DE3876108T2

DE3876108T2 - Diagnostischer test unter verwendung von nucleinsaeure-sonden.

Info

Publication number: DE3876108T2
Application number: DE8888100162T
Authority: DE
Inventors: Mary C Kuhns
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1987-01-09
Filing date: 1988-01-08
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2008-01-09
Also published as: AU630836B2; US5981171A; ES2052607T3; ATE82773T1; JPS63245698A; CA1340840C; AU1082492A; DE3876108D1; AU619170B2; AU1010688A; EP0278220A1; JP2690738B2; EP0278220B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren und Kits zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen unter Einschluß von Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) ("Zielnukleinsäuren" oder "Zielnukleinsäuresequenz") in einer biologischen Probe. Das Verfahren erlaubt die schnelle Bestimmung der Gegenwart spezifischer DNA- oder RNA-Sequenzen in der biologischen Probe durch Hybridisierung markierter DNA- oder RNA-Sonden mit Zielnukleinsäuren in einer Lösung. Nach der Hybridisierung der markierten Sonden an die Zielnukleinsäure werden die resultierenden, hybridisierten und nicht-hybridisierten Sonden durch Gelausschlußchromatographie getrennt. Die Testmethoden sind zur Anwendung auf biologische Proben, wie Rohserum, Plasma oder Gewebekulturzellen oder Gewebeextrakte, oder auf gereinigte oder teilweise gereinigte Proben geeignet.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Nukleinsäuren DNA und RNA enthalten lineare Sequenzen von Purin- und Pyrimidinbasen, die die Fähigkeit zur Ausbildung von Wasserstoffbindungen, die zu doppelsträngigen Helixregionen führen, haben. Das Verfahren zur Ausbildung einer doppelsträngigen wasserstoffgebundenen Helixregion wird als Hybridisierung oder DNA-Renaturierung bezeichnet. Solch eine Hybridisierung tritt auf, wenn DNA- oder RNA-Proben mit komplementären Sequenzen unter geeigneten Salz-, pH- und Temperaturbedingungen inkubiert werden. Beide Nukleinsäuresequenzen können miteinander beliebig hybridisieren, das heißt DNA:DNA, RNA:RNA oder RNA:DNA, vorausgesetzt, sie haben eine komplementäre Nukleotidsequenz. Die Doppelhelixbildungsrate ist eine Funktion sowohl der Konzentration der Reaktionspartner als auch der Temperatur. Wenn eine der beiden Nukleinsäuresequenzen eine bekannte Sequenz und eine Markierung enthält, dann kann die Gegenwart einer komplementären Nukleinsäuresequenz in einer unbekannten Lösung durch Hybridisierung und Nachweis der Markierung bestimmt werden.
Mit Radioisotopen markierte DNA-Sonden wurden vielfach zur Lokalisierung von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in Mischungen aus DNA-Restriktionsfragmenten verwandt, die durch Gelelektrophorese fraktioniert wurden. Eine Replik des Musters einer Gelelektrophorese wird durch Transferieren fraktionierter DNA-Fragmetne auf ein Blatt Nitrocellulosepapier entweder durch Elektrophorese oder durch Diffusion in einem, Blotten genannten Verfahren erzeugt. Durch Hybridisieren einer radioaktiven Sonde an an Nitrocellulosepapier gebundene DNA oder RNA werden Hybride zwischen der Sonde und der gesuchten spezifischen DNA-Sequenz gebildet. Nicht hybridisierte Sonde wird weggewaschen und markierte Flächen auf dem Nitrocellulosepapier werden durch Autoradiographie nachgewiesen.
Ein anderes, zum Nachweis von Hepatitis B-Virus-DNA in Serum oder Plasma geeignetes Blot-Verfahren wurde von Scotto et al., Hepatology, 3, 279-284 (1983) beschrieben. Dieses Verfahren erlaubt die Verwendung eines größeren Probenvolumens von nicht extrahiertem Serum oder Plasma durch Binden von DNA aus der Probe direkt an Nitrocellulosepapier durch Verwendung einer Vakuumfiltrationsvorrichtung.
Die oben beschriebenen Verfahren beruhen auf der Bindung der Ziel-Nukleinsäuresequenzen an eine feste Phase, wie Nitrocellulosepapier, dann Entfernung von nicht hybridisierter, markierter Sonde durch Waschen und Nachweis von markierter Sonde, die mit den an die feste Phase gebundenen Zielnukleinsäuresequenzen hybridisiert hat. Diese Festphasenmethoden können zu übermäßigem Probenverlust führen, sind zeitaufwendig und beinhalten zahlreiche Schritte unter Einschluß der Festphasenherstellung, Bindung, Blockierung und Wäsche. Die gegenwärtig zur Zubereitung der Probe, Hybridisierung und Trennung der hybridisierten Sonde von unhybridisierter Sonde verfügbaren Prozeduren sind nicht allgemein zur Routineverwendung geeignet, sei es wegen der Kompliziertheit der Prozeduren, die hochqualifiziertes Personal erfordern, wegen der zeitaufwendigen Natur der Prozedur oder wegen des Gebrauchs spezieller Ausrüstung. Es besteht ein Bedarf an einem einfachen Verfahren, das die zur Durchführung des Test benötigte Zeit verkürzt, minimale Materialmengen erfordert, verläßlich und reproduzierbar ist und eine Methode zur Quantifizierung bietet.
Nobrega et al., Analytical Biochemistry, 131, 141-145 (1983), beschreiben ein Verfahren zum Nachweis von speziellen RNA-Transkripten bei der RNA-Verarbeitung, worin sowohl die Zielnukleinsäure und die Sonde in Lösung vorliegen. In diesem Verfahren werden freie DNA-Sonden nach der Hybridisierung unter Verwendung der elektrophoretischen Migration auf Agarose und der Visualisierung durch Autoradiographie getrennt.
Das Prinzip der Trennung kleiner Moleküle von größeren mit höherem Molekulargewicht auf Basis der Unterschiede in Gewicht und/oder Konformation ist aus der Literatur bekannt. Solche Verfahren schließen die differenzielle Zentrifugation, chromatographische Verfahren, elektrophoretische Verfahren, die Dialyse und ähnliche Methoden ein.
