DE69527392T2

DE69527392T2 - Nachweis von Nukleinsäure-Amplifikation

Info

Publication number: DE69527392T2
Application number: DE69527392T
Authority: DE
Inventors: James Gregory Nadeau; George Terrance Walker
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-03
Publication date: 2003-03-06
Anticipated expiration: 2015-04-04
Also published as: ATE220724T1; KR0145908B1; EP0678582A1; TW306977B; AU1502395A; DE69527392D1; CA2145576C; ES2177590T3; USRE39885E1; US5547861A; CA2145576A1; AU685903B2; SG34216A1; BR9501582A; EP0678582B1; JPH07289299A; JP2674737B2; US5593867A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis und zur Messung von Amplifikation einer Nukleinsäure-Zielsequenz.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In-vitro-Nukleinsäure-Amplifikationstechniken haben leistungsfähige Werkzeuge zum Nachweis und zur Analyse geringer Nukleinsäuremengen bereitgestellt. Die extreme Empfindlichkeit solcher Verfahren hat zu Versuchen geführt, sie für die Diagnose infektiöser und genetischer Erkrankungen, die Isolation von Genen zwecks Analyse und den Nachweis spezifischer Nukleinsäuren wie in der forensischen Medizin weiterzuentwickeln. Nukleinsäure-Amplifikationstechniken können entsprechend den Temperaturanforderungen des Verfahrens in Gruppen eingeteilt werden. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR; R. K. Saiki et al. 1985, Science 230, 1350-1354), Ligase-Kettenreaktion (LCR; D. Y. Wu et al. 1989, Genomics 4,560-569; K. Barringer et al. 1990, Gene 89, 117-122; F. Barany 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193) und die auf Transkription beruhende Amplifikation (D. Y. Kwoh et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177) erfordern die Durchführung von Temperatur-Zyklen. Dagegen sind Verfahren wie die Strangverdrängungsampliflkation (SDA; G. T. Walker et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 und G. T. Walker et al. 1992, Nuc. Acids Res. 20, 1691-1696), die sich selbsterhaltende Sequenzreplikation (3SR; J. C. Guatelli et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878) und das Qβ-Replikase-System (P. M. Lizardi et al. 1988, BioTechnology 6, 1197-1202) isotherme Reaktionen. Zudem beschreiben die WO 90/10064 und die WO 91/03573 die Verwendung des Replikationsstartpunkts vom Bakteriophagen Phi29 zur isothermen Replikation von Nukleinsäuren.
Es ist auch eine Vielzahl verschiedener Verfahren entwickelt worden, um Nukleinsäureamplifikation nachzuweisen und/oder zu messen. Überwiegend beruhen diese Verfahren auf Primern, was bedeutet, dass sie von der Hybridisierung eines Primers an die Zielsequenz abhängen, in einigen Fällen gefolgt von der Verlängerung des Primers. Der Nachweis amplifizierter Nukleinsäuren auf Primerbasis bei der PCR beruht oft auf dem Einbau eines Amplifikationsprimers in das amplifizierte Produkt (Amplikon) während der Ampliflkationsreaktion. Merkmale, die in den PCR-Amplifikationsprimer eingebaut wurden, erscheinen daher in dem Ampliflkationsprodukt und können entweder dazu verwendet werden, die amplifizierte Zielsequenz zu detektieren, oder dazu, das Amplikon für den Nachweis durch andere Mittel zu immobilisieren. Zum Beispiel berichten Syvanen et al. (1988, Nucleic Acids Res. 16, 11327-11338) von der Verwendung biotinylierter PCR-Amplifikationsprimer zur Erzeugung biotinhaltiger Amplifikationsprodukte. Diese Amplikons können dann an eine zweite Sonde hybridisiert werden, die einen Fluoreszenzfarbstoff oder eine andere Reportergruppe enthält. Der hybridisierte Komplex wird dann durch eine auf Affinität beruhende Immobilisation des biotinhaltigen Komplexes selektiv von anderen Komponenten des Reaktionsgemisches getrennt und wird mittels der Reportergruppe nachgewiesen. Laongiaru et al. (1991, europäische Patentanmeldung Nr. 0 420 260) beschreiben eine ähnliche Verwendung biotinhaltiger PCR-Amplifikationsprimer, die zum Nachweis von PCR- Amplifikationsprodukten an Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert sind. Die Amplikons, welche die Primer enthalten, werden von unverlängerten Primern auf Basis der Größe getrennt, und Multiplex-Amplifikation wurde mittels verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe an zwei Amplifikationsprimer-Sätzen nachgewiesen. Kemp et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2423-2427; 1990, PCT-Patentanmeldung Nr. WO 90/06374) beschreiben ein Verfahren zum Einfang amplifizierter DNS durch Einbau eines modifizierten Amplifikationsprimers und Verwendung eines zweiten modifizierten Amplifikationsprimers als Mittel zum Nachweis. Der Kempsche "Fang-Primer" enthält einen 5'-Schwanz, der die einzelsträngige Form der Erkennungssequenz für das doppelsträngige DNS bindende Protein GCN4 ist. Der Kempsche "Nachweis-Primer" enthält einen Biotin-Anteil an seinem 5'-Ende. Das amplifizierte Produkt wird durch Bindung an die durch Amplifikation mittels des Fang-Primers erzeugte doppelsträngige GCN4-Erkennungssequenz immobilisiert. Der von dem Nachweis-Primer eingeführte Biotin-Anteil wird an einen Avidin-Peroxidase-Komplex gebunden, um einen kolorimetrischen Nachweis des immobilisierten PCR-Amplifikationsprodukts zu ermöglichen. Wahlberg et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6569-6573) berichten von einem ähnlichen Verfahren, bei dem ein PCR-Ampliflkationsprimer biotinyliert ist und der andere einen 5'-Schwanz enthält, der die E.-coli-lac-Operator-Sequenz codiert. Doppelsträngige Amplifikationsprodukte werden durch Bindung an Streptavidin immobilisiert und kolorimetrisch durch Bindung eines lac-Repressor-β-Galactosidase-Fusionsproteins an den durch Amplifikation erzeugten doppelsträngigen lac-Operator nachgewiesen. Das Verfahren von Wahlberg et al. unterscheidet sich von dem Verfahren von Kemp et al. darin, dass statt des doppelsträngigen Bindungsproteins die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung die Immobilisation des Amplifikationsprodukts gewährleistet und das doppelsträngige Bindungsprotein den kolorimetrischen Nachweis ermöglicht. Dies legt nahe, dass die beiden Verfahren kombiniert werden könnten, indem zwei Amplifikationsprimer verwendet werden, jeder mit einem 5'-Schwanz, der die Erkennungssequenz für ein anderes doppelsträngiges Bindungsprotein codiert. Amplifizierte Produkte könnten dann durch Bindung an ein doppelsträngiges Bindungsprotein immobilisiert und durch Bindung an das andere detektiert werden. C. A. Vary (1992, Clinical Chemistry 38, 687-694; 1992, PCT-Patentanmeldung Nr. WO 92/11390) beschreibt die Verwendung von Amplifikationsprimern, die 5'-Schwänze enthalten, welche Hybridisierungsstellen für ein drittes Oligonukleotid bilden, wenn sie in ansonsten doppelsträngige Amplikons eingebaut sind. Die Hybridisierung des einen Schwanzes wurde verwendet, um das amplifizierte Produkt einzufangen, und der andere wurde verwendet, um es durch Hybridisierung an eine mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugierte Sonde nachzuweisen.
Sämtliche dieser auf Primern beruhenden Verfahren zum Nachweis von PCR- Amplifikationsprodukten erfordern zwei Amplifikationsreaktionen zur Erzielung einer hohen Empfindlichkeit, d. h. Nachweis von weniger als 100 Kopien der Zielsequenz. Das heißt, auf eine erste Amplifikation der Zielsequenz folgt eine zweite Amplifikation unter Verwendung geschachtelter Primer, welche die gewünschten Modifikationen zum Einfang und/oder zur Detektion enthalten. Zwei aufeinanderfolgende Amplifikationen dieser Art sind notwendig, um unakzeptabel hohe Hintergrundsignalpegel zu vermeiden, die durch Amplifikation von Nicht-Ziel-DNS entstehen, welche unerwünschterweise mit den modifizierten, signalerzeugenden Primern geprimet wurde. Dieses Merkmal der dem Stand der Technik entsprechenden Verfahren macht sie zeitraubend und mühsam, und die Vorteile der auf Primern beruhenden Nachweisverfahren werden daher oft durch die Notwendigkeit einer zweiten nachfolgenden Amplifikationsreaktion aufgewogen.
Man würde erwarten, dass nichtspezifische Amplifikation von DNS ein besonderes Problem für den auf Primern beruhenden Nachweis von Amplifikationsprodukten bei SDA-Reaktionen darstellt, da diese Amplifikationen bei relativ niedriger Temperatur (etwa 37º-40ºC) durchgeführt werden, die ein im Vergleich zur PCR erhöhtes fehlerhaftes Priming ermöglicht, was zu noch höheren Hintergrundsignalpegeln führt. Unerwarteterweise führten die vorliegenden Verfahren zum Nachweis von SDA auf Primerbasis trotz der Verwendung von nur einer einzigen Amplifikationsreaktion, die gleichzeitig mit der Amplifikation der Zielsequenz Produkte zur Detektion erzeugt, zu niedrigen Hintergrundsignalpegeln. Die simultane oder gleichzeitige Erzeugung eines sekundären Amplifikationsproduktes und der amplifizierten Zielsequenz wird hier als Echtzeit-Primerverlängerung, Echtzeit-Detektion von Amplifikation etc. bezeichnet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird in den beigefügten Ansprüchen definiert und stellt Verfahren zur gleichzeitigen Erzeugung eines sekundären Amplifikationsproduktes und eines Amplifikationsproduktes in einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion auf Primerbasis bereit. Die Primer-Verlängerungsprodukte sind sekundäre, zielspezifische DNS-Produkte, die während der SDA der Zielsequenz erzeugt werden, und können daher zum Nachweis und/oder zur Messung von Zielsequenz-Amplifikation verwendet werden. Die sekundären Produkte sind jedoch nicht amplifizierbar und bleiben bei der SDA-Reaktion inert, nachdem sie ohne Beeinträchtigung der exponentiellen Amplifikation der Zielsequenz gebildet worden sind. Das sekundäre Produkt kann so gestaltet oder modifiziert sein, dass es spezielle Merkmale enthält, die seine Detektion, Immobilisation (Einfang) oder Lokalisierung erleichtern. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind zur Echtzeit-Verfolgung von SDA-Reaktionen einsetzbar, insbesondere in Situationen, wo der Nachweis von Zielsequenz-Amplikons eine weitere Amplifikation oder Manipulation beeinträchtigen würde. Die vorliegenden Verfahren werden ebenfalls zum Nachweis von Amplifikationsprodukten in fixierten Zellen nach in-situ-SDA brauchbar sein, insbesondere, wenn die sekundären Produkte 5'-Schwanzsequenzen zur Erleichterung der Detektion oder Lokalisierung von Amplifikationsprodukten enthalten:

