JPH08301891A - 標的オリゴヌクレオチド被検体の精製方法 - Google Patents
標的オリゴヌクレオチド被検体の精製方法Info
- Publication number
- JPH08301891A JPH08301891A JP12642596A JP12642596A JPH08301891A JP H08301891 A JPH08301891 A JP H08301891A JP 12642596 A JP12642596 A JP 12642596A JP 12642596 A JP12642596 A JP 12642596A JP H08301891 A JPH08301891 A JP H08301891A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- analyte
- complex
- sample
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 磁気反応性粒子を使って、生物試料からオリ
ゴヌクレオチドを精製する方法を提供する。 【解決手段】 オリゴヌクレオチドに結合するパートナ
ーを連結している磁気反応性粒子をインキュベートし、
その結果、生物試料を調製して粒子結合パートナーと被
検体の複合体を形成させる。その後、磁場を印加して複
合体を細胞細片から分離する。
ゴヌクレオチドを精製する方法を提供する。 【解決手段】 オリゴヌクレオチドに結合するパートナ
ーを連結している磁気反応性粒子をインキュベートし、
その結果、生物試料を調製して粒子結合パートナーと被
検体の複合体を形成させる。その後、磁場を印加して複
合体を細胞細片から分離する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般には、細胞成
分の精製法に関し、より詳細には、オリゴヌクレオチド
に結合するパートナーが連結されている磁気反応性粒子
を使って生物試料からオリゴヌクレオチドを精製する方
法に関する。
分の精製法に関し、より詳細には、オリゴヌクレオチド
に結合するパートナーが連結されている磁気反応性粒子
を使って生物試料からオリゴヌクレオチドを精製する方
法に関する。
【０００２】
【技術背景】分子生物学及び組換えＤＮＡ技術の臨床的
応用によって、ヒトの遺伝性疾病についての知識が大い
に向上した。これらの進歩の利益を活用するためには、
高品質の完全なオリゴヌクレオチドを迅速かつ容易に分
離し、隔離しそして精製する方法を有することが必須で
ある。
応用によって、ヒトの遺伝性疾病についての知識が大い
に向上した。これらの進歩の利益を活用するためには、
高品質の完全なオリゴヌクレオチドを迅速かつ容易に分
離し、隔離しそして精製する方法を有することが必須で
ある。
【０００３】最も早く論じられたオリゴヌクレオチド精
製法の１つは、臭化アルキルトリメチルアンモニウムに
よる細菌ＤＮＡの沈澱に関連したものであった。Ｊｏｎ
ｅｓ（１９５３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ １０：６０７〜６１２。精製ＤＮＡを得るため
に必要なその後の一連の抽出と沈澱に１〜２日がかか
る。
製法の１つは、臭化アルキルトリメチルアンモニウムに
よる細菌ＤＮＡの沈澱に関連したものであった。Ｊｏｎ
ｅｓ（１９５３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ １０：６０７〜６１２。精製ＤＮＡを得るため
に必要なその後の一連の抽出と沈澱に１〜２日がかか
る。
【０００４】その後、Ｍａｒｍｕｒ（１９６１）Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：２０８〜２１８は、同様の長さの
ＤＮＡ分離手順を解説しており、これもフェノールとク
ロロホルムを用いる一連の抽出と沈澱に関連している。
当初のＭａｒｍｕｒの手順で誘導された典型的プロトコ
ルは、最初の一晩中、試料を、試料中のタンパク質を消
化するプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）
又はプロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）と共に、塩化ナトリ
ウム−トリス−ＥＤＴＡ（ＳＴＥ）緩衝液中で、５５℃
で、インキュベートすることを必要とするものである。
消化したタンパク質は、フェノール／クロロホルムで試
料から抽出する。オリゴヌクレオチドを含んでいる水性
層を回収し、緩衝液に対して一晩中透析する。エタノー
ル又はイソプロパノールによる沈澱によって試料からオ
リゴヌクレオチドを回収する。リボヌクレアーゼ（ＲＮ
ａｓｅ）処理、それに続く２回目のフェノール／クロロ
ホルム抽出及び２回目の一晩中の透析によってエタノー
ル沈殿物からＲＮＡを取り除く。２８０ｎｍでの吸光度
に対する２６０ｎｍでの吸光度の比をとって最終透析物
中のＤＮＡの濃度を決定する。
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：２０８〜２１８は、同様の長さの
ＤＮＡ分離手順を解説しており、これもフェノールとク
ロロホルムを用いる一連の抽出と沈澱に関連している。
当初のＭａｒｍｕｒの手順で誘導された典型的プロトコ
ルは、最初の一晩中、試料を、試料中のタンパク質を消
化するプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）
又はプロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）と共に、塩化ナトリ
ウム−トリス−ＥＤＴＡ（ＳＴＥ）緩衝液中で、５５℃
で、インキュベートすることを必要とするものである。
消化したタンパク質は、フェノール／クロロホルムで試
料から抽出する。オリゴヌクレオチドを含んでいる水性
層を回収し、緩衝液に対して一晩中透析する。エタノー
ル又はイソプロパノールによる沈澱によって試料からオ
リゴヌクレオチドを回収する。リボヌクレアーゼ（ＲＮ
ａｓｅ）処理、それに続く２回目のフェノール／クロロ
ホルム抽出及び２回目の一晩中の透析によってエタノー
ル沈殿物からＲＮＡを取り除く。２８０ｎｍでの吸光度
に対する２６０ｎｍでの吸光度の比をとって最終透析物
中のＤＮＡの濃度を決定する。
【０００５】この手順は、タンパク質を取り除き、かつ
オリゴヌクレオチドを定量的に回収する上で有効である
と今でも考えられている；しかし、この方法には、臨床
試験室環境でのその用途を限定する多少の欠陥がある。
第一に、その分離法は１〜２日かかる。第二に、フェノ
ール／クロロホルム抽出手順は、結果的に、サブオプチ
マル（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）で、容認すらできない、
オリゴヌクレオチド生成物を分離することになるかも知
れない。例えば、タンパク質を完全に取り除くには、フ
ェノール／クロロホルム抽出を数回繰り返さなければな
らない。オリゴヌクレオチドは、フェノールの酸化生成
物でダメージを受ける可能性があり、この反復抽出処理
は、クロロホルム／フェノール抽出毎の生成物の損失を
免れない。第三に、この方法によるＤＮＡの収量は低
く、大量の元材料を必要とする。最後に、危険な有機溶
剤を使用するので、前述の手順は、臨床上の用途に容認
できない。
オリゴヌクレオチドを定量的に回収する上で有効である
と今でも考えられている；しかし、この方法には、臨床
試験室環境でのその用途を限定する多少の欠陥がある。
第一に、その分離法は１〜２日かかる。第二に、フェノ
ール／クロロホルム抽出手順は、結果的に、サブオプチ
マル（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）で、容認すらできない、
オリゴヌクレオチド生成物を分離することになるかも知
れない。例えば、タンパク質を完全に取り除くには、フ
ェノール／クロロホルム抽出を数回繰り返さなければな
らない。オリゴヌクレオチドは、フェノールの酸化生成
物でダメージを受ける可能性があり、この反復抽出処理
は、クロロホルム／フェノール抽出毎の生成物の損失を
免れない。第三に、この方法によるＤＮＡの収量は低
く、大量の元材料を必要とする。最後に、危険な有機溶
剤を使用するので、前述の手順は、臨床上の用途に容認
できない。
【０００６】アルカリ有機薬品の使用と冗長な試料処理
時間を避けるため、オリゴヌクレオチドを分離する別法
がいくつか開発されている。しかし、これらの方法にも
依然としていくつかの問題がある。ある方法は高度に純
化した元材料を必要とし、他の方法では、例えば、バク
テリアから小量のゲノムＤＮＡを分離するのに有効なだ
けである。他の方法は、大量試料の迅速なバッチ処理に
はすぐに役立たない。
時間を避けるため、オリゴヌクレオチドを分離する別法
がいくつか開発されている。しかし、これらの方法にも
依然としていくつかの問題がある。ある方法は高度に純
化した元材料を必要とし、他の方法では、例えば、バク
テリアから小量のゲノムＤＮＡを分離するのに有効なだ
けである。他の方法は、大量試料の迅速なバッチ処理に
はすぐに役立たない。
【０００７】高純度のオリゴヌクレオチドを容易に得る
上でのこれらの限界の故に、診断に役立つハイブリダイ
ゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）又は臨床試
験室での他の検定のためのオリゴヌクレオチドを分離す
るのは、まだ一般的手段になっていない。臨床の検定に
使用できるオリゴヌクレオチドを生物試料から抽出する
のに使えるであろう方法は、１）高速で、分オーダーで
完了でき；２）実行が容易で、試料準備は最低限でよ
く；３）不快で危険な有機薬品が無く；４）一本又は二
本鎖の、任意の長さのＤＮＡ又はＲＮＡの抽出に十分に
適応性があり；かつ５）高純度のオリゴヌクレオチドを
生成できるものでなければならない。
上でのこれらの限界の故に、診断に役立つハイブリダイ
ゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）又は臨床試
験室での他の検定のためのオリゴヌクレオチドを分離す
るのは、まだ一般的手段になっていない。臨床の検定に
使用できるオリゴヌクレオチドを生物試料から抽出する
のに使えるであろう方法は、１）高速で、分オーダーで
完了でき；２）実行が容易で、試料準備は最低限でよ
く；３）不快で危険な有機薬品が無く；４）一本又は二
本鎖の、任意の長さのＤＮＡ又はＲＮＡの抽出に十分に
適応性があり；かつ５）高純度のオリゴヌクレオチドを
生成できるものでなければならない。
【０００８】オリゴヌクレオチドを生物試料から分離す
る別の方法も、下に例示するように、いくつか報告され
ている。
る別の方法も、下に例示するように、いくつか報告され
ている。
【０００９】１９９０年３月１３日付け米国特許第４，
９０８，３１８号（対Ｌｅｒｎｅｒ）は、血液試料のバ
フィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）部分からオリゴ
ヌクレオチドを抽出する方法を記述しており、この場合
はそこにある細胞を溶解し、その結果放出されるオリゴ
ヌクレオチドを、可溶化し、次いで選択的に沈澱させる
ものである。
９０８，３１８号（対Ｌｅｒｎｅｒ）は、血液試料のバ
フィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）部分からオリゴ
ヌクレオチドを抽出する方法を記述しており、この場合
はそこにある細胞を溶解し、その結果放出されるオリゴ
ヌクレオチドを、可溶化し、次いで選択的に沈澱させる
ものである。
【００１０】１９９０年６月１９日付け米国特許第４，
９３５，３４２号（対Ｓｅｌｉｇｓｏｎ等）は、アニオ
ン交換カラムクロマトグラフィーを使って生物試料から
オリゴヌクレオチドを分離・精製する方法を記述してい
る。
９３５，３４２号（対Ｓｅｌｉｇｓｏｎ等）は、アニオ
ン交換カラムクロマトグラフィーを使って生物試料から
オリゴヌクレオチドを分離・精製する方法を記述してい
る。
【００１１】１９９１年１月８日付け米国特許第４，９
８３，５２３号（対Ｌｉ等）は、試料の無攻撃性超音波
処理で細胞を溶解して、ハイブリダイゼーション用オリ
ゴヌクレオチドを作製する方法を記述している。
８３，５２３号（対Ｌｉ等）は、試料の無攻撃性超音波
