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經濟部中央標準局員工消費合作杜印聚 B7 ------------ 五、發明説明（'） 發明領域 本發明係鼷於核酸目標序列放大作用之檢測與测量方 法。 發明背景 賭外核酸放大技術對檢测與分析小量核酸提供有利的 1具。此種方法棰端敏威，因此試圖開發用於診斷傳染 _及遣傳病，分離基因以供分析，及法醫學上檢測特定 核酸。核酸放大技術根據程序溫度需求分類。聚合酶連 鎖反應（PCR;R.K.Saiki,et al.1985 Science 230,1350 - 1 3 5 4 )接合酶連鎖反應（LCR; D.Y.Wu, et al.1989 Genomics 4, 5 6 0 - 5 6 9 ; K. Barringer, e t a 1 . 1 9 9 0 Gene 8 9,117-122; F. Barany. 1991. P r o c . Natl. A c a d.S c i. USA 8 8 , 1 8 9 - 1 9 3 )及基於轉錄的放大作用（D.Y.kwoh, et a 1. 1 9 8 9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177) 需要溫度周期。相反地，例如股置換放大（SDA; G.T. Walker, e t a 1 . 1 9 9 2 Pore. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396¾ G.T.Walker, e t a 1 , 1 9 9 2 . Hue. Acids. Res. 20,1691-1696,二文皆術述於此以供參考 自行持鑲 式序列複製（3SR; J_C· Guatelli et al. 1990· Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 7, 1 8 7 4 - 1 8 7 8 )及 QB複製酶条统 (P.M.Lizardi, et al.1988. BioTechnology 6,1197-1202)等方法為恒溫反應。此外，WO 90/ 10064及W0 91/03573説明使用噬_體Phi 29複製起點，供核酸之 恆溫複製》 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ---------- 裝------訂------Μ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( ) 1 1 也 曾 開 發 多 種 方 法 » 來 檢 測及 / 或 測 量 核酸放 大 作用 1 1 〇 大 半 方 法 為 以 引 子 為 基 礎 ,表 示 依 靠 引 子與目 標 序列 1 I 雜 交 * 某 些 例 中 接 著 延 長 引 子。 P C R中以引子為基礎檢 /--v 請 1 測 放 大 核 酸 經 常 依 靠 放 大 反 應過 程 中 9 放 大引子 併 入放 先 閱 1 1 讀 1 I 大 産 物 (放大子） 〇 因 此 » 遣 傳工 程 給 予 PCR放大引子的 背 1 1 之 1 待 性 出 現 在 放 大 産 物 1 且 可 用於 檢 測 放 大 目標序 列 或固 注 | 意 I 定 放 大 子 » 供 藉 其 它 手 段 檢 測。 例 如 9 Sy v a n e η等（ 1988 ,. 事 項. 1 I 再 1 1 Nu cl e i C A c id S Re s . 1 6 , 11 3 2 7 - 11 3 3 8 ) 報 告使用 生 物素 填 化 PC R放大引子， 生産含生物素之放大産物。然後此等 寫 本 頁 裝 1 放 大 子 可 雜 交 至 含 螢 光 染 料 或其 它 報 告 子 基之第 二 探針 1 1 〇 然 後 » 雜 交 複 合 體 藉 含 生 物素 複 合 體 之 以親和 為 基礎 1 I 的 固 定 作 用 $ 從 反 應 混 合 物 之其 它 成 分 選 擇性分 離 ,且 1 1 利 用 報 告 子 基 檢 測 〇 L a ο η g i aru等( 19 9 1 .歐洲第0 4 2 0 2 6 0 訂 | 號 專 利 串 請 案 )說明類似使用含生物素P CR放大引 子 與螢 1 光 染 料 共 軛 接 合 > 供 檢 測 PC R放大産物。 含引子之放大 1 1 子 利 用 尺 寸 大 小 而 由 未 延 長 引子 分 離 9 使 用不同 螢 光染 1 | 料 對 兩 組 放 大 引 子 檢 测 複 合 體放 大 作 用 〇 Kenp 等 (1 9 8 9 . 1 r | Pr 0 C • N a t 1 • Ac ad Sc i . U S A 8 6 , 2 4 2 3- 2 4 2 7; 19 90 1 1 PC T第W0 90/ 0 6 3 7 4號專利申請案）説 明 藉 併入一 種 修飾 1 I 放 大 引 子 及 使 用 第 二 修 飾 放 大引 子 作 檢 測 手段， 捕 捉放 1 1 大 D N k之方法。 K e姐 P" 捕 捉 引 子"含有5 '尾， 其對雙股D N A 1 1 結 合 蛋 白 質 GC N4為 識 別 序 列 之單 股 形 0 Ke mp”檢測引子” 1 I 於 其 5 , 端 含 有 一 個 生 物 素 部 分。 放 大 産 物 經由結 合 至使 1 1 用 捕 捉 引 子 放 大 産 生 的 雙 股 4 GC N 4 識 別 序 列 固定。 由 檢測 1 1 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 fc。. i‘· ▲ I gy 五、發明説明（3 ) 經濟部中央標準局負工消費合作杜印裝

In I tm nn I n^i m - nn ^^^1 ^^^1 i^m mu In TJ 、va (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 引子引進的生物素部分結合至抗生物素-過氣化酶複合 體，提供固定PCR放大産物的比色檢測。Wahlberg. et al. (1990.Pore. Natl. Acad . S c i. USA 87,6 56 9-6573) 報告類似方法，其中一種PCR放大引子經生物素化，而 另一 PCR放大引子含有编碼大腸桿菌lac操縱子序列之51 尾。雙股放大産物經由結合至鏈抗生物素固定，及經由 lac阻遏子-半乳糖甘酶融合蛋白質結合至放大産生 的雙股lac操縱子，而比色檢測e Wahlberg等之方法與 Keap等之方法之差異在於並非雙股結合蛋白質，而是 生物素-鐽抗生物素交互作用，提供放大産物之固定，及 雙股結合蛋白質提供比色檢測。如此提示兩種方法可混 合使用兩種放大引子，個別有一個编碼不同的雙股結合 蛋白質識別序列之5’尾。然後放大産物經由結合至一 種雙股結合蛋白質而固定，及藉結合至另一種雙股結合 蛋白質而檢測。C.A.Vary(1992.Clinical Chemistry 38,687-694;1992. PCT 第 W0 92/ 11390號專利申請案） 說明使用含5’尾之放大引子，其併入雙股放大子時，可 生成第三寡核甘酸之雜交位置。一尾雜交用來捕捉放大 産物，另一尾雜交用來藉雜交至與螢光染料共軛接合之 探針而檢測。 全部檢測PCR放大産物之此等以引子為基礎的方法需 要兩種放大反應，來逹成高21敏度，亦即檢測少於100 複#之目標序列。換言之，第一次放大目標序列接著使 用併入期望修飾的窩藏引子進行第二放大作用，供捕捉 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS > A4規格（210X297公釐） B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明 ( 4 ) 1 1 及 / 或 檢 測 〇 需 要 此 種 方 式 之 兩 次 連缠 放 大 作 用，以避 1 1 免 因 修 飾 信 號 産 生 性 引 子 剌 激 引 發 非 巨 標 DN Α放大作用， 1 1 産 生 無 法 接 受 的 高 度 背 景 信 PJa 撕 〇 此 種 先 前 技 術 方法特性 /·—s 請 1 1 促 成 其 費 時 繁 瑣 t 因 此 » 以 引 子 為 基 礎 之 檢 測 方法的優 先 閱 1 I 讀 1 1 點 經 常 被 第 二 連 鑲 放 大 反 應 需 求 抵 消 〇 背 面 1 I DN A之非特異性放大預期會對S DA反 應 中 « 以 引子為基 之 注 1 I 意 I 礎 的 檢 測 放 大 産 物 造 成 待 殊 問 題 9 因 此 等 放 大 傜於相當 事 項 1 I •S- 1 低 溫 (約3 7。 - 4 0°C )下進行， 因此， 比較PCR造 成的錯誤 引 發 增 多 9 結 果 導 致 又 更 高 度 背 景 信 號 〇 出 乎 意外地， 寫 本 頁 袈 1 本 以 引 子 為 基 礎 的 檢 m SD A方法雖然僅使用單- -放大反 1 1 應 1 其 放 大 百 標 序 列 之 同 時 » 産 生 檢 測 産 物 • 但導致低 1 I 度 背 景 信 PJh m 〇 同 時 産 生 第 二 放 大 産 物 及 放 大 巨 標序列於 1 1 此 處 稱 為 實 時 引 子 延 長 9 實 時 檢 測 放 大 等 〇 訂 I 發 明 概 述 1 1 本 發 明 提 供 偶 合 至 巨 標 序 列 t 且 可 指 示 百 標 序列之放 1 1 大 的 SD A反應引子延長産物之檢測。 固定（捕 捉 )或定位 1 1 方 法 0 引 子 延 長 産 物 為 巨 標 序 列 SD A反應過程中産生的 ，- 第 二 % 巨 標 特 異 性 DN A産物， 因此可用於檢測及/或測 1 1 量 巨 標 序 列 放 大 作 用 〇 但 第 二 産 物 •faT Μ 法 放 大 於生成後 1 I 於 SD A反應維持惰性， 不會干擾目標序列的指數放大作 1 1 用 〇 第 二 産 物 可 設 計 或 修 飾 以 含 有 恃 殊 性 質 9 俾便檢測 1 1 9 固 定 (捕捉）或 定 位 〇 本 發 明 方 法 可 用 於 實 時 監測SDA 1 I 反 應 » 特 別 用 於 巨 標 序 列 放 大 子 之 檢 測 可 能 干 擾進一步 1 1 放 大 或 操 縱 之 情 況 〇 本 方 法 6 也 可 用 於 在 位 S D A反應後， 1 1 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 85.12. i6 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明 ( r ) 1 1 檢 測 固 定 細 胞 内 的 放 大 産 物 9 特 別 當 第 二 産 物 含 有 5 , 1 1 尾 序 列 $ 俾 便 檢 測 或 定 位 放 大 産 物 時 尤 為 如 此 〇 1 I 圖 式 之 說 明 -V 請 1 1 第 1 k 圖 及 1 B圖 舉 例 說 明 本 發 明 方 法 之 步 驟 〇 第 1 A圖 舉 先 閱 1 I 讀 1 I 例 說 明 使 用 兩 種 信 號 引 子 由 單 股 巨 標 序 列 生 産 第 二 放 大 背 1 I 産 物 〇 第 1 B圖 顯 示 當 原 先 百 標 序 列 為 雙 股 時 來 白 互 補 1 I t- I 股 之 類 似 方 法 〇 項 1 I 再 1 第 2 圖 舉 例 説 明 使 用 單 一 信 號 引 子 生 産 等 二 産 物 Ο 填 發 明 之 詳 細 説 明 寫 本 頁 裝 1 本 發 明 為 m 實 時 引 子 延 長 作 用 檢 測 監 测 或 定 位 SD A 1 1 反 應 放 大 産 物 之 方 法 〇 藉 SD A之放大目標序列可經由同 1 I 時 生 成 第 二 放 大 産 物 檢 測 X 監 測 或 定 位 其 生 産 與 百 標 1 1 序 列 的 放 大 緊 密 偶 合 〇 此 種 第 二 放 大 産 物 % 於 SDA反應 訂 I 過 程 中 生 成 ♦ 無 需 額 外 放 大 步 驟 或 操 縱 〇 第 二 放 大 産 物 1 一 旦 生 成 » 則 於 反 應 混 合 物 呈 惰 性 9 不 會 干 擾 或 抑 制 所 1 1 需 百 標 序 列 的 正 常 S D A反應。 因此， 此種方法可用於實 1 1 時 監 測 SD A, 及檢測目標序列之放大， 待別於檢測放大 1 百 標 序 列 本 身 可 能 抑 制 或 抑 制 放 大 子 的 進 一 步 反 應 或 操 1 1 縱 的 情 況 尤 為 如 此 〇 1 I 本 發 明 提 供 種 以 引 子 為 基 礎 的 放 大 檢 測 方 法 » 可 免 1 1 除 第 二 放 大 反 應 需 求 〇 該 方 法 使 用 類 似 捕 捉 探 針 • 及 檢 1 1 測 探 針 之 信 號 引 子 ♦ 但 於 S D A反應無法作為放大引子。 1 I 結 果 f 經 由 此 等 信 號 引 子 對 非 百 標 模 版 進 行 漫 無 百 標 之 1 1 延 長 反 應 生 成 的 延 長 産 物 9 7 無 法 進 行 後 缠 的 放 大 作 用 〇 1 1 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 85. 12, 16 A7 B7 經濟部中失揉準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（ b ) 1 1 由 於 錯 誤 引 發 本 身 比 較 罕 見 9 故 僅 能 於 引 發 錯 誤 序 列 後 1 1 績 放 大 後 檢 知 〇 如 同 本 發 明 方 法 • 沒 有 此 種 後 绩 放 大 反 1 I 應 存 在 下 t 信 號 引 子 可 於 引 發 放 大 作 用 前 » 加 至 放 大 反 請 1 1 應 $ 而 未 顯 著 增 高 背 景 信 P上 號 水 平 〇 如 此 大 為 簡 化 檢 測 過 先 閱 1 I 讀 1 程 1 且 可 均 勻 地 實 時 分 析 S D A反應。 背 1 I 如 此 處 使 用 下 列 術 語 及 Η 語 定 義 如 後 之 注 1 | 意 I 放 大 引 子 為 籍 引 子 延 長 放 大 巨 標 序 列 之 引 子 〇 用 於 SD A 事 項 1 I 再 1 1 放 大 引 子 (目標結合序列） 3 1 端 於 百 標 序 列 3 ' 端 雜 交 填 放 大 引 子 包 括 一 個 接 近 5 ' 端 之 限 制 核 酸 内 切 酶 識 別 位 置。 % 本 頁 裝 1 識 別 位 置 俗 供 限 制 核 酸 内 切 酶 用 9 當 識 別 位 置 如 Va lk e r 1 1 等 (1 99 2 , PN AS , 參見上文）所 述 經 半 修 飾 (" 切 開 ") 時 1 1 I 該 酵 素 可 剪 接 DN A 雙 倍 體 之 一 股 〇 半 修 飾 識 別 位 置 為 限 1 1 剪 核 酸 内 切 酶 之 雙 股 識 別 位 置 9 其 中 一 股 含 有 至 少 一 種 訂 [ 衍 生 核 甘 酸 9 其 可 使 限 制 核 酸 内 切 酶 切 開 引 子 股 9 而 非 1 切 割 識 別 位 置 兩 股 〇 通 常 ，半修飾識別h ^:置之引子股不含 1 1 衍 生 核 酸 » 且 可 以 限 制 核 酸 内 切 函每 切 開 〇 另 外 » 引 子 1 1 可 含 衍 生 核 甘 酸 » 其 使 未 修 飾 巨 標 股 不 切 割 而 修 飾 引 W卜 I 子 股 被 切 開 Ο 較 佳 半 修 飾 識 別 位 置 為 限 制 核 酸 内 切 酶 1 1 Hi η c II 9 Hi n d II 9 Aval, N c i I 及 F η u 4 HI 之 半 硫 代 m 酸 化 識 1 I 別 位 置 Ο 放 大 引 子 也 包 括 一 3 f -0 Η基， 當放大引子之目 1 1 標 結 合 序 列 雜 交 至 巨 標 序 列 時 t 3 ' -0 Η基可藉D ΝΑ聚 合 酶 1 1 延 長 0 對 大 半 SDA反應而言， 放大引子負貴目標序列指 1 I 數 放 大 作 用 〇 1 1 延 長 産 物 為 核 酸 » 其 包 括 一 個 引 子 和 一 痼 新 合 成 股 1 1 1 8 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( 7 ) 1 1 新 合 成 股 為 引 子 結 合 位 置 下 游 巨 標 序 列 的 互 補 股 〇 延 長 1 1 産 物 來 白 於 引 子 與 百 標 序 列 之 雜 交 及 使 用 巨 標 序 列 作 模 1 I 版 ， 引 子 藉 聚 合 酶 之 延 長 〇 請 1 1 緩 衝 引 子 為 與 放 大 引 子 上 游 百 標 序 列 配 對 之 引 子 t 因 先 閱 1 I 讀 1 I 此 緩 衝 引 子 延 長 置 換 下 游 放 大 引 子 及 其 延 長 産 物 〇 缓 衝 背 1 I 之 1 引 子 延 長 乃 置 換 放 大 引 子 之 延 長 産 物 之 方 法 » 但 加 熱 也 注 | 意 I 適 合 〇 事 項 1 I 再 1 \ t±i· 兀 全 相 同 序 列 將 雜 交 至 相 同 互 補 核 甘 酸 序 列 大 體 相 填 同 序 列 之 核 甘 酸 序 列 充 分 類 似 > 因 此 也 雜 交 至 相 同 的 部 % 本 頁 裝 1 分 互 補 之 核 甘 酸 序 列 〇 1 1 百 標 或 巨 標 序 列 等 詞 表 示 有 待 放 大 的 核 酸 序 列 〇 此 等 1 I 序 列 包 含 有 待 放 大 原 始 核 酸 序 列 f 其 互 補 第 二 股 9 及 放 1 1 大 反 應 中 産 生 的 原 始 序 列 複 本 任 一 股 〇 巨 標 序 列 也 稱 為 訂 | 雜 交 放 大 引 子 之 延 長 模 販 0 1 1 信 號 引 子 為 雜 交 至 放 大 引 子 下 游 目 標 序 列 之 引 