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1A und Fig. 1B erläutern die Schritte der Verfahren der Erfindung. Fig. 1A erläutert die Erzeugung des sekundären Amplifikationsproduktes anhand einer einzelsträngigen Zielsequenz unter Verwendung zweier Signalprimer. Fig. 1B zeigt den entsprechenden Prozess, der von dem komplementären Strang ausgeht, wenn die ursprüngliche Zielsequenz doppelsträngig ist.
Fig. 2 erläutert die Erzeugung des sekundären Produkts mittels eines einzigen Signalprimers.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion, Verfolgung oder Lokalisierung von Amplifikationsprodukten von SDA-Reaktionen durch Echtzeit-Primerverlängerung. Die Amplifikation einer Zielsequenz durch SDA wird nachgewiesen, verfolgt oder lokalisiert, indem gleichzeitig ein sekundäres Amplifikationsprodukt erzeugt wird, dessen Bildung eng mit der Amplifikation der Zielsequenz gekoppelt ist. Dieses sekundäre Ampliflkationsprodukt wird während der SDA-Reaktion erzeugt, ohne dass irgendwelche zusätzlichen Amplifikationsschritte oder Manipulationen erforderlich wären. Sobald es erzeugt worden ist, ist das sekundäre Amplifikationsprodukt in dem Reaktionsgemisch inert und beeinträchtigt oder hemmt nicht die normale SDA der gewünschten Zielsequenz. Die Verfahren sind daher zur Echtzeit-Verfolgung von SDA und Detektion von Amplifikation der Zielsequenz einsetzbar, insbesondere in Situationen, wo der Nachweis der amplifizierten Zielsequenz selbst eine weitere Reaktion oder Manipulation der Amplikons hemmen oder verhindern würde.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von Amplifikation auf Primerbasis bereit, bei dem die Notwendigkeit einer zweiten Ampliflkationsreaktion nicht mehr besteht. Das Verfahren verwendet Signalprimer, die Fang- und Nachweissonden ähneln und nicht als Amplifikationsprimer in der SDA-Reaktion fungieren. Folglich können irgendwelche Verlängerungsprodukte, die durch fehlgehende Verlängerung dieser Signalprimer an Nicht-Ziel-Matrizen gebildet werden, keine anschließende Amplifikation erfahren. Da fehlerhaftes Priming an sich vergleichsweise selten ist, ist es nur nach anschließender Amplifikation der fälschlich geprimeten Sequenz erkennbar. Bei Fehlen einer solchen anschließenden Amplifikation wie bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Signalprimer der Amplifikationsreaktion vor Start der Amplifikation ohne sichtbaren Anstieg der Hintergrundsignalpegel zugesetzt werden. Dies vereinfacht das Nachweisverfahren erheblich und ermöglicht eine homogene Echtzeit-Analyse von SDA- Reaktionen.
Die folgenden Begriffe und Ausdrücke, wie sie hier verwendet werden, sind wie folgt definiert:
Ein Amplifikationsprimer ist ein Primer zur Amplifikation einer Zielsequenz durch Primerverlängerung. Bei der SDA hybridisiert das 3'-Ende des Amplifikationsprimers (die Zielbindungssequenz) an das 3'-Ende der Zielsequenz. Der Amplifikationsprimer enthält eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuklease nahe seinem 5'-Ende. Die Erkennungsstelle ist für eine Restriktions-Endonuklease, die einen Strang eines DNS- Doppelstranges einschneiden wird, wenn die Erkennungsstelle hemimodifiziert ist ("Nicking"), wie von Walker et al. (1992, PNAS, oben) beschrieben. Eine hemimodifizierte Erkennungsstelle ist eine doppelsträngige Erkennungsstelle für eine Restriktions- Endonuklease, bei der ein Strang wenigstens ein derivatisiertes Nukleotid enthält, das bewirkt, dass die Restriktions-Endonuklease den Primerstrang nickt, statt beide Stränge der Erkennungsstelle zu schneiden. Gewöhnlich enthält der Primerstrang der hemimodifizierten Erkennungsstelle keine derivatisierten Nukleotide und wird von der Restriktions- Endonuklease genickt. Alternativ kann der Primer derivatisierte Nukleotide enthalten, die bewirken, dass der unmodifizierte Zielstrang vor dem Schneiden geschützt wird, während der modifizierte Primerstrang genickt wird. Die bevorzugten hemimodifizierten Erkennungsstellen sind hemiphosphorothioatierte Erkennungsstellen für die Restriktions- Endonukleasen HincII, HindII, AvaI, NciI und Fnu4HI. Die Amplifikationsprimer enthalten auch eine 3'-OH-Gruppe, die durch DNS-Polymerase verlängerbar ist, wenn die Zielbindungssequenz des Amplifikationsprimers an die Zielsequenz hybridisiert ist. Beim überwiegenden Teil der SDA-Reaktion ist der Amplifikationsprimer für die exponentielle Amplifikation der Zielsequenz verantwortlich.
Verlängerungsprodukte sind Nukleinsäuren, die einen Primer und einen neu synthetisierten Strang umfassen, der das Komplement der Zielsequenz stromabwärts der Primer- Bindungsstelle darstellt. Verlängerungsprodukte resultieren aus der Hybridisierung eines Primers an eine Zielsequenz und der Verlängerung des Primers durch Polymerase mittels der Zielsequenz als einer Matrize.
Ein Bumper-Primer ist ein Primer, der an eine Zielsequenz stromaufwärts vom Amplifikationsprimer bindet, so dass die Verlängerung des Bumper-Primers den stromabwärtigen Amplifikationsprimer und sein Verlängerungsprodukt verdrängt. Die Verlängerung von Bumper-Primern ist eine Methode zur Verdrängung des Verlängerungsproduktes von Amplifikationsprimern, Erwärmung ist jedoch ebenfalls geeignet.
Identische. Sequenzen werden an die gleiche komplementäre Nukleotidsequenz hybridisieren. Im wesentlichen identische Sequenzen sind ausreichend ähnlich in ihrer Nukleotidsequenz, dass sie ebenfalls an die gleiche teilweise komplementäre Nukleotidsequenz hybridisieren.
Die Begriffe Ziel oder Zielsequenz bezeichnen Nukleinsäuresequenzen, die amplifiziert werden sollen. Diese schließen die ursprüngliche zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz, ihren komplementären zweiten Strang und jeden Strang einer Kopie der ursprünglichen Sequenz ein, der in der Amplifikationsreaktion erzeugt wird. Die Zielsequenz kann auch als Matrize zur Verlängerung hybridisierter Amplifikationsprimer bezeichnet werden.
Ein Signalprimer ist ein Primer, der an eine Zielsequenz stromabwärts eines Amplifikationsprimers hybridisiert, so dass die Verlängerung des Amplifikationsprimers den Signalprimer und sein Verlängerungsprodukt verdrängt. Der Signalprimer umfasst eine 3'- OH-Gruppe, die durch DNS-Polymerase verlängert werden kann, wenn der Signalprimer an die Zielsequenz hybridisiert ist. Der Signalprimer kann unmodifiziert sein, z. B. zur Detektion von sekundären Amplifikationsprodukten auf der Basis ihrer Größe. Alternativ kann der Signalprimer eine Reportergruppe oder Markierung oder ein Strukturmerkmal zur Erleichterung des Nachweises seines Verlängerungsprodukts enthalten.
Amplifikationsprodukte, amplifizierte Produkte oder Amplikons sind Kopien der Zielsequenz, die durch Hybridisierung und Verlängerung eines Amplifikationsprimers erzeugt werden. Dieser Begriff bezeichnet sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukte, die eine Kopie der ursprünglichen Zielsequenz enthalten, einschließlich der Zwischenstufen der Ampliflkationsreaktion.
Sekundäre Amplifikationsprodukte oder sekundäre Produkte sind Kopien der Zielsequenz, die durch Hybridisierung und Verlängerung eines Signalprimers erzeugt werden. Die sekundären Amplifikationsprodukte umfassen ein inneres Segment der amplifizierten Zielsequenz. Diese Begriffe bezeichnen ebenfalls sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Verlängerungsprodukte von Signalprimern, einschließlich der Zwischenstufen in dem Prozess, der die doppelsträngige Endform erzeugt. Im Gegensatz zu Amplifikationsprodukten ist das doppelsträngige sekundäre Amplifikationsprodukt im allgemeinen für eine weitere Amplifikation nicht verfügbar, obwohl einige sekundäre Amplifikationsprodukte linear amplifizierbar sein mögen.