Verfahren zur Erzeugung von DNA, die die Sequenz des Hepatitis B-Virusgenoms enthält, durch die Klonierung der Hepatitis- Sequenz auf ein bakterielles Plasmid sind in der britischen Patentanmeldung GB-2 034 323A, veröffentlicht am 4. Juni 1980, beschrieben. Reagentien und Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Virus-DNA, wie Hepatitis B-Virus-DNA, unter Verwendung einer bekannten Menge eines Phagenvektors, wurden in der PCT-Anmeldung WO 85/3951, veröffentlicht am 12. Seotember 1985, beschrieben. Verfahren und Zusammensetzungen, die zum Nachweis von denaturierter, Festphasen-fixierter pathogener DNA zusammen mit einer zur Hybridisierung geeigneten markierten DNA-Sonde geeignet sind, wurden auch in US-Patent 4 358 535 beschrieben.
EP-A-0 133 671 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien durch Nukleinsäurehybridisierung der bakteriellen Zielnukleinsäuren mit markierten Polynukleotidsonden, die eine zu wenigstens einer Basensequenz der Zielnukleinsäuren homologe Basensequenz aufweisen. Während eines Tests gebildete Hybride können auf zwei Wegen isoliert werden. Einer beinhaltet zunächst die Hydrolyse der nach der Hybridisierung verbleibenden Einzelstrang-Nukleinsäure zu kleinen Fragmenten unter Verwendung von S&sub1;-Nuklease und danach die Durchführung einer Ausfällung des Hybrids mit Säure, gefolgt von Zentrifugation oder Filtration. Ein zweites Verfahren zur Trennung des Hybrids vom Einzelstrang-Polynukleotid ist die Chromatographie auf Hydroxyapatit.
WO-A-85/2628 beschreibt einen Nukleinsäurehybridisierungstest , bei dem ein markiertes vernetztes Hybrid gebildet wird. Es wird berichtet, daß eine hybridisierte und vernetzte Sonde nach mehreren Verfahren von der unhybridisierten Sonde isoliert wird, unter denen sich die Chromatographie an Hydroxyapatit, die enzymatische Verdauung der unhybridisierten Sonde mit S&sub1;-Nuklease, gefolgt beispielsweise von einer Gelausschlußchromatographie, und die Gelausschlußchromatographie nur unter denaturierenden Bedingungen befinden.
EP-A-0 245 129, die als zum Stand der Technik gemäß Art. 54(3) und (4) EPÜ gehörend angesehen werden muß, betrifft einen Nukleinsäurehybridisierungstest und beschreibt die Trennung unhybridisierter Sonde von hybridisierter Sonde durch Chromatographie an Hydroxyapatit oder durch andere Methoden, wie Gelausschlußchromatographie nach enzymatischer Verdauung der unhybridisierten Sonde mit S&sub1;-Nuklease.
EP-A-0 124 124 beschreibt eine Festphasen-Hybridisierungsmethode zum Nachweis von genetischem Material. Darin erwähnt werden aus M13-Klonen mit dem Klenow-Enzym und biotinylierten Nukleotiden erzeugte Einzelstrangsonden zur Verwendung im Test.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt Verfahren und Kits für den schnellen quantitativen Test zum Nachweis einer Zielnukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bereit. Das Verfahren umfaßt die Bereitstellung einer biologischen Probe, die eine Zielnukleinsäure enthalten kann, welche mit einer markierten Nukleinsäuresonde in einem flüssigen Medium hybridisieren kann, wobei diese Sonde von vorbestimmter gewünschter Länge ist. Die Zielnukleinsäuresequenz wird dann mit der markierten Nukleinsäuresonde zusammengebracht. Die hybridisierten und nicht hybridisierten Sonden werden durch Gelausschlußchromatograhie getrennt. Die Menge an hybridisierter Sonde wird nach dem Trennschritt als Maß für die in der biologischen Probe vorhandene Menge an Zielnukleinsäure bestimmt. Für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbare Sondenzusammensetzungen umfassen spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen, die mit einer nachweisbaren Markierung stabil verbunden sind, etwa einem Radioisotop, einem Enzym, einer radiopaken Substanz, einem Fluoreszenzerzeuger, einem chemilumineszenten Molekül, eine beliebige der vorstehenden Substanzen enthaltende Liposomen oder ein Glied eines spezifischen Bindungspaares. Die markierte Nukleinsäuresonde ist komplementär zu einer Zielnukleinsäuresequenz und hat ein effektives Molekulargewicht oder ein spezifisches Bindungspaarglied, so daß die hybridisierte Sonde durch Gelausschlußchromatographie einfach von der nicht hybridisierten Sonde abgetrennt werden kann. Weiterhin werden neue Verfahren zur Herstellung von Sonden für die Verwendung im erfindungsgemäßen Test beschrieben.
Kits zum Gebrauch bei der Bestimmung der Gegenwart einer Zielnukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe enthalten eine Nukleinsäuresonde einer vorbestimmten erwünschten Länge, die stabil mit einer nachweisbaren Markierung verbunden ist, sowie eine Vorrichtung zur Gelausschlußchromatographie, die zur Abtrennung nicht hybridisierter Sonde von an die Zielnukleinsäuresequenz hybridisierter Sonde geeignet ist.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt eine log-log-Auftragung einer Hepatitis B-Virus-DNA-Teststandardkurve, die auf der X-Achse die Zahl der Hepatitis B-Virusgenome und auf der Y-Achse die Zählung der Probe dividiert durch die Zählung der negativen Kontrollprobe gegeneinanderstellt, und
Fig. 2 zeigt ein Gelausschlußchromatographieprofil, in dem das Leervolumen die an eine Nukleinsäuresonde hybridisierte Zielnukleinsäuresequenz enthält und das einbezogene Volumen die Nukleinsäuresonde, die nicht hybridisiert hat.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Definitionen

