet øker også. 5. Inkuberingstemperatur. Optimal gjenherding opptrer ved en temperatur ca. 25-30°C under smeltetemp-eraturen (Tm) for et gitt dupleks. Inkubering ved temperaturer signifikant under den optimale, muliggjør at mindre beslektede basesekvenser hybridiserer. 6. Nukleinsyrekonsentrasjon og -inkuberingstid.

For å drive reaksjonen mot hybridisering, vil normalt

en av de hybridiserbare prøvenukleinsyrene være tilstede i overskudd, vanligvis 100 gangers overskudd eller mere. 7. Denatureringsreagenser. Nærvær av hydrogen-bindingsspaltende midler som f.eks. formamid og urea øker hybridiseringsstringensen. 8. Inkuberingstid. Jo lenger inkuberingstiden

er, jo mere fullstendig vil hybridiseringen være.

9. Volumutelukkelsesmidler. Nærværet av disse midler, som eksemplifiseres med dekstran og dekstransulfat, er tenkt effektivt å øke konsentrasjonen av de hybridiser-ende elementene og derved øke graden av den resulterende hybridiseringen.

Praktiseringen av foreliggende analytiske fremgangsmåte

er ikke begrenset til noe spesielt hybridiseringsprodukt.

En hvilket som helst konvensjonell hybridiseringsteknikk kan anvendes. Når det gjøres forbedringer og det derved utvikles nye produkter, kan disse lett anvendes for utførelse

av foreliggende fremgangsmåte. Konvensjonelle hybridiseringsprodukter som er spesielt anvendbare, omfatter de

hvor prøvenukleinsyrene er immobilisert på en fast bærer (fast fasehybridisering), og de hvor alle polynukleotid-

artene er i løsning (løsningshybridisering).

I produkter fra fastfast-hybridisering, er prøvepolynukleo-tider fiksert på en passende måte i deres enkeltstrengede form på en fast bærer. Anvendbare faste bærere er vel kjente på fagområdet, og omfatter de som binder nukleinsyrer enten kovalent eller ikke-kovalent. Ikke-kovalente bærere som generelt anses å omfatte hydrofobe bindinger, inkluderer naturlig forekommende og syntetiske polymere materialer,

som f.eks. nitrocellulose, nylonderivater og fluorerte polyhydrokaroner, i en rekke former slik som f.eks. filtere eller faste ark. Bærere med kovalent binding er også anvendbare og omfatter materialer med kjemisk reaktive grupper eller grupper, som f.eks. diklortriazin, diazo-benzyloksymetyl o.l., som kan aktiveres for binding til polynukleotider.

En typisk fast-fase hybridiseringsteknikk begynner med immobiliseringav prøvenukleinsyrer på bæreren i enkelt-strenget form. Dette starttrinnet hindrer i hovedsak gjenherding av komplementære strenger fra prøven og kan anvendes som en fremgangsmåte for konsentrering av prøve-materialet på bæreren for øket påvisbarhet. Polynukleotid-prøven bringes så i kontakt med bæreren og hybridisering påvises som beskrevet her. Den faste bæreren tilveiebringer en hensiktsmessig måte for separering av merket reagens forbundet med hybridisert prøve fra det som forblir ubundet.

En annen fremgangsmåte av interesse er "sandwich" hybridi-seringsteknikken, hvor en av to fragmenter av den homogene sekvensen i prøven som gjensidig utelukker hverandre, immobiliseres og den andre merkes. Nærværet av den interessante polynukleotidsekvensen resulterer i dobbelt hybridisering til de immobiliserte og merkede prøvesegment-ene, igjen med den samme endelige måling av bærer-forbundne innskytningskomplekser. Se Methods inEnzymology 65:468

(1980) og Gene 21:77-85(1983) for ytterligere detaljer.

Oppfinnelsen gjelder også :forsøk som omfatter påvisnings-prøver hvor den ikke-hybridiserbare delen er modifisert slik at den fester seg til en proteingjenkjennelsesstilling, som med et furocoumarin, som en binding mellom den ikke-hybridiserbare dobbelt- eller enkelt-strengede bestanddelen og proteingjenkjennelsesstillingen, som kan være et hapten eller en ligand.. En immobilisert separasjonsprøve eller testprøve underkastes hybridiseringsbetingelser i nærvær av en påvisningsprøve som er modifisert slik at den binder et protein og bærer et merke, og merket påvises. Alternativt kan proteinet utgjøre et antistoff og påvises immuno-logisk på konvensjonell måte uten formell merking av proteinet. Som et annet alternativ, dersom et hapten eller en ligand er ved proteingjenkjennelsesstillingen, kan dets nærvær påvises. Furocoumarinet kan også binde en fluorofor og fluoroforen anvendes som det påvisbare elemen-tet.

