JPS63245698A - 核酸の検出方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物学的試料中に存在するデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸配列（
以下、「目的核酸」または「目的核酸配列」という）の
検出方法および組成物に関する。本発明の方法によれば
、標識ＤＮＡまたはＲＮＡプロ、−ブを目的核酸と溶液
中でハイブリダイズすることにより、特定のＤＮＡまた
はＲＮＡの生物学的試料中での存在を速やかに検出する
ことができる。

標識プローブを目的核酸にハイブリダイズした後、得ら
れたハイブリダイズしたプローブおよびハイブリダイズ
していないプローブをゲル排除またはアフィニティーク
ロマトグラフィーで分離する。

このようなアッセイ法は、粗製の血清、血漿、組織培養
細胞または組織抽出物のような生物学的試料、または精
製したもしくは部分的に精製した試料に用いるのに適し
ている。

［従来技術］ 核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）はプリンおよびピリミジン
塩基の一次配列を有しており、この塩基は水素結合を形
成して二本鎖のらせん領域を生成することができる。水
素結合した二本鎖のらせん領域を生成する過程は、ハイ
ブリダイゼーションまたはＤＮＡ復元と呼ばれる。この
ようなハイブリダイゼーションは、相補的な配列を有す
るＤＮＡまたはＲＮＡ試料を適当な塩、ｐＨおよび温度
条件下でインキュベートすると起こる。いかなる２個の
核酸配列も、それらが相補的な核酸配列を有している限
りお互いにハイブリダイズすることができる（すなわち
、ＤＮＡ：ＤＮＡ５ＲＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮ
Ａ）。二重らせんを形成する速度は、反応物の濃度と温
度の両方の関数である。

２個の核酸鎖の一方に既知の配列および標識が含まれて
おれば、ハイブリダイズして標識を検出することによっ
て未知の溶液中の相補的な核酸配列の存在を決定するこ
とができる。

ゲル電気泳動で分画されたＤＮＡ制限断片の混合物から
特定の核酸配列を集める（ｌｏｃａｌｉｚｅ）のに、放
射性同位元素で標識したＤＮＡプローブが広く用いられ
ている。電気泳動かまたはプロッティングと呼ばれる方
法での拡散により、分画ＤＮＡ断片をニトロセルロース
紙のシートに移動させることによってゲル電気泳動パタ
ーンのレプリカをつくる。ニトロセルロース紙に吸着し
たＤＮＡまたはｒｔＮＡに放射性プローブをハイブリダ
イズさせることによって、求める特定のＤＮＡ配列とプ
ローブとの間にハイブリッドを形成させる。ハイブリダ
イズしなかったプローブは洗い落とし、ニトロセルロー
ス紙の標識領域をオートラジオグラフィーなどによって
検出する。

血清または血漿中のＢ型肝炎ウィルスＤＮＡを検出する
ように適合させた他のプロッティング法が、スコツトら
［Ｓｃｏ’ｔｔｏ　　ｅｔ　　ａＬ　Ｈｅｐａｔｏｌｏ
ｇｙ。

３．２７９〜２８４（１９８３）］に記載されている。

この方法では、真空濾過装置を用い試料ＤＮＡを直接ニ
トロセルロース紙に結合させることによって、抽出して
いない血清または血漿試料を一層大きな容積で使用する
ことができる。

上記文献に記載された方法は、目的とする核酸配列をニ
トロセルロース紙のような固体相に結合し、ハイブリダ
イズしなかった標識プローブを洗浄して取り除き、つい
で固体相に結合している目的核酸配列とハイブリダイズ
した標識プローブを検出することによっている。しかし
ながら、このような固体相を用いる方法は、−試料を大
量に浪費したり時間がかかるうえ、固体相の調製、結合
、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）、および洗浄など
の多くの工程からなるという欠点を有する。

現在利用できる試料の調製法、ハイブリダイゼーション
法、およびハイブリダイズしていないプローブからハイ
ブリダイズしたプローブを分離する方法は、高度の熟練
者を要する手順の複雑さや手順に時間のかかることや特
別の装置を必要とすることなどから、一般に日常的に使
用するには適していない。このため、アッセイを行なう
のに要する時間を短縮でき、試料も最小限の量でよく、
再現性があって信頼でき、正確な定量法を提供できるよ
うな簡単な方法を確立する必要があった。

ノブレガら［Ｎｏｂｒｅｇａ　　ｅｔ　　ａｌ、　Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、上ｌ上
、１４１−１４５（１９８３）コは、ＲＮＡのプロセッ
シングのあいだに特定のＲＮＡ写しを検出する方法を記
載しているが、この場合、目的核酸およびプローブはと
もに溶液中にある。この方法では、電気泳動による移動
を利用してアガロース上でハイブリダイズさせ、オート
ラジオグラフィーによって視覚化したのち、ＤＮＡプロ
ーブを分離する。

重量および／またはコンホメーションの違いに基づいて
、小さな分子を一層大きな高分子量の分子から分離する
ための原理が文献に知られている。

このような方法には、分画遠心法、クロマトグラフ法、
電気泳動法および透析などが含まれる。

Ｂ型肝炎ウィルスゲノムの配列を細菌プラスミド上にク
ローニングすることにより該配列を含むＤＮＡを製造す
る方法が、英国特許出願公開第２０３４３２３Ａ号０９
８０年６月４日公開）に記載されている。既知の量のフ
ァージベクターを用いてＢ型肝炎ウィルスＤＮＡのよう
なウィルスＤＮＡを定量するための試薬および方法が、
ＰＣＴ出願公開第８５／３９５１号（１９８５年９月１
２日公開）に記載されている。ハイブリダイゼーション
に適した標識ＤＮＡプローブとともに、変性し固体相に
付着した病原体ＤＮＡを検出するのに有用な方ｉおよび
組成物もまた米国特許第４゜３５８．５３５号に記載さ
れている。