処理で細胞を溶解して、ハイブリダイゼーション用オリ
ゴヌクレオチドを作製する方法を記述している。
【００１２】国際出願Ｎｏ．ＷＯ９３／０３１５０は、
カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）試薬中で細胞
に無攻撃性超音波処理を施し、それによって放出される
オリゴヌクレオチドを均一の長さのフラグメントに切
り、そのフラグメントを一本鎖オリゴヌクレオチドに変
性することによって、ハイブリダイゼーション用一本鎖
オリゴヌクレオチドの剪断フラグメントを作製する方法
を記述している。
カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）試薬中で細胞
に無攻撃性超音波処理を施し、それによって放出される
オリゴヌクレオチドを均一の長さのフラグメントに切
り、そのフラグメントを一本鎖オリゴヌクレオチドに変
性することによって、ハイブリダイゼーション用一本鎖
オリゴヌクレオチドの剪断フラグメントを作製する方法
を記述している。
【００１３】Ｖｅｒｍａ（１９８８）ＢｉｏＦｅｅｄｂ
ａｃｋ ６：８４９〜８５１は、高濃度のカオトロピッ
ク試薬を使ってＲＦＬＰ分析に適するＤＮＡの分離法を
記述している。
ａｃｋ ６：８４９〜８５１は、高濃度のカオトロピッ
ク試薬を使ってＲＦＬＰ分析に適するＤＮＡの分離法を
記述している。
【００１４】Ｙａｎａｍａｎｄｒａ等（１９８９）Ｇｅ
ｎｅ Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎ．６：７１〜７４は、アガ
ロース溶液中に浮遊している細胞を必要とするアガロー
スゲル法を使い、そのアガロース溶液を凝固させ、かつ
在来法を使ってそのアガロースゲル中の細胞を処理し
て、ＤＮＡを分離し、その特性を決定する方法が記述さ
れており、これによって在来技術を使って分離したＤＮ
Ａより高分子量のＤＮＡが得られる。
ｎｅ Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎ．６：７１〜７４は、アガ
ロース溶液中に浮遊している細胞を必要とするアガロー
スゲル法を使い、そのアガロース溶液を凝固させ、かつ
在来法を使ってそのアガロースゲル中の細胞を処理し
て、ＤＮＡを分離し、その特性を決定する方法が記述さ
れており、これによって在来技術を使って分離したＤＮ
Ａより高分子量のＤＮＡが得られる。
【００１５】Ｍａｊｕｍｄａｒ等（１９９１）ＢｉｏＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：９４０〜１０１は、界面活
性剤で細胞を溶解し、フェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコールで水性試料からオリゴヌクレオチドを
抽出し、ｐＨを上げて有機層からＤＮＡを溶離すること
により、ＤＮＡを分離する方法を記述している。
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：９４０〜１０１は、界面活
性剤で細胞を溶解し、フェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコールで水性試料からオリゴヌクレオチドを
抽出し、ｐＨを上げて有機層からＤＮＡを溶離すること
により、ＤＮＡを分離する方法を記述している。
【００１６】
【発明の目的】上述の技術上の必要性に対処するため、
本発明は、臨床検定及び、精製して汚染物質を除去した
オリゴヌクレオチドを必要とするその他の検定に適する
高純度オリゴヌクレオチドの作製法を提供することを目
的とする。
本発明は、臨床検定及び、精製して汚染物質を除去した
オリゴヌクレオチドを必要とするその他の検定に適する
高純度オリゴヌクレオチドの作製法を提供することを目
的とする。
【００１７】
【発明の概要】上記の目的を達成するために、本発明の
方法は、オリゴヌクレオチドに結合するパートナーで表
面被覆した磁気反応性粒子を用い、この被覆した粒子を
生物試料に加える。オリゴヌクレオチドは、それらの結
合パートナーとの相互作用によってその粒子に結合さ
れ、次いで、磁場の印加によって試料から分離される。
方法は、オリゴヌクレオチドに結合するパートナーで表
面被覆した磁気反応性粒子を用い、この被覆した粒子を
生物試料に加える。オリゴヌクレオチドは、それらの結
合パートナーとの相互作用によってその粒子に結合さ
れ、次いで、磁場の印加によって試料から分離される。
【００１８】すなわち、本発明は、標的の被検体を含む
試料を生成し、同試料をオリゴヌクレオチド被検体に結
合するパートナーが連結されている磁気反応性粒子と接
触させ、その粒子と共に同試料をインキュベートし、そ
れによって粒子に結合するパートナー−被検体の複合体
を形成し、その試料を磁場に曝して試料から複合体を分
離して、標的とするオリゴヌクレオチド被検体を精製す
る方法を要旨とする。
試料を生成し、同試料をオリゴヌクレオチド被検体に結
合するパートナーが連結されている磁気反応性粒子と接
触させ、その粒子と共に同試料をインキュベートし、そ
れによって粒子に結合するパートナー−被検体の複合体
を形成し、その試料を磁場に曝して試料から複合体を分
離して、標的とするオリゴヌクレオチド被検体を精製す
る方法を要旨とする。
【００１９】本発明の実施には、特に指示がなければ、
従来技術の範囲にある分子生物学、微生物学、組換えＤ
ＮＡ技術、及び免疫学といった在来技術を利用する。そ
の種の技術は文献に詳しく説明されている。例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．１９
８４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ
Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，１９８６）；
ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．
Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，ｉｎｃ．）；及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
ｓ．Ｉ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂ
ｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗ
ｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ）を参照。
従来技術の範囲にある分子生物学、微生物学、組換えＤ
ＮＡ技術、及び免疫学といった在来技術を利用する。そ
の種の技術は文献に詳しく説明されている。例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．１９
８４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ
Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，１９８６）；
ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．
Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，ｉｎｃ．）；及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ
ｓ．Ｉ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂ
ｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗ
ｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ）を参照。
【００２０】Ａ．定義：本発明を詳細に説明するに先立
ち、本発明は、特定の被検体に結合するパートナー、磁
気反応性粒子又は前述のように変化してよい被覆技術に
限定されるものではないことを理解すべきである。ま
た、ここに使用する技術は、特殊な実施例を説明するた
めのみのものであって、限定しようとするものでないこ
とも理解すべきである。留意すべきは、本明細書に用い
られているように、単数形の用語は、前後関係が別途明
確に指示されない限り、複数の指示物を包含するという
ことである。従って、例えば、“被検体”なる用語は、
被検体群の混合物を含み、“被検体に結合するパートナ
ー”なる用語は、２つ以上の前記結合パートナーの混合
物、及びその類を含む。この点に関して、留意すべき重
要なポイントは、本発明の諸技術は、例えば、磁気反応
性粒子上に捕捉されるような、試料からの多数の被検体
を精製するのに用いてよいということである。
ち、本発明は、特定の被検体に結合するパートナー、磁
気反応性粒子又は前述のように変化してよい被覆技術に
限定されるものではないことを理解すべきである。ま
た、ここに使用する技術は、特殊な実施例を説明するた
めのみのものであって、限定しようとするものでないこ
とも理解すべきである。留意すべきは、本明細書に用い
られているように、単数形の用語は、前後関係が別途明
確に指示されない限り、複数の指示物を包含するという
ことである。従って、例えば、“被検体”なる用語は、
被検体群の混合物を含み、“被検体に結合するパートナ
ー”なる用語は、２つ以上の前記結合パートナーの混合
物、及びその類を含む。この点に関して、留意すべき重
要なポイントは、本発明の諸技術は、例えば、磁気反応
性粒子上に捕捉されるような、試料からの多数の被検体
を精製するのに用いてよいということである。
【００２１】本明細書において、多数の用語について下
記意味を有するものとする：
記意味を有するものとする：
【００２２】ここに用いられているように、用語“オリ
ゴヌクレオチド”は、二本−及び一本鎖ＲＮＡの外に二
本−及び一本鎖ＤＮＡも含む。用語“オリゴヌクレオチ
ド被検体”は、標的被検体に結合するパートナーが連結
することになる一本−又は二本鎖オリゴヌクレオチドに
該当する。被検体オリゴヌクレオチドは、種々の発生
源、例えば、血液、尿、脳脊髄液、大便、たん、又は外
科的滲出液、バクテリア又はウイルス由来の遺伝ＤＮＡ
又はＲＮＡ、食物成分、環境物質等を含むヒトもしくは
他のほ乳動物の生体流動物又は組織からのものであって
よく、かつ様々の手段、例えば、プロテイナーゼＫ／Ｓ
ＤＳ、カオトロピック塩、又はその類によって精製処理
できるよう作製してよい。用語“オリゴヌクレオチド被
検体”は、ここでは“被検体”及び“標的被検体”と入
れ換えて用いられる。
ゴヌクレオチド”は、二本−及び一本鎖ＲＮＡの外に二
本−及び一本鎖ＤＮＡも含む。用語“オリゴヌクレオチ
ド被検体”は、標的被検体に結合するパートナーが連結
することになる一本−又は二本鎖オリゴヌクレオチドに
該当する。被検体オリゴヌクレオチドは、種々の発生
源、例えば、血液、尿、脳脊髄液、大便、たん、又は外
科的滲出液、バクテリア又はウイルス由来の遺伝ＤＮＡ
又はＲＮＡ、食物成分、環境物質等を含むヒトもしくは
他のほ乳動物の生体流動物又は組織からのものであって
よく、かつ様々の手段、例えば、プロテイナーゼＫ／Ｓ
ＤＳ、カオトロピック塩、又はその類によって精製処理
できるよう作製してよい。用語“オリゴヌクレオチド被
検体”は、ここでは“被検体”及び“標的被検体”と入
れ換えて用いられる。
【００２３】ここで用いる用語“被検体”は、精製され
る分子種を意味するものとする。上記したように、被検
体群は、被検体に結合するパートナーで表面被覆されて
いる磁気反応性粒子にそれらが結合して、粒子結合パー
トナーと被検体の複合体を作ることによって精製され
る。複合体は、その後、試料に磁場を印加し、それによ
って、試料の残留成分を除去する以後の処理に備えて被
検体を固定化することによって、試料から分離する。用
語“被検体”はまた、特有の状況で重大性を有する被検
体群と機能的に等価である分子種を含むものとする。従
って、用語“被検体”は、被検体類似体、被検体フラグ
メント、及びその類を包含する。
る分子種を意味するものとする。上記したように、被検
体群は、被検体に結合するパートナーで表面被覆されて