Påvisningsprøver som er fremstilt og anvendt som beskrevet ovenfor, oppviser større følsomhet enn tidligere på grunn av det meget større antall merker pr. enkeltstrenget nuklein-syreprøvemolekyl enn det er mulig med direkte merking av prøvemolekylene.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i tillegg et reagenssystem, dvs. reagenskombinasjon eller -midler, som omfatter alle de essensielle elementene som kreves for å utføre en ønsket forsøksmetode. Reagenssystemet presenteres i en kommersielt pakket form, som et preparat eller en blanding hvor foreneligheten mellom reagensene vil mulig-gjøre, i form av en testanordning, eller mere vanlig,

som en prøveutrustning, dvs. en pakket kombinasjon av en eller flere beholdere, anordninger, e.l., som inneholder de nødvendige reagenser, og vanligvis inkludert skrevne instruksjoner for utførelse av undersøkelsene.Reagens-systemer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter alle former og preparater for fremstilling av de forskjellige

hybridiseringsprodukter som er beskrevet her.

I alle tilfeller vil reagenssystemet omfatte (1) en prøve som beskrevet her, og (2) bindeproteinreagenset, fortrinnsvis merket med en påvisbar kjemisk gruppe også som beskrevet her. Systemet kan i tillegg omfatte en fast bærer for immobilisering av enkeltstrengede nukleinsyrer fra testmediet. For et "sandwich"-produkt, inkluderes en andre separasjonsprøve som beskrevet ovenfor, i systemet. En form av prøveutrustningen i systemet kan i tillegg omfatte underordnede kjemikalier som f.eks. bestanddelene i hybridi-seringsløsningen og denatureringsmidler som er istand til å omdanne dobbeltstrengede nukleinsyrer i en testprøve til en enkeltstrenget form. Fortrinnsvis er det inkludert et kjemisk lysings- og denaturerings-middel, f.eks. alkali, for behandling av prøven for å frigjøre enkeltstrengede nukleinsyrer derfra.

Oppfinnelsen skal beskrives ytterligere med henvisning

til de medfølgende eksempler hvor alle deler er etter vekt om ikke annet er angitt.

Eksempel I.

Trinn I - Isolering av lac repressor- protein.

E. coli stamme BMH 4 61:

A (lac pro) (\Cj_857t68d lac i<q>z<+>y~)/(F' lac i<q>z<+>y ~pro<+>), utviklet av Muller-Hill et al., bærer et varmeinduserbart lambda lysogen med et lac repressorgen og den produserer proteinet 1000 ganger mere enn stamme av den ville typen. (Andre E. coli-stammer kan også anvendes for å isolere proteinet). Stammen dyrkes i det vesentlige som beskrevet av Muller-Hill et al., og Platt et al., (Muller-Hill et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 59 1259 (1968), Platt et al., i Exp. in Mol Genetics (utg. J. Miller (CSH, sider 363-393 (1972)) som følger: Cellene;dyrkes i et medium' inneholdende 3% Bactotryptone, 2% Bacto gjærekstrakt (begge fra Difco) og 0,5% natriumklorid ved- 32°C til en OD. 550 på 3. Temperaturen heves så til 44°C i 20- minutter for å virke i 5 timer. Cellene oppsamles fra kulturen ved sentrifugering ved 6000 opm

og lagres frossent ved -80°C.

100 g av cellene tines og blandes i en Waring blandemaskin og den overstående væske etter sentrifugering fylles opp til 100 ml med en buffer omfattende 0,2M Tris HC1, Ph 6,9, 0,2M KC1, 10 mM mg acetat, 0,1 mM ditiotreitol, 5%

(vol/vol) glycerol) og utfelles ved tilsetning av 0,23 g/ml ammoniumsulfat. Bunnfallet oppsamles ved sentrifugering ved 10 000 opm og gjenoppløses i 5 ml av den foran nevnte buffer, og avsaltes ved uttømmende dialyse mot en bufferløsning omfattende 0,12M kaliumfosfat (Ph7,4) 0,lmM ditioteritol, 5% (vol/vol) glycerol, 2% (vol/vol) dimetylsulfat.

lac repressor-protein-eluat renses til slutt på en fosfo-cellulosekolonne ved bruk av fosfatbuffer som ovenfor,

med en lineær gradient av 0,12 til 0,24 kaliumfosfat.