［発明の構成および効果］ 本発明は、生物学的試料中に存在する目的核酸配列を速
やかに定量アッセイするための方法および組成物を提供
するものである。すなわち、本発明は、（ａ）　　液体
媒質中で標識核酸プローブとハイブリダイズすることが
可能な目的核酸配列を含む生物学的試料を調製し、 （ｂ）　　該生物学的試料をハイブリダイズ条件下で標
識核酸プローブと混合し、 （Ｃ）　　ゲル排除もしくはアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーを用いて、ハイブリダイズしなかったプ
ローブをハイブリダイズしたプローブから分離し、つい
で （ｄ）　　試料中の目的核酸配列を測定するために、ハ
イブリダイズした標識核酸プローブを検出することを特
徴とする、生物学的試料中の目的核酸配列の検出方法、
さらにこの方法に用いるキットおよびプローブ組成物に
関する。この方法ではまず、液体媒質中で核酸プローブ
とハイブリダイズすることのできる目的核酸を含む生物
学的試料を調製する。ついで目的核酸配列を標識核酸プ
ローブと結合させる。ハイブリダイズしたプローブおよ
びハイブリダイズしなかったプローブを、ゲル排除もし
くはアフィニティークロマトグラフィーで分離する。生
物学的試料中に存在する目的核酸の量を測定するために
、上記分離工程のあとハイブリダイズしたプローブの量
を測定する。本発明の方法に使用するためのプローブ組
成物は特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり、これらは
放射性同位元素、酵素、放射線不透過性物質、蛍光剤、
化学発光分子、以上の物質のどれかを含むリボソーム、
または特異的結合ペアの一方のような検出可能な標識と
安定に結合している。標識核酸プローブは目的核酸配列
と相補的であり、またハイブリダイズしたプローブがゲ
ル排除もしくはアフィニティークロマトグラフィーによ
ってハイブリダイズしなかったプローブから容易に分離
できるように、有効な分子量または特異的結合ペアの一
方を有している。本明細書では本発明のアッセイに用い
るプローブの製造方法もまた開示する。

生物学的試料中に存在する目的核酸配列の決定に使用す
るキットには、検出可能な標識と安定に結合した核酸プ
ローブ、および目的核酸配列にハイブリダイズしたプロ
ーブからハイブリダイズしなかったプローブを分離する
のに適したゲル排除またはアフィニティーカラムクロマ
トグラフィー装置が含まれる。

本発明の理解を一層容易にするために、以下に本発明に
使用する語句について説明する。

（１）ゲル排除クロマトグラフィー この方法はゲル濾過としても知られており、粒状物質（
通常はデキストラン）を使用することからなる。この粒
状物質は２相からなる媒質を形成する。このう、ちｌ相
は粒状物質内部の液体であり、他の１相は粒状物質外部
の液体物質である。溶液中にあった物質でその大きさの
ために粒状物質内に入ることを完全に排除されたものは
カラムを最初に通り抜け、このものはボイド容積として
知られる。溶液中の一層小さな分子は粒状物質中への移
動によって遅延し、有効な分子量の関数として粒状物質
により遅延される。粒状物質中に入り込んだ物質は包含
容積として知られ木。それゆえ、核酸プローブとハイブ
リダイズして二本鎖を形成した大きな核酸と小さな核酸
プローブとの混合物をゲル排除クロマトグラフィーにか
けると、小さな核酸プローブは粒状物質により包含容積
中に遅延され、大きなハイブリダイズ二本鎖分子はボイ
ド容積中に排除される。上記の粒状物質は、たとえばフ
ァルマシア社からセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ
　　）およびセファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ　　
）の商標名で、バイオ・ラド社からバイオゲル（Ｂ　ｉ
ｏｇｅｌ　　）の商標名で入手することができる。

（２）アフィニティークロマトグラフィーこの方法は不
溶性多糖類または合成樹脂の充填カラムを利用するもの
である。これらの充填物は、第２の分子と特異的に結合
して特異的結合ペアを形成する分子と共有結合している
。特異的結合ペアの典型的な例としては、抗原・抗体、
基質・酵素およびビオチン・アビジンが挙げられる。特
異的結合ペアに結合した樹脂を含むカラムは、粗製のま
たは部分的に精製した抽出物または調製物から、カラム
の特異的結合ペアに特異的に結合した分子を取り除く。

カラムに付着した物質は、高いイオン強度の溶出溶液を
使用するか、Ｉ）Ｈを変えるなどして得ることができる
。溶出させた物質は、ついで定量することができる。

（３）特異的結合ペア 特異的結合ペアは二つの異なる分子からなっており、そ
のうちの一方の分子の表面または空洞内には、他の分子
の特定の空間的および極性的構造と特異的に結合する領
域がある。特異的結合ペアの各部は、しばしばリガンド
とレセプターまたはリガンドと抗リガンドと呼ばれる。

しばしばレセプターは抗体であり、リガンドは抗原であ
る。他の特異的結合ペアとしては、ホルモン・レセプタ
ーペア、酵素・基質ペア、ビオチン・アビジンペアおよ
び糖タンパク・レセプターペアが挙げられ、またＦａｂ
断片などを含む免疫グロブリン断片のような、結合特異
性を保持している特異的結合ペアの断片または部分もま
た含まれる。抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナ
ル抗体のいずれであってもよい。

（４）検出可能な標識 標識は核酸プローブに共有結合するかまたは堅固に結合
することのできる物質であって、これによってプローブ
の量を検出し定量することができる。このような物質と
しては　３Ｈ，Ｉ！Ｓｉ、１３１■、！ＩＰ、１４ｃお
よび３″、Ｓのような放射性同位元素；アクリジンやル
ミノールのような化学発光分子；フルオレセイン、フィ
コビワンタンパク（ｐｈｙｃｏｂｉｌ　１ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）、希土類キレート、ダンシル（ｄａｎｓｙｌ）、ロ
ーダミンなどの蛍光剤二西洋ワサビペルオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステ
ラーゼのような酵素基質および阻害剤；金コロイドや磁
性粒子のような金属粒子または他の放射線不透過性分子
；上記物質のいずれかを含むリボソーム；タンパク質、
炭水化物またはハプテン分子のような抗原およびこれら
の抗原に特異的な抗体；および糖脂質または糖タンパク
が挙げられる。