いる磁気反応性粒子にそれらが結合して、粒子結合パー
トナーと被検体の複合体を作ることによって精製され
る。複合体は、その後、試料に磁場を印加し、それによ
って、試料の残留成分を除去する以後の処理に備えて被
検体を固定化することによって、試料から分離する。用
語“被検体”はまた、特有の状況で重大性を有する被検
体群と機能的に等価である分子種を含むものとする。従
って、用語“被検体”は、被検体類似体、被検体フラグ
メント、及びその類を包含する。
【００２４】ここで用いられているような用語“被検体
に結合するパートナー”、“標的に結合するパートナ
ー”及び“オリゴヌクレオチドに結合するパートナー”
は、被検体オリゴヌクレオチドに結合することになる分
子を包含するものとする。被検体に結合するパートナー
は、標的被検体の一般的構造特性を識別するタンパク質
であってよい、即ち、それらは一本−又は二本鎖オリゴ
ヌクレオチドに結合してよく、もしくは、標的被検体の
特定ヌクレオチド配列を識別してよい。
に結合するパートナー”、“標的に結合するパートナ
ー”及び“オリゴヌクレオチドに結合するパートナー”
は、被検体オリゴヌクレオチドに結合することになる分
子を包含するものとする。被検体に結合するパートナー
は、標的被検体の一般的構造特性を識別するタンパク質
であってよい、即ち、それらは一本−又は二本鎖オリゴ
ヌクレオチドに結合してよく、もしくは、標的被検体の
特定ヌクレオチド配列を識別してよい。
【００２５】ここで用いられる用語“分離”及び“精
製”は、他のオリゴヌクレオチドの種類を含有する他の
物質に加えて、特定オリゴヌクレオチド被検体を含有す
る組成を、即ち、従ってその組成が実質上純粋な形のオ
リゴヌクレオチドを含むようなオリゴヌクレオチドに、
有効に濃縮できる、ということを意味するものとする。
オリゴヌクレオチドの純度を測定するのに光学法又は蛍
光法を用いてよい。Ｓｃｈｌｅｉｆ等（１９８１）Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ
ａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。典型的には、“精製”
オリゴヌクレオチドは、少なくとも約９０ｗｔ％の、よ
り著しくは少なくとも約９５ｗｔ％の、最も著しくは少
なくとも約９９ｗｔ％の、そのオリゴヌクレオチドを含
有する組成を表す。一般に、Ａ２６０で３５％というハ
イパークロミシティ（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔ
ｙ）は、純粋なＤＮＡに予測されるものである。純粋な
二本鎖ＤＮＡについてのＡ２６０：Ａ２８０の比は、約
１．６５と１．８５の間にある。
製”は、他のオリゴヌクレオチドの種類を含有する他の
物質に加えて、特定オリゴヌクレオチド被検体を含有す
る組成を、即ち、従ってその組成が実質上純粋な形のオ
リゴヌクレオチドを含むようなオリゴヌクレオチドに、
有効に濃縮できる、ということを意味するものとする。
オリゴヌクレオチドの純度を測定するのに光学法又は蛍
光法を用いてよい。Ｓｃｈｌｅｉｆ等（１９８１）Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌ
ａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。典型的には、“精製”
オリゴヌクレオチドは、少なくとも約９０ｗｔ％の、よ
り著しくは少なくとも約９５ｗｔ％の、最も著しくは少
なくとも約９９ｗｔ％の、そのオリゴヌクレオチドを含
有する組成を表す。一般に、Ａ２６０で３５％というハ
イパークロミシティ（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔ
ｙ）は、純粋なＤＮＡに予測されるものである。純粋な
二本鎖ＤＮＡについてのＡ２６０：Ａ２８０の比は、約
１．６５と１．８５の間にある。
【００２６】オリゴヌクレオチド被検体に連結するパー
トナーの例としては、シス抑制信号と呼ばれる短いヌク
レオチド配列と直接相互作用する、ヒトのサイトメガロ
ウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）のＩＥ−
２タンパク質（Ｌａｎｇ等（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ，６７：３２３〜３３１）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ）淋病のＤＮＡに結合するタンパク質（Ｄｏｒ
ｗａｒｄ等（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７
１：４１９６〜４２０１）、繊維状ファージ（ｐｈａｇ
ｅ）Ｍ１３及びｆｄ遺伝子Ｖ生成物（Ａｌｂｅｒｔｓ等
（１９７２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６８：１３９〜１
５２；Ｏｅｙ等（１９７２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６
８：１２５〜１３８）、ファージＩｋｅ ＰＩＫＥタン
パク質（Ｐｅｅｔｅｒｓ等（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６９：１９７〜２１５）、バクテリオファー
ジＴ４遺伝子３２タンパク質（Ａｌｂｅｒｔｓ等（１９
７０）Ｎａｔｕｒｅ２２７：１３１３〜１３１８）、バ
クテリオファージＴ７遺伝子２．５タンパク質（Ｒｅｕ
ｂｅｎ（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７０：１８４６〜１８５０）、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｆ性因子でコード化されたＳＳＦタン
パク質（Ｃｈａｓｅ等（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：５４８０〜５４
８４）、ＳＳＢタンパク質（Ｍｏｌｉｎｅｕｘ（１９７
４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：６０９０〜６０
９８）、Ｎ４ ＳＳＢ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ等（１９８
９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１２７００〜１
２７０８、ヘルペス単純ウイルス・タイプ１及び２主Ｄ
ＮＡ結合タンパク質ＩＣＰ８（ＭｃＧｅｏｃｈ等（１９
８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１〜１５
７４；Ｔｏｈ等（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１
２９：１８３〜１９６）又はＨＳＶＤＮＡ結合タンパク
質ＩＣＰ４及びＩＣＳＰ１１／１２（Ｌｅｈｔｉｎｅｎ
（１９８６）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．８７：１０７〜１
１８；Ｌｅｈｔｉｎｅｎ等（１９８５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖ
ｉｒｏｌ．１６：２４５〜２５６）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ動原体（セントロメア（ｃｅｔｒｏｍｅｒ
ｅ））ＤＮＡエレメントＩ結合タンパク質（Ｂｒａｍ等
（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：４０３
〜４０９）、ＵＶ−誘導、ダメージ−特定ＤＮＡ結合タ
ンパク質（Ａｂｒａｍｉｃ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２２４９３〜２２５００）、Ｍ
ｅＣＰ２、メチル化ＤＮＡに親和性を有する脊椎動物Ｄ
ＮＡ結合タンパク質（Ｍｅｅｈａｎ等（１９９２）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００：５０８５〜
５０９２）、（ニュークリア・マトリックス／スカホー
ルド《ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｔｒｉｘ／ｓｃａｆｆｏｌ
ｄ》付着ＤＮＡと高い親和性を有する）ＳＡＦ−Ａ（Ｒ
ｏｍｉｎｇ等（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３４３
１〜３４４０）、及びその類がある。本発明に有用なさ
らに別のタンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ）、ｌａｃリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓ
ｏｒ）及びオペレーター、アデノウイルス主要後期転写
因子、及びショウジョウバエ熱ショック・アクチベータ
ータンパク質を含む。高い親和性を有するが配列の特異
性を有さずに一本鎖ＤＮＡと結合する他のタンパク質
は、Ｃｈａｓｅ等（１９８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．５３：１０３〜１３６に記述されている。
トナーの例としては、シス抑制信号と呼ばれる短いヌク
レオチド配列と直接相互作用する、ヒトのサイトメガロ
ウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）のＩＥ−
２タンパク質（Ｌａｎｇ等（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ，６７：３２３〜３３１）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ）淋病のＤＮＡに結合するタンパク質（Ｄｏｒ
ｗａｒｄ等（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７
１：４１９６〜４２０１）、繊維状ファージ（ｐｈａｇ
ｅ）Ｍ１３及びｆｄ遺伝子Ｖ生成物（Ａｌｂｅｒｔｓ等
（１９７２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６８：１３９〜１
５２；Ｏｅｙ等（１９７２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６
８：１２５〜１３８）、ファージＩｋｅ ＰＩＫＥタン
パク質（Ｐｅｅｔｅｒｓ等（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６９：１９７〜２１５）、バクテリオファー
ジＴ４遺伝子３２タンパク質（Ａｌｂｅｒｔｓ等（１９
７０）Ｎａｔｕｒｅ２２７：１３１３〜１３１８）、バ
クテリオファージＴ７遺伝子２．５タンパク質（Ｒｅｕ
ｂｅｎ（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７０：１８４６〜１８５０）、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｆ性因子でコード化されたＳＳＦタン
パク質（Ｃｈａｓｅ等（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：５４８０〜５４
８４）、ＳＳＢタンパク質（Ｍｏｌｉｎｅｕｘ（１９７
４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：６０９０〜６０
９８）、Ｎ４ ＳＳＢ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ等（１９８
９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１２７００〜１
２７０８、ヘルペス単純ウイルス・タイプ１及び２主Ｄ
ＮＡ結合タンパク質ＩＣＰ８（ＭｃＧｅｏｃｈ等（１９
８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１〜１５
７４；Ｔｏｈ等（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１