Bei den Verfahren der Erfindung werden Amplifikationsprimer zur SDA an eine Zielsequenz hybridisiert und wird die Zielsequenz gewöhnlich wie von Walker et al. 1993, PNAS oder Walker et al. 1993, Nuc. Acids Res., oben, amplifiziert. Wie in diesen beiden Veröffentlichungen beschrieben, kann die Zielsequenz für die SDA entweder durch Restriktion von Gesamt-DNS mit einer geeigneten Restriktions-Endonuklease (z. B. HincII) oder durch Erzeugung von Ziel-Fragmenten mit den geeigneten Restriktions-Endonuklease- Erkennungsstellen an den Enden mittels Bumper-Primern und Amplifikationsprimern hergestellt werden. Hergestellte Fragmente, welche die Zielsequenz enthalten, können dann wie beschrieben durch SDA amplifiziert werden. Jedoch beinhaltet die SDA-Reaktion der Erfindung außerdem wenigstens einen Signalprimer, der zu einer simultanen oder gleichzeitigen Erzeugung eines sekundären Amplifikationsproduktes zur Verwendung bei der Detektion, Verfolgung oder Lokalisierung von durch die SDA-Reaktion erzeugten Amplifikationsprodukten führt. Die sekundären Amplifikationsprodukte können auch Merkmale enthalten, die ihren Einfang oder ihre Immobilisation erleichtern, so dass sie zur Detektion, Quantifizierung oder weiteren Manipulation isoliert werden können. Die sekundären Amplifikationsprodukte werden bei der SDA-Reaktion durch Beifügen wenigstens eines Signalprimers zum Reaktionsgemisch erzeugt. Für gewisse Anwendungen mag es vorzuziehen sein, ein Signalprimer-Paar beizufügen. Der oder die Signalprimer hybridisieren an die Zielsequenz stromabwärts von der Hybridisierungsstelle der Amplifikationsprimer. Ihre Verlängerung erfolgt durch Polymerase auf gleiche Weise wie die Verlängerung der Amplifikationsprimer. Der Signalprimer hybridisiert so an eine Stelle in der Zielsequenz, dass die Verlängerung des Amplifikationsprimers das Verlängerungsprodukt des Signalprimers verdrängt. Zumindest das 3'-Ende des Signalprimers enthält eine Sequenz, die an die. Zielsequenz hybridisiert. Es kann der gesamte Signalprimer an die Zielsequenz hybridisieren, z. B. wenn er unmodifiziert oder zwecks Detektion durch Hinzufügen einer Reportergruppe, Markierung oder eines Affinitätsliganden chemisch modifiziert ist. Alternativ kann das 5'-Ende des Signalprimers eine Sequenz umfassen, die nicht an die Zielsequenz hybridisiert, die jedoch spezielle Nukleotidsequenzen enthält (oft mit Strukturmerkmalen), welche Detektion oder Einfang des sekundären Amplifikationsproduktes erleichtern. Diese chemischen Modifikationen und speziellen Sequenzen werden in das sekundäre Ampliflkationsprodukt eingebaut, wenn die Signalprimer hybridisiert sind und auf einer Matrize verlängert werden. Beispiele für chemische Modifikationen umfassen Affinitätsliganden (z. B. Avidin, Streptavidin, Biotin, Haptene, Antigene und Antikörper) und Reportergruppen (Markierungen, z. B. Radioisotope, Fluoreszenzfarbstoffe, Enzyme, die unter Erzeugung nachweisbarer Reaktionsprodukte reagieren, und sichtbare Farbstoffe). Beispiele für spezielle Nukleotidsequenzen umfassen (i) Sequenzen, die durch Hybridisierung einer markierten Oligonukleotid-Sonde an das doppelsträngige sekundäre Ampliflkationsprodukt eine Tripelhelix bilden werden, und (ii) Erkennungsstellen für doppelsträngige DNS bindende Proteine, welche die Fähigkeit erlangen, das doppelsträngige DNS bindende Protein zu binden, wenn sie während der Amplifikation doppelsträngig gemacht werden (z. B. Repressoren, regulatorische Proteine, Restriktions-Endonukleasen, RNS-Polymerasen). Nukleotidsequenzen, die zu doppelsträngigen Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstellen führen, sind ein bevorzugtes Merkmal zur Verwendung bei Signalprimern, da die anschließende Restriktion dazu verwendet werden kann, ein sekundäres Ampliflkationsprodukt zu erzeugen, das durch eine charakteristische Größe erkennbar ist.
Wenn die erfindungsgemäßen Verfahren zwei Signalprimer verwenden, die an gegenüberliegende Stränge einer doppelsträngigen Zielsequenz binden, wie in Fig. 1A und 1B dargestellt, kann einer der Signalprimer eine spezielle Nukleotidsequenz oder chemische Modifikation enthalten, um den Einfang oder die Immobilisation des sekundären. Amplifikationsprodukts zu erleichtern, und kann der andere eine nachweisbare Reportergruppe oder Markierung zur Detektion des eingefangenen oder immobilisierten sekundären Amplifikationsproduktes enthalten. Die Verwendung von Markierungen und Reportergruppen zur Detektion von Nukleinsäuren sowie die Verwendung von Liganden, chemischen Modifikationen und Nukleinsäurestrukturmerkmalen zum Einfang oder zur Immobilisation von Nukleinsäuren ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Alternativ kann der Signalprimer unmodifiziert sein, d. h. ohne Reportergruppen, Fang-Gruppen oder Strukturmerkmale zur Erleichterung des Nachweises oder Einfangs des sekundären Amplifikationsproduktes. Die sekundären Amplifikationsprodukte können dann auf Basis ihrer Größe nachgewiesen werden, z. B. durch Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung. Sämtliche dieser Verfahren sind in der vorliegenden Erfindung brauchbar, und der Fachmann kann routinemäßig geeignete Verfahren zur Verwendung in irgendeinem speziellen Amplifikationstestsystem wählen.
Es ist ein wichtiges Merkmal der Erfindung, dass die Signalprimer in der SDA-Reaktion, in der sie verwendet werden, nicht als Amplifikationsprimer fungieren. Ohne durch irgendeinen spezifischen Mechanismus, durch den die erfindungsgemäßen Verfahren funktionieren, gebunden sein zu wollen, glauben die Anmelder, dass es dieses Merkmal ist, das die Zugabe der Signalprimer zum Amplifikationsreaktionsgemisch ermöglicht, ohne dass die von anderen auf Primern basierenden Verfahren erzeugten hohen Hintergrundsignalpegel gefördert werden. Es wird angenommen, dass hohe Pegel an Hintergrundsignal auf nicht-spezifisches Priming und anschließende Amplifikation fälschlich geprimeter Nicht-Ziel-DNS zurückzuführen sind, wenn die Primer imstande sind, als Amplifikationsprimer zu wirken. Die vorliegende Erfindung vereinfacht daher in hohem Maße die Verfahren für Nachweisverfahren auf Primerbasis, die zuvor auf zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationsreaktionen zur Erzielung einer hohen Empfindlichkeit und Spezifität beruhten, wobei die zweite Reaktion mit innerlich geschachtelten signalerzeugenden Amplifikationsprimern durchgeführt wird.
Wie oben erwähnt, können Nukleinsäurefragmente, die geeignete Restriktions-Endonuklease- Erkennungssequenzen an den Enden aufweisen und die Zielsequenz enthalten, entweder wie von Walker et al. 1992, PNAS, oben, beschrieben oder wie von Walker et al. 1992, Nuc. Acids Res., oben, beschrieben zur Amplifikation hergestellt werden. Der Einfachheit halber beginnen die Darstellungen der erfindungsgemäßen Verfahren in Fig. 1A, Fig. 1B und Fig. 2 mit einem die Zielsequenz enthaltenden Nukleinsäurefragment. Wenn es nach Walker et al. 1992, PNAS, oben, hergestellt wurde, dann stellt es restringierte doppelsträngige DNS dar, die denaturiert worden ist. Wenn es nach Walker et al. 1992, Nuc. Acids Res., oben, hergestellt wurde, dann sind dem Fragment entsprechend dem offenbarten Zielerzeugungsschema geeignete Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstellen hinzugefügt worden. Bei dem Zielerzeugungsschema von Walker et al. (1992, Nuc. Acids Res., oben) wird angenommen, dass Bumper-, Amplifikations- und Signalprimer gleichzeitig an eine Zielsequenz hybridisieren können, wobei die Verlängerung jedes stromaufwärtigen Primers das Verlängerungsprodukt des stromabwärtigen Primers verdrängt und gleichzeitig amplifizierbare Zielfragmente und sekundäre Amplifikationsprodukte erzeugt.
Fig. 1A und Fig. 1B erläutern eine Ausführungsform der Erfindung, bei der ein Signalprimer- Paar zur Detektion der Amplifikation einer doppelsträngigen Zielsequenz (5'-A-B-C-D/5'-D'- C'-B'-A') verwendet wird. Fig. 1A erläutert das Verfahren der Erfindung für den ersten der zwei komplementären Stränge der Zielsequenz (5'-D'-C'-B'-A'). Der erhabene Abschnitt der in Fig. 1A, 1B und 2 dargestellten Amplifikationsprimer bezeichnet eine nickbare Restriktions- Endonuklease-Erkennungsstelle, wie sie oben und von Walker et al. (1992, PNAS und Nuc. Acids Res.) beschrieben ist. Lange erhabene Abschnitte stellen vollständige Restriktions- Endonuklease-Erkennungsstellen dar und kurze erhabene Abschnitte stellen Teile von Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstellen dar, die gewöhnlich nach dem Nicking und der Verdrängung eines Strangs entstehen. Die Nukleinsäurefragmente, welche die Zielsequenz enthalten, können entweder durch Endonuklease-Restriktion größerer Nukleinsäuren (Walker et al. 1992, PNAS, oben) oder durch Zielerzeugung wie von Walker et al. (1992, Nuc. Acids Res., oben) beschrieben erzeugt werden. Zum Zwecke der Erläuterung und zur Vereinfachung der Diagramme beginnen jedoch Fig. 1A, 1B und 2 mit der Zielsequenz, die auf einem Nukleinsäurefragment enthalten ist, das zuvor mit einer Restriktions-Endonuklease restringiert wurde, welche die Zielsequenz nicht schneidet.