子 9 因 1 1 此 放 大 引 子 之 延 長 置 換 信 號 引 子 及 其 延 長 産 物 0 信 號 引 1 I 子 含 有 一 個 3 ' -0 Η基， 當信號引子雜交至目標序列時， 奴 3 1 -0H基可藉D N A聚 合 酶 延 長 〇 信 m 引 子 可 未 經 修 飾 9 例 1 1 如 供 基 於 其 大 小 檢 測 第 二 放 大 産 物 〇 另 外 9 信 Μ 引 子 可 1 I 含 報 告 子 基 或 標 記 9 或 結 構 特 擻 俾 便 檢 測 其 延 長 産 物 〇 1 1 放 大 産 物 t 經 放 大 的 産 物 或 放 大 子 為 經 由 雜 交 及 延 長 1 1 放 大 引 子 生 成 的 巨 標 序 列 複 本 〇 本 詞 表 示 含 原 始 百 標 序 1 I 列 複 本 » 包 括 放 大 反 應 中 間 體 之 cm 早 股 及 雙 股 放 大 引 子 延 1 1 長 産 物 〇 - 9 - i 1 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( ) 1 1 第 二 放 大 産 物 或 第 二 産 物 為 經 由 信 號引 子雜 交及 延 長 1 1 生 成 的 巨 標 序 列 複 本 〇 第 二 放 大 産 物 包括 經放 大之 百 標 1 1 序 列 内 段 〇 本 詞 也 表 示 信 號 引 子 之 單 股及 雙股 延長 産 物 f—v 請 1 1 1 9 包 括 可 生 成 最 终 雙 股 形 之 製 程 中 間 體。 與放 大産 物 相 先 閲 1 I 讀 1 1 反 9 雙股第二放大産物- -般不可用於進- -步放大， 但 背 1 I 之 1 某 些 第 二 放 大 産 物 可 以 線 性 方 式 放 大 Ο 注 | 意 I 本 發 明 方 法 中 » SD A放大引子雜交至目標序列，目標 事 項 1 I 再 1 序 列 一 般 如 Wa lk e r e t a 1 . ,1 99 3 P N AS或 Walk e r , e t 填 述放 如 寫 本 裝 a 1 1993 Ν U C • A c id s Re S . (參見上文）所 大。 同 頁 1 此 二 公 開 文 獻 所 述 9 百 標 序 列 可 經 由 使用 適當 限制 核 酸 1 1 内 切 酶 (例如Η i η cl I)限 制 全 體 DN A , 或使用緩衝引子及 1 I 放 大 引 子 生 成 含 有 適 田 限 制 核 酸 内 切 酶識 別位 置之 百 標 1 1 片 段 於 末 端 製 備 供 SD A用。 然後含目標序列之準備妥 訂 I 的 Η 段 如 所 述 藉 SDA放大。 然而， 本發明SDA反 應又 包 括 1 1 至 少 一 値 信 號 引 子 t 其 導 致 同 時 生 成 第二 放大 産物 9 供 1 1 檢 測 9 監 測 或 定 位 SD A反應産生的放大産物用。 第二放 1 1 大 産 物 也 含 有 可 輔 助 捕 捉 或 固 定 的 特 性， 因此 可經 分 離 知/V 1 以 供 檢 測， 定 量 或 進 一 步 操 作 〇 經 由 於 反應 混合 物内 含 括 1 I 至 少 一 種 信 號 引 子 $ 可 於 S D A反應産生第二放大産物。 1 I 用 於 某 用 途 較 佳 含 括 一 對 信 號 引 子〇 單一 或多 數 之 1 1 信 號 引 子 雜 交 至 放 大 引 子 之 雜 交 位 置 下游 的目 標序 列 Ο 1 1 以 類 似 放 大 引 子 延 長 之 方 式 « 藉 聚 合 酶延 長。 信號 引 子 1 I 於 百 標 序 列 的 ___- 個 位 置 雜 交 〇 因 此 » 放大 引子 之延 長 置 1 1 換 信 號 引 子 之 延 長 産 物 〇 至 少 信 號 引 子3， 端含 有一 段 可 1 [ -1 0 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4说格（210 X 297公釐） A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明 ( 9 ) 1 1 舆 巨 標 序 列 雜 交 的 序 列 〇 整 锢 信 m 引 子 可 雜 交 至 巨 標 序 1 1 列 例 如 未 經 修 飾 或 藉 添 加 報 告 子 基 、 標 記 或 親 和 配 1 | 位 基 9 以 化 學 方 式 修 飾 供 檢 測 時 〇 另 外 9 信 號引 子 5 ' 端 -v 讀 1 1 可 含 有 段 不 會 雜 交 至 百 榡 序 列 之 序 列 但 其 含 特 殊 核 先 閱 1 I 讀 1 I 甘 酸 序 列 (經常牽涉結構待擻） 有 助 於 第 二 放 大 産 物 之 檢 背 1 | 之 1 測 或 捕 捉 〇 當 信 號 引 子 於 模 販 上 雜 交 及 延 長 時 t 此 等 化 注 I 意 I 學 修 飾 及 特 殊 序 列 併 入 第 二 放 大 産 物 〇 化 學 修 飾 之 例 包 事 項 1 I 再 1 | 含 親 和 配 位 基 (例如抗生物素， 鏈抗生物素， 生物素， 填 半 抗 原 * 抗 原 及 抗 體 )及報告子基（ 標 記 例 如 放 射 性 同 % 本 頁 裝 1 位 素 螢 光 染 料 > 反 應 而 産 生 可 檢 測 産 物 之 酵 素 及 可 1 1 見 染 料 )〇 待殊核苜酸序列之例包含（i) 經 由 標 記 寡 核 甘 1 I 酸 探 針 雜 交 至 雙 股 第 二 放 大 産 物 生 成 三 重 螺 旋 體 之 序 列 1 1 * 及 (i i) 雙 股 D N A結合蛋白質之識別位置， 放大過程中 訂 I 變 成 雙 股 時 » 可 結 合 雙 股 DN A結合蛋白質（例 如 阻 遏 子 > 1 I 調 節 蛋 白 質 限 制 核 酸 内 切 酶 9 RN A聚合酶）。 獲 得 雙 股 1 1 限 制 核 酸 内 切 酶 識 別 位 置 之 核 甘 酸 序 列 為 用 於 信 號 引 子 1 I 之 較 佳 結 構 特 激 9 因 後 缠 限 制 反 應 可 用 來 生 産 可 由 特 戡 Μ 1 性 尺 寸 辨 別 的 第 二 放 大 産 物 故 〇 1 1 當 本 發 明 方 法 使 用 兩 種 信 m 引 子 > 其 雜 交 至 雙 股 巨 標 1 | 序 列 之 相 對 股 (如第1 A及1 B圖舉例說明）時 9 ___* 種 信 號 引 1 1 子 含 有 待 殊 核 甘 酸 序 列 1 或 化 學 修 飾 俾 便 捕 捉 9 或 固 定 1 1 第 二 放 大 産 物 9 而 另 一 種 信 號 引 子 含 有 可 檢 測 報 告 子 基 1 I 或 標 記 9 供 檢 測 被 捕 捉 或 被 固 定 的 第 二 放 大 産 物 〇 使 用 1 1 標 記 及 報 告 子 基 供 檢 測 核 酸 < 及 使 用 配 位 基 化 學 修 飾 1 I -1 1 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） A7 B7 306(/ 85. 12. 16 五、發明説明（…） 及核酸結構持擻，供捕捉或固定核酸乃業界眾所周知。 s外，信號引子可未經修飾，亦即不含報告子基、捕捉 基或結構待徴，俾便檢測或捕捉第二放大産物。則第二 放大産物可基於其尺寸檢测，例如藉凝謬電泳及溴化乙 錠（eth ί d i UB bro· i de) 染色。全部此等方法皆可 用於本發明，業界人士可例行選用適當方法用於任何 待殊放大檢定分析条統。 本發明之一大待點為信號引子於使用彼等之SDA反慝中並不 作為放大引子。不欲囿限於本發明方法之任何待定機轉，申請 人相信此種待點使信號引子可添加至放大反應混合物， 而不會促成其它以引子為基礎的方法所産生的高度背景 信號。相信高度背景信號傜來自當引子可作為放大引子 功能時，被剌激引發的非目標D N A進行非待異性引發及 後績放大所致。因此，本發明可大為簡化以引子為基礎 的檢测方法程序，該方法先前仰賴兩次連纗放大反應， 以逹成高S敏度及高度待異性，第二反應僳使用内部窩 藏信號生成性放大引子進行。 如前述，於末端含適當限制核酸内切酶識別序列，及 含目標序列之核酸段可由Walker , et al . 1 9 9 2 . PNAS ( 參見上文)或如 Walker· , et al . 1 9 9 2 Nuc . Acids Res ., (參見上文）所述準備進行放大。簡化起見，第ΙΑ, IB及 2圖舉例說明本發明方法，其始於含目標序列之核酸段 ,若根據Walker, et al. 1 9 9 2 . PNAS(參見上文）準備， 則表示已經變性的限制雙股DNA。若根據Walker ，et al. 1992 Nuc· Acids Res.