（５）核酸配列 本発明の方法で検出できる核酸配列は、リボヌクレオチ
ドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチド
の配列である。これらの核酸配列は一本鎖であっても二
本鎖であってもよく、また部分的に一本鎖で部分的に塩
基対の領域を有していてもよい。リボ核酸配列にはメツ
センジャーＲＮＡおよびリボソームＲＮＡの両方が含ま
れる。

（６）ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションとは核酸配列間での水素結合お
よび積み重ね力（ｓｔａｃｋｉｎｇ　　ｆｏｒｃｅｓ）
による安定な結合の形成をいい、核酸配列は充分に結合
しているのでハイブリダイズした配列とハイブリダイズ
していない配列とを分離することができる。ハイブリダ
イゼーションの速度は、温度、塩、ｐＨレベル、反応物
の濃度、およびデキストラン硫酸のような他の分子の存
在に依存している。

（７）プロテイナーゼ プロテイナーゼとはペプチド結合を切断することのでき
る酵素をいい、エキソペプチダーゼおよびエンドペプチ
ダーゼの両方を含み、プロテアーゼ、プロテア−ゼに１
プロナーゼ、トリプシン、アルカリプロテアーゼ、サブ
チリシンおよびキモトリプシンなどがある。

（８）目的核酸または目的核酸配列 本明細書において、これらの語は一本組、二本鎖にかか
わらずＤＮＡまたはＲＮＡを指し、この中にはメツセン
ジャーＲＮＡおよびリボソームＲＮＡが含まれる。本発
明の方法で検出できる目的核酸は、たとえばウィルス、
微生物（原核または真核）、および病気もしくは病理学
的状態に関連するあらゆる異常型細胞に見出だされる。

これらの目的核酸の中には、Ｉ−ＩＩＶ（ＨＴＬＶ、Ｉ
［［またはＬＡＶ）、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス
、ヒトレトロウィルス、ヒトパピローマウィルス、エプ
スタイン・バーウィルス、サイトメガロライ　。

ルス、ウィルスのＲＮＡ写し、および複製中間体の核酸
がある。またマイコプラズマ、リケッチアおよびクラミ
ジアのような細菌；およびかび、酵母および異常もしく
は変異体宿主細胞（とりわけオンコジン、遺伝欠失もし
くは遺伝マーカーを含むもの）のような真核病原体も含
まれる。

（９）生物学的試料 本発明に用いる生物学的試料は、当該目的核酸を含んで
おりさえすればどのような試料であってもよい。このよ
うな生物学的試料の採取源としては、植物、昆虫および
動物ゐ（ある。好ましい生物学的試料には、血清、血漿
、滑液、生検材料、組織培養細胞もしくは組織培養細胞
からの増殖培地、組織抽出物および膜洗浄液がある。

侠里麦抜 本発明ρ方法は、標識核酸プローブを利用して目的核酸
配列をすみやかに定量アッセイするためのものである。

この方法は、まず第１段階として液体媒質中に目的核酸
を含む生物学的試料を調製することからなる。血清、血
漿、組織切片もしくは抽出物、リンパ球、および組織培
養細胞もしくは組織培養からの増殖培地の上澄みのよう
な液体媒質中の粗製の生物学的試料を、前辺て精製する
ことなくアッセイに用いることができる。そのかわりに
、精製したもしくは部分的に精製した試料も用いること
ができる。精製工程には、分離、抽出、細胞破砕または
組織もしくは生物学的流体のホモジネート化を含めるこ
とができる。さらに、核酸の非特異的損失を減少させる
ために゛プローブと反応しない担体核酸を精製工程の間
に試料に加えることもできる。

ついで可溶化しアッセイ用の核酸を放出させるために、
試料を界面活性剤またはプロテイナーゼで処理する。プ
ロテイナーゼを添加することは、一層安定で可溶化され
た核酸を生じるので幾分好ましいといえる。本発明の方
法で有用と思われるプロテイナーゼには、プロテイナー
ゼに、）リプシン、キモトリプシン、プロナーゼ、アル
カリプロテアーゼ、リゾチームおよびサブチリシンがあ
る。目的核酸を調製するのに有用な他の酵素には、目的
核酸配列がＲＮＡである場合のＤＮＡａｓｅ。

および目的核酸配列がＤＮＡである場合のＲＮＡａｓｅ
が含まれる。

目的核酸配列が一本鎖の形状で生物学的試料中に存在し
ていない場合には、核酸プローブとハイブリダイズする
ことができるように変性させなければならない。変性は
、水酸化ナトリウムを加えるなどのアルカリ性の条件下
で処理するか、または加熱することによって行うことが
できる。目的核酸配列がＲＮＡであるときは、好ましい
変性方法は熟度性であり、これによりＲＮＡの二次構造
が破壊される。

目的核酸の二次構造を破壊して一本鎖核酸を生じさせた
のち、標識プローブを目的核酸に選択的に結合させるの
に適した条件下で標識プローブとのハイブリダイゼーシ
ョン反応を行う。ハイブリダイゼーション反応およびプ
ローブ合成のための一般的な方法は、ティー・マニアテ
ィスらの「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ％Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ％
Ｅ、　Ｐ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　　ａｎｄ　　Ｊ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　Ｃｏ１ｄ、　Ｓｐｒｉｎｇ　　
Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２　
）Ｊに開示されている。ハイブリダイゼーション反応は
、多くのＰＨ，塩および温度条件下で行うことができる
。ｐＨは６〜９の範囲で変化させることができるが、６
．８〜８．５の範囲のｐＨが好ましい。塩濃度はナトリ
ウム０．１５Ｍ〜０．９Ｍの範囲で変化させることがで
きる。

他のカチオンも、イオン強度がナトリウムと等価である
限りにおいて利用することができる。ハイブリダイゼー
ション反応を行なう温度は３０〜８０℃の範囲で変化さ
せることができるが、４５〜７０℃の範囲であるのが好
ましい。さらに、特定のハイブリダイゼーション反応を
室温もしくはそれに近い温度のような低温で進めるため
に、他の化合物をハイブリダイゼーション反応に加える
こともできる。温度要件を低下させるための化合物とし
ては、ホルムアミドがある。