In Fig. 1A wird der Signalprimer R-B dem SDA-Reaktionsgemisch beigefügt und hybridisiert an die Zielsequenz stromabwärts eines ersten Amplifikationsprimers durch Hybridisierung des B-Teils des Signalprimers an B'. Der R-Teil der R-B-Signalprimer-Sequenz enthält eine Reportergruppe oder Markierung oder ist ein Strukturmerkmal zur Erleichterung der Detektion oder des Einfangs. R mag hybridisieren oder auch nicht, wie dies oben erörtert wurde, ist jedoch hier als nicht-hybridisierend dargestellt, um die unterschiedlichen funktionellen Merkmale des Signalprimers zu verdeutlichen. Zum Zwecke dieser Erläuterung wird R eine Reportergruppe enthalten, kann jedoch andere chemische Modifikationen oder Strukturmerkmale, wie sie oben erörtert wurden, enthalten. Sowohl der Amplifikationsprimer A als auch der Signalprimer R-B werden durch DNS-Polymerase mittels der Zielsequenz als Matrize verlängert. Das Signalprimer-Verlängerungsprodukt R-B-C-D (Struktur #1) wird durch Verlängerung des Amplifikationsprimers A von der Matrize verdrängt und dient wiederum als Matrize zur Hybridisierung und Verlängerung eines zweiten Signalprimers Q'- C' und eines zweiten Amplifikationsprimers D'. Der C'-Teil der Q'-C'-Sequenz hybridisiert an C. Der Q'-Teil des zweiten Signalprimers ist analog zu R, und zum Zwecke dieser Erläuterung wird Q' eine Modifikation oder Sequenz zur Erleichterung des Einfangs des sekundären Amplifikationsproduktes enthalten. Das Q'-C'-Verlängerungsprodukt wird durch Verlängerung des zweiten Amplifikationsprimers verdrängt. Das verdrängte Q'-C'- Verlängerungsprodukt (Struktur #2) dient dann als eine Matrize zur Hybridisierung und Verlängerung von R-B, was zu einem doppelsträngigen, zielspezifischen sekundären Amplifikationsprodukt (Struktur #3) führt, welches die Endsegmente (R und Q') der Signalprimer und das innere Segment B'-C' der Zielsequenz umfasst. Da das sekundäre Ampliflkationsprodukt keine nickbaren Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstellen enthält, ist es in der SDA-Reaktion nicht amplifizierbar und bleibt während der übrigen Amplifikationsreaktion tatsächlich inert, anhand der Zielsequenz werden jedoch zusätzliche Kopien des sekundären Amplifikationsproduktes erzeugt.
Hybridisierung und Verlängerung des zweiten Amplifikationsprimers (D') erzeugt abgesehen von der Verdrängung des R'-B'-C'-Q'-Verlängerungsproduktes ein doppelsträngiges Fragment mit der R/R'-Sequenz an einem Ende und einer hemimodifizierten Endonuklease- Erkennungsstelle an dem anderen Ende (Struktur #4). Diese Restriktions-Endonuklease- Erkennungsstelle ist mit der in der SDA-Reaktion anwesenden Restriktions-Endonuklease nickbar. Die in der SDA-Reaktion anwesende DNS-Polymerase kann dann an dem Nick Polymerisation und Verdrängung initiieren, was zum dargestellten R'-B'-C'-D'-Produkt führt, welches einen Teil der Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstelle enthält. Dieses Produkt kann durch Hybridisierung und Verlängerung von R-B doppelsträngig gemacht werden (Struktur #5). Trotz zyklischer Wiederholung amplifiziert der Nick-, Polymerisations- und Verdrängungszyklus dieses Fragment mit linearer Geschwindigkeit, und aufgrund des Fehlens des Q/Q'-Teils, der die Modifikation oder Sequenz zur Erleichterung des Einfangs enthält, wird gewöhnlich weder das einzelsträngige noch das doppelsträngige Produkt nachweisbar sein. Wenn die Funktionen von Q/Q' und R/R' umgekehrt sind (d. h. Q/Q' die Reportergruppe oder Markierung enthält und R/R' die Modifikation oder Sequenz zur Erleichterung des Einfangs enthält), würden diese Produkte, obwohl gefangen, aufgrund des Fehlens der Reportergruppe oder Markierung nicht nachweisbar sein. Es versteht sich jedoch, dass Struktur #5 nachweisbar sein kann, wenn die Reportergruppe unabhängig vom Einfang nachweisbar ist, z. B., wenn die Reportergruppe eine Fluoreszenzmarkierung, die durch Anisotropie oder Fluoreszenzpolarisation (WO 92/18650; R. Devlin et al. 1993, Clin. Chem. 39, 1939-1943) detektierbar ist, oder ein Radioisotop ist, das durch Gelelektrophorese und Autoradiographie nachgewiesen werden kann.
Fig. 1A zeigt auch, wie die Verlängerung des ersten Amplifikationsprimers an der Zielsequenz neben der Verdrängung des Verlängerungsproduktes von R-B die doppelsträngige Zielsequenz mit der hemimodifizierten, nickbaren Restriktions- Endonuklease-Erkennungsstelle erzeugt, die zur Amplifikation der Zielsequenz durch SDA erforderlich ist (Struktur #6). Diese Reaktionsprodukte treten in die herkömmliche SDA- Reaktion ein und werden amplifiziert. Die Bildung des sekundären Amplifikationsproduktes ist daher eng mit der Amplifikation der Zielsequenz gekoppelt und kann zur Kontrolle, ob eine Amplifikation erfolgt ist oder nicht, sowie als Maß der Zielamplifikation dienen. Trotz der engen Verbindung zwischen der Erzeugung des sekundären Amplifikationsproduktes und der Erzeugung von Amplifikationsprodukten wird jedoch die Amplifikation der Zielsequenz nicht gehemmt, sofern wesentliche Reaktionskomponenten im Überschuss vorhanden sind. Zudem können amplifizierte Zielsequenzen ebenfalls Signalprimer binden, was zur Erzeugung zusätzlicher Kopien des sekundären Amplifikationsproduktes führt.
Fig. 1B erläutert die Erzeugung sekundärer Amplifikationsprodukte anhand des komplementären zweiten Stranges der doppelsträngigen Zielsequenz (5'-A-B-C-D). Im allgemeinen entsprechen die Reaktionsschritte für den komplementären zweiten Strang denen für den ersten Strang. Jedoch hybridisieren zunächst der zweite Amplifikationsprimer (D') und der Signalprimer C'-Q' an den komplementären Strang und werden verlängert. Dann hybridisieren der erste Amplifikationsprimer (A) und der Signalprimer R-B an das verdrängte Verlängerungsprodukt von C'-Q'(A'-B'-C'-Q', Struktur #7) und werden verlängert, um R-B-C- Q (Struktur #8) zu erzeugen. Die Hybridisierung von Q'-C' an R-B-C-Q und die Verlängerung führen zum doppelsträngigen sekundären Amplifikationsprodukt R'-B'-C'-Q'/R-B-C-Q (Struktur #9). Dieses sekundäre Amplifikationsprodukt ist in Systemen nachweisbar, die sowohl Fang- als auch Reportergruppen erfordern, und zwar aufgrund des Vorhandenseins beider Merkmale in Struktur #9. Die Reaktion für den komplementären Strang erzeugt außerdem ein Reaktionsprodukt, das durch Nicking, Polymerisation und Verdrängung linear amplifiziert werden kann (Struktur #10). Der verdrängte Einzelstrang dieser linearen Amplifikation wird durch Hybridisierung und Verlängerung von Q'-C' doppelsträngig (Struktur #11). Gewöhnlich sind aufgrund des Fehlens entweder der Reportergruppe oder der Fanggruppe weder die einzelsträngigen noch die doppelsträngigen Reaktionsprodukte dieser linearen Amplifikation nachweisbar. Sie sind nicht weiter amplifizierbar, da ihnen eine intakte Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstelle fehlt. Wenn Q jedoch eine Reportergruppe enthält, die unabhängig vom Einfang nachweisbar ist (z. B. eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Radioisotop, wie oben beschrieben), dann werden die Strukturen #10 und #11 ebenfalls nachweisbar sein.
Die Nachweisspezifität wird gewöhnlich verbessert sein, wenn wie in Fig. 1A und Fig. 1B zwei Signalprimer verwendet werden, es kann jedoch auch ein einziger Signalprimer Verwendung finden. Dieses Verfahren ist in Fig. 2 dargestellt. In diesem Fall kann der Signalprimer entweder eine Fanggruppe oder eine Reportergruppe enthalten, und die Zielsequenz selbst oder ein Amplifikationsprimer kann wahlweise eine zweite Fang- oder Reportergruppe bereitstellen. Alternativ kann, wenn sowohl eine Fang- als auch eine Reportergruppe erforderlich sind, der Signalprimer sowohl eine Fang- als auch eine Reportergruppe enthalten, die nur dann in Verbindung wirken, wenn das Signaloligonukleotid doppelsträngig wird. Diese Struktur wird nur gebildet, wenn die Anwesenheit von Zielsequenzen Priming, Verlängerung, Verdrängung und erneutes Priming induziert, wie in Fig. 2 dargestellt. Solche bifunktionellen Signalprimer können auch die Grundlage für eine Vielzahl verschiedener homogener Nachweisverfahren wie Fluoreszenzanisotropie oder Fluoreszenz-Energietransfer bilden.
Um sekundäre Amplifikationsprodukte mittels eines einzigen Signalprimers gemäß Fig. 2 zu erzeugen, werden ein erster Amplifikationsprimer (A) und der Signalprimer R-B an eine einzelsträngige Zielsequenz A'-B'-C'-D' hybridisiert. Beide Primer werden verlängert, und die Verlängerung des ersten Amplifikationsprimers verdrängt das Verlängerungsprodukt des Signalprimers R-B (R-B-C-D), wodurch Struktur #1 entsteht. Da es keinen zweiten Signalprimer gibt, hybridisiert nur der zweite Amplifikationsprimer (D') an R-B-C-D und wird verlängert, wodurch Struktur #2 mit einer einschneidbaren ("nickbaren"), hemimodifizierten Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstelle entsteht. Die lineare Amplifikation dieses Produkts durch Nicking, Polymerisation und Verdrängung erzeugt, wie dargestellt, Fragmente, woran der Signalprimer hybridisieren und verlängert werden kann. Dies erzeugt das doppelsträngige sekundäre Amplifikationsprodukt, Struktur #3. Es ist aufgrund des Fehlens einer intakten Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstelle nicht amplifizierbar, ist jedoch mittels R/R' detektierbar, wenn die Reporter- oder Fanggruppe nur in der doppelsträngigen Form nachweisbar ist, oder durch R, wenn die Reportergruppe allein nachweisbar ist. Wenn die Detektion der Reportergruppe keine Doppelsträngigkeit erfordert (z. B. eine Fluoreszenzmarkierung) dann sind die Strukturen #1, #2 und #3 als sekundäre Amplifikationsprodukte nachweisbar.