Gelausschlußchromatographie:

Dieses Verfahren ist auch als Gelfiltration bekannt und umfaßt die Verwendung eines granularen Materials, gewöhnlich eines Dextrans, das ein Medium bildet, worin zwei Phasen vorliegen. Eine Phase ist die Flüssigkeit innerhalb des granularen Materials und die andere Phase das flüssige Material ausserhalb des granularen Materials. Material in Lösung, das aufgrund seiner großen Größe vom Eintritt in das granulare Material vollständis ausgeschlossen ist, durchläuft die Säule zuerst und ist als Leervolumen bekannt. Kleinere Moleküle in Lösung werden durch die Bewegung in das granulare Material verzögert und werden von dem Material als Funktion ihres effektiven Molekulargewichts zurückgehalten. Das in das granulare Material einbezogene Material ist als Einschlußvolumen bekannt. Daher führt die Ausschlußchromatographie einer Mischung aus kleineren Sondennukleinsäuren und größeren Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuresonden unter Bildung eines Duplex hybridisiert sind, dazu, daß die kleineren Sondennukleinsäuren vom granularen Material im Einflußvolumen verzögert werden und der größere hybridisierte Duplex im Leervolumen ausgeschlossen wird. Solche Materialien sind verfügbar, beispielsweise von Pharmacia Co. unter der Markenbezeichnung Sephadex und Sepharose sowie von BioRad Co. unter der Bezeichnung Biogel .