ハイブリダイゼーション反応に引き続き、標識プローブ
とハイブリダイズした目的核酸をハイブリダイズしなか
った核酸プローブから分離し、ハイブリダイズしたプロ
ーブ、したがって試料中に存在する目的核酸をゲル排除
もしくはアフィニティークロマトグラフィーにより定量
する。好ましい分離方法は、ゲル排除クロマトグラフィ
ーにより行うものである。上記分離方法の条件は、ハイ
ブリダイズした目的核酸と検出プローブとが互いに結合
したままであるようなものでなければならない。分離溶
液は、ヌクレアーゼの阻害剤、およびプローブと相互反
応しないさらなる担体核酸配列を含んでいてよい。

ハイブリダイズしなかったプローブからハイブリダイズ
したプローブを分離するための好ましい方法としては、
ポリアクリルアミド、セファロース、架橋セファロース
、アガロース、架橋アガロースまたは他の同様の物質か
らできたマトリックスを用いたゲル排除クロマトグラフ
ィーがある。

このようなゲル排除クロマトグラフィーに適した製品と
しては、Ｇ５０、Ｇ１００、Ｇ２００と表示されたファ
ルマシア社製の製品セファデックス、およびＣＬ２Ｂ、
ＣＬ４Ｂ％ＣＬ６ＢＳＳ−２００、Ｓ−４００，５−ｔ
ｏｏｏと表示された同じファルマシア社製の製品セファ
ロース　がある。他の好適な製品はバイオ・ラド社製の
もので、Ｐ−２０、Ｐ−６０、Ｐ−１００、Ｐ−２００
、Ａ−０，５ｍおよびＡ−１，５ｍがある。

分離反応の目的は、ハイブリダイズしなかったプローブ
が過剰のバックグラウンドレベルを起こしてハイブリダ
イズしたプローブの正確な検出を妨害することなく、目
的核酸に結合したプローブの量を差別的に検出すること
ができるようにすることである。したがって検出プロー
ブと結合した目的核酸は、検出プローブ単独から充分区
別でき、試料のゲル排除クロマトグラフィーでの反応に
基づいて分離を行なうことができるような大きさもしく
はコンホメーシジンを有していなければならない。それ
ゆえ、標識核酸の長さを以下に一層詳しく述べる方法に
よって注意深く調節することは重要である。目的核酸が
ゲル排除クロマトグラフィーにより分離するのに充分な
程大きくない場合は、目的核酸・プローブ複合体の大き
さを有効に増加させるために特定の非標識担体核酸を用
いることができる。

キットに含まれているような標準ゲル排除クロマトグラ
フィー試薬を用いて分離を行うときには、カラムに流し
た試料および溶出バッファーの容積を注意深く調節しな
ければならない。

ハイブリダイズしなかったプローブからハイブリダイズ
したプローブを分離した後、ハイブリダイズしたプロー
ブの存在もしくは量を決定する。

検出方法は、プローブ上に存在する標識の種類に依存す
る。標識が放射性同位元素であるときは、検出方法はガ
ンマもしくはシンチレーションカウント、またはオート
ラジオグラフィーもしくは写真検出のような他の検出可
能な方法であってよい。

特異的結合ペアの一方を標識としてプローブ上に用いた
ときは、有効な検出および定量のために該ペアの他の一
方を用いることができる。特異的結合ペアの他の一方は
、それ自身酵素もしくは同位元素のような第２の検出マ
ーカーを有していてよい。標識が酵素または酵素阻害剤
であるときは、酵素活性の存在もしくは不存在の検出反
応を利用することができる。好ましい酵素反応は比色変
化を起こすものであって、これは比色計を用いて検出す
ることができる。他の標識としては、電磁放射を用いて
検出できる放射線不透過性物質；磁場を用いて検出でき
る磁性粒子；特定の抗原と抗体を用いる免疫学的方法：
蛍光および化学発光マーカー；糖脂質もしくは糖タンパ
クのようなあらゆる特異的結合ペアの一方が挙げられる
。

未知のま初学的試料中に存在する目的核酸配列の量を正
確に決定するために、試料と平行して既知の量の目的核
酸配列を含む陽性対照および陰性対照をアッセイするこ
とができ、これによりアッセイ結果を標準化することが
できる。

本発明の方法は、生物学的試料中に存在する一本鎖もし
くは二本鎖の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を検出するた
めに用いることができる。好ましい目的核酸配列には、
ウィルス、細菌、酵母、かび類、原生動物または真核細
胞のような病原体と結合した核酸配列が含まれる。上記
真核細胞の分類に含まれるもめとしては、形質転換した
、またはオンコジンもしくは既知の遺伝マーカーを有す
る宿主自身が含まれる。本発明の方法により検出可能な
好ましいウィルス性病原体の核酸は、肝炎、ヘルペス、
後天性免疫不全症候群の原因となるウィルス病原体（Ｈ
ＩＶ、ＨＴＬＶＩ［ＩまたはＬＡＶ）、ヒトパピローマ
ウィルス、エブスタインリく−ウイルス、または他のウ
ィルスもしくは微生物などである。

本発明の方法は、少量の目的核酸を検出するのに適して
おり、０．０７ピコグラムもの少量の核酸を検出するこ
とができる。本発明の方法を容易にする試薬を、手動の
アッセイまたは自動化診断装置もしくはアナライザーに
使用するキットに含めることができる。また、たとえば
組織培養中でウィルスを増殖させたり目的核酸を増幅さ
せたりして［５ｃｉｅｎｃｅ、　　２３０．１３５０〜
１３５４（１９８５）］目的核酸の量を増加させる方法
を、本発明の方法に適用することもできる。

ズユニエｑ長辻 本発明に用いるプローブは、検出しようとする目的核酸
に相補的なりＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい
。本発明のプローブは長さが少なくとも２０ヌクレオチ
ドであり、天然の形で存在する目的核酸の長さの１０〜
２０％であるのが好ましい。目的核酸およびプローブ分
子の有効分子量がゲル排除クロマトグラフィーでの分離
を可能にする程大きくないときは、ゲル排除クロマトグ
ラフィーによる分離を可能にするのに充分な太きさの非
標識の特異的担体ＤＮＡまたはＲＮＡを用いることがで
きる。担体ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、プローブ分子と
は異なる、すなわち部分的に重複せずクロスハイブリダ
イズしないもしくはプローブ分子のハイブリダイゼーシ
ョンを立体的に妨害しないような目的核酸の領域に対し
相補的な配列を含んでいる。それゆえ担体ＤＮＡまたは
ＲＮＡは比較的安価に調製でき、標識する必要もない。