BEISPIEL 1

Die Echtzeit-Detektion von Amplifikation der vorliegenden Erfindung wurde mit herkömmlicher, nach der Amplifikation erfolgender Detektion amplifizierter Zielsequenzen verglichen. Fragmente der IS6110-Sequenz von Mycobacterium tuberculosis (M.tb) wurden in SDA-Reaktionen amplifiziert, die im wesentlichen wie von Walker et al. (1992, Nuc. Acids Res.) beschrieben durchgeführt wurden, mit der Ausnahme, dass jedes 60-ul-Reaktionsgemisch 0,2 ug humane Plazenta-DNS und verschiedene Mengen genomischer M.tb- DNS enthielt. Amplifikationsprimer-Sequenzen (S&sub1; und S&sub2;) und Bumper-Primer-Sequenzen (B&sub1; und B&sub2;) waren ebenfalls wie in Walker et al. (1992, Nuc. Acids Res.). Für die. Signalprimer einbauenden Amplifikationsreaktionen wurde der Reaktion vor der Amplifikation der ³²P-markierte Signalprimer ³²P-CGTTATCCACCATAC (SEQ ID Nr. 1) mit einer Endkonzentration von 60 nM zugesetzt. Vorausgesagte sekundäre Amplifikationsprodukte, die in diesen Reaktionen erzeugt wurden, waren 35 und 56 Nukleotide lang. Für die nach der Amplifikation erfolgende Detektion amplifizierter Zielsequenzen wurde ein Zehntel des Reaktionsgemisches zur Detektion von Amplifikationsprodukten durch Primerverlängerung von SEQ ID Nr. 1 wie von Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res., oben) beschrieben verwendet, was Verlängerungsprodukte von entweder 35 oder 56 Nukleotiden Länge erzeugte.
Die Amplifikation wurde 2 h bei 37ºC in Gegenwart von 1 bis 500.000 Genomkopien von M.tb fortgeführt. Nach Beendigung der Amplifikation wurde ein Zehntel jeder Reaktion einer Elektrophorese auf denaturierenden Polyacrylamidgelen unterzogen. Eine so geringe Menge wie eine Kopie genomischer M.tb-DNS wurde mittels des erfindungsgemäßen Signalprimers nachgewiesen. Zudem nahm die Signalstärke mit sinkenden Zielpegeln ab, was zeigt, dass die Pegel sekundärer Amplifikationsprodukte den Amplifikationsgrad der Zielsequenz wiederspiegeln. Die Echtzeit-Verlängerung des Signalprimers schien auf dem Gel um ein Mehrfaches weniger empfindlich zu sein als das herkömmliche Primer-Verlängerungsverfahren nach der Amplifikation, möglicherweise weil der ³²P-markierte Signalprimer während der SDA in Konzentrationen vorlag, die etwa 10fach geringer waren als die der SDA-Primer. Wenn SDA-Primer auf der Zielsequenz verlängert werden, bevor ein Signalprimer bindet und verlängert wird, wird es zu keinem Signal kommen. Folglich sollten höhere Konzentrationen an Signalprimern die Empfindlichkeit des Verfahrens erhöhen, indem sie die Hybridisierungskinetik für die Signalprimer verbessern. Höhere Signalprimer- Konzentrationen werden daher bevorzugt, wenn Reaktionsprodukte zur Detektion abgetrennt werden, die Konzentration an Amplifikationsprimern kann aber mit den bei herkömmlicher SDA verwendeten Konzentrationen gleich gehalten werden. Jedoch werden geringere Signalprimer-Konzentrationen bevorzugt, um bei homogenen Nachweisverfahren wie Fluoreszenzanisotropie den Hintergrund gering zu halten. Die geringeren Konzentrationen an Signalprimer werden vorzugsweise bei geringeren Konzentrationen an Polymerase verwendet, und der Amplifikationsprimer, der stromaufwärts von dem Signalprimer hybridisiert, ist dann der bei herkömmlicher SDA übliche. Dieser Versuch zeigte außerdem, dass die Anwesenheit des Signalprimers in dem Amplifikationsreaktionsgemisch nicht zu signifikanten Pegeln an Hintergrundsignal führt. Tatsächlich schienen Hintergrundsignalpegel in Proben, die durch Echtzeit-Signalprimer-Verlängerung detektiert wurden, verglichen mit nach der Amplifikation erfolgender Primerverlängerung geringer zu sein.