，（參見上文）準備，則適當限制 -1 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） I I I - I i I 訂 I I I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局貝工消费合作社印裝 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ " ) 1 1 核 酸 内 切 酶 識 別 位 置 根 據 掲 示 的 巨 標 生 成 計 劃 加 至 該 段 1 1 〇 相 信 缓 衝 引 子 » 放 大 引 子 及 信 m 引 子 可 於 Walker > e t 1 I a 1 .之目標生成計割（1 S 9 2 N u C . A c i d S Re S . 9 參 見 上 文） /—ν 讀 1 中 同 時 雜 交 至 巨 標 序 列 t 各 上 游 引 子 之 延 長 置 換 下 游 引 先 閱 1 I 讀 1 1 子 之 延 長 産 物 * 及 同 時 生 成 可 放 大 的 百 標 片 段 及 第 二 放 背 1 I 大 産 物 〇 冬 1 | % I 圖 1 A及 1 B (S3 圖 舉 例 説 明 本 發 明 之 具 體 例 9 其 中 一 對 信 號 事 項 1 I 再 1 1 引 子 用 於 檢 m 雙 股 百 標 序 列 (5 » ^ A- B ~ C- D/5 ' -D C , -E '-A ) 填 f 之 放 大 〇 第 1 A 圖 說 明 本 發 明 方 法 用 於 巨 標 序 列 二 互 補 股 寫 本 頁 裝 1 之 第 一 股 (5 1 D， -C 1 B ' -A •) 〇 第 1 A * 1B及 2 圖 之 放 大 引 1 1 子 升 高 部 分 指 示 如 前 述 及 如 Walker > e t a 1 . (1 9 9 2 PN AS 1 I a η d Ν υ C . A c i d s R e s .)所 述 之 可 切 開 之 限 制 核 酸 内 切 酶 1 1 識 別 位 置 〇 長 的 升 高 部 分 說 明 全 長 限 制 核 酸 内 切 酶 識 別 訂 I 位 置 及 短 的 升 高 部 分 指 示 部 分 限 制 核 酸 内 切 酶 識 別 位 置 1 I 9 通 常 係 於 切 割 及 置 換 一 股 後 産 生 〇 包 括 巨 標 序 列 之 核 1 1 酸 Η 段 可 核 酸 内 切 酶 限 制 較 大 核 酸 (WalKer » e t a 1 • 1 1 1992 Ρ N AS . 參 見 上 文 )或如 Walkei" » e t a 1 .1 9 9 2 Nu C . 锑 Ac id S Re s , 參 見 上 文 )所述， 藉目標生成産生。 然而 1 1 i 供 舉 例 說 明 之 用 及 簡 化 附 圖 9 第 1 A 9 1B及 2 圖 始 於 含 1 I 在 先 前 使 用 不 會 切 割 百 標 序 列 的 限 制 核 酸 内 切 酶 限 制 的 1 1 核 酸 Η 段 上 的 百 標 序 列 〇 1 I 第 1 A 圖 中 SD A反應混合物含有信號引子R ~ B t 並 m 信 1 I Μ m 引 子 B 部 分 分 雜 交 至 B， * 以 雜 交 至 第 一 放 大 引 子 下 游 1 1 百 標 序 列 〇 R- B信號引子序歹 J之R 部分包含報告子基或 I | -1 3- 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格_( 21〇Χ：297公釐）

V V 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 A7 _ 五、發明説明（ρ ) 標記，或屬於結構特擻以方便：檢測或捕捉。如前述，R 可或可未雜交，但此處顯示未雜交以澄清信號引子的不 同功能特歡。供 舉例說明之用，R含有報告子基，但 可含前述其它化學修飾或結構特獻。放大引子A及信號 引子R-B使用目標序列作模販，MDNA聚合酶延長。信號 引子延長産物R-B-C-D(結構式#1)8放大引子A延長，由 模販置換，其又作為第二信號引子Q'-C'及第二放大引子 D’之雜交與延長模版。Q'-C·序列之C’部分雜交至C。第 二信號引子之^部類似R,供舉例說明之用Q’含有修飾 或序列，俾便捕捉第二放大産物。Q'-C_延長物藉延長 等二放大引子置換。然後，置換後的Q'-C'延長産物（結 構式#2)作為R-B之雜交與延長模版，獲得雙股目標特異 性第二放大産物（結構式#3)其包括信號引子之未端段（ R及Q')及目標序列之内段B'-C'»因以第二放大産物不 含可切開之限制核酸内切酶識別位置，故於S D A反應無法 放大，整値其餘放大反應過程中保持有效惰性，但第二 放大産物之額外複本由目標序列生成。 除置換R’-B'-C'-Q’延長産物外，第二放大引子（D’） 之雜交與延長生成雙股Η段，一端R/R'序列，及另一 端有半修飾限制核酸内切酶識別位置（结構式#4)。此種 限制核酸内切酶識別位置可藉SDA反應存在的限制核酸 内切酶切割。然後存在於SDA反應的DNA聚合沾可於切口引發聚合及 置換，導致生成示例說明包括部分限制核酸内切酶識別 位置之R’-B'-C'-D’ -産物。此種産物可藉R-B雜交及延長 -1 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 抑衣 訂 ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 五、發明説明（Η ) 變成雙股（結構式#5)。雖然周期性重複切割、聚合與置 換周期，可用以線性速率放大此片段，但因不存在含有 方便捕捉的修飾或序列之Q/Q'部分，故通常無法檢知 單股或雙股産物。若反轉Q/Q'及R/R'功能（亦即Q/Q'含 報告子基或標記，及R/R'含方便捕捉的修飾或序列）， 此等産物雖被捕捉，但因不存在有報告子基或標記，故 無法檢知。但需了解當與捕捉無關，而可檢知報告子基 時，例如當報告子基為可藉各向異性或螢光棰化檢測的螢 光標記（W0 92/ 18650; R.Devlin，et al. 1993. Clin, Chem. 39, 1939-1943)或可藉凝膠電泳及自動放射性攝 影檢測之放射性同位素時，可檢知結構式#5。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第1A圖也顯示，除置換R-B延長産物外，第一放大引 子於目標序列延長如何生産雙股目標序列，其含有目標 序列藉S D A放大所需的半修飾可切割之限制核酸内切酶 識別位置（結構式#6)。此等反應産物進入習知SDA反應 且被放大。因此，生成第二放大産物緊密偶合至目標序列的 放大，可用於監測放大是否已經發生，以及提供測量目 標放大作用。儘管第二放大産物之生成與放大産物之生 成間有緊密關聯，但 只要反應成分存在過量，則目標 序列放大不受抑制。此外，放大目標序列也可結合信號 引子，導致生成第二放大産物額外複本。 第1 B画舉例説明，由雙股目標序列（5 ’ - A - B - C - D )之互 補第二股生成第二放大産物。通常，互補第二股反應步 驟類似第一股。但第二放大引子（D’）及信號引子C'-Q’ -1 5 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 306^77 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ \4 ) 1 1 先 雜 交 至 互 補 股 且 被 延 長 〇 然 後 第 一 放 大 引 子 (A )及信 1 1 號 引 子 R- B雜交至C 1 Q ' 經 置 換 之 延 長 産 物 (A '- B ' -C t _ Q " 1 I » 結 構 式 # 'i ), 及延長生成S .-Ϊ t-c -Q (結構式#8)。 Q -C t 請 1 雜 交 至 R- B - C- Q , 及延長導致生成雙股第二放大産物R'- 先 閱 1 I 讀 1 I Β， -C 1 _ Q η .-Ε -C -G (結構式#9) 〇 此 種 第 二 放 大 産 物 因 結 背 面 1 1 構 式 捕 捉 之 1 #9存 在 有 基 及 報 告 子 基 9 故 可 於 需 要 捕捉基及 報 注 意 1 告 子 基 糸 統 内 檢 測 〇 互 補 股 反 應 也 産 生 可 Μ 切 割 聚 合 孝 項 1 I 再 1 I 及 置 換 線 性 放 大 的 反 應 産 物 (結構式# 10)。 