別のやり方として、担体ＤＮＡまたはＲＮＡは特異的結
合ペアの一方を含む比較的短い核酸分子であってもよく
、この特異的結合ペアの一方は抗体やアビジンのような
比較的高分子量の他の分子に付着することができるので
プローブ・目的核酸複合体の有効分子量を増加させるこ
とができる。

検出用標識は、既に述べたように放射性同位元素、化学
発光分子、゛蛍光剤、酵素、抗原または特異的結合ペア
の一方であってよい。検出用標識はプローブ合成後にプ
ローブに付着させることもできルシ、＊ｔ：、”ｐ、”
Ｈ，”’Ｌ　”Ｃｔたは”Ｓを用いた場合のようにプロ
ーブの合成中に組み込むこともできる。

本発明の方法には、プライマー伸張に基づくＢ型肝炎ウ
ィルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ検出のためのプローブの調製が
含まれる。このプローブの長さは５０〜４００ヌクレオ
チドであってよく、７５〜３００ヌクレオチドの長さで
あるのが好ましく、■５０〜２５０ヌクレオチドの長さ
であるのがさらに好ましい。鋳型はりａ−ン化したＢ型
肝炎ウィルスＤＮＡの挿入部を含むＭ１３ファージＤＮ
Ａからなる。一本鎖鋳型は、Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡ挿
入部に相補的で長さが少なくとも１７ヌクレオチドのプ
ライマーとハイブリダイズまたはアニーリングする。プ
ライマー配列は、チャーネイら［Ｃｈａｒｎａｙ、　　
ｅｔ　　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、、７エ、２２２２（１９７９）］記載のＢ型
肝炎ウィルスＤＮＡの既知の配列から選ぶことができる
。アニーリング後、鋳型とプライマー、ヌクレオチド（
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴ。

ＰかまたはｄＵＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノー断片を加える。１または２以上のヌクしオチド種
はＩ’ｌｌ　（のような標識を含んでいてよい。ＤＮＡ
またはＲＮＡの合成はブライマーの伸張によって起こり
、挿入ＤＮＡが標識されてコピーされるという結果にな
る。プローブの長さは上記ヌクレオチドの一種の濃度を
制限することによって調節することができる。

たとえば、Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡの３２００塩基対挿
入部を含むＭ１３ファージの調製物から単離された一本
鎖ＤＮＡ７２μ２を、Ｂ型肝炎ゲノムの表面抗原領域に
相補的な２３塩基プライマ一分子とアニーリングさせる
。アニーリングは、１０　ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８、５）
、１０　ｆｆ１Ｍ　　ＭｇＣ１ｍ１２０μａ中、６５℃
で１時間加温して行なう。

ヌクレオチドｄＧＴＰＳｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの各１
５００ピコモルを９０μＣの容積で加える。ｄＣＴＰ　
１５０ピコモルを加え、ついでｌ！Ｊ−ｄｃＴＰ［ＮＥ
Ｎデュポンまたはアメリシャム（Ａｍｅｒｉｓｈａｍ）
より入手可能コのような標識ｄｃＴＰ１５０ピコモルを
加える。このように反応中でのｄＣＴＰの濃度は所定範
囲にある。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を最終
濃度０，６ユニツト／μσで加え、既にアニーリングし
たブライマーの伸張を１５℃で２時間進める。反応は、
ＥＤＴＡを最終濃度２５ｍＭで加えることによって停止
させる。

ついで３．４ｘＱの床容積（ｂｅｄ　　ｖｏｌｕｍｅ）
のセファロ−ス　ＣＬ４Ｂを含むクロマトグラフィーカ
ラムに反応混合物を流し、組み込まれなかったヌクレオ
チドを新たに合成されたコピーから分離させる。

ついで鋳型および新たに合成されたコピーＤＮＡを含む
ボイド容積部分を、最終濃度０．１５ＮのＮａＯＨで処
理して鋳型と放射性同位元素を含む伸張ブライマーを変
性させる。変性処理した試料を、０．０３Ｎ　　ＮａＯ
Ｈで平衡化したセファロース　０Ｌ４Ｂゲルカラムに流
す。これらの変性条件下でのクロマトグラフィーによっ
て、分子量の小さい標識伸張ブライマーから高分子量の
鋳型を分離することができる。鋳型はボイド容積中に含
まれ、一方、標識伸張ブライマーは包含容積中に残留す
る。包含容積からなるフラクションをプールし、ｐＨを
２Ｍ　　ＮＨ，Ａｃで中性に調節する。

中性にしプールしたフラクションは１１１１−標識プロ
ーブからなる。ついで各ハイブリダイゼーション反応に
４０，０００〜２００．０００ｄｐｍのｌ！Ｊ−プロー
ブを加え、アッセイに使用する。概してプローブの比活
性は少なくとも１０　”ｄｐｍ／μ２である。

別の方法では、熱変性させ、変性条件下でゲル電゛気泳
動により精製して所望の長さのプローブ分子を選択する
ことによって鋳型から標識コピーを分離する。選択され
る長さは、アッセイ法で目的核酸にハイブリダイズした
プローブからハイブリダイズしなかったプローブを分離
する能力に依存する。あらゆるＤＮＡまたはＲＮＡ配列
を一本鎖ファージまたはプラスミドベクター中にクロー
ン化することができ、適当なブライマーを用いたときに
は鋳型として使用することができる。また、Ｍ１３ファ
ージ中の挿入配列に隣接するブライマーのハイブリダイ
ゼーションまたはシーフェンシングを、ブライマーの合
成またはプローブの製造に使用することができる。

上記方法によって実質的にあらゆる長さのプローブを製
造することができる。この方法により、調節された長さ
のプローブを高収率で得ることが容易になる。また少な
くとも５０％の放射性同位元素標識を組み入れて、上記
本発明のアッセイ法により約４０００のハイブリダイゼ
ーションアッセイを行うに充分なプローブを生成させる
ことができる。