Renheten i den lac repressor-holdige fraksjonen bestemmes ved elektroforese med SDS-polyakrylamid-gel. Aktivteten til lac repressor-proteinet måles ved dets evne til å binde operator-holdig DNA på kjent måte. Proteinet kan lagres ved -80°C inntil bruk.

Trinn II - Kovalent kobling av påvisningsprøve til

lac operator- DNA.

Fremstilling av et plasmid med både multiple kopier av

lac repressor-protein-bindestillingen ( lac operator) og en del av B-hemoglobin-gen, ifølge Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

1. pHWl04 er et derivat av pBR322 som har 4-

5 kopier av 203 bp Hae III-segmentet av det lac operon som inneholder lac repressor-bindestillingen. Segmentet er avsluttet med Eco RI-forbindere, og tandemkopier innføres i Ap R Tc S-vektoren pHWl (et derivat av PBR322 fremstilt ved Hae II-fordøyelse slik at de mangler sekvensen 236

til 2352) ved Eco Ri-stillingen.

2. pSS737 er et derivat av pBR322 som har det 737 bp Alu I-segment av det humane 8-globin-genet som inneholder ca. 0,5 kb av genet og ca. 0,25 kb av oppstrøms flankesekvens. Segmentet avsluttes med Eco RI-forbindere og er innført i Eco Ri-stillingen i pBR322.

Fremgangsmåten for innføring av lac repressor-bindestilling-ene og segmentet av B-globin-genet i det enkle plasmidet som i 1 og 2 ovenfor, er som følger:

a. Lineariser pHW104 med Hind III; behandle

med alkalisk fosfatase for å hindre resirkularisering i trinn c.

b. Fordøy pSS737 med Hind III pluss Fnu DII; samle opp det segmentet som er større enn 0,7 6 kb segment fra en preparativ agarosegel.

c. Forbind produktene fra trinnene a og b,

og fyll så inn frie Hind III-ender ved bruk av Klenow-fragmenter fra DNA-polymerase og deksyribonukleotid-trifos-fater.

d. Forbind (c)-molekyler ende mot ende for

å fremstille sirkulære plasmider, og omdann E. coli-celler til ampicillin-motstand.

e. Samle et antall Ap -kolonier og dyrk celler for minilysatproduksjon av små mengder av plasmid.

f. Undersøk plasmidene på sammensetning ved begrenset enzymfordøyelse. Det ønskede plasmid har:

i. en enkelt Hind III-stilling; ii. Eco RI segmenter på 2.2, 0,74 og 0,21 kb; iii. fordøyelighet av Mst II; iv. ønskelig et Cia I-segment på ca. 0,75 kb, avhengig av orienteringen av det innførte glodingenet.

Separasjons- og påvisnings-prøve for dobbelt hybridiserings-analyse av sigdcelledefekter er beskrevet i detalj i søknad nr. 511.063, innlevert 5. juli 1983, under behandling. 3. Bruk av et plasmid med både multiple kopier av lac-bindestillingen og en del av -hemoglobin-genet som en hybridiseringsprøve: For at plasmidet skal være en anvendbar prøve for påvisning av B-globin-gen-sekvens i en enkel DNA, må globin-gen-delen i plasmidet være enkeltstrenget, slik at det i en etterfølgende test kan hybridisere til en prøve av denaturert DNA, og lac operator-området må være dobbeltstrenget for å tillate binding av lac repressor-proteinet.

For å oppnå dette, lineariseres plasmidproduktet fra (2) ved bruk av Hind III, og underkastes så en regulert fordøy-else med eksonuklease III (X-eksonuklease eller T^DNA-polymerase kan anvendes på lignende måte). En slik behandling gjør det meste eller hele globin-gen-delen enkelt-strenget, og etterlater det meste av resten av plasmidet, inkludert kopiene av lac operator-området, dobbeltstrenget.