２９：１８３〜１９６）又はＨＳＶＤＮＡ結合タンパク
質ＩＣＰ４及びＩＣＳＰ１１／１２（Ｌｅｈｔｉｎｅｎ
（１９８６）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．８７：１０７〜１
１８；Ｌｅｈｔｉｎｅｎ等（１９８５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖ
ｉｒｏｌ．１６：２４５〜２５６）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ動原体（セントロメア（ｃｅｔｒｏｍｅｒ
ｅ））ＤＮＡエレメントＩ結合タンパク質（Ｂｒａｍ等
（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：４０３
〜４０９）、ＵＶ−誘導、ダメージ−特定ＤＮＡ結合タ
ンパク質（Ａｂｒａｍｉｃ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２２４９３〜２２５００）、Ｍ
ｅＣＰ２、メチル化ＤＮＡに親和性を有する脊椎動物Ｄ
ＮＡ結合タンパク質（Ｍｅｅｈａｎ等（１９９２）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００：５０８５〜
５０９２）、（ニュークリア・マトリックス／スカホー
ルド《ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｔｒｉｘ／ｓｃａｆｆｏｌ
ｄ》付着ＤＮＡと高い親和性を有する）ＳＡＦ−Ａ（Ｒ
ｏｍｉｎｇ等（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３４３
１〜３４４０）、及びその類がある。本発明に有用なさ
らに別のタンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ）、ｌａｃリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓ
ｏｒ）及びオペレーター、アデノウイルス主要後期転写
因子、及びショウジョウバエ熱ショック・アクチベータ
ータンパク質を含む。高い親和性を有するが配列の特異
性を有さずに一本鎖ＤＮＡと結合する他のタンパク質
は、Ｃｈａｓｅ等（１９８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．５３：１０３〜１３６に記述されている。
【００２７】さらに別のオリゴヌクレオチドに結合する
パートナーには、ＲＮＡ結合タンパク質、例えば、真核
開始因子−３、特に６２−ｋＤａサブユニット（Ｎａｒ
ａｎｄａ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
９：３２２８６〜３２２９２）、ヒトのカルレチクリン
（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）、風疹ウイルスＲＮＡ結
合タンパク質（Ｓｉｎｇｈ等（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２７７０
〜１２７７４）、ＳｅｃＡタンパク質（Ｋｉｓｅｒ等
（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
９：３２３〜３２９）、（Ａ＋Ｕ−ｒｉｃｈエレメント
に結合する）ＡＵＦ１（Ｅｈｒｅｎｍａｎ等（１９９
４）Ｇｅｎｅ１４９：３１５〜３１９）、ＲＮＡ結合タ
ンパク質Ｋ及びＨ１６（Ｇａｉｌｌａｒｄ等（１９９
４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４１
８３〜４１８６；Ａａｓｈｅｉｍ等（１９９４）Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：９５９〜９６
４）、Ｔａｔ、ｔｒａｎｓ活性化応答エレメントＲＮＡ
に結合するＨＩＶ−１核調節タンパク質（Ｊｏｎｅｓ等
（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：
７１７〜７４３）、ヌクレオリン、及びその類がある。
パートナーには、ＲＮＡ結合タンパク質、例えば、真核
開始因子−３、特に６２−ｋＤａサブユニット（Ｎａｒ
ａｎｄａ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
９：３２２８６〜３２２９２）、ヒトのカルレチクリン
（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）、風疹ウイルスＲＮＡ結
合タンパク質（Ｓｉｎｇｈ等（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２７７０
〜１２７７４）、ＳｅｃＡタンパク質（Ｋｉｓｅｒ等
（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
９：３２３〜３２９）、（Ａ＋Ｕ−ｒｉｃｈエレメント
に結合する）ＡＵＦ１（Ｅｈｒｅｎｍａｎ等（１９９
４）Ｇｅｎｅ１４９：３１５〜３１９）、ＲＮＡ結合タ
ンパク質Ｋ及びＨ１６（Ｇａｉｌｌａｒｄ等（１９９
４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４１
８３〜４１８６；Ａａｓｈｅｉｍ等（１９９４）Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：９５９〜９６
４）、Ｔａｔ、ｔｒａｎｓ活性化応答エレメントＲＮＡ
に結合するＨＩＶ−１核調節タンパク質（Ｊｏｎｅｓ等
（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：
７１７〜７４３）、ヌクレオリン、及びその類がある。
【００２８】加えて、オリゴヌクレオチド被検体に結合
するタンパク質は、周知の諸法を使って識別してよい。
前述の諸法は、例えば、Ｊ．−Ｃ．Ｌｅｌｏｎｇ（１９
９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８：６０９〜６
１８、Ｋｈｕｎｔｉｒａｔ等（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ．２９：９７〜１０４、Ｓｉ
ｎｇｈ等（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４７：６５〜７０に記述され
ている。さらに、ロイシン−ジッパー（ｌｅｕｃｉｎｅ
−ｚｉｐｐｅｒ）遺伝子調節タンパク質の“Ｙ−形鋏グ
リップ”に基づいてＤＮＡの配列を識別できるよう設計
されたオリゴヌクレオチドに結合するタンパク質を作製
してよい（Ｐａｒｋ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９０９４〜９０
９６）。
するタンパク質は、周知の諸法を使って識別してよい。
前述の諸法は、例えば、Ｊ．−Ｃ．Ｌｅｌｏｎｇ（１９
９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８：６０９〜６
１８、Ｋｈｕｎｔｉｒａｔ等（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈ．２９：９７〜１０４、Ｓｉ
ｎｇｈ等（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４７：６５〜７０に記述され
ている。さらに、ロイシン−ジッパー（ｌｅｕｃｉｎｅ
−ｚｉｐｐｅｒ）遺伝子調節タンパク質の“Ｙ−形鋏グ
リップ”に基づいてＤＮＡの配列を識別できるよう設計
されたオリゴヌクレオチドに結合するタンパク質を作製
してよい（Ｐａｒｋ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９０９４〜９０
９６）。
【００２９】さらに、被検体に結合するパートナーは抗
体であってよい。標的オリゴヌクレオチド又はそのフラ
グメントは、抗原として用いられ、周知の方法によって
抗体群、ポリクローナル又はモノクローナルの何れか又
は両方を作り出すことができる。もし、ポリクローナル
抗体群が望まれるなら、選択したほ乳動物、（例えば、
マウス、ラビット、ヤギ、馬、豚等）所望の抗原又はそ
のフラグメントで免疫化する。そのほ乳動物から血清を
収集し、既知の手順に従って処理する。もし、ポリクロ
ーナル抗体群を含有する血清が使われれば、ポリクロー
ナル抗体群は、既知の手順を使ってイムノアフィニティ
・クロマトグラフィーによって精製することができる。
体であってよい。標的オリゴヌクレオチド又はそのフラ
グメントは、抗原として用いられ、周知の方法によって
抗体群、ポリクローナル又はモノクローナルの何れか又
は両方を作り出すことができる。もし、ポリクローナル
抗体群が望まれるなら、選択したほ乳動物、（例えば、
マウス、ラビット、ヤギ、馬、豚等）所望の抗原又はそ
のフラグメントで免疫化する。そのほ乳動物から血清を
収集し、既知の手順に従って処理する。もし、ポリクロ
ーナル抗体群を含有する血清が使われれば、ポリクロー
ナル抗体群は、既知の手順を使ってイムノアフィニティ
・クロマトグラフィーによって精製することができる。
【００３０】特異なオリゴヌクレオチド被検体に対する
モノクローナル抗体群も当業者が容易に作ることができ
る。ハイブリドーマ技術を使ってモノクローナル抗体群
を作るための一般的方法はよく知られている。不死の抗
体を作り出す細胞系は、細胞融合によって、及びがん関
連遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接トランスフォメ
ーション（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、又はエプ
スタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
ｖｉｒｕｓ）によるトランスフェクション（ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｉｏｎ）のような他の技術によって生成して
よい。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒ等、Ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８０）；Ｈａｍｍ
ｅｒｌｉｎｇ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９８０）；さらに、米国
特許第４，３４１，７６１；４，３９９，１２１；４，
４２７，７８３；４，４４４，８８７；４，４５２，５
７０；４，４６６，９１７；４，４７２，５００；４，
４９１，６３２；及び４，４９３，８９０号を参照。対
象抗原に対して作られるモノクローナル抗体群のパネル
（ｐａｎｅｌ）、又はそのフラグメントは、種々の特性
について、即ち、イソタイプ、エピトープ、親和性につ
いて選別することができる。
モノクローナル抗体群も当業者が容易に作ることができ
る。ハイブリドーマ技術を使ってモノクローナル抗体群
を作るための一般的方法はよく知られている。不死の抗
体を作り出す細胞系は、細胞融合によって、及びがん関
連遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接トランスフォメ
ーション（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、又はエプ
スタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
ｖｉｒｕｓ）によるトランスフェクション（ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔｉｏｎ）のような他の技術によって生成して
よい。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒ等、Ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８０）；Ｈａｍｍ
ｅｒｌｉｎｇ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔ等、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９８０）；さらに、米国