第１図は、上記のようにして調製した１″６！を用いた
Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡの標準曲線を示す。

このアッセイの実験記録は実施例１に記載しである。第
１図かられかるように、ハイブリダイズした標識プロー
ブのカウントは存在するウィルスゲノムに比例して増加
する。これらの方法は、パイプリダイゼーシゴンおよび
ゲル排除クロマトグラフィーに有利な特性を有する一本
鎖ＤＮＡプローブを高収率で製造するための効率的で再
現性のある方法である。プローブの長さおよびプローブ
の比活性は、粗製の血清もしくは血漿、他の体液および
細胞もしくは組織溶解物に有用である。これらの生物学
的試料のハイブリダイゼーションに続き、本発明の分離
方法は目的核酸の存在についての高度に特異的で高感度
の診断アッセイとして有用である。

プローブの別の製造方法としては、リボプローブ（Ｒ１
ｂｏｐｒｏｂｅ）システム［プロメガ・バイオチク（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ　　Ｂ　１ｏｔｅｃ）より入手可能］を用
いて既知の長さのＲＮＡプローブを製造する方法、およ
び既知の方法により末端標識したオリゴマーを製造する
方法が含まれる。

３３Ｐ−ヌクレオチドを押いた末端標識核酸の一般的な
製造法悼、ティー・マニアティスらの実験室便覧「モレ
キエ、ラー・クローニング」（前述）に記載されている
。

また核酸プローブは当該技術分野で知られた方法により
ｌｊＪで標識することができる。標識したもしくはＩＮ
熾していない特定の一本ＩＩ（Ｓ　５）ＤＮＡは、ジン
グツォングら（Ｊ　ｉｎｇｚｈｏｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ
）記載の方法［Ｇｅｎｅ、　■、１１３〜１１７（１９
８６）コにより製造することができる。

キット 本発明の方法に使用するのに適したキットには、標識核
酸プローブ、および該プローブに結合した目的核酸配列
をハイブリダイズしなかったプローブから分離するのに
適したゲル排除もしくはアフィニティーカラムクロマト
グラフィー装置を含む。

便利なようにこのキットはさらに試薬および装置を備え
ることができ、たとえばプロテイナーゼにのような生物
学的試料を調製するのに有用な酵素；水酸化ナトリウム
のような目的核酸の変性用溶液；ゲル排除クロマトグラ
フィーでの分離工程に用いるのに適したバッファー；コ
レクションチューブ、ハイブリダイゼーション反応に適
したフローテーシジンラック；試料の希釈液；およびハ
イブリダイゼーション法を行う手順に関する説明書を備
えることができる。

次ぎに実施例を基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例！ 血清および血漿中のＢ型肝炎ウィルスＤＮＡの決友 血清または血漿の試料２００μｅに、プロテイナーゼＫ
を１０ｘｇ／ｘ（ｌの最小濃度で含有するバッファーｌ
Ｏμｅを加えて可溶化し変性させた。試料をプロテイナ
ーゼにとともに室温で１時間インキュベートした後、Ｎ
ａＯＨ溶液２０μＱを加えてＮａＯＨの最小濃度を０．
ＩＮにした。これにより試料中の核酸を変性した。別法
として、ＮａＯＨの添加および中和工程を省いて熱変性
を利用することもできる。アルカリ変性工程に引き続き
、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩを含有する中和バッファー７０μＱ
を加えてｐＨを中性に調節するとと６にＮａＯＨの最終
濃度を０．５Ｍとし、既に記載したようにして調製した
標識ＨＢ　Ｖプローブを加えた。上記Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ
の代わりに酢酸バッファーまたはリン酸バッファーを用
いることもできる。−重鎖ＨＢＶプローブはｌｊＪで標
識したが、”Ｓ％　’Ｈ％またはビオチンや抗原のよう
な他の検出マーカーを用いることもできる。ＳＤＳをハ
イブリダイゼーション溶液中に１０％まで含ませること
ができる。実際のハイブリダイゼーション反応は、６５
℃で１６時間行った。ついで試料を床容積３，４ｒｐ（
ｌのセファロース　０Ｌ４Ｂ（カラムの大きさ：　０　
、５　ａｘＸ２０ｃｍ）に負荷させた。ゲル床容積内に
試料を入り込ませた後、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を含む一定容飛のバッ
ファーを、加えた溶出バッファーと試料との容量が１゜
５１１２となるように加えた。ついでその排除されたウ
ィルスＤＮＡ・プローブハイブリッドの溶出を行った。

溶出工程は自動的に停止し、放射活性または他の検出マ
ーカーの存在について溶出容量を分析することができる
。

陽性対照または陰性対照（ＨＢＶ　　ＤＮＡを含まない
血清）として既知の量のＨＢＶ　　ＤＮＡを含有する試
料も、標準として平行して行った。未知の試料を標準試
料と比較することによって、各試料中のＨＢＶの推定量
を決定することができた。

第１図は、既知量のＢ型肝炎ウィルスＤＮＡを含有する
試料の系列希釈したものについて本発明方法によりアッ
セイした結果を示す。

実施例２ ハイブリダイズした目的ＤＮＡ−標識プローブの溶出デ
ータ 実施例１のカラムおよび放射活性プローブを用いて生物
学的試料中のＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａを検出した。

陰性対照としてＢ型肝炎マーカーに対し陰性の血清試料
を用いた。また陽性対照としてＢ型肝炎の慢性保菌者か
ら採った血清試料を用いた。実施例１に記載したハイブ
リダイゼーションを６５℃で１６時間行なった。実施例
１に記載のハイブリダイゼーション混合物をカラムに入
れ、ｌＯｍＭＴ　ｒｉｓ（ｐｌ−Ｉ　８　、　Ｏ）およ
び１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むバッファーで溶出した。第
２図はゲル排除クロマトグラフィーカラムからの溶出グ
ラフを示す。目的Ｂ型肝炎ウィルスＤＮＡおよびハイブ
リダイズしたプローブはボイド容積中（フラクション１
〜３３）に含まれ、ハイブリダイズしなかったプローブ
はカラムにより遅延され包含容積中に溶出された。