此種線性放 填 I 大 之 經 置 換 acr 早 股 t 藉 Q ' -C 雜交與延長變成雙股（結 構 式 % 本 頁 裝 1 # 1 1) 〇 通 常 因 不 存 在 有 報 告 子 基 或 捕 捉 基 故 9 此 種 線 1 1 性 放 大 的 αα 早 股 或 雙 股 反 應 産 物 無 法 檢 測 〇 因 缺 乏 兀 整 1 I 限 制 核 酸 内 切 酶 識 別 位 置 9 故 無 法 進 一 步 放 大 〇 然 而 $ 1 1 若 Q 包 括 與 捕 捉 無 關 而 可 被 檢 測 的 報 告 子 基 (例如前 訂 | 述 螢 光 標 記 或 放 射 性 同 位 素 ), 則結構式# 10及 # 1 1也可 1 | 檢 測 0 1 1 如 第 1 Α及 1 B 圖 * 使 用 兩 種 信 號 引 子 時 * 通 常 可 改 良 檢 1 1 2ΑΙΙ Μ 特 異 性 9 但 也 可 使 用 單 一 種 倍 號 引 子 〇 此 種 方 法 說 明 綉 於 第 2 圖 〇 例 中 * 信 號 引 子 可 含 捕 捉 基 或 報 告 子 基 > 巨 1 1 標 序 列 本 身 或 放 大 引 子 可 選 擇 性 提 供 第 二 捕 捉 基 或 報 告 1 1 子 基 0 另 外 f 當 需 要 捕 捉 基 及 報 告 子 基 時 f 信 號 引 子 可 1 1 含 有 唯 有 當 信 號 寡 核 甘 酸 變 雙 股 時 > 可 合 作 發 揮 作 用 的 1 1 捕 捉 基 及 報 告 之 基 〇 此 種 結 構 式 為 當 如 第 2 圖 所 示 9 巨 1 I 標 序 列 之 存 在 誘 生 引 發 延 長 、 置 換 及 再 度 引 發 時 方 可 1 1 生 成 〇 此 種 雙 功 能 信 號 引 子 也 可 構 成 多 種 均 勻 檢 測 方 法 1 I -1 6 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 85. 12, ί δ Α7 Β7五、發明説明（·〇 ，如螢光各向異性或螢光能量轉移方法之基礎。 欲根據第2圖使用單一種信號引子生産第二放大産物 ,第一放大引子（Α)與信號引子R-B雜交成單股目標序列 A’-B'-C’-D’e兩種引子經延長，第一放大引子延長置 換信號引子R-B之延長産物（R-B-C-D),産生結構式#1。 因並無第二信號引子存在，僅有第二放大引子（D’）雜交 至R - B - C - D且經延長，故産生含有一偁可切割半修飾限 制核酸内切酶識別位置的結構式#2。如所示，此種産物 藉切割、聚合及置換線性放大，生成信號引子可雜交且 放由 法可 無， 故時 ，測 置檢 位形 別股 雙識雙 生酶於 産切可 此内僅 如酸基 。核捉 段制捕 片限或 的整基 長完子 延缺告 可因報 股 時 基 子 告 報 式 構 結 物 産 大 放 當 但 檢 R 大R/ 由 可 記 標 光 螢 如 例 /IV 形 測股 檢雙第 可需為 獨不測 單測檢 當檢可 或的#31 ，基及例 測子#2實 物 産 大 放 二 告 ， 報#1 當式 〇 構 測結 檢， 時

R 列 序 標 巨 的S 大Γ1 放te 已ac 知Ob 習yc 與(Μ 用菌 作桿 大核 放結 測 〇 檢較 時比 實測 之檢 明後 發大 本放 之 b C t u . N Η /V · \7 2 s 9 •1 9 之 a 反 w A 於SD IS 的 大行 以進 段述 Η 所 列.) 序es 盤 2 胎 CO 類及 人 1 e s /IV Μ 2 列 ο 序 有子 含引 物大 合放 應DN 反 b L t #M 6 組 各因 但基 ，量 大等 放不 應及 列 序 子 引 緩 及 如 也 --I - I I I n '艮.......丁 I _ _ _ _ 广 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 述 所 號 信 入 併 於 至 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 及 •反 92大 19放 /V ，之 a 子 3^6^77 ，， A7 .〆_ _ B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印褽 五、發明説明 ( ) 1 1 應 fp -標號引子 ?iP-CGTTft-TCCACCATAC (序列識別编號： 1)於 放大 反 1 1 應 進 行 刖 加 入 1 其 終 濃 度 60 nM 〇 反 應 中 所 生 産 預 期的 第 二 1 I 放 大 産 物 長 35及 56個 核 酸 〇 供 放 大 後 檢 測 已 放 大的 巨 標 y-V 請 1 1 序 列 t 1/ 10 量 反 應 混 合 物 用 於 如 Wa lk e r 9 e t a 1 , (1992. N u c . 先 閱 1 I 讀 1 A< :i i s Res., s u p r 'a)所 述 9 藉 序 列 、識 別 编 號 :Hi'子延 長 背 1 1 檢 測 放 大 産 物 ， 産 生 長 35或 56個 核 苷 酸 之 延 長 産 物。 之 注 1 I 意 I 放 大 反 應 在 Μ . t b 1 至500 ,006 基 因 組 複 本 存 在 下， 於 37 孝 項 1 I 1 下 進 行 2 小 時 ο 放 大 終 止 後 t 各 反 應 組 取 1/ 10 量於 變 性 填 聚 丙 烯 醯 胺 膠 上 進 行 電 泳 〇 使 用 根 據 本 發 明 之 信 號引 子 寫 本 頁 裝 1 檢 測 蚕 敏 度 可 達 僅 有 一 複 本 之 Μ . t b 基 因 組 DHA c >同時， 信號 1 1 強 度 隨 巨 標 程 度 下 降 而 減 低 表 示 第 二 放 大 産 物 含量 反 映 1 I 出 巨 標 序 列 放 大 程 度 〇 出 現 於 凝 膠 上 之 信 號 引 子 之實 時 延 1 1 長 比 習 知 放 大 後 引 子 延 長 方 法 蚕 敏 度 低 數 倍 ) 可 能原 因 為 1 丁 1 SDA反應中存在 η P- 標 記 信 號 引 子 濃 度 比 SDA引子低約10 1 I 倍 〇 若 於 信 號 引 子 結 合 及 延 長 前 1 SD A引子於目標序列 1 1 上 延 長 則 無 法 産 生 信 號 〇 因 此 * 較 高 濃 度 之 信 號引 子 1 1 可 藉 著 改 良 信 號 引 子 雜 交 動 力 學 * 而 提 高 方 法 菝 敏度 〇 | 因 此 當 反 應 産 物 分 離 供 檢 測 時 以 較 高 濃 度 信 m 引子 為 1 佳 » 但 放 大 引 子 濃 度 可 維 持 如 習 知 SDA所用濃度。 然而 1 I t 欲 維 持 均 質 檢 測 方 法 如 螢 光 各 向 異 性 之 背 景 低 ,以 較 1 1 低 IU. 辰 度 信 號 引 子 為 佳 〇 比 較 習 知 S D A , 較低濃度信號引 1 1 子 較 佳 與 較 低 濃 度 聚 合 酶 及 與 信 號 引 子 上 游 雜 交 的放 大 1 I 引 子 合 併 使 用 〇 本 實 驗 It 驗 證 放 大 反 應 混 合 物 内 存在 有 1 1 信 號 引 子 不 會 導 致 顯 著 程 度 背 景 信 號 〇 事 實 上 » 背景 信 1 1 -1 8 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

抵.i2. {6 ΑΊ 五、發明説明（) 號程度於樣品内出現程度藉實時佶號引子延長檢測較放 大後引子延長檢測更低。 寘例2 槪略如所述（Walker.1993.PCR-Methods and

A P P 1 i c a t i ο π s 3，1 )於 5 0 η Μ K i P 0 4 ( ρ Η 7 . 5 )，0 . 1 麗 g / 祖 L 牛血清白蛋白，〇·5·Μ dUTP，各〇.2bM dGTP,dCTP及 dATPa S, 7bM MgCl2 ,11%(V/V)甘油，所示濃度之放 大引子，25nM緩衡引子，50ng人類胎盤DNA,指示濃度之 不具核酸外切酶活性之KlenowUlnited States

Biochenicals), 150單位 HincII(New England Biolabs) 進行SDA反應，反慝於4KC下進行指示時間》SDA反應含 有不等量M.tb DHA,其含IS6110待放大之目標序列。Si 放大引子序列，B i緩衝引子序列及B 2缓衝引子序列如 Walker, et al, ( 1 9 9 2 · Nuc. Acids. Res. ’supra)所述 使用。S2放大引子（序列識別编號：2)含有作者掲示之 目檫結合序列及HincII位置，但5'端含不同序列。放大 引子雜交至IS6110序列之核甘酸位置972-984及1011-1023 。缓衝引子雜交至核甘酸位置954-966及1032 - 1 0 4 4。於 變性聚丙烯醛胺膠上電泳後，藉自動放射性攝影觀察第 二放大産物。 S D A反應於0 . 1 η Μ 5 · - # P -標記倍號引子（序列識別编號： 3)存在下進行3小時。信號引子長28個核《酸•，並雜交至 介於放大引子間之IS6110序列核¥酸位置985-1012。Si與 S2存在之濃度分別為180及30nM。不具核酸外切酶活性之 -1 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（2丨〇><297公釐） !||^_ II 裝irI— Μ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局Λ工消费合作杜印製 85._ 85._ 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 五、發明説明（‘s )