特許第４，３４１，７６１；４，３９９，１２１；４，
４２７，７８３；４，４４４，８８７；４，４５２，５
７０；４，４６６，９１７；４，４７２，５００；４，
４９１，６３２；及び４，４９３，８９０号を参照。対
象抗原に対して作られるモノクローナル抗体群のパネル
（ｐａｎｅｌ）、又はそのフラグメントは、種々の特性
について、即ち、イソタイプ、エピトープ、親和性につ
いて選別することができる。
【００３１】Ｂ．一般的方法：全般に、本発明の方法
は、標的とするオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、
ＲＮＡ又はその両方を複雑な生物試料から迅速かつ容易
に精製することに関連する。最も興味深いことは、ハイ
ブリダイゼーション検定を使う臨床的診断に使えるよう
関連した血液又は組織からのオリゴヌクレオチドの分離
・精製である。精製オリゴヌクレオチドの分析も、通
常、例えば、増幅又は配列決定のような諸技術を使って
実施される。
は、標的とするオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、
ＲＮＡ又はその両方を複雑な生物試料から迅速かつ容易
に精製することに関連する。最も興味深いことは、ハイ
ブリダイゼーション検定を使う臨床的診断に使えるよう
関連した血液又は組織からのオリゴヌクレオチドの分離
・精製である。精製オリゴヌクレオチドの分析も、通
常、例えば、増幅又は配列決定のような諸技術を使って
実施される。
【００３２】ここに開示した方法は、試料中の細胞成分
の高速溶解と、磁気反応性粒子に連結した特定オリゴヌ
クレオチド結合パートナーへ放出された標的オリゴヌク
レオチドを結合することと、磁場の印加による粗溶液か
らのオリゴヌクレオチドの分離とを組合わせるものであ
る。
の高速溶解と、磁気反応性粒子に連結した特定オリゴヌ
クレオチド結合パートナーへ放出された標的オリゴヌク
レオチドを結合することと、磁場の印加による粗溶液か
らのオリゴヌクレオチドの分離とを組合わせるものであ
る。
【００３３】生物試料から諸成分を分離するために磁気
反応性粒子を利用することは、すでに評価されている
（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ等（１９８２）Ｃｈｅｍｔｅｃ
ｈ Ｍａｒｃｈ １９８２：１７２〜１７９；Ｐｏｕｒ
ｆａｒｚａｎｅｈ（１９８２）Ｔｈｅ Ｌｉｇａｎｄ
Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ５：４１〜４７；及びＨａｌｌｉ
ｎｇ等（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅ
ｃｈｎｏｌ．２：２〜１０）。
反応性粒子を利用することは、すでに評価されている
（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ等（１９８２）Ｃｈｅｍｔｅｃ
ｈ Ｍａｒｃｈ １９８２：１７２〜１７９；Ｐｏｕｒ
ｆａｒｚａｎｅｈ（１９８２）Ｔｈｅ Ｌｉｇａｎｄ
Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ ５：４１〜４７；及びＨａｌｌｉ
ｎｇ等（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅ
ｃｈｎｏｌ．２：２〜１０）。
【００３４】オリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡ、を血
液試料のような複雑かつ混合された試料から精製するた
めには、試料中の細胞成分を、先ず、リゾチーム、ＳＤ
Ｓ、トリトンＸ−１００、又はその類のような分解剤に
曝す。細胞を溶解する薬剤と方法は当業者に周知であ
る。例えば、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ（１９９２）Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１６：１５４〜１６０及びＳａｍｂ
ｒｏｏｋ等、同上、を参照。
液試料のような複雑かつ混合された試料から精製するた
めには、試料中の細胞成分を、先ず、リゾチーム、ＳＤ
Ｓ、トリトンＸ−１００、又はその類のような分解剤に
曝す。細胞を溶解する薬剤と方法は当業者に周知であ
る。例えば、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ（１９９２）Ｍｅｔｈ．
Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１６：１５４〜１６０及びＳａｍｂ
ｒｏｏｋ等、同上、を参照。
【００３５】例えば、オリゴヌクレオチドは、試料上で
の界面活性剤、塩基、酸、カオトロプ、有機物及びこれ
らの薬品類の混合物の化学作用を含む様々な方法を介し
て生物系から放出させることができる。試料の物理的処
理法を用いてよく、それには、圧力、熱、凍解サイクル
及びガラスビーズを使うか使わない超音波処理がある。
さらに、化学的溶解それに続く超音波処理のような化学
的方法と物理的方法の組合せが試料作成に用いることが
できる。
の界面活性剤、塩基、酸、カオトロプ、有機物及びこれ
らの薬品類の混合物の化学作用を含む様々な方法を介し
て生物系から放出させることができる。試料の物理的処
理法を用いてよく、それには、圧力、熱、凍解サイクル
及びガラスビーズを使うか使わない超音波処理がある。
さらに、化学的溶解それに続く超音波処理のような化学
的方法と物理的方法の組合せが試料作成に用いることが
できる。
【００３６】オリゴヌクレオチドに結合するパートナー
で表面被覆されている磁気反応性粒子を、標的オリゴヌ
クレオチド被検体を含有するか又は含有していると思わ
れる試料を保持している反応容器、例えば、ホウケイ酸
ガラス、ポリプロピレン又はポリカーボネートの試験管
に添加して懸濁液を作る。表面被覆粒子が所望の標的に
結合して粒子結合パートナーと被検体の複合体を形成で
きるだけの十分な時間にわたって、その懸濁液をインキ
ュベートする。次いで、反応容器を磁界源に極く近づけ
て配置してその複合体を反応容器内壁に固定化する。そ
の上澄液を容器から移すか、吸引するか又は別の方法で
取り除いた後、粒子結合パートナーと被検体の複合体を
適当な緩衝液又は他の試薬を加えて洗浄し、磁石から容
器を外し、そして粒子−標的複合体を懸濁する。洗浄処
理は、必要なら度々繰り返してよい。
で表面被覆されている磁気反応性粒子を、標的オリゴヌ
クレオチド被検体を含有するか又は含有していると思わ
れる試料を保持している反応容器、例えば、ホウケイ酸
ガラス、ポリプロピレン又はポリカーボネートの試験管
に添加して懸濁液を作る。表面被覆粒子が所望の標的に
結合して粒子結合パートナーと被検体の複合体を形成で
きるだけの十分な時間にわたって、その懸濁液をインキ
ュベートする。次いで、反応容器を磁界源に極く近づけ
て配置してその複合体を反応容器内壁に固定化する。そ
の上澄液を容器から移すか、吸引するか又は別の方法で
取り除いた後、粒子結合パートナーと被検体の複合体を
適当な緩衝液又は他の試薬を加えて洗浄し、磁石から容
器を外し、そして粒子−標的複合体を懸濁する。洗浄処
理は、必要なら度々繰り返してよい。
【００３７】磁気反応性粒子は、当業者に周知であり
（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎに対する米国特許第４，６７２，
０４０号参照）、例えば、Ｄｙｎａｌ社（Ｌａｋｅ Ｓ
ｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）及びＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社（Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ）から市販されてい
る。磁気反応性ラテックス粒子は、ジビニルベンゼン、
ポリスチレン、又は他のポリマー、コポリマー及びター
ポリマーから作ってよく、それらは−ＣＯＯＨ又は−Ｎ
Ｈ２表面基を有し、又は、生体分子がそれらによって共
有的に、イオン的に、吸着的に又は別の方法で結合され
てよい別の限定された化学官能性、例えば、アルデヒ
ド、脂肪族アミン、アミド、芳香族アミン、ハロアルキ
ル、ヒドラジド又はヒドロキシルを有する。その粒子
は、磁性、常磁性であり、さもなくば印加磁場に反応す
るものである。磁気反応性粒子の好ましいサイズは、
０．５〜５．０μの範囲である。粒子は、重量で約１０
〜６０％の酸化鉄含量と粒子１グラム当り約２０〜２０
０μ当量の範囲の表面−ＣＯＯＨの含量とを有する。
（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎに対する米国特許第４，６７２，
０４０号参照）、例えば、Ｄｙｎａｌ社（Ｌａｋｅ Ｓ
ｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）及びＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ社（Ｃａｒｍｅｌ，ＩＮ）から市販されてい
る。磁気反応性ラテックス粒子は、ジビニルベンゼン、
ポリスチレン、又は他のポリマー、コポリマー及びター
ポリマーから作ってよく、それらは−ＣＯＯＨ又は−Ｎ
Ｈ２表面基を有し、又は、生体分子がそれらによって共
有的に、イオン的に、吸着的に又は別の方法で結合され
てよい別の限定された化学官能性、例えば、アルデヒ
ド、脂肪族アミン、アミド、芳香族アミン、ハロアルキ
ル、ヒドラジド又はヒドロキシルを有する。その粒子
は、磁性、常磁性であり、さもなくば印加磁場に反応す
るものである。磁気反応性粒子の好ましいサイズは、
０．５〜５．０μの範囲である。粒子は、重量で約１０
〜６０％の酸化鉄含量と粒子１グラム当り約２０〜２０
０μ当量の範囲の表面−ＣＯＯＨの含量とを有する。
【００３８】磁界源は、永久磁石、例えば、フェロ−又
はフェリ磁性材料、もしくは誘導磁石、即ち、電磁石で
あってよい。その種の磁石の１つはネオジム−鉄−ボロ
ンの永久磁石（Ｄｙｎａｌ《登録商標》）である。
はフェリ磁性材料、もしくは誘導磁石、即ち、電磁石で
あってよい。その種の磁石の１つはネオジム−鉄−ボロ
ンの永久磁石（Ｄｙｎａｌ《登録商標》）である。
【００３９】オリゴヌクレオチド被検体に結合するパー
トナーは、文献に記述されている手順によって作成して
よい。結合パートナーは、生物試料から精製するか、既
知のアミノ酸配列から合成して作成するか、オリゴヌク
レオチド群、例えば、ロイシン−−ジッパータンパク質
（Ｖｉｎｓｏｎ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
６：９１１〜９１６）又はＣｙｓ２Ｈｉｓ２亜鉛フィン
ガー（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ）タンパク質（Ｄｅｓｊ
ａｒｌａｉｓ等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２２５６〜２２６０）を
結合することが示されているモチーフから作成するか、
組換え的に作成するか又は市販品、例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｒｅｃ Ａタンパク質（Ｓｉｇｍａ）を入手するか
してよい。加えて、オリゴヌクレオチドに結合するパー
トナーは、オリゴヌクレオチド群で表面被覆した磁気反
応性粒子、又はそのフラグメントを使って分離してよ
い。Ｇａｂｒｉｅｌｓｅｎ等（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．２１８：５０８〜５２５参照。
トナーは、文献に記述されている手順によって作成して
よい。結合パートナーは、生物試料から精製するか、既
知のアミノ酸配列から合成して作成するか、オリゴヌク
レオチド群、例えば、ロイシン−−ジッパータンパク質
（Ｖｉｎｓｏｎ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
６：９１１〜９１６）又はＣｙｓ２Ｈｉｓ２亜鉛フィン
ガー（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ）タンパク質（Ｄｅｓｊ