実施例３ 組織培養中のＨＩ　Ｖ特異配列のアッセイ（Ａ）組織培
養上澄み液 １２０ｍＭバナジル、１０％ＳＤＳおよびプロテイナー
ゼＫ　２１１９／ＩＱの溶液２５μＱを、感染させてい
ないもしくは前置てＨＩ’Ｖで感染させたリンパ球（Ｈ
９細胞）の細胞培養から得た上澄み試料２００μｇに加
えた。室温で１時間インキユベートシた後、０．５Ｍ　
　ＮａＣ１およびＨＩＶ配列からの２３ヌクレオチドを
有する！１Ｐ−オリゴマープローブ［Ｃｅ１１．土立土
、１０（１９８５）に開示］を含むプローブ混合物７５
μＱを加えた。典型的なプローブは７３２〜７５３塩基
に相補的な配列を含んでいた。４５℃で１６時間インキ
ュベートしたのち試料をセファロース　ＣＬ４Ｂカラム
に流し、ｌｏｍＭ　　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）を含むバ
ッファー１４２０μＱで溶出した。溶出液に含まれてい
た全１７２０μＱについて放射活性をカウントした。典
型的な陰性対照は８２ｃｐｍを含んでおり、一方、典型
的な陽性対照は３０００ｃｐｍを含んでいた。

（Ｂ）組織培養細胞 上記（Ａ）の培養からの細胞をアッセイすることもでき
る。既知数の細胞を含む細胞ペレットを、遠心分離して
組織培養培地を取り除くことによって調製する。細胞を
食塩水などのバッファ−２００μｇ中に再懸濁し、上記
（Ａ）記載の試料と同様にして処理する。ハイブリダイ
ゼーションを行う前にさらに試料を熱変性する工程を加
えることもできる。

溶出液中の全ＣＰＭ ｔｏ’　　　　４７　　　　　　６６４５Ｘ　１０’　
　　２００　　　　　　３３１６１０’　　　　３７３
　　　　　　５５４１５Ｘ　ｔｏ＠１４３９　　　、　
　　１３４３５（Ｃ）組織培養細胞の核酸抽出物 マニアナイスら記載の方法（前述）のような当業者によ
く知られた方法により組織培養細胞もしくは上澄み液か
ら核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出し、１０ａＭ　　
Ｔｒｉｓバッフｙ−（ｐＨ８，０）２００μｌ中に再懸
濁させることもできる。ついで試料を上記（Ｂ）に記載
したようにして処理する。患者から直接採取したリンパ
球またはマクロファージ調製物を用いてもよい。第２表
は、組織培養細胞から抽出されたＤＮＡのアッセイから
得られた１分間当たりのカウントを示す。

１２１　　組織培養細胞からのＤＮＡ抽出物溶出液中の
全ＣＰＭ 全ＤＮＡ　　　非感染細胞　　ＨＩＶｔ％染細胞（μ９
）　　　からのＤＮＡ　　　からのＤＮＡ０．６　　　
　　１３　　　　　　１０６３．０　　　　　６４　　
　　　　４２４６．０　　　　　９４　　　　　　９４
８３０．０　　　　　３５０　　　　　　４７４１実施
例４ 酵素・抗体複合体を以下のようにして調製した。

ウィルソン［Ｗｉｌｓｏｎ、　ｒ　５ｓｕｎｏｆｌｕｏ
ｒｅ＊ｃ、　Ｒｅ１ａｔ。

Ｓｔａｉｎｉｎｇ　　Ｔｅａｈ、　、Ｐｒｏｃ、　　Ｉ
ｎｔ、　Ｃｏａｔ、　、６ｔｈｅｄ口ｈｉｏｎ：Ｋａａ
ｐｐ、Ｈｏ１ｕｂａｒ、　　Ｗｉｃｋ、　　Ｅｌｇｅｖ
ｉｅｒ。

ＡｇｎＬｅｒｄａｓ（１９７８）］記載のペルオキシダ
ーゼ法により、ビオチンに特異的な抗体を西洋ワサビペ
ルオキシダーゼと複合させた。Ａ−５０Ｍアガロース上
でのゲル排除クロマトグラフィーにより、低分子量複合
体（ＭＷ≦２６０，０００）を調製した。カラムに保持
された複合体１００μＩを、重ＯｍＭ　　Ｔｒｉｓ（ｐ
Ｈ８，０）１００μｅ中のＨＢＶ挿入部含有Ｍ１運ファ
ージＤＮＡ１００ａｌｌとともに４０℃で１２分間イン
キネベートした。上記ＨＢＶ挿入部は、ビオチン化ＵＴ
Ｐを含むニック翻訳したＨＢＶ特異的プａ−プＳａｇと
６５℃で２５分間前前辺ハイブリダイズさせてあった。

陰性対照はＨＢＶ配列を含まない１０＊Ｍ　　Ｔｒｉｍ
（ｐＨ８゜０）１００ｇＩｌからなっており、陽性対照
、と同様にして処理した。ついで試料を１０ｍ１床容積
のアガロースＡ−５０Ｍ（バイオ・ラド社より市販）を
含むカラムに流し、’ｔｏｏμｇのフラクシジンを溶出
した。２２のフラクシーンを集めた。過酸化水°　索を
含む酢酸−リン酸バッフ１−中の０ＰＤ（オルトフェニ
レンジアミン）の溶液２５０μｅを加えた。この混合物
を室温で４分間インキエベートし、ついでＩＮ　　ＨＩ
ＳＯ４１−を加えた。各試料の４９２ｎ−での吸光度を
読み取った。その結果を第３表に示す、結果は陽性対照
／陰性対照の吸光度比として表される。