Alternativt kan par av pEMBL plasmider (tilgjengelig fra European Molecular Biology Laboratories, Heidelbart) anvendes. Disse plasmider inneholder en del av F^-fag-genomer, slik at de oppfører seg på samme måte som fag M13 ved å produsere enkeltstrengede DNA-molekyler. Men forskjellig fra M13, er det mulig med pEMBL å oppsamle begge komplementære strenger av et plasmid i ren form, ganske enkelt ved å ha F^-delen av pEMBL-genomet i forskjellig orienter-ing i to strenger. Det er orienteringen av F^-genene i plasmidet som bestemmer hvilken av de to strengene i plasmid DNA som vil utskilles fra den infiserte bakterien som enkelt-strenget DNA-fag.

Eksempelvis behandles et plasmid pEMBL8(+), slik at det inneholder tandemkopier av lac repressor-bindestillingen pluss en del av g-hemoblobinbenet. Et annet plasmid, pEMBL8(-), inneholder bare tandemkopiene av lac-repressor-bindestillingen. Den enkeltstrengede DNA av pEMBL8(+) hybridiseres til en prøve av ukjent DNA, og kontakt gjøres ved hjelp av sekvenshomologi mellom globin-gen-delen av prøven og komplementære sekvenser i prøven.

lac operator-delen av prøven gjøres dobbeltstrenget for lac repressor-binding ved herding av pEMBL8(-) til pEMBL8(+)-komplekset.

Det er mulig å utføre slike reaksjoner med den gjentatte

(men ikke den enkeltstrengede fag) formen av M13 såvel som med en hvilken som helst plasmid-DNA, men enten må

de komplementære strengene separeres, eller det må tas med et betydelig tap i hybridiseringseffektivitet ved å ha begge strengene i et plasmid tilstede i en hybridiser-ingsblanding, hvor de på uønsket måte kan selvherde.

Trinn III - ( a) - Merking av proteinet med fluorescein.

Fluoresceinisotiocyanat (FITC) oppløses i etanol (5 mg fast/ml). Til 2 ml av en 5 mg/ml proteinløsning fra (I),'tilsettes 0 , 5 ml karbonat-f ubber^ (lM_NaHC03-Na2-CO-,-buf f er, pH 9), fulgt av 50 |al FITC-løsning. Blandingen rystes godt og det frie FITC separeres kromatigrafisk fra de bundne molekylene på en "Sephadex" G50-kolonne ved bruk av en buffer omfattende 10 mMTris, 1 mM EDTA, 50 mM KC1,

pH 7,4. Det merkede proteinet oppsamles i det tomme volumet.

( b) - Merking med B- galaktosidase- enzym.

Lac repressor-protein fra I og8-galaktosidase (1:1 mol-forhold) (alkalisk fosfatase, pepperrot peroksydase reagerer på lignende måte),. blandes i fosfatbuffer og glutaraldehyd tilsette_s til sluttkonsentrasjonen på 0,2%. Reaksjonen får lov å gå i 4 timer. Proteinblandingen dialyseres mot den samme Tris-EDTA-buffer som i (a).

Trinn iv - Hybridisering og påvisning ved hjelp av merker

på lac repressoren.

For fiksering av separasjonsprøven til en fast bærer behandles den med 0,1 M NaOH i 5 minutter, avkjøles så i is. Prøven nøytraliseres med et like stort volum 0,1 N HC1,

0,9 M NaCl, 0,09 M Na-citrat, filtreres så under svakt sug gjennom et nitrocellulosefilter (f.eks. BA 85 fra Schleicher og Schuell) som på forhånd har vært neddykket

i 0,9 M NaCl, 0,09 M Na-citrat (6 x SCC, 1 x standard-salt-citrat = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-citrat). Filteret vaskes så med 6 x SCC, så 70% etanol og oppvarmes under vakuum ved 80°C i noen få timer, eller uten vakuum ved 65°C over natten. På dette punkt er filteret klart for hybridiseringsfremgangsmåter, men det kan lagres i mange måneder.

Formålet med alkalibehandlingen av separasjonsprøven er

å denaturere DNA. Dette gjør den både istand til å bindes til nitrocellulose (nativ DNA gjør det ikke) og tilgjengelig for påfølgende hybridisering med andre enkelt-strengede DNA. Nøytralisasjon av den denaturerte DNA-løsningen med syre og tilsetningen av salt (som 6 x SSC), letter bindingen av denaturert DNA til nitrocellulose, og den lave temperaturen hindrer gjenherding av separasjonsprøven mens den påføres på nitrocellulosen. Oppvarming av filteret imobiliserer til slutt DNA.