ａｒｌａｉｓ等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２２５６〜２２６０）を
結合することが示されているモチーフから作成するか、
組換え的に作成するか又は市販品、例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｒｅｃ Ａタンパク質（Ｓｉｇｍａ）を入手するか
してよい。加えて、オリゴヌクレオチドに結合するパー
トナーは、オリゴヌクレオチド群で表面被覆した磁気反
応性粒子、又はそのフラグメントを使って分離してよ
い。Ｇａｂｒｉｅｌｓｅｎ等（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．２１８：５０８〜５２５参照。
【００４０】磁気反応性粒子の表面は、当業者に周知の
任意の方法によって、そこへ被検体に結合するパートナ
ーを連結できるよう作成してよい。好ましい方法の１つ
は、結合パートナーで被覆する前にその表面を官能基化
することを含む。
任意の方法によって、そこへ被検体に結合するパートナ
ーを連結できるよう作成してよい。好ましい方法の１つ
は、結合パートナーで被覆する前にその表面を官能基化
することを含む。
【００４１】磁気反応性粒子の表面は、オルガノシラン
結合剤で処理してその表面を官能基化する。オルガノシ
ラン結合剤は、好ましくは、式ＲｎＳｉＹ（４−ｎ）で
表される。式中、Ｙは、加水分解基、例えば、アルコキ
シ、典型的低級アルコキシ、アシロキシ、低級アシロキ
シ、アミン、ハロゲン、典型的塩素、又はその類を表
し；Ｒは、結合剤を有機樹脂及びポリマーに結合させる
官能性を有する非加水分解有機ラジカルを表し；ｎは、
１、２又は３である。その種のオルガノシラン結合剤の
一例は、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン
（“ＧＯＰＳ”）であり、その結合化学は当業者に周知
である。例えば、Ａｒｋｉｎｓ，“Ｓｉｌａｎｅ Ｃｏ
ｕｐｌｉｎｇ Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｐ
ｅｔｒａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ
ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｅｄｓ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ等
（１９８７）参照。オルガノシラン結合剤の別の例とし
ては、（γ−アミノプロピル）トリエトキシシラン及び
（γ−アミノプロピル）トリメトキシシランがある。そ
の他の適当な結合剤は、熟練した当業者に周知である。
次の段階で、今度は基質表面に共有結合したオルガノシ
ラン結合剤が誘導され、もし必要なら、結合パートナー
被覆に結合する表面反応性基を供給する。例えば、もし
オルガノシラン結合剤が表面近接のジオール基群を供給
するなら、これらは、在来法により（例えば、過ヨウ素
酸ナトリウムとの反応により）反応性アルデヒド基に変
換できる。反応性アルデヒド基は、タンパク質中のアミ
ノ基と反応してイミン（即ち、シッフ塩基、−Ｎ＝Ｃ
＜）を生成する。適切なｐＨのシアノホウ化水素ナトリ
ウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄ
ｅ）のような適当な還元剤でそのイミンを還元すると、
アミン誘導体が得られ、そしてそのタンパク質が磁気反
応性粒子の表面に共有付着することになる。あるいは、
もしオルガノシラン結合剤が表面のアミノ基を供給する
と、これらはタンパク質上にあるカルボキシル基と直接
反応できて共有アミド結合を形成する。この実施例で
は、表面のアミノ基との反応に先立ってタンパク質のカ
ルボキシル基を活性化するのが望ましいかも知れない。
結合剤で処理してその表面を官能基化する。オルガノシ
ラン結合剤は、好ましくは、式ＲｎＳｉＹ（４−ｎ）で
表される。式中、Ｙは、加水分解基、例えば、アルコキ
シ、典型的低級アルコキシ、アシロキシ、低級アシロキ
シ、アミン、ハロゲン、典型的塩素、又はその類を表
し；Ｒは、結合剤を有機樹脂及びポリマーに結合させる
官能性を有する非加水分解有機ラジカルを表し；ｎは、
１、２又は３である。その種のオルガノシラン結合剤の
一例は、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン
（“ＧＯＰＳ”）であり、その結合化学は当業者に周知
である。例えば、Ａｒｋｉｎｓ，“Ｓｉｌａｎｅ Ｃｏ
ｕｐｌｉｎｇ Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｐ
ｅｔｒａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ
ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｅｄｓ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ等
（１９８７）参照。オルガノシラン結合剤の別の例とし
ては、（γ−アミノプロピル）トリエトキシシラン及び
（γ−アミノプロピル）トリメトキシシランがある。そ
の他の適当な結合剤は、熟練した当業者に周知である。
次の段階で、今度は基質表面に共有結合したオルガノシ
ラン結合剤が誘導され、もし必要なら、結合パートナー
被覆に結合する表面反応性基を供給する。例えば、もし
オルガノシラン結合剤が表面近接のジオール基群を供給
するなら、これらは、在来法により（例えば、過ヨウ素
酸ナトリウムとの反応により）反応性アルデヒド基に変
換できる。反応性アルデヒド基は、タンパク質中のアミ
ノ基と反応してイミン（即ち、シッフ塩基、−Ｎ＝Ｃ
＜）を生成する。適切なｐＨのシアノホウ化水素ナトリ
ウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄ
ｅ）のような適当な還元剤でそのイミンを還元すると、
アミン誘導体が得られ、そしてそのタンパク質が磁気反
応性粒子の表面に共有付着することになる。あるいは、
もしオルガノシラン結合剤が表面のアミノ基を供給する
と、これらはタンパク質上にあるカルボキシル基と直接
反応できて共有アミド結合を形成する。この実施例で
は、表面のアミノ基との反応に先立ってタンパク質のカ
ルボキシル基を活性化するのが望ましいかも知れない。
【００４２】タンパク質をカルボキシル化−又はアミノ
化したラテックス粒子と結合させる別法には、粒子とタ
ンパク質とを１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド中でインキュベートする方法が
ある。
化したラテックス粒子と結合させる別法には、粒子とタ
ンパク質とを１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３
−エチルカルボジイミド中でインキュベートする方法が
ある。
【００４３】タンパク質を基質表面に結合するさらに別
の方法は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ等、“Ｉｍｍｏ
ｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２），ｐ１９５〜
１９７、及びＳ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，“ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９１），ｃｈａｐｔｅｒ １２に記述されてい
る。前述の別法の例には、臭化シアン及び過ヨウ素酸塩
で誘導されるセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の活
性化があり、その後、タンパク質をその活性化表面へ直
接結合させることができる。その表面も、塩化トシルと
の反応で活性化させトシル活性化粒子を形成してよい
（Ｊａｃｋｓｏｎ等（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃ
ｉ．９６：２５７〜２６２）。抗体を磁気反応性基質へ
付着させる諸方法も記述されている（例えば、Ｋａｍｅ
ｌ等（１９８０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：１２８１
〜１２８４及び米国特許第４，１７７，２５３号（対Ｄ
ａｖｉｅｓ等）を参照）。タンパク質を粒子上に吸着さ
せるか又はタンパク質を粒子に化学結合させるための付
帯的プロトコルは、Ｂａｎｇｓ研究所からの技術文献１
３Ａと１３Ｃにそれぞれ記述されている。
の方法は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ等、“Ｉｍｍｏ
ｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２），ｐ１９５〜
１９７、及びＳ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，“ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９１），ｃｈａｐｔｅｒ １２に記述されてい
る。前述の別法の例には、臭化シアン及び過ヨウ素酸塩
で誘導されるセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の活
性化があり、その後、タンパク質をその活性化表面へ直
接結合させることができる。その表面も、塩化トシルと
の反応で活性化させトシル活性化粒子を形成してよい
（Ｊａｃｋｓｏｎ等（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃ
ｉ．９６：２５７〜２６２）。抗体を磁気反応性基質へ
付着させる諸方法も記述されている（例えば、Ｋａｍｅ
ｌ等（１９８０）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：１２８１
〜１２８４及び米国特許第４，１７７，２５３号（対Ｄ
ａｖｉｅｓ等）を参照）。タンパク質を粒子上に吸着さ
せるか又はタンパク質を粒子に化学結合させるための付
帯的プロトコルは、Ｂａｎｇｓ研究所からの技術文献１
３Ａと１３Ｃにそれぞれ記述されている。
【００４４】被検体に結合するパートナーが連結されて
いる磁気反応性粒子を、その後、液体に放出した標的被
検体を含む粗試料混合物を入れた反応容器へ添加する。
数分間インキュベートした後、磁気反応性粒子へ固定化
された被検体に結合するパートナーは、試料液中の標的
被検体に結合し、かつそれを捕捉し、よって、粒子結合
パートナーと標的被検体の複合体を形成する。結合パー
トナーに連結された粒子も試料とともに一晩中４℃で、
もしくは熟練した当業者に既知と思われる任意の条件下
で、インキュベートしてよい。
いる磁気反応性粒子を、その後、液体に放出した標的被
検体を含む粗試料混合物を入れた反応容器へ添加する。
数分間インキュベートした後、磁気反応性粒子へ固定化
された被検体に結合するパートナーは、試料液中の標的
被検体に結合し、かつそれを捕捉し、よって、粒子結合
パートナーと標的被検体の複合体を形成する。結合パー
トナーに連結された粒子も試料とともに一晩中４℃で、
もしくは熟練した当業者に既知と思われる任意の条件下
で、インキュベートしてよい。
【００４５】次いで、好ましくは約１００〜１０００エ
ルステッドの範囲にある、磁気反応性粒子を引きつける
のに十分な強度の磁場を、粒子結合パートナーと被検体
の複合体を粗生物混合物から分離することができる十分
長い時間にわたって、反応容器の外側に印加する。その
磁力は、粒子結合パートナーと被検体の複合体を反応容
器の内壁へ“引き付ける（ｐｕｌｌ）”。反応容器の組
成は、磁気反応性粒子に外部からかけられる磁場の効果
に干渉しないようなものでなければならないことは、通
常の技術をもつ当業者には理解されるであろう。
ルステッドの範囲にある、磁気反応性粒子を引きつける
のに十分な強度の磁場を、粒子結合パートナーと被検体
の複合体を粗生物混合物から分離することができる十分
長い時間にわたって、反応容器の外側に印加する。その
磁力は、粒子結合パートナーと被検体の複合体を反応容