Klenow以0.25單位使用。樣品1-4分別含有100,10,1及0 M . tb基因組分子。SDA反應中，序列識別编號：3使用目 標序列作模販，藉聚合酶延長至44核甘酸長。如前述， 此種模販最可能主要為SD A過程中産生的已被置換的放 大目標股，但未排除於原始目標序列上，同時延長的緩 衝、放大及信號引子預期也可能出現。4 4聚物藉上游放 大引子（S2>延長，由目標序列置換。44-聚物之3·端雜 交至第二放大引子（Si)之3'端，藉聚合酶延長後生成 雙股65-聚物。44-聚物及65-聚物第二放大産物唯有於 M.tb目標序列（樣品1-3)存在下方觀察得，指示信號引 子延長並轉形為雙股. 先前SDA反應於O.lnM(樣品1-3)或InM(樣品4-6)5^32 p-信號引子（長1 5個核苷酸（序列識別编號：4 ))存在下重複進 行。此信號引子雜交於介於放大引子間之i S 6 1 1 0序列之 核苷酸位置999-1013。Si &S2以500nM使用。使用二單 位不具核酸外切酶活性之K 1 e η 〇 w ,及進行S D A 2小時。 於序列識別编號：4 5 端之三個核苷酸，及於序列識別 编號：2(S2放大引子）3’端之三個核苷酸相同，因此競爭 相同的IS6U0結合位置。樣品1及4含有10000 M.tb基因 組分子，而樣品2及5含有100基因組分子。樣品3及6 不含 M.tb DNA。 SDA反應中，當目標序列放大時，産生45-聚物及66-聚物第二産物。唯有於M.tb DN A存在下，方觀察得，表 示信號引子延長，並轉形成雙股形（樣品1,2,4及5)。於 -2 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 批衣 訂 . 』 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 12. i C a? Β7 五、發明説明（θ ) 無M.tb DNA(樣品3及6)存在下，未見放射性標記産物。 使用濃度InM信號引子（樣品4-6)較O.lnM可獲得萑敏的 檢測，最可能原因為SDA中信號引子之雜交動力學更有 利，及信號引子/目標序列雜交體之熱力學安定性改良。 於0 . 1 η Μ長4 2個核苷酸之5 ’ - a P -標記信號引子（序列識 別编號：5)存在下，重複SDA。於信號引子（目標結合序列 )3’端之26個核苜酸雜交至介於放大引子間核苷酸位置 9 8 5 - 1 0 1 0之IS 6 11 0目標序列。目標結合序列5 ’端為限制 内切酶HincII之識別位置。Si及$2存在量為180及30nM 。不具核酸外切酶活性之Klenov使用0.25單位及SDA進行 3小時。樣品1-4分別含有10 0,1 0,1及0 M.tb基因組分子。 SDA反應中，信號引子藉聚合酶延長至58個核替酸長度。 此種58 -聚物藉上游放大引子延長（序列識別编號：2)置 換。58 -聚物之3’端雜交至其它放大引子（Si )3’端，於 藉聚合酶延長後生成雙股79 -聚物。於信號引子5‘端之 HincII識別位置，於生成雙股79 -聚物時，可為HincII 所切割。換言之，於雙股79 -聚物中，包括原始信號引 子之股及使用dGTP,dCTP,TTP及dATPa S進行聚合酶延長 生成之股可切割。HincII不會切割原始單股形信號引子 。SDA反應中，雙股79 -聚物之切割，産生5’-32p -標記 13 -聚物，其可檢測為第二放大産物。 58-聚物及79-聚物引子延長第二放大産物及13-聚物 切割第二放大産物唯有於M.tb目標DHA(樣品1-3)存在下 方可觀察到，表示信號引子延長，並轉形成雙股形；於 無（4.tb DNA存在下，無法觀察到第二放大産物（延長産物 或切割産物）。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝 訂 ^ (請先閱讀背面之注意事爷再填寫本頁) A7 3 蝴:/:7 B7 五、發明説明（>。） 於0 . InM長3 3個核苷酸之5 ’ - P-標記信號引子（序列 識別编號：6)存在下重複SDA。信號引子（目標結合序列） ---------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 3 '端之26個核苷酸雜交至介於放大引子間，位在核苷酸 位置985-1010之IS6110目標序列。目標結合序列5’端為 限制核酸内切酶之E c 〇 R I識別位置。S i及S 2存在量分別 為180及30 nM。不具核酸外切酶活性之Klenow用量為 0.25單位。SDA進行3小時。樣品1-4含有100,10,1及0 M.tb基因組分子。SDA後，20單位EcoRI加至各SDA反慝， 及樣品於37·〇培育30分鐘。 SDA反應中，信號引子藉聚合酶延長至49個核¥酸之 長度。49-聚物藉上游放大引子延長（序列識別编號：2) 置換。49-聚物之3’端雜交至另一放大引子（Si )3’-端， 於藉聚合贿延長後生成雙股70-聚物。信號引子5 ’端之 EcoRI識別位置，於70 -聚物生成及添加EcoRI後變成可 藉EcoRI切割。EcoRI切割雙股70 -聚物生成切割産物， 其為5’- =p-標記二核甘酸。此種二核甘酸可藉自動放 射性攝影檢測為第二放大産物。 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 49 -聚物及70 -聚物延長産物及二核甘酸切割第二放大 産物，唯有於M.tb目標DNA(樣品1-3)存在下方可觀察到 ,指示信號引子延長並轉形成雙股形。於無M.tbDNA存在下 ，未觀察得第二放大産物（延長産物或切割産物）。 32p -二核甘酸切割産物可藉液體閃爍計數交替檢測。 SDA於（K5nM 5'-32p-標記序列識別编號：6存在下重複。 用於SDA前，32 P-標記信號引子藉變性凝膠電泳，由激 -2 2 - 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央揉率局員工消费合作社印聚 ίβ Α7 Β7 五、發明説明（d ) 酶標記反應所使用的y-Tp-ATP中經純化。Si&s2# 在置為180及30nM ,不具核酸外切is活性之K 1 enow用量為 0.25單位。SDA進行3小時。樣品1-7分別含有105 ,104 ,103 ,102 ,1 0, 1 及 0 M.tb基因組分子。SDA後，40單 位EcoRI加至各SDA反應及樣品於37C培育30分鐘。 12.5// 1得自各50a1 SDA反應之整分於20bM TRIS-HC1 (PH7.4), 50mM KC1, 5 mM MgCl2 中稀釋至 75# 1。然 後各樣品使用MICROCOH-IO徹濃縮器（ABicon，Beverly, ΜΑ)過濾，及藉液體閃爍計數檢測濾液及過濾器上的up 活性。結果顯示如下： 樣品 M . t b基因組分 濾液 過濾器 子之最初數量 (c p B ) (cpn ) 1 105 13,449 44,802 2 104 12,299 49,366 3 103 9,006 50,739 4 102 6,689 52,712 5 10 3,153 57,732 6 1 2,072 55,835 7 0 2,120 57,995 藉 EcoRI切割雙股70 -聚物延 長産物放出的 32 p核苜酸 夠小 ，故可通過Μ I C R 0 C 0 N - 1 0過濾器，而較大的初始32 f 標記 3 3 -聚物信號引子，及& p …標記4 9-聚物 延長産物保 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公嫠） . 裝 訂 知 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Bk.H1 A7 B7 經濟部中央橾準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（ ) 1 ! 留 於 過 濾 器 上 〇 使 用 此 種 過 濾 檢 測 方 法 ，可在進行SDA 1 1 前於含有低至 10 値 N. tb基因組之樣品内檢測出 IS6110目標序列。 1 1 實 例 3 /-V 請 /fc 1 I 兩 種 信 號 引 子 > —* 種 修 飾 以 方 便 捕 捉 ,另一種修飾以 无 閱 1 方 便 檢 測 9 用 於 SI 丨A反應中産生第二放大産物。實驗中 背 1 I 之 1 t 種 信 號 引 子 有 親 和 配 位 基 (C ', 三傾生物素部分）接 注 意 1 1 到 5， 端 t 及 第 二 信 號 引 子 為 5 端 標 記 有 報告子基（R,含 事 項 1 1 再 32 P之磷酸基） 者 〇 如 此 ，含報告子基及親和配合基兩者之 填 % 本 裝 I 雙 股 第 二 放 大 産 物 (如第1 A及1B圖之結構式#3及#9)可被 頁 '—^ 1 I 捕 捉 及 撿 測 〇 本 例 中 塗 有 鐽 抗 生 物 素 之磁珠用於捕捉 1 1 及 分 離 第 二 放 大 産 物 9 然 後 藉 閃 爍 計 數 檢测。 