Hybridisering utføres ved som påvisningsprøve å anvende

den prøven som er fremstilt i II og som bærer den ikke-homologe DNA som er lac repressor-protein-bindestillingen.

Da hybridiseringsfremgangsmåten omfatter enkeltstrenget DNA, må det nitrocellulosefilter på hvilket separasjons-prøven imobiliseres være forhåndsbehandlet, slik at den ukjente DNA og påvisningsprøven ikke binder seg til det på slump. En slik behandling omfatter vanligvis metning av tilgjengelige stillinger på filteret med protein og polysakkarid i en blanding kjent som Denhardfs løsning (0,2 % hver av okseserumalbumin, "Ficoll", og polyvinylpyrrolidon i vann), i hvilken, sammen med noe salt og buffer, (f.eks. 6 x SSC, 0,1 M Tris, pH 8), et filter neddykkes i noen få timer ved den temperaturen som skal anvendes for hybridisering (f.eks. 65°C). Den forhåndsned-dykkede løsningen erstattes så med hybridiseringsmedium som omfatter denaturert prøve (ukjent) DNA og denaturert påvisningsprøve, og DNA-herding får lov å fortsette i noen få timer. To representative hybridiseringsbetingelser er: (I) E x SSC, 0,1 M Tris, pH 8, 65°C. Innføring av Denhardfs løsning er eventuell: og (II) 4 x SSC, 40%,

40°C, +/- Denhardfs løsning.

For å minske volumet av væske som er nødvendig og hindre fordampning, utføres ofte hybridiseringer i plastposer som er presset flate og forseglet.

Etter hybridisering vaskes den faste bæreren med BSA-løsning 1% vekt/volum i Tris-EDTA buffer som i eksempel I, trinn III (a), og så tilsettes lac repressor, merket som i III(a), (b) eller (c). Den bundne repressor påvises optisk (i eksemplet med fluorescein-merket repressor) eller enzymatisk (i eksemplet med enzym-merket repressor).

Eksempel 2.

Hybridisert prøve fra eksempel 1 som bærer lac-proteinet kan undersøkes immunokjemisk som følger: 50 mg N-hybroksysuccinimidobiotin oppløses i 2 ml dimetyl-sulfoksyd (løsning A). 10 mg 4'-aminometyltrioksalen (eller andre -aminoalkyl-forbindelser) , oppløses i 10 ml (løsning B) vandig buffer, (f.eks. "10 mM natriumtetraborat, pH justert med HC1), løsningens pH ca. 8. Løsning (A)

og (B) blandes i.et volumforhold på 1:10 og vektforhold på 10:1, slik at det aktiverte hapten er tilstede i stort overskudd. Reaksjonen får lov å fortsette ved 35°C i 1 time. Reaksjonsgraden styres ved tynnsjiktskromatografi på silicagel-plater"med en fluorescens-indikator i et løsningsmiddel 1/1/8-metanol/eddiksyre/kloroform. Under disse TLC-betingelser, beveger uomsatt aminometyltrioksalen seg med løsningsmiddelfronten, mens produktene har lang-sommere bevegelighet. Biotin viser ingen fluorescens,

men adduktet flourescerer på grunn av trioksalen. Vekst av den nye fluorescerende flekken og forsvinning av den opprinnelige fluorescerende flekken, indikerer graden av produktdannelse. Siden det aktiverte biotinet er i stort overskudd, forsvinner fluorescens som tilsvarer startmaterialet på TLC etter at reaksjonen er ferdig. Overskudd aktivt biotin omsettes med glucy1-glycin eller lysin. Nærvær av aminosyrebiotinprodukt innvirker ikke på den fotokjemiske reaksjonen mellom psoralen-biotin-forbindelser og DNA. Derfor er det ikke nødvendig med et rensetrinn etter den ovenstående reaksjonen.