器の内壁へ“引き付ける（ｐｕｌｌ）”。反応容器の組
成は、磁気反応性粒子に外部からかけられる磁場の効果
に干渉しないようなものでなければならないことは、通
常の技術をもつ当業者には理解されるであろう。
【００４６】細胞細片、破損膜、タンパク質、脂質等
は、粗上澄液中で何ら影響されない。この上澄液は、磁
石をその場所に保持したまま、吸引、移し変え、もしく
はその類によって反応容器から容易に除去される。
は、粗上澄液中で何ら影響されない。この上澄液は、磁
石をその場所に保持したまま、吸引、移し変え、もしく
はその類によって反応容器から容易に除去される。
【００４７】粒子結合パートナーと被検体の複合体を適
当な溶液で洗浄し、さらに標的オリゴヌクレオチドを精
製する。磁場を引っ込めれば、粒子結合パートナーと被
検体の複合体は再び懸濁液中へ放出される。磁場の印
加、試料の洗浄及び磁場の撤回の循環を何回も繰り返し
て、所要純度のオリゴヌクレオチドを得る。
当な溶液で洗浄し、さらに標的オリゴヌクレオチドを精
製する。磁場を引っ込めれば、粒子結合パートナーと被
検体の複合体は再び懸濁液中へ放出される。磁場の印
加、試料の洗浄及び磁場の撤回の循環を何回も繰り返し
て、所要純度のオリゴヌクレオチドを得る。
【００４８】標的被検体は、当業者に既知の方法、例え
ば、洗浄液のｐＨの変更、インキュベート温度の上昇、
及びその類により、被検体結合パートナーから放出され
る。その後、磁場をかけてよく、それによって、磁気反
応性粒子を引きつけて、反応容器の壁に被検体結合パー
トナーを固定化する。標的オリゴヌクレオチドは、以後
の処理、例えば、診断上のハイブリダイゼーション検定
の用途にすぐ使えるよう溶液中で自由にしておく。
ば、洗浄液のｐＨの変更、インキュベート温度の上昇、
及びその類により、被検体結合パートナーから放出され
る。その後、磁場をかけてよく、それによって、磁気反
応性粒子を引きつけて、反応容器の壁に被検体結合パー
トナーを固定化する。標的オリゴヌクレオチドは、以後
の処理、例えば、診断上のハイブリダイゼーション検定
の用途にすぐ使えるよう溶液中で自由にしておく。
【００４９】本発明をその好ましい特定の具体例に関連
して説明してきたが、上の記述並びに以下の実施例は説
明のためのものであって、本発明の範囲を限定するもの
ではない、ということは理解すべきである。本発明の範
囲内での他の諸様相、利点の数々及び諸々の変更は、本
発明が関わる技術に熟練した当業者には明らかであろ
う。
して説明してきたが、上の記述並びに以下の実施例は説
明のためのものであって、本発明の範囲を限定するもの
ではない、ということは理解すべきである。本発明の範
囲内での他の諸様相、利点の数々及び諸々の変更は、本
発明が関わる技術に熟練した当業者には明らかであろ
う。
【００５０】下記の実施例は、本発明の方法の使い方に
ついての完全な開示と説明を通常の技術の当業者に提供
できるよう公表するものであって、本発明者が本発明と
みなすものの範囲を限定しようとするものではない。数
値（例えば、量、温度等）に関しては正確をきしたが、
いくつかの間違い及び逸脱は説明がつく筈である。指示
されない限り、部（割合）は重量部であり、温度は℃で
あり、圧力は大気圧かその近傍である。
ついての完全な開示と説明を通常の技術の当業者に提供
できるよう公表するものであって、本発明者が本発明と
みなすものの範囲を限定しようとするものではない。数
値（例えば、量、温度等）に関しては正確をきしたが、
いくつかの間違い及び逸脱は説明がつく筈である。指示
されない限り、部（割合）は重量部であり、温度は℃で
あり、圧力は大気圧かその近傍である。
【００５１】
実施例１〔淋病ＤＮＡの精製〕 Ａ．ＤＮＡに結合するタンパク質の磁気反応性粒子への
共有付着：一本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質（ＳＳ
Ｂ）及びＲｅｃＡタンパク質（両方ともＵｎｉｔｅｓ
Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨより入手）を次のようにカル
ボキシル化磁気反応性粒子へ連結する。
共有付着：一本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質（ＳＳ
Ｂ）及びＲｅｃＡタンパク質（両方ともＵｎｉｔｅｓ
Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，
Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨより入手）を次のようにカル
ボキシル化磁気反応性粒子へ連結する。
【００５２】カルボキシル化変性磁気反応性粒子（５０
ｍｇ；Ｂａｎｇｓ研究所）を０．１Ｍの２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ５．
５で５ｍｌに希釈する。その後、その粒子を磁界をかけ
て回収し、上澄液を捨てる。その粒子は、４５ｍｇ／ｍ
ｌの水溶性カルボジイミド、例えば、１−シクロヘキシ
ル−３−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミドを
含有する０．１Ｍのジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ１
０．５で再懸濁し、室温で３０分間攪拌し、そして新鮮
なジエタノールアミン緩衝液で３回洗浄する。
ｍｇ；Ｂａｎｇｓ研究所）を０．１Ｍの２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ５．
５で５ｍｌに希釈する。その後、その粒子を磁界をかけ
て回収し、上澄液を捨てる。その粒子は、４５ｍｇ／ｍ
ｌの水溶性カルボジイミド、例えば、１−シクロヘキシ
ル−３−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミドを
含有する０．１Ｍのジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ１
０．５で再懸濁し、室温で３０分間攪拌し、そして新鮮
なジエタノールアミン緩衝液で３回洗浄する。
【００５３】洗浄した粒子をジエタノールアミン緩衝液
中で２〜７ｍｇ／ｍｌのＳＳＢ又はＲｅｃＡタンパク質
とともに再懸濁し、室温で６０分間攪拌し、緩衝液で洗
浄する。誘導された粒子は、それらを１ｍｇ／ｍｌの牛
の血清アルブミンで飽和した後、４℃で保管する。
中で２〜７ｍｇ／ｍｌのＳＳＢ又はＲｅｃＡタンパク質
とともに再懸濁し、室温で６０分間攪拌し、緩衝液で洗
浄する。誘導された粒子は、それらを１ｍｇ／ｍｌの牛
の血清アルブミンで飽和した後、４℃で保管する。
【００５４】Ｂ．淋菌ＤＮＡに結合するタンパク質の精
製：上記Ｄｏｒｗａｒｄ等によって説明されたように、
淋菌全細胞ＤＮＡを、培養した淋病３１４２６（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から精製する。
エタノールで沈澱したＤＮＡを７０％のエタノールで一
度洗浄し、次いでジエタノールアミン緩衝液中に１ｍｇ
／ｍｌで溶解する。
製：上記Ｄｏｒｗａｒｄ等によって説明されたように、
淋菌全細胞ＤＮＡを、培養した淋病３１４２６（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から精製する。
エタノールで沈澱したＤＮＡを７０％のエタノールで一
度洗浄し、次いでジエタノールアミン緩衝液中に１ｍｇ
／ｍｌで溶解する。
【００５５】ＳＳＢ又はＲｅｃＡタンパク質で誘導した
磁気反応性粒子（〜５ｍｇ）をＤＮＡの溶液に添加す
る。その懸濁液を１０〜２０分間インキュベートし、次
いでそれを磁石（ネオジム−鉄−ボロンの永久磁石、Ｄ
ｙｎａｌ社）を配置した磁場に置き；ビーズを速やかに
堅いペレットに集める。懸濁液を吸引した後、磁石を取
り外し、ペレットを緩衝液で３回洗浄する。最後の洗浄
は１．０ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で行い、結合し
たＤＮＡを誘導ビーズから分離する。精製したＤＮＡ
は、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等によって説明されたよう
に、アガロースゲル電気泳動法で分析する。
磁気反応性粒子（〜５ｍｇ）をＤＮＡの溶液に添加す
る。その懸濁液を１０〜２０分間インキュベートし、次
いでそれを磁石（ネオジム−鉄−ボロンの永久磁石、Ｄ
ｙｎａｌ社）を配置した磁場に置き；ビーズを速やかに
堅いペレットに集める。懸濁液を吸引した後、磁石を取
り外し、ペレットを緩衝液で３回洗浄する。最後の洗浄
は１．０ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で行い、結合し
たＤＮＡを誘導ビーズから分離する。精製したＤＮＡ
は、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ等によって説明されたよう
に、アガロースゲル電気泳動法で分析する。
【００５６】以上のように、本発明は、 〔１〕（ａ）標的を含有するか又は含有していると思わ
れる試料を生成するステップ； （ｂ）前記試料を、オリゴヌクレオチド被検体に結合す
るパートナーであって、かつ磁気反応性粒子に連結され
た該結合パートナーと接触させるステップ； （ｃ）前記粒子を含む前記試料をインキュベートし、そ
れによって粒子結合パートナーと被検体との複合体を形
成するステップ； （ｄ）前記複合体を磁場に置くステップ； （ｅ）前記複合体を前記試料から分離するステップ； （ｆ）標的被検体を前記複合体から放出させるステッ
プ；からなる標的オリゴヌクレオチド被検体の精製方法
に関し、次のような好ましい実施態様を有する。
れる試料を生成するステップ； （ｂ）前記試料を、オリゴヌクレオチド被検体に結合す
るパートナーであって、かつ磁気反応性粒子に連結され
た該結合パートナーと接触させるステップ； （ｃ）前記粒子を含む前記試料をインキュベートし、そ
れによって粒子結合パートナーと被検体との複合体を形
成するステップ； （ｄ）前記複合体を磁場に置くステップ； （ｅ）前記複合体を前記試料から分離するステップ； （ｆ）標的被検体を前記複合体から放出させるステッ
プ；からなる標的オリゴヌクレオチド被検体の精製方法
に関し、次のような好ましい実施態様を有する。
【００５７】〔２〕標的オリゴヌクレオチド被検体がＲ
ＮＡ又はＤＮＡである〔１〕記載の方法。
ＮＡ又はＤＮＡである〔１〕記載の方法。
【００５８】〔３〕標的オリゴヌクレオチドがＤＮＡで
ある〔２〕記載の方法。
ある〔２〕記載の方法。
【００５９】〔４〕被検体に結合するパートナーがタン
パク質又は抗体である〔１〕記載の方法。
パク質又は抗体である〔１〕記載の方法。
【００６０】〔５〕被検体に結合するパートナーがタン
パク質である〔４〕記載の方法。
パク質である〔４〕記載の方法。
【００６１】〔６〕タンパク質がＤＮＡに結合するタン
パク質である〔５〕記載の方法。
パク質である〔５〕記載の方法。
【００６２】〔７〕ＤＮＡに結合するタンパク質が、ロ
イシン−ジッパータンパク質、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２亜鉛フ
ィンガータンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃ Ａタンパ
ク質、ヒトのサイトメガロウイルスのＩＥ−２タンパク
質、ナイセリア淋病のＤＮＡに結合するタンパク質、繊
維状ファージＭ１３遺伝子Ｖ生成物、繊維状ファージｆ
ｄ遺伝子Ｖ生成物、ファージＩｋｅ ＰＩＫＥタンパク
質、バクテリオファージＴ４遺伝子３２タンパク質、バ
クテリオファージＴ７遺伝子２．５タンパク質、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ Ｆ性因子コード化ＳＳＦタンパク質、Ｎ４ Ｓ
ＳＢ、ヘルペス単純ウイルス・タイプ１主ＤＮＡ結合タ
ンパク質ＩＣＰ８、ヘルペス単純ウイルス・タイプ２主
ＤＮＡ結合タンパク質ＩＣＰ８、ＨＳＶ ＤＮＡ結合タ
ンパク質ＩＣＰ４、ＨＳＶ ＤＮＡ結合タンパク質ＩＣ
ＳＰ１１／１２、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ動原体ＤＮ
ＡエレメントＩ結合タンパク質、ＵＶ−誘導、ダメージ
−特定ＤＮＡ結合タンパク質、ＭｅＣＰ２、ＳＡＦ−