Spezifisches Bindungspaar:

Ein spezifisches Bindungspaar umfaßt zwei verschiedene Moleküle, von denen eines der Moleküle eine Fläche an seiner Oberfläche oder in einer Höhlung aufweist, die spezifisch an eine besondere räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet. Die Glieder des spezifischen Bindungspaares werden oft als Ligand und Rezeptor und Ligand und Anti-Ligand bezeichnet. Oft ist der Rezeptor ein Antikörper und der Ligand ein Antigen. Andere spezifische Bindungspaare schließen Hormon-Rezeptor-Paare, Enzym-Substrat-Paare, Biotin-Avidin-Paare und Glycoprotein-Rezeptor-Paare ein. Auch einbezogen sind Fragmente oder Teile von spezifischen Bindungspaaren, die die Bindungsspezifität beibehalten, etwa Fragmente von Immunoglobulinen unter Einschluß von Fab-Fragmenten und dergleichen. Die Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein.

Nachweisbare Markierungen:

Eine Markierung ist eine Substanz, die kovalent an eine Nukleinsäuresonde angeheftet oder fest damit verbunden werden kann, was die Fähigkeit zum Nachweis und zur Quantifizierung der Menge der Sonde einschließt. Unter den in Betracht gezogenen Substanzen sind Radioisotope, wie ³H, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³²P, ¹&sup4;C und ³&sup5;S; chemilumineszente Moleküle, wie Acridine oder Luminol; Fluoreszenzerzeuger, wie Fluorescein, Phycobiliproteine, Seltenerdchelate, Dansyl, Rhodamin; Enzymsubstrate und Inhibitoren, wie Meerrettichperoxydase, Glucoseoxydase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, ß-Galactosidase, Pyruvatkinase, alkalische Phosphatase, Acetylcholinesterase; Metallteilchen oder andere radiopake Moleküle, wie kolloidales Gold, magnetische Teilchen; beliebige der vorstehenden Substanzen enthaltende Liposome; Antigene, wie Proteine, Kohlenhydrate oder Hapten-Moleküle und auf diese Antigene spezifische Antikörper; sowie Glycolipide oder Glycoproteine, die Glieder spezifischer Bindungspaare sind.

Nukleinsäuresequenz:

Eine mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachweisbare Nukleinsäuresequenz ist eine Nukleotidsequenz unter Einschluß von Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden. Diese Nukleinsäuresequenzen können entweder einzelsträngig oder doppelsträngig oder teilweise einzelsträngig mit partiellen basen-gepaarten Regionen sein. In Betracht gezogene Ribonukleinsäuresequenzen schließen sowohl Boten-RNA als auch Ribosom-RNA ein.

Hybridisierung:

Hybridisierung ist die Bildung eienr stabilen Verbindung durch Wasserstoffbrückenbindung und Schichtungskräften zwischen Nukleinsäuresequenzen, wodurch die Sequenzen hinreichend gebunden werden, um die Trennung hybridisierter von nicht hybridisierten Sequenzen zu erlauben. Die Hybridisierungsgeschwindigkeit ist in Abhängigkeit von Temperatur, Salz, pH-Bereich, Konzentration der Reaktionspartner und Gegenwart anderer Moleküle, wie Dextransulfat.

Proteinase:

Eine Proteinase ist ein Enzym, das eine Peptidbindung aufbrechen kann und sowohl Exopeptidasen als auch Endopeptidasen einschließt, wie Protease, Proteinase K, Pronase, Trypsin, alkalische Protease, Subtilisin oder Chymotrypsin.

Zielnukleinsäuren oder Zielnukleinsäuresequenzen:

Wie hier verwandt, bezeichnen diese Begriffe DNA oder RNA, entweder in einzel- oder in der doppelsträngigen Form, unter Einschluß von Boten- oder Ribosom-RNA. Beispielsweise werden Zielnukleinsäuren, die zum Nachweis durch das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, in Viren, Mikroorganismen, entweder prokaryotisch als auch eukaryotisch, und in abweichenden Zellen, die mit einer Krankheit oder einem physiologischen Zustand verbunden sein können, gefunden. Unter diesen Zielnukleinsäuren sind die Nukleinsäure von HIV (HTLV- III oder LAV), Hepatitisviren, Herpesviren, menschlichen Retroviren, menschlichen Papillomviren, des Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus, Transkripte von Virus-RNA und replikative Zwischenprodukte. Auch einbezogen sind Nukleinsäuren von Bakterien, wie Mycoplasmen, Rickettsien und Chlamydien sowie eukaryotische Pathogene, wie Pilze, Hefen und anormale oder abweichende Wirtszellen, insbesondere solche, die Oncogene oder genetische Defekte oder genetische Markierungen enthalten.

Biologische Probe:

Wie hier verwandt, ist eine biologische Probe eine beliebige Probe, die eine Zielnukleinsäure von Interesse enthält. Die Quelle der biologischen Probe schließt Pflanzen, Insekten und Tiere ein. Unter den bevorzugten biologischen Proben sind Sirup, Plasma, Gelenkflüssigkeit, Biopsiematerial, Gewebekulturzellen oder Wachstumsmedium von Zellen in Gewebekultur, Gewebeextrakte und Membranwaschflüssigkeiten.