試料　　　４９２１で　　　陽性対照／陰性陰性対照　
　０．３９　　　　　　　１．Ｇ。

陽性対照　　１．ｌＪＩ　　　　　　　　３．０３

【図面の簡単な説明】

第１図は、”’ＩＩＩ識プローブを用いたＢ型肝炎ウィ
ルスＤＮＡアッセイの対数一対数プロットで表示した標
準曲線を表すグラフである。第２図は、実施例２でのゲ
ル誹緑クロマトグラフィーカラムからの溶出データを表
すグラフである。 第１図におけるデータは４８アツセイの平均値±Ｓ、Ｄ
、で示し、また縦軸のＳ／Ｎは下記式で示される値を特
徴する 特許出願人　アボット・ラボラトリーズ代理人　弁理士
　　青　山　葆　ほか型名図面の浄７１（内容に変更な
υ 第２図 フラクション数 手続補正書　（方式） ％式％ ２、発明の名称 核酸の検出方法および装置 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国イリノイ　６００６４、アボット
・パーク　（番地の表示なし）名称　アボット・ラボラ
トリーズ ４、代理人 ７、補正の内容 別紙のとおり、図面の浄書を提出する（内容に変更なし
）。 以上

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）液体媒質中で標識核酸プローブとハイブリ
   ダイズすることが可能な目的核酸配列を含む生物学的試
   料を調製し、 （ｂ）該生物学的試料をハイブリダイズ条件下で標識核
   酸プローブと混合し、 （ｃ）ゲル排除もしくはアフィニティーカラムクロマト
   グラフィーを用いて、ハイブリダイズしなかったプロー
   ブをハイブリダイズしたプローブから分離し、ついで （ｄ）試料中の目的核酸配列を測定するために、ハイブ
   リダイズした標識核酸プローブを検出することを特徴と
   する、生物学的試料中の目的核酸配列の検出方法。
2. （２）工程（ｂ）の前に生物学的試料をプロテイナーゼ
   で処理する特許請求の範囲第（１）項記載の検出方法。
3. （３）プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである特許請
   求の範囲第（２）項記載の検出方法。
4. （４）工程（ｂ）の前に生物学的試料をアルカリ処理ま
   たは熱変性により変性させる特許請求の範囲第（１）項
   記載の検出方法。
5. （５）標識核酸プローブの標識が、放射性同位元素、酵
   素、蛍光剤、化学発光分子、放射線不透過性物質、リボ
   ソームおよび特異的結合ペアの一方よりなる群から選ば
   れたものである特許請求の範囲第（１）項記載の検出方
   法。
6. （６）目的核酸配列がデオキシリボ核酸またはリボ核酸
   である特許請求の範囲第（１）項記載の検出方法。
7. （７）工程（ｂ）の前または工程（ｂ）のあいだに、前
   記標識核酸プローブがハイブリダイズする領域とは異な
   る領域で目的核酸配列とハイブリダイズする第２の担体
   核酸プローブを、前記目的核酸配列と混合する特許請求
   の範囲第（１）項記載の検出方法。
8. （８）第２の担体核酸プローブが特異的結合ペアの一方
   を含む特許請求の範囲第（７）項記載の検出方法。
9. （９）標識核酸プローブがデオキシリボ核酸またはリボ
   核酸である特許請求の範囲第（１）項記載の検出方法。
10. （１０）第２の担体核酸プローブがデオキシリボ核酸ま
    たはリボ核酸である特許請求の範囲第（７）項記載の検
    出方法。
11. （１１）目的核酸配列が病原体の特性を示す配列である
    特許請求の範囲第（１）項記載の検出方法。
12. （１２）病原体がウィルス、原核細胞および真核細胞よ
    りなる群から選ばれたものである特許請求の範囲第（１
    １）項記載の検出方法。
13. （１３）ウィルスが、肝炎ウィルス、ＨＩＶ、ヘルペス
    ウィルス、ヒトレトロウィルス、ヒトパピローマウィル
    ス、エプスタイン・バーウィルスおよびサイトメガロウ
    ィルスよりなる群から選ばれたものである特許請求の範
    囲第（１２）項記載の検出方法。
14. （１４）検出しようとする目的核酸配列がオンコジンで
    ある特許請求の範囲第（１）項記載の検出方法。
15. （１５）検出しようとする目的核酸配列が遺伝子マーカ
    ーまたは遺伝子欠損をコードしている特許請求の範囲第
    （１）項記載の検出方法。
16. （１６）（ａ）目的核酸配列とハイブリダイズすること
    のできる標識核酸プローブ、および （ｂ）該標識核酸プローブにハイブリダイズした該目的
    核酸配列を、ハイブリダイズしなかったプローブから分
    離するのに適したゲル排除もしくはアフィニティーカラ
    ムクロマトグラフィー装置からなる、生物学的試料中の
    目的核酸配列検出用キット。
17. （１７）標識核酸プローブの標識が、放射性同位元素、
    酵素、蛍光剤、化学発光分子、放射線不透過性物質およ
    び特異的結合ペアの一方よりなる群から選ばれたもので
    ある特許請求の範囲第（１６）項記載のキット。
18. （１８）さらにプロテイナーゼを含む特許請求の範囲第
    （１６）項記載のキット。
19. （１９）プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである特許
    請求の範囲第（１８）項記載のキット。
20. （２０）さらに変性用溶液またはカラムクロマトグラフ
    ィー溶出用バッファーを含む特許請求の範囲第（１６）
    項記載のキット。
21. （２１）（ａ）目的核酸配列に相補的な配列を含む一本
    鎖鋳型ＤＮＡを精製し、 （ｂ）該一本鎖鋳型ＤＮＡに特定の核酸プライマー配列
    をアニーリングし、 （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、およびヌ
    クレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴ
    Ｐを付加することによって該プライマー配列を伸長し、
    その際、該ヌクレオチドの少なくとも一種を標識し、ま
    た所望の長さの標識核酸プローブを得るのに充分な所定
    濃度で該ヌクレオチドの一種を存在させ、ついで （ｄ）変性条件下でクロマトグラフィーにより標識核酸
    プローブを精製、単離する ことにより調製された、特許請求の範囲第（１）項の検
    出方法に使用するための特定の所望の長さを有する一本
    鎖標識核酸プローブ。
22. （２２）工程（ｃ）においてｄＴＴＰの代わりにｄＵＴ
    Ｐを用いる特許請求の範囲第（２１）項記載の核酸プロ
    ーブ。
23. （２３）核酸プローブの長さが目的核酸の約１０〜２０
    ％である特許請求の範囲第（２１）項記載の核酸プロー
    ブ。