Ａ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｌａｃリプレッサー、ｌａｃ
オペレーター、アデノウイルス主要後期転写因子、及び
ショウジョウバエ熱ショック・アクチベータータンパク
質からなる群から選択される〔６〕記載の方法。
イシン−ジッパータンパク質、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２亜鉛フ
ィンガータンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒｅｃ Ａタンパ
ク質、ヒトのサイトメガロウイルスのＩＥ−２タンパク
質、ナイセリア淋病のＤＮＡに結合するタンパク質、繊
維状ファージＭ１３遺伝子Ｖ生成物、繊維状ファージｆ
ｄ遺伝子Ｖ生成物、ファージＩｋｅ ＰＩＫＥタンパク
質、バクテリオファージＴ４遺伝子３２タンパク質、バ
クテリオファージＴ７遺伝子２．５タンパク質、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ Ｆ性因子コード化ＳＳＦタンパク質、Ｎ４ Ｓ
ＳＢ、ヘルペス単純ウイルス・タイプ１主ＤＮＡ結合タ
ンパク質ＩＣＰ８、ヘルペス単純ウイルス・タイプ２主
ＤＮＡ結合タンパク質ＩＣＰ８、ＨＳＶ ＤＮＡ結合タ
ンパク質ＩＣＰ４、ＨＳＶ ＤＮＡ結合タンパク質ＩＣ
ＳＰ１１／１２、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ動原体ＤＮ
ＡエレメントＩ結合タンパク質、ＵＶ−誘導、ダメージ
−特定ＤＮＡ結合タンパク質、ＭｅＣＰ２、ＳＡＦ−
Ａ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｌａｃリプレッサー、ｌａｃ
オペレーター、アデノウイルス主要後期転写因子、及び
ショウジョウバエ熱ショック・アクチベータータンパク
質からなる群から選択される〔６〕記載の方法。
【００６３】〔８〕標的オリゴヌクレオチドがＲＮＡで
ある〔２〕記載の方法。
ある〔２〕記載の方法。
【００６４】
〔９〕タンパク質がＲＮＡに結合するタン
パク質である〔５〕記載の方法。
パク質である〔５〕記載の方法。
【００６５】〔１０〕ＲＮＡに結合するタンパク質が、
真核開始因子−３、カルレチクリン、ＳｅｃＡタンパク
質、ＡＵＦ１、ＲＮＡ結合タンパク質Ｋ、ＲＮＡ結合タ
ンパク質Ｈ１６、Ｔａｔ、及びヌクレオリンからなる群
から選択される
真核開始因子−３、カルレチクリン、ＳｅｃＡタンパク
質、ＡＵＦ１、ＲＮＡ結合タンパク質Ｋ、ＲＮＡ結合タ
ンパク質Ｈ１６、Ｔａｔ、及びヌクレオリンからなる群
から選択される
〔９〕記載の方法。
【００６６】〔１１〕結合パートナーが、磁気反応性粒
子に、共有的に、イオン的に又は吸着的に連結される
〔１〕記載の方法。
子に、共有的に、イオン的に又は吸着的に連結される
〔１〕記載の方法。
【００６７】〔１２〕結合パートナーが磁気反応性粒子
に共有的に連結される〔１１〕記載の方法。
に共有的に連結される〔１１〕記載の方法。
【００６８】〔１３〕磁場が永久磁石又は誘導磁石で発
生される〔１〕記載の方法。
生される〔１〕記載の方法。
【００６９】〔１４〕ステップ（ｆ）に先立ち、さらに
複合体を洗浄することを含む〔１〕記載の方法。
複合体を洗浄することを含む〔１〕記載の方法。
【００７０】
【発明の効果】本発明によれば、１）高速で、分オーダ
ーで完了でき；２）実行が容易で、試料準備は最低限で
よく；３）不快で危険な有機薬品を使用する必要が無
く；４）一本又は二本鎖の、任意の長さのＤＮＡ又はＲ
ＮＡの抽出に十分に適応性があり；かつ５）高純度のオ
リゴヌクレオチドを生成することができる。従って、本
発明は、臨床検定、その他の精製オリゴヌクレオチドを
必要とする種々検定に適する高純度オリゴヌクレオチド
の作製法として好適である。
ーで完了でき；２）実行が容易で、試料準備は最低限で
よく；３）不快で危険な有機薬品を使用する必要が無
く；４）一本又は二本鎖の、任意の長さのＤＮＡ又はＲ
ＮＡの抽出に十分に適応性があり；かつ５）高純度のオ
リゴヌクレオチドを生成することができる。従って、本
発明は、臨床検定、その他の精製オリゴヌクレオチドを
必要とする種々検定に適する高純度オリゴヌクレオチド
の作製法として好適である。
Claims (1)
- 【請求項１】 （ａ）標的を含有するか又は含有してい
ると思われる試料を生成するステップ； （ｂ）前記試料を、オリゴヌクレオチド被検体に結合す
るパートナーであって、かつ磁気反応性粒子に連結され
た該結合パートナーと接触させるステップ； （ｃ）前記粒子を含む前記試料をインキュベートし、そ
れによって粒子結合パートナーと被検体との複合体を形
成するステップ； （ｄ）前記複合体を磁場に置くステップ； （ｅ）前記複合体を前記試料から分離するステップ； （ｆ）標的被検体を前記複合体から放出させるステッ
プ；からなる標的オリゴヌクレオチド被検体の精製方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43411195A | 1995-05-04 | 1995-05-04 | |
| US434111 | 1995-05-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08301891A true JPH08301891A (ja) | 1996-11-19 |
Family
ID=23722874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12642596A Pending JPH08301891A (ja) | 1995-05-04 | 1996-04-23 | 標的オリゴヌクレオチド被検体の精製方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0741141A2 (ja) |
| JP (1) | JPH08301891A (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7078224B1 (en) | 1999-05-14 | 2006-07-18 | Promega Corporation | Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles |
| EP1621618B1 (en) * | 1999-05-14 | 2011-10-26 | Promega Corporation | Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles |
| CA2372485A1 (en) * | 1999-05-14 | 2000-11-23 | Rex M. Bitner | Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles |
| US7601491B2 (en) | 2003-02-06 | 2009-10-13 | Becton, Dickinson And Company | Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor |
| JP2008511816A (ja) * | 2004-08-03 | 2008-04-17 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | サンプルを分別するための磁性材料の使用 |
| US8030034B2 (en) | 2005-12-09 | 2011-10-04 | Promega Corporation | Nucleic acid purification with a binding matrix |
| US8222397B2 (en) | 2009-08-28 | 2012-07-17 | Promega Corporation | Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods |
| US8039613B2 (en) | 2009-08-28 | 2011-10-18 | Promega Corporation | Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods |
| CN116656781B (zh) * | 2023-07-07 | 2024-04-26 | 中国药科大学 | 一种用于检测反义寡核苷酸类药物的荧光探针及检测方法 |
-
1995
- 1995-09-29 EP EP19950115478 patent/EP0741141A2/en not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-04-23 JP JP12642596A patent/JPH08301891A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0741141A2 (en) | 1996-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4175670B2 (ja) | 固体相核酸の単離 | |
| JP4456046B2 (ja) | 磁性色素 | |
| JP4594467B2 (ja) | 常磁性粒子を用いた核酸の精製とその操作方法 | |
| JP3253638B2 (ja) | シリカ磁気粒子を使用する生物学的目標物質の分離法 | |
| JP5537894B2 (ja) | 磁性色素 | |
| JP3761573B2 (ja) | 極度に少量でかつ非常に強く汚染された非常に種々の出発物質から核酸を単離および精製する一般的方法 | |
| CA2270106C (en) | Nucleic acid purification and process | |
| KR0148693B1 (ko) | 핵산 분리방법 | |
| US5683875A (en) | Method for detecting a target nucleic acid analyte in a sample | |
| JP5576363B2 (ja) | 短鎖核酸を単離する方法 | |
| US4446237A (en) | Method for detection of a suspect viral deoxyribonucleic acid in an acellular biological fluid | |
| JP3943601B2 (ja) | アルカリプロテアーゼを用いる核酸の単離方法 | |
| US20060024701A1 (en) | Methods and reagents for the isolation of nucleic acids | |
| US8481262B2 (en) | Method for enriching and/or separating prokaryotic DNA using a protein that specifically bonds to unmethylated DNA containing CpG-motifs | |
| EP0339686B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay | |
| WO2014063651A1 (zh) | 纯化核酸的方法及试剂盒 | |
| JP2008510456A (ja) | 多官能基コート化固相担体を用いる核酸の単離方法 | |
| JPS63270000A (ja) | ラテックス固定化プローブを用いた迅速ハイブリッド形成試験 | |
| JPS63245698A (ja) | 核酸の検出方法および装置 | |
| JP2006517225A (ja) | 核酸抽出のための生物学的試料の化学処理および該処理用のキット | |
| JPH09327291A (ja) | Ｒｎａの抽出精製方法 | |
| JPH08301891A (ja) | 標的オリゴヌクレオチド被検体の精製方法 | |
| JPH11511335A (ja) | 液体組成物からのウィルスの吸着方法 | |
| JP3082908B2 (ja) | リボ核酸の単離方法 | |
| KR20050057152A (ko) | 원핵 ｄｎａ의 농축 방법 |