Anwendungsmethoden

Es werden Verfahren zur schnellen quantitativen Bestimmung einer Zielnukleinsäuresequenz unter Bereitstellung einer markierten Nukleinsäureprobe einer vorbestimmten erwünschten Menge bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt als ersten Schritt die Bereitstellung einer biologischen Probe, die in einem flüssigen Medium eine Zielnukleinsäure enthalten kann. Eine rohe biologische Probe in einem flüssigen Medium, etwa ein Serum, Plasma, Gewebeabschnitte oder Extrakte, Lymphozyten, Gewebekulturzellen oder das überstehende Wachstumsmedium einer Gewebekultur kann im Test ohne vorherige Reinigung eingesetzt werden. Alternativ kann eine gereinigte oder partiell gereinigte Probe getestet werden. Reinigungsschritte können die Trennung, Extraktion, das Aufbrechen der Zellen oder die Homogenisierung von Gewebe oder biologischen Flüssigkeiten einschließen. Zusätzlich können Trägernukleinsäuren, die mit einer Sonde nicht reagieren, der Probe während der Reinigung zugesetzt werden, um den unspezifischen Verlust an Nukleinsäure zu vermindern.
Danach kann die Probe mit einem Detergent oder einer Proteinase behandelt werden, um die Nukleinsäuren für den Test löslich zu machen und freizusetzen. Die Zugabe einer Proteinase ist bevorzugt, teilweise deshalb, weil die Behandlung zu stabileren und besser löslich gemachten Nukleinsäuren führt. Unter den für dieses Verfahren als nützlich erachteten Proteinasen befinden sich Proteinase K, Trypsin, Chymotrypsin, Pronase, alkalische Proteasen, Lysozym und Subtilisin. Andere zur Herstellung der Zielnukleinsäuren geeignete Enzyme schließen DNAse, wenn die Zielnukleinsäuresequenz RNA ist, oder RNAse, wenn die Zielsequenz DNA ist, ein.
Falls die Zielnukleinsäuresequenz in der biologischen Probe nicht in Einzelstrangform vorliegt, muß sie denaturiert werden, um die Hybridisierung mit einer Nukleinsäureprobe zu erlauben. Die Denaturierung kann durch Behandlung unter alkalischen Bedingungen bewirkt werden, etwa durch Zugabe von Natriumhydroxid oder durch Erhitzen. Wenn die Zielnukleinsäuresequenz RNA ist, ist ein bevorzugtes Verfahren zur Denaturierung die thermische Denaturierung, bei der die sekundäre RNA-Struktur unterbrochen wird.
Nach dem Aufbrechen der Sekundärstruktur der Zielnukleinsäure zur Erzeugung einer einsträngigen Nukleinsäure wird die Hybridisierungsreaktion mit einer markierten Sonde unter Bedingungen durchgeführt, die zur selektiven Bindung der markierten Sonde an die Zielnukleinsäure geeignet sind. Allgemeine Verfahren für Hybridisierungsreaktionen und die Synthese von Sonden sind in Molecular Cloning von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben. Die Hybridisierungsreaktion kann unter einer Anzahl von pH-, Salz und Temperaturbedingungen stattfinden. Der pH-Wert kann von 6 bis 9 reichen, wobei der bevorzugte pH-Wert 6,8 bis 8,5 ist. Die Salzkonzentration kann von 0,15 M Natrium bis 0,9 M Natrium reichen. Andere Kationen können verwandt werden, solange die Ionenstärke äquivalent zu der für Natrium genannten ist. Die Temperatur der Hybridisierungsreaktion kann von 30ºC bis 80ºC reichen, mit einem bevorzugten Temperaturbereich von 45ºC bis 70ºC. Zusätzlich können andere Verbindungen der Hybridisierungsreaktion zugesetzt werden, um die spezifische Hybridisierung bei niedrigen Temperaturen zu fördern, etwa bei oder in der Nähe von Raumtemperatur. Unter den für die Verminderung der Temperaturanforderungen in Betracht gezogenen Verbindungen befindet sich Formamid.
Nach der Hybridisierungsreaktion wird die an die markierte Sonde hybridisierte Zielnukleinsäure von der nicht hybridisierten markierten Sonde getrennt, um die Menge an hybridisierter Sonde und damit an in der Probe vorhandener Zielnukleinsäure durch Gelausschlußchromatographie zu bestimmen. Das bevorzugte Verfahren zur Trennung wird durch Gelausschlußchromatographie bewirkt. Die Bedingungen für das Trennverfahren müssen so sein, daß die hybridisierte Zielnukleinsäure und die nachweisbare Sonde aneinander gebunden bleiben. Die Trennlösung kann Inhibitoren und Nukleasen enthalten sowie weiterhin zusätzliche Trägernukleinsäuresequenzen, die nicht mit der Sonde wechselwirken.
Unter den bevorzugten Verfahren zur Trennung der hybridisierten Sonde von der nicht hybridisierten Sonde befindet sich die Gelausschlußchromatographie durch aus Polyacrylamid, Sepharose, vernetzte Sepharose, Agarose, vernetzte Agarose oder andere ähnliche Materialien gebildete Matrices. Geeignete Produkte für solche Gelausschlußchromatographie beziehen die als G50, G100, G200 bezeichneten Sephadex -Produkte von Pharmacia, als Sepharose CL2B, 4B, 6B, S-200, S-400 und S-1000 bezeichnete Pharmacia- Produkte ein. Andere geeignete Produkte der BioRad Corporation schließen P-20, P-60, P-100, P-200, A-0,5 m und A-1,5 m ein.
Ziel der Trennreaktion ist es, den differentiellen Nachweis der Menge der an die Zielnukleinsäure gebundenen Sonde zu erlauben, ohne daß nicht hybridisierte Sonde einen übermäßigen Hintergrund bildet, was den genauen Nachweis der hybridisierten Sonde verhindert. Daher muß die Zielnukleinsäure in Kombination mit der nachweisbaren Sonde eine Größe oder Konformation aufweisen, die sich von der nachweisbaren Sonde allein hinreichend unterscheidet, damit auf Basis des Gelausschlußchromatographieverhaltens der Probe eine Trennung eintritt. Daher ist es wesentlich, daß die Länge der markierten Nukleinsäuresonde nach im einzelnen nachstehend beschriebenen Verfahren sorgfältig gesteuert wird. Wenn die Zielnukleinsäure nicht groß genug ist, um die Trennung durch Gelausschlußchromatographie zu erlauben, kann eine spezifische, nicht markierte Trägernukleinsäure verwandt werden, um die Größe des Komplexes aus Zielnukleinsäure und Sonde effektiv zu erhöhen.
Wenn die Trennung unter Verwendung üblicher Reagentien für die Gelausschlußchromatographie bewirkt wird, wie etwa solche, wie sie in einem Kit enthalten sind, muß das Volumen der auf die Säule aufgebrachten Probe und des Elutionspuffers sorgfältig kontrolliert werden.
Nach der Trennung der hybridisierten Sonde von der nicht hybridisierten Sonde wird die Gegenwart oder Menge an hybridisierter Sonde bestimmt. Das Nachweisverfahren hängt von der Art der an der Sonde vorhandenen Markierung ab. Wenn die Markierung ein Radioisotop ist, kann der Nachweis durch Gamma- oder Scintillationszählung erfolgen oder nach einem anderen Verfahren, das zum Nachweis geeignet ist, etwa der Nachweis durch Autoradiographie oder Photographie. Wenn ein Glied eines spezifischen Bindungspaares als Markierung an der Sonde verwandt wird, dann kann das zweite Glied des Paares verwandt werden, um Nachweis und Quantifizierung zu bewirken. Das zweite Glied des Paares kann selbst eine zweite nachweisbare Markierung enthalten, etwa ein Enzym oder Isotop. Falls die Markierung ein Enzym oder Enzyminhibitor ist, dann können Reaktionen verwandt werden, die die Gegenwart oder Abwesenheit enzymatischer Aktivität nachweisen. Bevorzugte enzymatische Reaktionen sind solche, die zu einem colorimetrischen Wechsel führen, der unter Verwendung eines Spektrophotometers nachgewiesen werden kann. Weitere Markierungen schließen radiopake Substanzen ein, die durch Verwendung elektromagnetischer Strahlung nachgewiesen werden; magnetische Teilchen, die durch Verwendung magnetischer Felder nachgewiesen werden; immunologische Methoden, die die Verwendung von Antikörpern und spezifischen Antigenen beinhalten; Fluoreszenz- und Chemilumineszenzmarkierungen; sowie Glieder beliebiger spezifischer Bindungspaare, wie Glycolipide oder Glycoproteine.
Um die in einer unbekannten biologischen Probe vorhandene Menge einer Zielnukleinsäuresequenz genau zu bestimmen, kann parallel zu der Probe eine positive und negative Kontrolle mit einer bekannten Menge der Zielnukleinsäuresequenz getestet werden, wodurch die Testergebnisse standardisiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis der Gegenwart einzel- und doppelsträngiger Nukleinsäure-DNA oder -RNA in einer biologischen Probe verwandt werden. Bevorzugte Zielnukleinsäuresequenzen schließen solche ein, die mit Pathogenen verbunden sind, etwa Viren, Bakterien, Hefen, Pilzen, Protozoen oder eukaryotischen Zellen. Einbezogen in die Klasse der eukaryotischen Zellen sind solche des Wirts selbst, die transformiert sind oder die eine Onkogen oder eine bekannte genetische Markierung enthalten. Bevorzugt unter pathogenen Virusnukleinsäuren, die mit den erfindungsgemäßen Methoden nachweisbar sind, sind die, die für Hepatitis, Herpes, das erworbene Immunschwächsyndrom (HIV, HTLV III oder LAV) verantwortlich sind sowie Human-Papillomviren, Epstein- Barr-Viren und andere Viren und Organismen.
Die Methoden der Erfindung sind zum Nachweis geringer Mengen der Zielnukleinsäuren bis hinunter zu 0,07 Picogramm Nukleinsäure geeignet. Reagienten, die die erfindungsgemäßen Methoden erleichtern, können in Form eines Kits zur Verwendung in manuellen Tests oder in automatisierten Diagnostikgeräten oder Analysatoren einbezogen sein. Verfahren zur Erhöhung der Menge an Zielnukleinsäure, wie beispielsweise die Vermehrung eines Virus durch Gewebekultur oder Verstärkung des Ziels, wie in Science, 230, 1350- 1354 (1985), beschrieben, stehen mit der Erfindung in Einklang.