b) Til hybridkomplekset inneholdende lac repressor-proteinet fra eksempel 1, inkuberes spesifike fortynninger

av antiserumet fra (a) il time ved romstemperatur. Ubundne antistoffer vaskes 3 ganger med en bufferløsning omfattende 5 mM NaH2P04, 150 mM NaCl (pH 7,4) og 0,04% "Triton"X-100. Protein A som er kovalent koblet til pepperrots-peroksydase (Sigma Chemical Co. P 8651), fortynnet 1:8000

i PBS som ovenfor, inkuberes med hybridiseringskomplekset fra eksempel 1 i 30 minutter ved romtemperatur, og vaskes 3 ganger med den foran nevnte buffer. Substrat o-fenylendiamin i citratbuffer inneholdende I^C^, pH 5,6, tilsettes, og det enzymatiske reaksjonsproduktet måles ved 492 nm. Mengden av bundet repressor bestemmes ved sammenligning

med standard kvantifiseringskurver.

Eksempel 3■

Den dobbeltstrengede del av påvisningsprøven fra eksempel

1 kan modifiseres for å binde et spesifikt antistoff som følger: Påvisningsprøven oppløses i 10 mM Tris 1 mM EDTA buffer og blandes med biotin-psoralen-addukt som beskrevet i eksempel 2A. Blandingen bestråles med 360 nm lys ved romtemperatur i 40 minutter. Etter reaksjonen dialyseres prøven mot hybridiseringsbufferen fra eksempel 1, for å utelukke uomsatt biotin-psoralen-addukt.

Den biotin-holdige påvisningsprøven hybridiseres så som

i trinn IV, og hybriden undersøkes på nærvær av biotin på kjent måte ved anvendelse av FITC-merket avidin.

Eksempel. 4.

Innføring av en antigen stilling i dobbeltstrenget nukleinsyre ved innskytning.

Kovalente etidium-DNA-komplekser fremstilles som følger: Ca. 250 mg laksesæd DNA (Sigma Chemical Co., St. Louis,

MO) oppløses i 40 ml 50 nM ZnCl2og skjæres ved 5 passerin-ger gjennom en nål av kaliber 23. Den skjærbehandlede DNA plasseres i en 250 ml kolbe og fortynnes med ytterligere 160 ml buffer. 145 mikroliter (145 |j.l ) av S^ nuklease, 200.000 enheter pr. ml, (Pharmacia P-L Bioche-micals,Piscataway, NJ), tilsettes og blandingen inkuberes ved 37°C i 50 minutter.

Reaksjonsblandingen ekstraheres så to ganger med fenol: kloroform, en gang med kloroform og DNA utfelles to ganger med etanol (Maniatis et al., (1982) "Molecular Cloning",

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Det endelige bunnfallet oppløses i 70 ml 20 mM Tris hydro-kloridbuffer, pH 8,0.

Denne DNA omsettes med 8-azidoetidium under følgende betingelser: Reaksjonsblandingen fremstilles med 33 ml 2,7

mg DNA/ml, 13,5 ml 49,5 mM 8-azidoetidium, 13,5 ml 0,2M Tris-hydroklorid-buffer, pH 8,0, 2 M NaCl og 76 ml vann. Blandingen plasseres i et 250 ml begerglass med en vannkappe holdt ved 22°C. Blandingen omrøres og belyses i 60 minutter med en 150 watt lyskaster med en avstand på 10 cm. Denne fotolyse gjentas med en identisk reaksjons-blanding.

De fotolyserte reaksjonsblandingene kombineres og ekstraheres 10 ganger med et like stort volum hver gang av n-butanol mettet med 20 mM Tris-hydroklorid-buffer, pH

8,0, 0,2 M NaCl. Den ekstraherte DNA-løsning kombineres med 23 ml 4,95 mM 8-azidoetidium og 77 ml 20 mM Tris-hydroklorid-buf fer , pH 8,0, 0,2 M NaCl. Denne oppløsning omrøres i begerglasset med vannkappe, og fotolyseres i 90 minutter. Reaksjonsproduktene ekstraheres 10 ganger med buffermettet butanol som beskrevet ovenfor, og DNA utfelles med etanol. Bunnfallet oppløses i 10 mM Tris-hydroklorid-buffer, pH

8,0, 1 mM EDTA og adsorbsjonene ved 260 og 490 nm nedtegnes. Beregninger utført som beskrevet i eksempel IA ovenfor, indikerer at 1 etidiumrest er innført pr. 4,5 DNA basepar.