BEISPIEL 2

SDA-Reaktionen wurden allgemein wie zuvor beschrieben (Walker, 1993, PCR-Methods and Applications 3, 1) in 50 mM KiPO&sub4; (pH 7,5), 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,5 mM dUTP, jeweils 0,2 mM dGTP, dCTP und dATPαS, 7 mM MgCl&sub2;, 1,1% (v/v) Glycerol, den angegebenen Konzentrationen an Amplifikationsprimern, 25 nM Bumper-Primern, 50 ng humaner Plazenta-DNS, der angegebenen Menge an exonukleasefreiem Klenow-Fragment (United States Biochemicals), 150 Einheiten HincII(New England Biolabs) durchgeführt. Die Reaktionen wurden für die angegebene Zeit bei 41ºC durchgeführt. SDA-Reaktionen enthielten verschiedene Mengen an M.tb-DNS, welche die IS6110-Zielsequenz für die Amplifikation enthält. Die verwendete S&sub1;-Amplifikationsprimer-Sequenz, B&sub1;-Bumper-Primer- Sequenz und B&sub2;-Bumper-Primer-Sequenz waren wie von Walker et al. (1992, Nuc. Acids Res., oben) beschrieben. Der S&sub2;-Amplifikationsprimer (SEQ ID NR. 2) besaß die von diesen Autoren offenbarte Zielbindungssequenz und HincII-Stelle, enthielt jedoch eine andere Sequenz am 5'-Ende. Die Amplifikationsprimer hybridisieren an die Nukleotidpositionen 972- 984 und 1011-1023 der IS6110-Sequenz. Die Bumper-Primer hybridisieren an die Nukleotidpositionen 954-966 und 1032-1044. Sekundäre Amplifikationsprodukte wurden durch Autoradiographie nach Elektrophorese auf denaturierenden Polyacrylamidgelen sichtbar gemacht.
SDA-Reaktionen wurden 3 h in Gegenwart von 0,1 nM eines 5'-³²P-markierten Signalprimers (SEQ ID NR. 3) durchgeführt. Dieser Signalprimer ist 28 Nukleotide lang und hybridisiert an die Nukleotidpositionen 985-1012 der IS6110-Zielsequenz, zwischen den Amplifikationsprimern. S&sub1; und S&sub2; waren mit 180 bzw. 30 nM vorhanden. Exonukleasefreies Klenow-Fragment wurde mit 0,25 Einheiten verwendet. Proben 1-4 enthielten jeweils 100, 10, 1 und 0 M.tb-Genommoleküle. Während der SDA-Reaktion wird SEQ ID NR. 3 durch Polymerase bis zu einer Länge von 44 Nukleotiden verlängert, wobei die Zielsequenz als eine Matrize dient. Wie oben erörtert, ist diese Matrize höchstwahrscheinlich vorwiegend der während der SDA erzeugte verdrängte, amplifizierte Zielstrang, gleichzeitige Verlängerung der Bumper-, Amplifikations- und Signalprimer an der ursprünglichen Zielsequenz ist jedoch nicht ausgeschlossen und wäre ebenfalls zu erwarten. Das 44-mer wird von der Zielsequenz durch Verlängerung des stromaufwärtigen Amplifikationsprimers (S&sub2;) verdrängt. Das 3'-Ende des 44-mers hybridisiert an das 3'-Ende des zweiten Amplifikationsprimers (S&sub1;), und es wird nach Verlängerung durch Polymerase ein doppelsträngiges 65-mer gebildet. Die 44-meren und 65-meren sekundären Amplifikationsprodukte wurden nur in Gegenwart der M.tb- Zielsequenz (Proben 1-3) beobachtet, was eine Signalprimer-Verlängerung und Umwandlung in die doppelsträngige Form anzeigt.
Die vorhergehenden SDA-Reaktionen wurden in Gegenwart von 0,1 nM (Proben 1-3) oder 1 nM (Proben 4-6) eines 5'-³²P-Signalprimers wiederholt, der 15 Nukleotide lang war (SEQ ID NR. 4). Dieser Signalprimer hybridisiert an die Nukleotidpositionen 999-1013 der IS6110- Zielsquenz, zwischen den Amplifikationsprimern. S&sub1; und S&sub2; wurden mit 500 nM verwendet. Es wurden zwei Einheiten exonukleasefreies Klenow-Fragment verwendet, und es wurde 2 h eine SDA durchgeführt. Die drei Nukleotide am 5'-Ende von SEQ ID NR. 4 und die drei Nukleotide am 3'-Ende von SEQ ID NR. 2 (dem S&sub2;-Amplifikationsprimer) sind identisch und konkurrieren daher um dieselbe Bindungsstelle von IS6110. Proben 1 und 4 enthielten 10000 M.tb-Genommoleküle, während Proben 2 und 5 100 Genommoleküle enthielten. Proben 3 und 6 enthielten keine M.tb-DNS.
Während der SDA-Reaktion werden 45-mere und 66-mere sekundäre Produkte erzeugt, wenn die Zielsequenz amplifiziert wird. Sie wurden nur in Gegenwart von M.tb-DNS beobachtet, was eine Verlängerung des Signalprimers und eine Umwandlung in die doppelsträngige Form anzeigt (Proben 1, 2, 4 und 5). Bei Fehlen von M.tb-DNS (Proben 3 und 6) waren keine radiomarkierten Produkte zu entdecken. Eine empfindlichere Detektion im Vergleich zu 0,1 nM wurde erzielt, wenn eine Konzentration von 1 nM Signalprimer (Proben 4-6) verwendet wurde, was höchstwahrscheinlich auf eine günstigere Hybridisierungskinetik für den Signalprimer und eine verbesserte thermodynamische Stabilität des Signalprimer/Zielsequenz-Hybrids während der SDA zurückzuführen ist.
Die SDA wurde in Gegenwart von 0,1 nM eines 5'-³²P-markierten Signalprimers, der 42 Nukleotide lang war (SEQ ID NR. 5), wiederholt. Die 26 Nukleotide am 3'-Ende des Signalprimers (die Zielbindungssequenz) hybridisieren an die IS6110-Zielsequenz an den Nukleotidpositionen 985-1010, zwischen den Amplifikationsprimern. 5' zur Zielbindungssequenz befindet sich eine Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuklease HincII. S&sub1; und S&sub2; waren mit 180 bzw. 30 nM vorhanden. Exonukleasefreies Klenow-Fragment wurde mit 0,25 Einheiten verwendet, und es wurde 3 h eine SDA durchgeführt. Proben 1-4 enthielten 100, 10, 1 und 0 M.tb-Genommoleküle.
Während der SDA-Reaktion wird der Signalprimer durch die Polymerase bis zu einer Länge von 58 Nukleotiden verlängert. Dieses 58-mer wird durch Verlängerung des stromaufwärtigen Amplifikationsprimers (SEQ ID NR. 2) verdrängt. Das 3'-Ende des 58-mers hybridisiert an das 3'-Ende des anderen Amplifikationsprimers (S&sub1;), wobei nach Verlängerung durch Polymerase ein doppelsträngiges 79-mer gebildet wird. Die HincII-Erkennungsstelle am 5'- Ende des Signalprimers wird nach Bildung des doppelsträngigen 79-mers für HincII schneidbar. Das heißt, bei dem doppelsträngigen 79-mer sind sowohl der Strang, der den ursprünglichen Signalprimer enthält, als auch der Strang, der durch Polymeraseverlängerung unter Verwendung von dGTP, dCTP, TTP und dATPαS gebildet wurde, schneidbar. HincII schneidet nicht den Signalprimer in seiner ursprünglichen einzelsträngigen Form. Das Schneiden des doppelsträngigen 79-mers während der SDA-Reaktion erzeugt ein 5'-³²P- markiertes 13-mer, das als sekundäres Amplifikationsprodukt nachweisbar ist.
58-mere und 79-mere sekundäre Primerverlängerungs-Amplifikationsprodukte und das 13- mere sekundäre Amplifikations-Spaltprodukt wurden nur in Gegenwart von M.tb-Ziel-DNS (Proben 1-3) beobachtet, was eine Verlängerung des Signalprimers und Umwandlung in die doppelsträngige Form anzeigt. Bei Fehlen von M.tb-DNS wurden keine sekundären Amplifikationsprodukte (Verlängerungsprodukte oder Spaltprodukte) beobachtet.
Die SDA wurde in Gegenwart von 0,1 nM eines 5'-³²P-markierten Signalprimers, der 33 Nukleotide lang war (SEQ ID NR. 6), wiederholt. Die 26 Nukleotide am 3'-Ende des Signalprimers (die Zielbindungssequenz) hybridisieren an die IS6110-Zielsequenz an den Nukleotidpositionen 985-1010, zwischen den Amplifikationsprimern. 5' zur Zielbindungssequenz befindet sich eine Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuklease EcoRI. S&sub1; und S&sub2; waren mit 180 bzw. 30 nM vorhanden. Exonukleasefreies Klenow-Fragment wurde mit 0,25 Einheiten verwendet. Es wurde 3 h eine SDA durchgeführt. Proben 1-4 enthielten 100, 10, 1 und 0 M.tb-Genommoleküle. Nach der SDA wurden jeder SDA- Reaktion 20 Einheiten EcoRI zugesetzt, und die Proben wurden 30 min bei 37ºC inkubiert.
Während der SDA-Reaktion wird der Signalprimer durch die Polymerase bis zu einer Länge von 49 Nukleotiden verlängert. Dieses 49-mer wird durch Verlängerung des stromaufwärtigen Amplifikationsprimers (SEQ ID NR. 2) verdrängt. Das 3'-Ende des 49-mers hybridisiert an das 3'-Ende des anderen Amplifikationsprimers (S&sub1;), wobei nach Verlängerung durch Polymerase ein doppelsträngiges 70-mer gebildet wird. Die EcoRI-Erkennungsstelle am 5'- Ende des Signalprimers wird nach Bildung des 70-mers und Zusatz von EcoRI für EcoRI schneidbar. Das Schneiden des doppelsträngigen 70-mers mit EcoRI erzeugt ein Spaltprodukt, das ein 5'-³²P-markiertes Dinukleotid ist. Dieses Dinukleotid ist durch Autoradiographie als sekundäres Amplifikationsprodukt nachweisbar.
49-mere und 70-mere Verlängerungsprodukte und das ein Dinukleotid darstellende sekundäre Amplifikations-Spaltprodukt wurden nur in Gegenwart von M.tb-Ziel-DNS (Proben 1-3) beobachtet, was eine Verlängerung des Signalprimers und Umwandlung in die doppelsträngige Form anzeigt. Bei Fehlen von M.tb-DNS wurden keine sekundären Amplifikationsprodukte (Verlängerungsprodukte oder Spaltprodukte) beobachtet.
Das ³²P-Dinukleotid-Spaltprodukt wurde alternativ durch Flüssigszintillationszählung detektiert. Die SDA wurde in Gegenwart von 0,5 nM 5'-³²P-markiertem SEQ ID NR. 6- Signalprimer wiederholt. Vor seiner Verwendung in der SDA wurde der ³²P-markierte Signalprimer durch denaturierende Gelelektrophorese vom in der Kinase-Markierungsreaktion verwendeten γ-³²P-ATP gereinigt. S&sub1; und S&sub2; waren mit 180 bzw. 30 nM vorhanden. Exonukleasefreies Klenow-Fragment wurde mit 0,25 Einheiten verwendet. Es wurde 3 h eine SDA durchgeführt. Proben 1-7 enthielten 10&sup5;, 10&sup4;, 10³, 10², 10, 1 und 0 M.tb- Genommoleküle. Nach der SDA wurden jeder SDA-Reaktion 40 Einheiten EcoRI zugesetzt, und die Proben wurden 30 min bei 37ºC inkubiert.
Ein 12,5-ul-Aliquot aus jeder 50-ul-SDA-Reaktion wurde in 20 mM TRIS-HCL (pH 7,4), 50 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2; auf 75 ul verdünnt. Jede dieser Proben wurde dann unter Verwendung eines MICROCON-10-Mikrokonzentrators (Amicon, Beverly, MA) filtriert, und es wurde durch Flüssigszintillationszählung in dem Filtrat und auf dem Filter ³²P-Aktivität detektiert. Die Ergebnisse sind unten dargestellt:
Das durch EcoRI-Spaltung des doppelsträngigen 70-meren Verlängerungsprodukts freigesetzte ³²P-Dinukleotid ist klein genug, dass es durch den MICROCON-10-Filter gelangt, während der größere ursprüngliche ³²P-markierte 33-mere Signalprimer und das ³²P-markierte 49-mere Verlängerungsprodukt auf dem Filter zurückgehalten werden. Mittels dieses Filtrationsverfahrens konnte die IS6110-Zielsequenz in einer Probe nachgewiesen werden, die vor der SDA nur 10 M.tb-Genome enthielt.