Sondencharakterisierung

Eine erfindungsgemäß erzeugte Sonde kann entweder aus DNA oder RNA bestehen, die komplementär zur nachzuweisenden Zielnukleinsäure ist. Eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Sonde hat eine Länge von wenigstens 20 Nukleotiden und entspricht vorzugsweise zwischen 10 und 20 % der Länge der Zielnukleinsäure in ihrer nativen Form. Wenn das effektive Molekulargewicht des Ziel- und des Sondenmoleküls die Trennung durch Gelausschlußchromatographie nicht erlauben, kann ein unmarkiertes spezifisches DNA- oder RNA-Trägermolekül in ausreichender Größe verwandt werden, um die Trennung durch Gelausschlußchromatographie zu erlauben. Das Trägermolekül enthält eine zu einem Teil der Zielnukleinsäure komplementäre Sequenz, die verschieden vom Sondenmolekül ist, das heißt bei der Hybridisierung des Sondenmoleküls nicht überlappt, damit nicht kreuzhybridisiert oder sterisch eingreift. Der Träger kann daher relativ preiswert in der Herstellung sein und muß nicht markiert sein. Alternativ kann der Träger ein relativ kurzes Nukleinsäuremolekül sein, das ein spezifisches Bindungspaarglied enthält, das die Anheftung an ein anderes Molekül relativ hohen Molekulargewichts erlaubt, etwa einen Antikörper oder Avidin, und dadurch das effektive Molekulargewicht des Komplexes aus Sonde und Ziel erhöht.
Die nachweisbaren Markierungen können Radioisotope, chemilumineszente Moleküle, Fluoreszenzerzeuger, Enzyme, Antigene oder Teile spezifischer Bindungspaare sein, wie zuvor diskutiert. Die nachweisbaren Markierungen können nach der Sondensynthese an die Sonde gebunden werden oder während der Synthese in die Sonde eingebracht werden, wie bei ³²P, ³H, ¹²&sup5;I, ¹&sup4;C oder ³&sup5;S.
Das erfindungsgemäße Verfahren schließt die Herstellung einer Sonde zum Nachweis von Hepatitis B-Virus-DNA (HBV) auf Basis einer Primerextension ein. Die Sonde kann zwischen 50 und 400 Nukleotide lang sein, vorzugsweise 75 bis 300 Nukleotide und stärker bevorzugt 150 bis 250 Nukleotide. Das Templat besteht aus M13- Phagen-DNA, die ein Insert aus klonierter Hepatitis B-Virus-DNA enthält. Das Einzelstrangtemplat wird mit einem Primer von wenigstens 17 Nukleotiden Länge hybridisiert oder verschmolzen, der komplementär zum Hepatitis B-Insert ist. Die Primersequenz wird aus bekannten Sequenzen des Hepatitis B-Virus ausgewählt, die in Charnay et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 2222 (1979) gefunden werden kann. Nach dem Verschmelzen von Templat und Primer werden die Nukleotide dGTP, dCTP, dATP und entweder dTTP oder dUTP und das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I hinzugefügt. Ein oder mehrere Nukleotidspezies können eine Markierung wie ¹²&sup5;I, enthalten. Die Synthese der DNA oder RNA erfolgt durch Extension des Primers, was zu einer markierten Kopie der insertierten DNA führt. Die Länge der Sonde wird durch Limitieren der Konzentration eines der Nukleotide gesteuert.
Beispielsweise werden 72 ug Einzelstrang-DNA, die aus der Herstellung eines M13-Phagen mit 3200 insertierten Basenpaaren von Hepatitis B-DNA isoliert wurde, mit 20 ng eines 23-basigen Primermoleküls, das komplementär zur Oberflächenantigenregion des Hepatitis B-Genoms ist, verschmolzen. Das Verschmelzen wird in einem Volumen von 120 ul 10 mM Tris von pH 8,5, 10 mM MgCl&sub2; über eine Stunde bei 65ºC bewirkt. 1500 Picomol eines jeden der Nukleotide dGTP, dTTP und dATP werden in einem Volumen von 90 ul zugesetzt. 150 Picomol dCTP werden zugefügt, gefolgt von der Zugabe von 150 Picomol markierter dCTP, etwa ¹²&sup5;I-dCTP, die im Handel von NEN Dupont oder Amerisham erhältlich ist. Die dCTP-Konzentration in der Reaktion ist somit limitierendes Substrat. Das Klenow- Fragment von DNA-Polymerase I wird bis zu einer Endkonzentration von 0,6 Einheiten/ul zugesetzt, wonach die Extension des zuvor verschmolzenen Primers für 2 Stunden bei 15ºC fortschreitet. Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA bei einer Endkonzentration von 25 mM beendet. Die Reaktionsmischung wird dann auf eine Chromatographiesäule mit 3,4 ml Bettvolumen Sepharose CL4B zur Abtrennung nicht eingebrachter Nukleotide von der neu synthetisierten DNA-Kopie aufgebracht. Das das Templat und die neu synthetisierte DNA-Kopie enthaltende Leervolumen wird dann mit NaOH bis zu einer Endkonzentration von 0,15 N zur Denaturierung von Templat und verlängertem Primer mit dem Radioisotop behandelt. Die denaturierte Probe wird auf eine mit 0,03 N NaOH equilibrierte Säule mit Sepharose CL4B-Gel aufgebracht. Chromatographie unter diesen denaturierenden Bedingungen erlaubt die Trennung des Templats mit hohem Molekulargewicht vom kleineren markierten, verlängerten Primer mit geringerem Molekulargewicht. Das Templat erscheint im Leervolumen, während der markierte verlängerte Primer im Einschlußvolumen verbleibt. Die das Einschlußvolumen enthaltenden Fraktionen werden zusammengegeben und im pH-Wert mit 2 M NH&sub4;Ac neutral eingestellt. Die neutralisierten vereinigten Fraktionen bilden die ¹²&sup5;I-markierte Sonde. Die Sonde wird dann für Tests durch Zugabe von 40 000 bis 200 000 dpm der ¹²&sup5;I-Sonde zu jeder Hybridisierung verwandt. Die spezifische Aktivität der Sonde ist typischerweise wenigstens 10&sup9;dpm/ug.
Alternativ wird die markierte Kopie durch Wärmedenaturierung und anschließender Reinigung durch Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen zur Auswahl der Sondenmoleküle erwünschter Länge abgetrennt. Die gewählte Länge hängt von der Fähigkeit ab, nicht hybridisierte Sonde von an das Ziel im Testverfahren hybridisierter Sonde abzutrennen. Jede DNA- oder RNA-Sequenz von Interesse kann in einen Einzelstrang-Phagen- oder Plasmid-Vektor kloniert und dann als Templat eingesetzt werden, wenn geeignete Primer verwandt werden. Alternativ können die Hybridisierungs- oder Sequenzierungsprimer, die in M13-Phagen insertierte Sequenzen flankieren, zum Primen der Synthese und Generierung einer Sonde verwandt werden.
Sonden tatsächlich jeder Länge können nach obigem Verfahren hergestellt werden. Dieses Verfahren erleichtert die Herstellung von Sonden kontrollierter Länge in hohen Ausbeuten. Ferner werden wenigstens 50 % der radioisotopen Markierung nach diesem Verfahren eingebracht, was ausreichend Sonde für etwa 4 000 Hybridisierungstests gemäß Testverfahren der Erfindung, wie es im vorstehenden Beispiel beschrieben ist, ergibt.
Die Daten in Fig. 1 erläutern eine Standardkurve für Hepatitis B-Virus-DNA unter Verwendung einer ¹²&sup5;I-markierten Sonde, die wie oben beschrieben hergestellt wurde. Das Testprotokoll ist im Beispiel I beschrieben. Wie aus Fig. 1 ersehen werden kann, nehmen die Zählraten markierter hybridiserter Sonde proportional zur Zahl der vorhandenen Virusgenome zu. Diese Methode stellt ein effizientes reproduzierbares Verfahren zur Herstellung von Einzelstrang-DNA-Sonden in hoher Ausbeute mit günstigen Eigenschaften für die Hybridisierung und Trennung durch Gelausschlußchromatographie dar. Die Sondenlänge und die spezifische Aktivität der Sonde sind für Rohserum oder Plasma und für andere Körperflüssigkeiten und Zell- oder Gewebelysate brauchbar. Nach der Hybridisierung derartiger biologischer Proben führen die Testverfahren zu einem hoch spezifischen und hoch empfindlichen diagnostischen Test auf das Vorhandensein der Zielnukleinsäure.
Alternative Verfahren zur Sondenherstellung schließen die Verwendung des Riboprobe -Systems (kommerziell erhältlich von Promega Biotec) zur Herstellung von RNA-Sonden bekannter Länge oder zur Herstellung end-markierter Oligomere nach bekannten Verfahren ein.
Ein allgemeines Verfahren zur Endmarkierung von Nukleinsäuren unter Verwendung von ³²P-Nukleotiden wurde im Laborhandbuch Molecular Cloning von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben.
Alternativ kann eine Nukleinsäuresonde mit ¹²&sup5;I nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren markiert werden. Markierte oder nicht markierte spezifische, einzelsträngige (SS) DNA-Sonden können nach dem von Jingzhong et al., Gene, 42, 113-117 (1986), beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Kits

Zur Verwendung bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Kits enthalten eine markierte Nukleinsäuresonde einer vorbestimmten erwünschten Länge und eine Vorrichtung zur Gelausschlußchromatographie, die zur Trennung der an die Sonde gebundenen Zielnukleinsäuresequenz von der nicht hybridisierten Sonde geeignet ist. Geeigneterweise kann das Kit weitere Reagentien und Vorrichtungen, etwa Enzyme, enthalten, die bei der Herstellung einer biologischen Probe nützlich sind, beispielsweise Proteinase K; Lösungen zur Denaturierung einer Zielnukleinsäure, etwa Natriumhydroxid; zur Verwendung in einem Trennschritt der Gelausschlußchromatographie geeignete Puffer; und eine Sammelröhrchen enthaltende Arbeitsstation, ein für die Hybridisierungsreaktion geeignetes Flotationsrack, Probenverdünner sowie Anweisungen zur Durchführung des Hybridisierungsverfahrens enthaltende Arbeitsstation.
Die folgenden Beispiele werden als Erläuterung gegeben und sollen nicht beschränken.