1 1 生 物 素 化 信 號 引 子 製 備 如 下 〇 於 應 用 生物糸統DNA合成 1 儀 訂 型 號 380B 上 f 使 用 標 準 脒 代 亞 璘 酸 酯 (phosphoramidite) 1 化 學 合 成 寡 核 苷 酸 序 列 識 別 m 號 ：7 〇 然 後儀器用來三次 1 1 連 纊 與 BIOT 1_脒 代 亞 m 酸 酯 (C 1 〇 n e t e ch)偶合，將三掴 1 I 生 物 素 基 接 到 寡 核 苷 酸 〇 合 成 後 % 以 濃 氛處理脱去寡核 1 1 ¥ 酸 保 護 i 及 藉 變 性 凝 膠 電 泳 純 化 〇 接 上親和配位基供 1 捕 捉 第 二 放 大 産 物 之 生 物 素 化 信 號 引 子 稱為捕捉信號引 1 1 子 > 供 本 例 之 用 類 似 第 1A及 1B圖 之 Q , -C ’信號引子，其 1 1 中 Q， 包 括 生 物 素 〇 1 I 欲 裂 備 32 P- 標 記 信 號 引 子 V 赛 核 甘 酸 序列織別编號： 1 1 及 序 列 識 別 编 號 :8 如ί a 1 k e Γ , e t a 1 ,( 1 9 9 2. N u c 1 . 1 1 A c i d s . e e s . S U P I • a )所 述 1 以 放 射 性 磷 酸基標記。放射 1 I 性 標 記 信 m 引 子 稱 為 檢 測 信 號 引 子 » 用 於本例，類似第 1 1 -1 4 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 12. 16 B7 五、發明説明（>〇 1 A及1B圖之R-B信號引子，其中R包括放射性標記。實 驗中，兩種檢測信號引子之一與捕捉信號引子合併用於 産生第二放大産物。 SDA大體於 Walker, et al, (1992. Nucl. Acids. Res. s u p r a )所述進行，而有下列修改。放大引子為序列識別 编號：9及10 (類似第1A及1B圖之A及D ’）。此等引子放大 M.tb IS6110插人聚物之103個核苷酸片段（核¥酸位置944 -1046)。各 50« 1反應組含下列成分：KiP04 ,pH7.5; 6mM MgCl2 ;0.1ng/ml 乙醛化 BSA; 12% 二甲亞 fiH ; 0.5mM dUTP;各 0.2bM dCTP,dGTP,dATP〇(S; 500nM放大引子；50nM 缓衝引子（序列識別编號：11及1 2 ) ; 7 5 η M檢測信號引子及 捕捉信號引子（序列識別编號1及7或8及7) ; 100ng人 類胎盤 DNA; 150單位 HincII(New England Biolabs); 2.5單位 exo- Klen〇w DNA聚合贿（US Biochenicals); 396 (v/v)添加酵素之甘油；及0或105 M.tb基因組複本e 全部反應成分（MgCl2, HincII及聚合酶除外）經组裝 ，及混合物加熱至95 °C 2分鐘。然後樣品置於40°C水浴 2分鐘，3/zl 0.1M MgCl2加至各樣品，及混合樣品。 加入3#1含50單位/>ul HincII, 0.833單位///1聚合 酶之酵素混合物，及5 0 % ( v / v )甘油，及樣品於4 0 °C培 育2小時。 培育後，各反應混合物5// 1整分藉變性凝膠電泳分析 。因為於凝膠上檢測，僅需存在有R,故含基因組M.tb DNA之樣品之多種産物出現於50-120個核苷酸範圍，缺M.tb -2 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝 訂 1·" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局貝工消费合作社印製 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印聚 85.12. 五、發明説明（A ) DNA之反應不存在有此等帶，顯示於此大小範圍之反應 産 物 具 S 標 持 異 性 〇 根 據第1A及1B圖之反應圖計算信號 引 子 已 知 大 小 及 結 合 位 置測知此例預期之第二放大産物 示 於 下 表 0 由 第 1 Α及 1 B 圖可見結構式#3(於變性凝膠上 為 單 股 形 )含有R 且可檢測。此外，結構式# 3之可檢測 單 股 與 結 構 式 # 2相 同 9 及與結構式#9之可檢測單股相同 〇 因 此 此 等 第 二 放 大 産 物於凝膠上無法區別。因存在有 R 故 9 也 可 檢 測 結 構 式 #4及#5(於變性凝膠上也呈單股 形 )〇 箱計笛二産物大小 (核 甘 酸，nt) 結 構 式 (笛1 1^1 R圖） 32 P -標記信號引子 序 列 識 別编號：1 序列識別编號·· 8 #3 ，"及 #8 52 n t 9 2 n t #4 58 n t 9 8 n t #5 79 nt 119nt 塗 有 鐽 抗 生 物 素 之 磁 珠(Streptavidin Paramagnetic Pa r t 1 C 1 e S , N U C 1 e i c A cid Qualified, leg/nl , Promega Co Γ Ρ 0 Γ at i 〇 η , Ν ad is on ,WI)如製造商推薦以IX PBS洗3次 Ο 用 於 各 次 分 析 ， 5 0// g珠懸浮於1 . 5b 1伊李朵夫管 (( sppendorf tube: 丨内 之 180 wl 1XPBS中，且與 20 w 1 SDA 反 應 混 合 物 合 併 ο 此 等 樣品於室溫下培育10分鏡，偶而 攪 拌 〇 然 後 使 用 磁 鐵 於 管一側上收集珠，及去除上清液 〇 然 後 磁 珠 再 度 懸 浮 於 lXPBS(200tfl)中洗滌，於管销上 - 2 6 - I n I I I I ϋ ^ I I I I ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X 297公釐） 和^ A7 B7 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 五、發明説明（ >r ) 1 1 以 磁 鐵 收 集 t 並 去 除上 清 液 〇 重 複 洗 滌 3 次， 藉 液體 閃 1 1 爍 計 數 測 量 珠 上 殘 存丨Up活 性 〇 結 果 示 於 下 表： 1 I 檢 測 信 號 引 子 105 個起始基因組分子 0個起始基因紐分子 | 序 列 識 別 编 號 ：1 80 , 5 4 7 c P SI 1 ,080 C P m 讀 先 閱 1 I 讀 1 1 序 列 識 別 编 號 ：8 54 , 38 5 c P m 9 6 1 c P m 背 1 I 閃 爍 計 數 前 9 取 出小 置 磁 珠 (10% ) i 於 50% 尿 素存 在下 冬 1 1 I 加 熱 至 95t： • 並 於 變性 聚 丙 烯 醯 胺 凝 膠 上 電泳 〇 唯有 結 事 項 1 I 再 1 構 結 式 構 #3及 式結 »9含 合至 有 珠 生 方 物素 可檢 修 測 飾 〇 及 凝 IX 膠 Ρ標記， 之自動 預測唯有此二 放射性攝影確實 填 寫 本 頁 裝 1 I 顯 示 結 構 式 #3及 #9第二 放 大 産 物 表 示 磁 力 分離 過 程中 » 1 1 珠 保 有 的 主 要 放 射 性物 種 〇 然 而 9 對 應 於 結構 式 # 1之 小 1 I 量 物 種 也 出 現 於 白 動放 射 性 照 Μ 0 可 能 由 撿測 信 號引 子 1 1 延 長 産 生 的 結 構 式 # 1 , 當 雜 交 至 Q ' -C '捕捉引子時可被 訂 I 捕 捉 (於捕捉信號引子延長及産生結構式# Λ "1i 11 2刖 參見第 1 | 1 A 画 結 構 式 # 1 後 方 反應 步 驟 )〇 雖然除預期之結構式# 3 1 1 及 #9外 ♦ 顯 然 可 捕 捉及 檢 測 小 量 結 構 式 # 1 ,但 全 部捕 捉 1 1 及 檢 測 第 二 放 大 産 物皆 為 百 標 特 異 性 > 不 會出 現 於缺 乏 I 基 因 組 Μ . t b D N A 之 樣品 〇 1 1 於 無 Μ . t b D N A (〇 初始基因組分子） 存 在 下， 於 珠上 檢 1 I 測 的背景放射性顯然來自於未反應檢測信號引子的非 1 1 特 異 性 結 合 0 來 白 此等 樣 品 之 珠 進 行 電 泳 分析 顯 示唯 一 1 1 存 在 的 放 射 性 物 料 即使 在 自 動 放 射 性 照 片 曝光 隔 夜後 > 1 I 對 應 於 檢 測 信 號 引 子仍 極 為 昏 暗 帶 〇 然 而 ,此 等 背景 信 1 1 BAi m 程 度 上 可 清 晰 檢 測到 第 二 放 大 産 物. I I -2 7 - 1 1 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4 ) 序列表 (1 ) 一般資訊： (i)申請人：Nadeau, James G.