Metylert thyroglobulin fremstilles som følger:

100 mg oksethyroglobulin (Sigma Chemical Co., St. Louis,MO), kombineres med 10 ml vannfri metanol og 400 |al 2,55

MHC1 i metanol). Denne blanding omrøres på en rotasjons-blander ved romtemperatur i 5 dager. Bunnfallet oppsamles ved sentrifugering og vaskes to ganger med metanol og to ganger med etanol. Det tørkes så under vakuum over natten. Ca.82 mg rørt pulver oppnås.

Antiserum til kovalent etidium-DNA titreres ved et enzym-merket immunosorbant forsøk. Polynukleotdier adsorberes på veggene i polystyren mikrotiterplater og så får kanin-antistoff lov å bindes til dem. Endelig påvises antistoffet med peroksydasemerket geit-anti-kanin-IgG. 50 |il alikvoter av løsninger inneholdende 5 \ iq polynukleotid pr. ml i 15 mM natriumcitrat, pH 7,0, 0,15 M NaCl overføres til brønner i Immulon II mikrotiterplater (Dynatek, Alexandria, VA) og ristes forsiktig ved romtemperatur i 2 timer. Brønnene tømmes så og vaskes med 10 mM natrium-fosfatbuffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% okseserum-albumin og 0,5% "Tween" 20 (PBS/BSA/Tween(<R>)).

Kanin-antiserum fortynnes i 10 mM natriumfosfat, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% BSA og 50 ul alikvoter tilsettes til brønnene og får stå i 30 minutter. Brønnene vaskes 3

(R)

ganger med PBS/BSA/TWeen . Peroksydase som er kovalent koblet til geit-antikanin IgG (Cappel Laboratories, Coch-ranville, PA), fortynnes 500 ganger i 10 mM natriumfosfat, pH 7,4, 0,15 M NaCL, 0,5% BSA og 50 |al alikvoter tilsettes til hver brønn. Denne løsning får stå i brønnene i 30 minutter ved romtemperatur og brønnene vaskes så 3 ganger med PBS/BSA/Tween(<R>).

100 mikromol (100 |aM) etidiumbromid innblandes i det fortyn-nede antiserum i brønnene som inneholder ikke kovalent etidium-DNA-kompleks og i etidium kontroll-brønnene. Alle vaskeløsnigner og reagenser som er beskrevet ovenfor for behandling av disse brønnene inneholder 100 |iM etidium.

En peroksydasesubstratløsning fremstilles med:

20 mg o-fenylendiamin

5 ml 0,5 M NaHP04

12 ml 0,1 M natriumcitrat

13 ml vann

20 (il 30% hydrogenperoksyd.

75 mikroliter (75 av substratløsningen tilsettes pr. brønn og får lov å reagere i 10 minutter ved romtemperatur. Reaksjonene stanses ved tilsetning av 50 |il 2,5 M svovelsyre. Så nedtegnes adsorbsjonene ved 488 nm med et Artek Model 210 mikroliter plate fotometer (Dynatek, Alexandria, VA).

Normalt kaninserum anvendes som en kontroll og behandles

som beskrevet for kanin-antiserumet.

Resultatene er angitt i tabell A og viser at antistoff

i kontrollkaninserumet ikke binder seg i signifikante mengder til noen av de belagte eller ubelagte brønnene.

Det kan ha en svak antistofftiter til enkeltstrenget DNA.

Antiserumet til den kovalente etidium-DNA har meget høy titer til den kovalente etidium-DNA. En del av disse antistoffene bindes sannsynligvis til etidiumrester som er koblet kovalent til fosfat ribose-kjeden. Denne konkul-sjon er basert på den observasjon at titerene til det ikke-kovalente etidium-DNA-komplekser er meget lavere (se tabell A).

Disse resultater viser at antistoffer kan heves til etidium-DNA-innskytningskompelset som ikke tverr-reagerer signifikant med nativ enkelt- eller dobbelt-strenget nukleinsyre .

Det skal forstås at beskrivelsen og eksemplene er illustrer-ende, men ikke begrensende for foreliggende oppfinnelse og at andre utførelsesformer innenfor ånd og område av oppfinnelsen vil være selvklare for fagmannen.

Claims (12)

1. Nukleinsyre påvisningsprøve, karakterisert ved at den omfatter en hybridiserbar enkelt-strenget del av nukleinsyre forbundet med en ikke-hybridiserbar, enkelt- eller dobbelt-strenget nukleinsyredel, idet den ikke-hybridiserbare delen omfatter en gjenkjennelsesstilling for binding med et spesielt protein.