Experimentelle Beispiele

Beispiel I: Bestimmung von Hepatitis B-Virus-DNA in Serum und Plasma

Eine Serum- oder Plasma-Probe (200 ul) wurde durch Zugabe von 10 ul einer Proteinase K in einer minimalen Konzentration von 10 mg/ml enthaltenden Puffers löslich gemacht und denaturiert. Nach der Inkubation der Probe mit Proteinase K über eine Stunde bei Raumtemperatur wurden 20 ul einer NaOH-Lösung zugegeben, um die minimale NaOH-Konzentration von 0,1 N zu erreichen. Dies führte zur Denaturierung der in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren. Alternativ kann die Denaturierung durch Wärme unter Fortlassen der NaOH-Zugabe und der Neutralisierungsschritte eingesetzt werden. Folgend auf den Schritt der alkalischen Denaturierung wurden 70 ul Tris-HCl enthaltender neutralisierender Puffer zugefügt, um den pH-Wert zur Neutralität zu bringen und NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M, und es wurde eine markierte HBV-Sonde, die wie zuvor beschrieben hergestellt worden war, zugefügt. Ein Acetatpuffer oder ein Phosphatpuffer können statt Tris-HCl-Puffer verwandt werden. Die Einzelstrang-HBV-Sonde war mit ¹²&sup5;I markiert, jedoch können auch ³&sup5;S, ³H oder andere nachweisbare Markierungen, etwa Biotin oder ein Antigen, verwandt werden. SDS kann bis zu 10 % in die Hybridisierungslösung einbezogen sein. Die tatsächliche Hybridisierungsreaktion wurde über 16 Stunden bei 65ºC vorgenommen. Die Probe wurde dann auf ein Bettvolumen von 3,4 ml Sepharose - CL4B mit den Säulendimensionen 0,5 cm bei 20 cm gegeben. Nach dem Eintretenlassen der Probe in das Gelbett wurde ein Puffervolumen mit 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 so zugesetzt, daß das Volumen der Probe und der zugesetzte Elutionspuffer gleich 1,5 ml waren. Die Elution des ausgeschlossenen Virus-DNA-Sondenhybrids verlief dann unbeeinflußt. Das Elutionsverfahren endet automatisch und das eluierte Volumen kann auf Radioaktivität oder die Gegenwart anderer nachweisbarer Markierungen analysiert werden.
Bekannte Mengen HBV-DNA als positive Kontrollen enthaltende Proben oder negative Kontrollen (Serum ohne HBV-DNA) wurden parallel als Standards gefahren. Durch Vergleich der unbekannten Probe mit Standardproben kann eine quantitative Abschätzung des HBV in jeder Probe vorgenommen werden. Fig. 1 zeigt die Testergebnisse für die serielle Verdünnung einer Probe, die bekannte Konzentrationen Hepatitis B-Virus-DNA enthält und nach diesem Verfahren bewertet wurde.

Beispiel II: Elutionsprofil von hybridisierter Ziel-DNA und markierter Sonde

HBV-DNA wurde in einer biologischen Probe unter Verwendung der in Beispiel I beschriebenen radioaktiven Sonde und Säule nachgewiesen. Die negative Kontrolle bestand aus einer Serumprobe ohne Hepatitis B-Markierungen. Die positive Kontrolle war eine Serumprobe von einem chronischen Träger von Hepatitis B. Die Hybridisierung, wie in Beispiel I beschrieben, wurde über 16 Stunden bei 65ºC durchgeführt. 300 ul Hybridisierungsmischung, wie in Beispiel I beschrieben, wurden auf die Säule angewandt und mit 10 mM Tris enthaltendem Puffer, pH 8,0, und 1 mM EDTA eluiert. Fig. 2 erläutert das Elutionsprofil der Gelausschlußchromatographiesäule mit der Ziel-Hepatitis B-Virus-DNA und der hybridisierten Sonde im Leervolumen (Fraktionen 1 bis 33) und nicht hybridisierter Sonde, die auf der Säule zurückgehalten und mit dem Einschlußvolumen eluiert wurde.

Beispiel III: Test auf HIV-spezifische Sequenzen in einer Gewebekultur

A) Überstehendes der Gewebekultur

25 ul einer Lösung von 120 mM Vanadyl, 10 % SDS und 21 mg/ml Proteinase K wurden zu 200 ul-Proben von Überstehendem, erhalten aus Zellkulturen von nicht infizierten oder zuvor mit HIV infizierten Lymphozyten (H9-Zellen), gegeben. Nach einstündiger Inkubierung bei Raumtemperatur wurden 75 ul einer Sondenmischung mit 0,5 M NaCl und einer ³²P-Oligomer-Sonde mit 23 Nukleotiden aus einer HIV-Sequenz, wie in Cell, 401, 10 (1985) beschrieben, hinzugefügt. Eine exemplarische Probe enthielt eine zu den Basen 732-753 komplementäre Sequenz. Nach 16-stündiger Inkubierung bei 45ºC wurde die Probe auf eine Säule mit Sepharose CL4B geladen und mit 1420 ul eines Puffers eluiert, der 10 mM Tris von pH 8,0 enthielt. Die insgesamt 1720 ul des Eluats wurden auf ihre Radioaktivität gezählt. Eine typische negative Kontrolle ergab 82 cpm, während eine typische positive Kontrolle 3000 cpm ergab.

B) Gewebekulturzellen

Alternativ können die Zellen aus der oben beschriebenen Kultur getestet werden. Eine bekannte Zahl Zellen enthaltende Zellpellets wurden durch Zentrifugieren zur Entfernung des Gewebekulturmediums hergestellt. Die Zellen werden in 200 ul Puffer resuspendiert, etwa Salzlösung, und wie die in Beispiel III A beschriebene Probe behandelt. Ein weiterer, in der Wärmedenaturierung der Probe vor der Hybridisierung bestehender Schritt kann einbezogen sein. Die folgende Tabelle erläutert die bei einem typischen Test der Zellen erhaltenen Zellimpulse pro Minute (cpm). Test an Zellen in Kultur Gesamt CPM im Eluat Zellzahl nicht infizierte Zellen mit HIV infizierte Zellen

C) Nukleinsäureextrakte von Gewebekulturzellen

Alternativ kann die Nukleinsäure (DNA und/oder RNA) aus Gewebekulturzellen oder Überstehendem nach dem Fachmann gut bekannten Methoden extrahiert werden, etwa wie von Maniatis et al., oben, beschrieben, und in 200 ul 10 mM Tris-Puffer, pH 8,0, resuspendiert werden. Die Probe wird dann behandelt, wie in Beispiel III B beschrieben. Direkt dem Patienten entnommene Lymphozyten- oder Makrophagenpräparationen können ebenfalls verwandt werden. Die folgende Tabelle erläutert die Zellimpulse pro Minute, die bei einem Test von Gewebekulturzellen extrahierter DNA erhalten wurden. Von Gewebekulturzellen extrahierte DNA Gesamt-CPM im Eluat ug Gesamt-DNA DNA aus nicht infizierten Zellen DNA aus mit HIV infizierten Zellen

Beispiel IV: Hepatitis B-Virus-DNA-Test unter Verwendung einer Biotin-markierten Sonde