BEISPIEL 3

Zwei Signalprimer, ein modifizierter, um den Einfang zu erleichtern, und ein modifizierter, um die Detektion zu erleichtern, wurden verwendet, um sekundäre Amplifikationsprodukte in einer SDA-Reaktion zu erzeugen. In diesem Versuch wies ein Signalprimer einen Affinitätsliganden (Q', drei Biotinanteile) auf, der an seinem 5'-Ende befestigt war, und der zweite Signalprimer war mit einer Reportergruppe (R, einer ³²P-haltigen Phosphatgruppe) 5'- endmarkiert. Auf diese Weise konnten doppelsträngige sekundäre Amplifikationsprodukte, die sowohl die Reportergruppe als auch den Affinitätsliganden enthielten (wie Struktur #3 und Struktur #9 von Fig. 1A und Fig. 1B) eingefangen und detektiert werden. In diesem Beispiel wurden mit Streptavidin beschichtete magnetische Kügelchen verwendet, um die sekundären Amplifikationsprodukte einzufangen und abzutrennen, die dann durch Szintillationszählung nachgewiesen wurden.
Biotinylierte Signalprimer wurden wie folgt hergestellt. Oligonukleotid SEQ ID NR. 7 wurde mit einem DNS-Synthesizer Modell 380B von Applied Biosystems unter Anwendung der Standard-Phosphoramidit-Chemie synthetisiert. Das Gerät wurde dann verwendet, um durch drei aufeinanderfolgende Kupplungen mit BIOTIN ON Phosphoramidit (Clonetech) drei Biotingruppen an dem Oligonukleotid zu befestigen. Im Anschluss an die Synthese wurde das Oligonukleotid durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak von der Schutzgruppe befreit und durch denaturierende Gelelektrophorese gereinigt. Die biotinylierten Signalprimer mit den gebundenen Affinitätsliganden zum Einfang der sekundären Amplifikationsprodukte werden als Fang-Signalprimer bezeichnet und sind zum Zwecke dieses Beispiels analog zum Q'-C'-Signalprimer von Fig. 1A und Fig. 1B, worin Q' Biotin umfasst.
Zur Herstellung von ³²P-markierten Signalprimern wurden die Oligonukleotide SEQ ID NR. 1 und SEQ ID NR. 8 wie von Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res., oben) beschrieben mit radioaktivem Phosphat markiert. Die radiomarkierten Signalprimer werden als Nachweis- Signalprimer bezeichnet und sind zum Zwecke dieses Beispiels analog zum R-B-Signalprimer von Fig. 1A und Fig. 1B, worin R eine Radiomarkierung umfasst. In dem Versuch wurde einer dieser zwei Nachweis-Signalprimer in Verbindung mit dem Fang-Signalprimer verwendet, um sekundäre Amplifikationsprodukte zu erzeugen.
Die SDA wurde im wesentlichen wie von Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res., oben) beschrieben mit den folgenden Modifikationen durchgeführt. Amplifikationsprimer waren SEQ ID NR. 9 und SEQ ID NR. 10 (analog zu A und D' in Fig. 1A und Fig. 1B). Diese Primer amplifizieren ein 103 Nukleotide langes Fragment (Nukleotidpositionen 944-1046) des IS6110-Insertionselements von M.tb. Jede 50 ul-Reaktion enthielt die folgenden Komponenten: 45 mM KiPO&sub4;, pH 7,5; 6 mM MgCl&sub2;; 0,1 mg/ml acetyliertes BSA; 12% Dimethylsulfoxid; 0,5 mM dUTP; jeweils 0,2 mM dCTP, dGTP, dATPαS; 500 nM Amplifikationsprimer; 50 nM Bumper-Primer (SEQ ID NR. 11 und SEQ ID NR. 12); 75 nM Nachweis-Signalprimer und Fang-Signalprimer (SEQ ID NR. 1 und SEQ ID NR. 7 oder SEQ ID NR. 8 und SEQ ID NR. 7); 100 ng humane Plazenta-DNS; 150 Einheiten HincII (New England Biolabs); 2,5 Einheiten exo&supmin;-Klenow-DNS-Polymerase (US Biochemicals); 3% (v/v) Glycerol, zugesetzt mit Enzymen; und entweder 0 oder 105 Kopien des M.tb-Genoms.
Sämtliche Reaktionskomponenten außer MgCl&sub2;, HincII und Polymerase wurden vereinigt, und die Gemische wurden für zwei Minuten auf 95ºC erhitzt. Die Proben wurden dann für zwei Minuten in ein Wasserbad mit 40ºC gegeben, es wurden jeder Probe 3 ul 0,1 M MgCl&sub2; zugesetzt, und die Proben wurden gemischt. Es wurden 3 ul eines Enzymgemisches zugesetzt, das 50 Einheiten/ul HincII, 0,833 Einheiten/ul Polymerase und 50% (v/v) Glycerol enthielt, und die Proben wurden 2 h bei 40ºC inkubiert.
Nach der Inkubation wurde ein 5-ul-Aliquot jedes Reaktionsgemisches durch denaturierende Gelelektrophorese analysiert. Da der Nachweis auf Gelen nur die Anwesenheit von R erfordert, traten bei Proben, die genomische M.tb-DNS enthielten, verschiedene Produkte im Bereich von 50-120 Nukleotiden in Erscheinung. Diese Banden fehlten in Reaktionen ohne M.tb-DNS, was zeigt, dass die Reaktionsprodukte in diesem Größenbereich zielspezifisch waren. Die vorausgesagten Amplifikationsprodukte für dieses Beispiel, die durch Berechnung anhand der bekannten Größen und Bindepositionen der Signalprimer entsprechend dem in Fig. 1A und Fig. 1B dargestellten Reaktionsschema bestimmt wurden, sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Wie aus Fig. 1A und Fig. 1B ersichtlich, enthält Struktur #3 (in einzelsträngiger Form auf denaturierenden Gelen) R und ist nachweisbar. Zudem ist die nachweisbare einzelsträngige Form von Struktur #3 identisch mit Struktur #2 und mit dem nachweisbaren Einzelstrang von Struktur #9. Diese sekundären Amplifikationsprodukte sind daher auf dem Gel nicht unterscheidbar. Struktur #4 und Struktur #5 (auch in einzelsträngiger Form auf denaturierenden Gelen) sind ebenfalls aufgrund der Anwesenheit von R nachweisbar. ERWARTETE GRÖSSEN VON SEKUNDÄRPRODUKTEN (Nukleotide, nt)
Streptavidin beschichtete magnetische Kügelchen (Streptavidin Paramagnetic Particles, Nucleic Acid Qualified, 1 mg/ml, Promega Corporation, Madison, WI) wurden wie vom Hersteller empfohlen dreimal mit 1x PBS gewaschen. Für jede Analyse wurden 50 ug der Kügelchen in einem 1,5-ml-Eppendorfröhrchen in 180 ul 1x PBS suspendiert und mit 20 ul des SDA-Reaktionsgemisches vereinigt. Diese Proben wurden unter gelegentlichem Mischen 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde ein Magnet verwendet, um die Kügelchen auf einer Seite des Röhrchens zu sammeln, und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden dann gewaschen, indem man sie in 1x PBS (200 ul) resuspendierte, sie magnetisch auf der Seite des Röhrchens sammelte und den Überstand entfernte. Dieser Waschvorgang wurde drei weitere Male wiederholt, und es wurde durch Flüssigszintillationszählung die auf den Kügelchen verbleibende ³²P-Aktivität detektiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
Kleine Aliquots der Kügelchen (10%), die vor der Szintillationszählung entfernt worden waren, wurden in Gegenwart von 50% Harnstoff auf 95ºC erhitzt und einer Elektrophorese auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel unterzogen. Nur Struktur #3 und Struktur #9 enthalten sowohl die Biotinmodifikation als auch die ³²P-Markierung, und es war vorausgesagt, dass nur diese Strukturen an die Kügelchen binden und nachweisbar sein würden. Die Autoradiographie des Gels zeigte, dass die sekundären Amplifikationsprodukte Struktur #3 und Struktur #9 die vorherrschenden radioaktiven Spezies darstellten, welche von den Kügelchen während des magnetischen Trennprozesses zurückgehaltenen wurden. Jedoch traten auch geringere Mengen einer Struktur #1 entsprechenden Spezies auf dem Autoradiogramm auf. Es ist möglich, dass Struktur #1, erzeugt durch Verlängerung des Nachweis-Signalprimers, eingefangen werden mag, wenn sie an einen Q'-C'-Fang- Signalprimer hybridisiert ist (vor der Fang-Signalprimer-Verlängerung und Erzeugung von Struktur #2; siehe Reaktionsschritt nach Struktur #1 in Fig. 1A). Obwohl zusätzlich zu den vorausgesagten Strukturen #3 und #9 offensichtlich geringe Mengen von Struktur #1 eingefangen und detektiert wurden, waren sämtliche eingefangenen und detektierten sekundären Amplifikationsprodukte zielspezifisch und traten nicht in Proben ohne genomische M.tb-DNS auf.
Die bei Fehlen von M.tb-DNS (0 anfängliche Genommoleküle) auf den Kügelchen detektierte Hintergrund-Radioaktivität scheint auf nichtspezifische Bindung von unreagierten Nachweis- Signalprimern zurückzuführen zu sein. Elektrophoretische Analyse von Kügelchen aus diesen Proben zeigte, dass das einzige vorhandene radioaktive Material eine sehr schwache Bande war, die den Nachweis-Signalprimern entsprach, sogar nach dem Exponieren des Autoradiogramms über Nacht. Jedoch wurden die sekundären Amplifikationsprodukte über diesen Hintergrundsignalpegeln eindeutig nachgewiesen.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: BECTON, DICKINSON AND COMPANY
(A) NAME: BECTON, DICKINSON AND COMPANY
(B) STRASSE: 1 Bacton Drive
(C) STADT: Franklin Lakes
(D) STAAT: NJ
(E) LAND: US
(F) PLZ: 07417
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: NACHWEIS VON NUKLEINSÄUREAMPLIFIKATION
(iii) ANZAHL SEQUENZEN: 12
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Floppy-Disk
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(v) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) TAG DER EINREICHUNG:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 1:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 2:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis
(ix) KENNZEICHEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) ORT: 19..24
(D) WEITERE INFORMATION: /function = "HincII recognition site"
(ix) KENNZEICHEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) ORT: 25..37
(D) WEITERE INFORMATION: /function = "Target Binding Sequence" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 3:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 4:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 5.
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis
(ix) KENNZEICHEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) ORT: 11..16
(D) WEITERE INFORMATION: /functions = "HincII recognition site" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 6:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 7:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.7:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 8:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 9:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 10:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 11:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 12 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 12:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS (genomisch)
(vi) ursprüngliche Quelle:
(A) ORGANISMUS: Mycobacterium tuberculosis (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12:

Claims

1. Verfahren zur gleichzeitigen Erzeugung eines sekundären Amplifikationsproduktes und eines Amplifikationsproduktes in einer Nukleinsäuren-Amplifikationsreaktion auf Basis eines Primer, wobei das Verfahren umfasst:

a) Hybridisierung eines Signalprimers ohne einschneidbare Erkennungsstellen für Restriktions-Endonukleasen mit einer Zielsequenz sowie eine in Bezug auf den Signalprimer stromaufwärts stattfindende Hybridisierung eines ersten Amplifikationsprimers mit der Zielsequenz;

b) Verlängerung des hybridisierten Signalprimers auf der Zielsequenz zur Bildung eines Signalprimer-Verlängerungsproduktes ohne einschneidbare Stellen sowie Verlängerung des hybridisierten, ersten Amplifikationsprimers auf der Zielsequenz, sodass durch die Verlängerung des ersten Amplifikationsprimers das Signalprimer- Verlängerungsprodukt von der Zielsequenz entfernt wird;

c) Hybridisierung eines zweiten Amplifikationsprimers mit dem Signalprimer-Verlängerungsprodukt und Verlängerung des hybridisierten zweiten Amplifikationsprimers auf dem Signalprimer- Verlängerungsprodukt zur Bildung eines zweiten Amplifikationsprimer- Verlängerungsproduktes, das einen neu synthetisierten Strang enthält;

d) Entfernung des neu synthetisierten Stranges vom Signalprimer- Verlängerungsprodukt; und

e) Hybridisierung des keine einschneidbaren Stellen enthaltenden Signalprimers mit dem entfernten, neu synthetisierten Strang sowie Verlängerung des Signalprimers, sodass ein doppelsträngiges, sekundäres Amplifikationsprodukt erzeugt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend die Erkennung des sekundären Amplifikationsproduktes mithilfe einer chemischen Modifikation oder einer speziellen Nukleotidsequenz, die in den Signalprimer eingebaut werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt mithilfe eines Affinitätsliganden oder einer Reportergruppe festgestellt wird, die in den Signalprimer eingebaut werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt mithilfe einer in den Signalprimer eingebauten Nukleotidsequenz festgestellt wird, wobei die Nukleotidsequenz eine Erkennungsstelle für ein an doppelsträngige DNS bindendes Protein enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 2, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt mithilfe einer in den Signalprimer eingebauten Nukleotidsequenz festgestellt wird, wobei die Nukleotidsequenz eine Erkennungsstelle für Restriktions-Endonukleasen enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt über Spaltung der Erkennungsstelle für Restriktions-Endonukleasen mit einer Restriktions-Endonuklease zur Erzeugung eines Spaltprodukts festgestellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt durch Abtrennung des Spaltprodukts auf Basis der Größe und Feststellung des Spaltprodukts erkannt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Spaltprodukt durch Filtration abgetrennt wird.

9. Verfahren zur gleichzeitigen Erzeugung eines sekundären Amplifikationsproduktes und eines Amplifikationsproduktes in einer Nukleinsäuren-Amplifikationsreaktion auf Basis eines Primer, wobei das Verfahren umfasst:

a) Hybridisierung eines ersten Signalprimers ohne einschneidbare Erkennungsstellen für Restriktions-Endonukleasen mit einem ersten Strang einer doppelsträngigen Zielsequenz sowie eine in Bezug auf den Signalprimer stromaufwärts stattfindende Hybridisierung eines ersten Amplifikationsprimers mit dem ersten Strang der Zielsequenz;

b) Verlängerung des hybridisierten, ersten Signalprimers auf dem ersten Strang zur Bildung eines ersten Verlängerungsproduktes ohne einschneidbare Stellen sowie Verlängerung des hybridisierten, ersten Amplifikationsprimers auf dem ersten Strang, sodass durch die Verlängerung des ersten Amplifikationsprimers das erste Verlängerungsprodukt von der Zielsequenz entfernt wird;

c) Hybridisierung eines zweiten, keine einschneidbaren Stellen enthaltenden Signalprimers mit dem ersten Verlängerungsprodukt sowie eine in Bezug auf den zweiten Signalprimer stromaufwärts stattfindende Hybridisierung eines zweiten Amplifikationsprimers mit dem ersten Verlängerungsprodukt;

d) Verlängerung des hybridisierten, zweiten Signalprimers auf dem ersten Verlängerungsprodukt zur Bildung eines zweiten Verlängerungsprodukts ohne einschneidbare Stellen sowie Verlängerung des hybridisierten, zweiten Amplifikationsprimers auf dem ersten Verlängerungsprodukt, sodass durch die Verlängerung des zweiten Amplifikationsprimers das zweite Verlängerungsprodukt vom ersten Verlängerungsprodukt entfernt wird; und

e) Hybridisierung des ersten, keine einschneidbaren Stellen enthaltenden Signalprimers mit dem entfernten, zweiten Verlängerungsprodukt ohne einschneidbare Stellen sowie Verlängerung des hybridisierten, ersten Signalprimers auf dem zweiten Verlängerungsprodukt, sodass ein doppelsträngiges, sekundäres Ampliflkationsprodukt erzeugt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, ferner umfassend die Erkennung des sekundären Amplifikationsproduktes mithilfe einer in den ersten Signalprimer eingebauten Reportergruppe und einer in den zweiten Signalprimer eingebauten Modifikation, um den Einfang sekundärer Amplifikationsprodukte zu erleichtern.

11. Verfahren nach Anspruch 10 ferner umfassend die Erkennung des sekundären Amplifikationsproduktes mithilfe einer chemischen Modifikation oder einer speziellen Nukleotidsequenz, die in den Signalprimer eingebaut werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt mithilfe eines Affinitätsliganden oder einer Reportergruppe festgestellt wird, die in den Signalprimer eingebaut werden.

13. Verfahren nach Anspruch 11, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt mithilfe einer in den Signalprimer eingebauten Nukleotidsequenz festgestellt wird, wobei die Nukleotidsequenz eine Erkennungsstelle für ein an doppelsträngige DNS bindendes Protein enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 11, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt mithilfe einer in den Signalprimer eingebauten Nukleotidsequenz festgestellt wird, wobei die Nukleotidsequenz eine Erkennungsstelle für Restriktions-Endonukleasen enthält.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt über Spaltung der Erkennungsstelle für Restriktions-Endonukleasen mit einer Restriktions-Endonuklease zur Erzeugung eines Spaltprodukts festgestellt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das sekundäre Amplifikationsprodukt durch Abtrennung des Spaltprodukts auf Basis der Größe und Feststellung des Spaltprodukts erkannt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das Spaltprodukt durch Filtration abgetrennt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 2, worin die sekundären Amplifikationsprodukte in Echtzeit detektiert werden.

19. Verfahren nach Anspruch 2, worin die sekundären Amplifikationsprodukte nach der Amplifikation detektiert werden.

20. Verfahren nach Anspruch 9, worin die sekundären Amplifikationsprodukte in Echtzeit detektiert werden.

21. Verfahren nach Anspruch 9, worin die sekundären Amplifikationsprodukte nach der Amplifikation detektiert werden.