Walker, George T . (i i)發明名稱：核酸放大之偵測 (i i i)序列數：1 2 (iv)通訊地址： (A) 受信人：Richard J. Rodrick-Becton Dickinson and Company (B) 街名：1 Becton Drive (C) 市名:Franklin Lakes

(D) 州名：N J (D)國名：US (F)郵遞區號：Q7417 (v )電腦可讀格式： (A)媒體類型：軟性磁碟 (B )電腦：I Β Μ P C相容

(C) 操作糸統：PC-D0S/MS-D0S (D) 軟體：PatentIN Release #1.0, Version #1.25 (v i )目前申請資料： (A )申請案號： (B )申請日： (C )分類： (v i i )代理人資訊： _ 2 8 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公嫠） 裝 訂 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) S〇69 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（V ) (A)姓名:Fugit, Donna R , (B )註冊编號：3 2，1 3 5 (C)檔案编號：P- 2821 (2 )序列識別编號1之資訊： (i )序列待徵： (A)長度：15氮齡基對 (B )類別：核酸 (C) 股：單 (D) 形態：線性 (i i )分子類別：D N A (基因組） Ui)原始來源： (A )有機體：結核桿菌 (X i )序列說明：序列識別编號：1 CGTTATCCAC CATAC (2 >序列識別编號2之資訊： (i )序列特激： (A)長度：37氮鹸基對 (B )類別：核酸 (C) 股：單 (D) 形態：線性 (i i )分子類別：D N A (基因組） (vi)原始來源： (A )有機體：結核桿菌 (i X )特性： -2 9 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（>δ> ) (A)名稱 / 關鍵字：misc-feature (B )位置：1 9 . . 2 4 (D)其它資訊:/ function="HincII recognition site" (i x )恃性： (A) 名稱 / 關鍵字：aisc-feature (B) 位置：25..37 (D)其它資訊：/function=" Target Binding Sequence" U i)序列說明：序列識別编號2 : GCATTATAGT' ACCTGTCTGT TGACACTGAG ATCCCCT (2 )序列識別编號3之資訊： (i )序列恃徵： (A)長度：28氮鹼基對 (B )類別：核酸 (C) 股：單 (D) 形態：線性 (ii)分子類別：DNA(基因組） (v i )原始來源： (A )有機體：結核桿菌 U i )序列說明：序列識別编號·. 3 : CTATCCGTAT GGTGGATAAC GTCTTTCA (2 )序列識別编號4之資訊： (i )序列特擞： -3 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 裝 訂^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 五、發明説明（>9 ) (A)長度：1 5氮鹼基對 (B )類別：核酸 (C) 股：單 (D) 形態：線性 (i i )分子類別：D N A (基因組） (vi)原始來源： (A)有機體：結核桿菌 U i )序列說明：序列識別编號：4 : CCTATCCGTA TGGTG (2 )序列識別编號5之資訊： (i )序列特擻： (A)長度：42氮鹼基對 (B )類別：核酸 (C) 股：單 (D) 形態：線性 (i i )分子類別：D N A (基因組） (vi )原始來源： (A )有機體：結核桿菌 (ix)恃性： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (A)名稱 / 關鍵字：misc-feature (B )位置：1 1 . · 1 6 (D )其它資訊：/ f u n c t i ο η = " H i n c I I識別位置 (x i )序列説明：序列識別编號：5 :

GTACGTCTAT GTCAACATCC GTATGGTGGA TAACGTCTTT C A -3 1 -本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 A7 B7 五、發明説明（Μ ) (2 )序列識別编號6之資訊： (i )序列待歡： (A)長度：33氮鹼基對 (B )類別：核酸 (C) 股：單 (D) 形態：線性 (i i )分子類別：D N A (基因組） (vi)原始來源： (A)有機體：結核桿菌 (X i )序列說明：序列識別编號：6 : GGAATTCATC CGTATGGTGG ATAACGTCTT TCA (2 )序列識別编號7之資訊： (i )序列待激： (A)長度：33氮_基對 (B )類別··核酸 (C)股：單 (D )形態：線性 (i i )分子類別：D N A (基因組） (vi)原始來源： (A)有機體：結核桿薗 (X i )序列説明：序列識別编號 7 : TGACAGCATG ATAGAGCGGC ACTGAGATCC CCT (2 )序列識別编號8之資訊： (i )序列待徽： -3 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝 訂 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 五、發明説明（Μ ) (Α)長度：3 3氮驗基對 (B )類別：核酸 (C)股：單 (D )形態··線性 (i i )分子類別：D N A (基因組） (v i )原始來源： (A)有機體：結核桿菌 (X i )序列説明：序列識別编號：8 : TTCATTGGCA CATAAACAGC GGCGTACTCG ACC (2)序列識別编號：9之資訊： (i )序列待激： (A)長度：36氮齡基對 (B )類別：核酸 (C) 股：單 (D) 形態：線性 (ii)分子類別：DNA(基因組） (vi>原始來源： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (A )有機體：結核桿菌 (X i )序列說明：序列識別编號：9 : TTGAATAGTG CCTTACTTGT TGACGCAAGC CATCTG (2 )序列識別编號：1 Q之資訊： (i )序列特擞： (A)長度：35氮鹼基對 (B )類別：核酸 -3 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 A7 B7 五、發明説明（P ) (C) 股：單 (D) 形態：線性 (i i )分子類別：D N A (基因組） (vi)原始來源： (A )有機體：結核桿菌 (X i)序列說明：序列識別编號：1 0 : TTGAAGTAAG GCACTATTGT TGACTCGCTG AACCG (2 )序列識別编號：1 1之資訊： (i )序列特擻： (A)長度：12氮鹼基對 (B )類別：核酸 (C) 股：單 (D) 形態：線性 (i i )分子類別：D N A (基因組） (v i )原始來源： (A )有機體··結核桿菌 (X i )序列說明：序列識別编號：1 1 : TCCATGGTCC TC (2 )序列識別编號：1 2之資訊： (i )序列待擻： (A)長度：13氮鹸基對 (B )類別：核酸 (C) 股：單 (D) 形態：線性 -3 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0'〆297公釐） ---------^-------ΐτ------0 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 五、發明説明（W ) (i i )分子類別：D N A (基因組） (v i )原始來源：

(A)有機體：結核桿菌 (X i )序列説明：序列識別编號：1 2 : CATAGGAGCT TCC 裝 訂 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims (1)

1. 3(j Oil / Ϋ 乂多正 j A8 :本年月日C8 ，:·甫充 I D8 **^garrr...... ......... ) ~ - 六、申請專利範圍 第8 4 0 2 7 7 6號「核酸放大之偵測」專利案 (85年丨2月修正） 巧申請專利範圍 1. 一種於股置換放大（SDA)反應同時産生第二放大産物 及放大産物之方法，其中該SDA反應包括U)具有股置 換活性，而缺5’-3'核酸外切酶活性之DNA聚合酶，及 (i i)可切割半修飾雙股限制核酸内切酶識別位置之限 制核酸内切W ,該方法包括： 'a)雜交信號引子至目標序列，及雜交第一 SDA放大 -引子至信號引子上游之目標序列； b )於目標序列上延長已雜交的倍號引子，産生信號 引子延長産物，及於目標序列上延長已雜交的第一放 大産物•因此第一放大引子延長，而由目標序列置換 信號引子延長産物； 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 -n - - - - m m - ^ m In - - - - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) c)雜交第二SDA放大引子至信號引子延長産物，及 於信號引子延長産物上延長已雜交的第二放大引子， 而産生第二放大引子延長産物，該産物包括新合成的 一股及限制核酸内切酶用之雙股半修飾識別位置； d )切割該半修飾識別位置，及使用D N A聚合酶由信 號引子延長産物置換新合成股； e)雜交信號引子至己置換的新合成股，及延長信號 引子因此産生雙股第二放大産物。 本纸張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 々、申請專利範圍 2. 如申請專利範圍第1項之方法，又包括利用併入信號 引子之化學修飾或待殊核苷酸序列檢測第二放大産物。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該第二放大産物 偽利用併入信號引子親和配位基或報告子基檢测。 4. 如申請專利範圍笫2項之方法，其中該第二放大産物 傜利用併入信號引子之核苷酸序列檢測，該核蒈酸序 列包括雙股DN A結合蛋白質之識別位置。 5. —種於股置換放大（SDA)反慝同時産生第二放大産物 及放大産物之方法，其中該SDA反應包括（i)具有股置 換活性，而缺5’-3’核酸外切酶活性之DKA聚合SS,及 (i i )可切割半修飾雙股限制核酸内切S§識別位置之限 制核酸内切該方法包括： a) 雜交第一信號引子至雙股目標序列之第一股，及 雜交第一 SD A放大引子至第一信號引子上游目標序列之 第一股； 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) b) 於第一股上延長已雜交的第一信號引子，而産生 第一延長產物，及於第一股上延長已雜交的第一放大 引子，因此第一放大引子之延長自目標序列置換第一 延長産物； c) 雜交第二信號引子至第一延長産物，及雜交第二 SD A放大引子至第二信號引子上游之第一延長産物； d) 於第一延長産物上延長已雜交的第二信號引子， -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） d(J6^7 Λ8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 而産生第二延長産物，及於第一延長産物上延長己雜 交的第二放大引子，因此第二放大引子之延長自第一 延長産物置換第二延長産物； e)雜交第一信號引子至已置換的第二延長産物，及 於第二延長産物上延長已雜交的第一信號引子，因此 生成雙股第二放大産物。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，又包括利用併入第一 信號引子之報告子基檢測第二放大産物，及修飾俾便 捕捉併入第二信號引子之第二放大産物。 7. 如申謓專利範圍第5項之方法，又包括下列步驟： a) 雜交第二信號引子至雙股目標序列之第二股，及 雜交第二放大引子至第二信號引子上游目標序列之第 二股； b) 於第二股上延長己雜交的第二信號引子，而産生 第三延長産物，及於第二股上延長已雜交的第二放 大引子，因此第二放大引子之延長自目標序列之第二 股置換第三延長産物； 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ---------/------1T (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) c) 雜交第一信號引子至己置換的第三延長産物，及 雜交第一放大引子至第一信號引子上游已置換的第三 延長産物； d) 於第三延長産物上延長己雜交的第一倍號引子， 而産生第四延長産物，及於第三延長産物上延長已雜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 六、申請專利範圍 A8 Βδ C8 D8 三 第 自 長 延 之 子 引 大 放 一 ; 第物 此産 因長 -延 子四 引第 大換 放置 一 物 第産 的長 交延 及此 , 因 物 - 産子 長引 延號 四信 第二 的第 換的 置交 已雜 至已 。 子長物 引延産 號上大 信物放 二産二 第長第 交延股 雜四雙 e)第成 於生 號物物 信産産 人大大 併放放 用二 二 利第第 括測該 包檢中 又列其 , 序 ， 法酸法 方»方 之核之 項殊項 Γ- 特 8 第或第 圍飾圍 範修範 利學利 專化專 請之請 申子申 如引如 0 物 測産 檢大 基放 子二 告第 報該 或中 基其 位 ， 配法 和方 親之 之項 子 8 引第 號圍 信範 入利 併專 用請 利申 係如 號 信DN 入股 併雙 用括 利包 俗列 序 酸» 核 該 測 檢 列 序 酸» 核 之 子 置 位 別 識 之 質 白 蛋 合 結 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨-· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）