Ein Enzym-Antikörper-Konjugat wurde wie folgt hergestellt: Auf Biotion Spezifische Antikörper wurden nach der von Wilson,
Immunofluoresc. Relat. Staining Tech., Proc. Int. Conf., 6. Auflage: Knapp, Holubar, Wick, Elsevier, Amsterdam (1978) beschriebenen Peroxydasemethode mit Meerrettichperoxydase konjugiert. Ein Konjugat mit niedrigem Molekulargewicht (MW 250 000) wurde durch Gelausschlußchromatographie an A-50 M-Agarose hergestellt. 100 ul des von der Säule zurückgehaltenen Konjugats wurden bei 40ºC 12 Minuten mit 100 ng M13 Phagen-DNA mit einem HBV-Insert in 100 ul 10 mM Tris, pH 8,0, zuvor 25 Minuten bei 65ºC mit 5 ng einer biotinyliertes UTP enthaltenden nick-translatierten HBV-spezifischen Sonde, inkubiert. Die negative Kontrolle bestand aus 100 ul 10 mM Tris, pH 8,0, das keine HBV-Sequenzen enthielt und behandelt wurde, wie für die positive Kontrolle beschrieben. Die Proben wurden dann auf eine Säule gegeben, die ein Bettvolumen von 10 ml Agarose A-50 M (kommerziell erhältlich von BioRad) enthielt, und es wurden 100 ul-Fraktionen eluiert. Fraktion 22 wurde gesammelt. 250 ul einer Lösung von OPD (Orthophenylendiamin) in Citrat-Phosphat-Puffer mit Wasserstoffperoxid wurden zugesetzt. Diese Mischung wurde 4 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit 1 ml 1 N H&sub2;SO&sub4; versetzt. Die Absorption einer jeden Probe bei 492 nm wurde abgelesen und ist in der folgenden Tabelle angegeben. Die Ergebnisse können als Verhältnis der Absorption der positiven Kontrolle dividiert durch die negative Kontrolle ausgedrückt werden. Probe Absorption bei 492 nm Verhältnis negative Kontrolle positive Kontrolle

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer biologischen Probe durch

a) Bereitstellen einer biologischen Probe, die eine Ziel- Nucleinsäuresequenz enthalten kann, welche mit einer markierten Nucleinsäuresonde in einem flüssigen Medium hybridisieren kann, wobei diese Sonde von vorbestimmter gewünschter Länge ist;

b) Kombinieren der Probe mit der markierten Nucleinsäuresonde unter Hybridisierungsbedingungen;

c) Abtrennen unhybridisierter Sonde von der hybridisierten Sonde durch Gelausschlußchromatographie; und

d) Nachweis der Gegenwart von markierter hybridisierter Sonde als Maß für die Ziel-Nucleinsäuresequenz in der Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe vor Schritt b) mit einer Proteinase behandelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Proteinase Proteinase K ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe vor Schritt b) durch Alkalibehandlung oder thermische Denaturierung denaturiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Markierung der markierten Sonde aus der aus Radioisotopen, Enzymen, Fluoreszenzerzeugern, chemilumineszenten Molekülen, radiopaken Substanzen, Liposomen sowie Gliedern eines spezifischen Bindungspaars bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

16. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ziel-Nucleinsäuresequenz Desoxyribonucleinsäure oder Ribonucleinsäure ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin eine zweite Trägernucleinsäuresonde, die mit einer Region der Zielnucleinsäuresequenz hybridisiert, welche von der Region verschieden ist, mit der die markierte Nucleinsäuresonde hybridisiert, vor oder während Schritt b) mit der Zielnucleinsäuresequenz kombiniert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die zweite Sonde ein Glied eines spezifischen Bindungspaars enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nucleinsäuresonde DNS oder RNS ist.

10. Verfahren nach Anspruch 7, worin die zweite Sonde DNS oder RNS ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zielnucleinsäuresequenz eine für ein Pathogen charakteristische Sequenz ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Pathogen aus Viren, einer prokaryontischen Zelle oder einer eukaryontischen Zelle ausgewählt ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Virus aus Hepatitis- Viren, HIV, Herpes-Viren, Retroviren des Menschen, Papillom- Viren des Menschen, dem Epstein-Barr-Virus und dem Cytomegalo-Virus ausgewählt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nucleinsäuresequenz zum Nachweis eines Onkogens dient.

15. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nucleinsäuresequenz für einen genetischen Marker oder Defekt kodiert.

16. Zum Nachweis einer Zielnucleinsäuresequenz in einer biologischen Probe geeignetes Kit, welches

a. eine markierte Nucleinsäuresonde von vorbestimmter gewünschter Länge, die mit der Zielnucleinsäuresequenz hybridisieren kann, und

b. eine Gelexklusionschromatographievorrichtung, die zur Abtrennung der mit der markierten Sonde hybridisierten Zielnucleinsäuresequenz von unhybridisierter Sonde geeignet ist, enthält.

17. Kit nach Anspruch 16, worin die Markierung der markierten Nukleinsäuresonde aus Radioisotopen, Enzymen, Fluoreszenzerzeugern, chemilumineszenten Molekülen, radiopaken Substanzen und Gliedern spezifischer Bindungspaaren ausgewählt ist.

18. Kit nach Anspruch 16, welches weiterhin eine Proteinase enthält.

19. Kit nach Anspruch 18, worin die Proteinase Proteinase K ist.

20. Kit nach Anspruch 16, welches weiterhin eine denaturierende Lösung oder einen Elutionspuffer für die Säulenchromatographie enthält.

21. Verfahren zur Herstellung einer einsträngigen markierten Sonde vorbestimmter und gewünschter Länge durch

a. Reinigen eines einsträngigen DNS-Templats mit einer Sequenz, die identisch mit der der Zielnucleinsäuresequenz ist;

b. Anheften einer spezifischen Nucleinsäureprimersequenz an das DNS-Templat;

c. Verlängern der Primersequenz durch Zugabe eines Klenow- Fragments von DNS-Polymerase I und dATP, dCTP, dGTP und entweder dUTP oder dTTP, worin wenigstens eines der Nucleotide markiert ist und eines der Nucleotide in einer zur Terminierung der Primerverlängerung ausgewählten limitierenden Konzentration zugesetzt wird, so daß eine markierte Nucleinsäuresonde erwünschter vorbestimmter Länge erzeugt wird, und

d. Reinigen und Isolieren der markierten Nucleinsäuresonde unter denaturierenden Bedingungen.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die Reinigung und Isolierung durch Chromatographie durchgeführt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin die Chromatographie die Gelausschlußchromatographie einschließt.

24. Verfahren nach Anspruch 21, worin die Markierung aus Radioisotopen, Enzymen, Fluoreszenzerzeugern, chemilumineszierenden Molekülen, radiopaken Substanzen und Gliedern von spezifischen Bindungspaaren ausgewählt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 21, worin das Templat in einen Vektor kloniert wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, worin der Vektor Einzelstrang- Phagen-DNS ist.