2. Påvisningsprøve ifølge krav 1, karakterisert ved at den hybridiserbare delen er kontinuerlig med en av strengene i den ikke-hybridiserbare delen.

3. Påvisningsprøve ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den ikke-hybridiserbare delen omfatter en gjenkjennelsesstilling for et protein valgt fra gruppen laktose-repressor, galaktose-repressor, lambda-repressor, katabolitt-gen-aktivator-protein og Cro-protein.

4. Påvisningsprøve ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at den ikke-hybridiserbare delen er modifisert for å danne protein gjenkjennelsesstillingen ved kontakt eller reaksjon med en modifiseringsforbindelse som innfører en spesiell antigen determinant i den ikke-hybridiserbare delen, idet modifiseringsforbindelsen fortrinnsvis er en innskytningsforbindelse, en platina-holdig ligand eller salt.

5. Påvisningsprøve ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at den omfatter det spesielle proteinet bundet til den protein-spesifike stillingen i den ikke-hybridiserbare delen, idet proteinet fortrinnsvis bærer et merke valgt fra en enzymatisk aktiv gruppe, et flourescerende middel, en kromofor, et luminescerende middel, en spesifikt bindbar ligand eller en radioisotop.

6. Påvisningsprøve ifølge krav 5, karakterisert ved at proteinet er et antistoff eller et fragment derav.

7. Fremgangsmåte for påvisning av en spesiell polynukleotidsekvens i et testmedium som inneholder enkelt-strengede nukleinsyrer, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) Kombinasjon av testmediet med en nukleinsyre på-visningsprøve omfattende minst en hybridiserbar enkelt-strenget basesekvens som er i det vesentlige komplementær til den sekvensen som skal påvises og en ikke-hybridiserbar dobbelt-strenget del med en gjenkjennelsesstilling for binding med et spesielt protein, under betingelser som begunstiger hybridisering mellom den sekvens som skal påvises og den komplementære hybridiserbare sekvensen i prøven, b) Separering av den hybridiserte prøven fra uhybridisert prøve og c) Tilsetning til den separerte hybridiserte prøven av det spesielle protein som bindes til gjenkjennelsesstillingen på den ikke-hybridiserbare delen i prøven og bestemmelse av det protein som blir bundet til den faste bærer.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, som er en hybridiseringsteknikk i fast fase, hvor de enkelt-strengede nuklein-syrene fra testmediet immobiliseres på en fast bærer og hvor proteinet som er forbundet med den faste bæreren bestemmes eller som er en "solid phase sandwich" hybridiseringsteknikk i fast fase, hvor testmediet kombineres med første og andre nukleinsyreprøver som hver omfatter minst en hybridiserbar enkelt-strenget basesekvens som er i det vesentlige komplementær til en del av den sekvensen som skal påvises og som gjensidig utelukker hverandre, og hvor en av prøvene immobiliseres på en fast bærer, og den andre har nevnte ikke- hybridiserbare del med nevnte proteingjenkjennelsesstilling.

9. Reagenssystem for påvisning av en spesiell polynukleotidsekvens i et testmedium, karakterisert ved at det omfatter: a) En nukleinsyre påvisningsprøve ifølge et av kravene 1-4, og b) nevnte spesielle protein som kan bindes til nevnte gjenkjennelsesstilling på påvisningsprøven, idet proteinet fortrinnsvis bærer et merke.

10. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at proteinet er et antistoff, eller et fragment derav, merket med en enzymatisk aktiv gruppe, et flourescerende middel, en kromofor, et luminescerende middel, en spesiell bindbar ligand eller en radio-isotop.

11. Antistoff eller fragment derav, karakterisert ved at det er istand til å bindes med et innskytningskompleks dannet mellom dobbeltstrenget nukleinsyre og en nukleinsyre, og fortrinnsvis i det vesentlige ikke istand til å bindes til enkelt-strengede nukleinsyrer.

12. Antistoff eller fragment derav ifølge krav 11, karakterisert ved at det er merket med en påvisbar kjemisk gruppe som f.eks. en enzymatisk aktiv gruppe, et fluorescerende middel, en kromofor, et luminescerende middel, en spesifikt bindbar ligand eller en radioisotop.