JPS61293399A - 相補的ｄｎａ鎖を使用することによるハイブリダイゼ−シヨンシグナルの増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、標的分子の検出および定量分析において使用
する生物学的プローブのシグナル発生能を高めるだめの
方法、試薬組成物ならびにキットに関する。よ）詳細に
は、本発明はＤＮＡ（デオキシリボ核酸）プローブまた
はＲＮＡ（ＩＪボ核酸）プローブのシグナル発生能が標
識物質の二次網状構造の形成によシ増幅または増強され
るＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリダイゼーション検定を
行うだめの方法、試薬組成物ならびにキットに関する。

従来の技術 本発明をよシよく理解するだめに次の定義を用いる。本
明細書中の”生物学的結合対”という用語は、相互に親
和力または結合力を示す全ての分子対を意味する。本明
細書中の”リガンドという用語は生物学的結合対の一方
の分子を意味し。

そして”抗すガンドパまたは”受容体”という用語は生
物学的結合対の他方の分子を意味するだろう。例えば、
制限するものではないが、本発明の実施態様は生物学的
結合対としてホリ核酸の２つの相補鎖を用いる核酸ハイ
ブリダイゼーション検定に適用される。これらの相補鎖
の一方はりガントと呼ばれ、他方は抗リガンドと呼ばれ
る。しかしながら、生物学的結合対には、二重の例を挙
ｄると、抗原と抗体、薬物と薬物受容体、および埋素と
酵素基質が含まれる。

“プローブという用語は標的リガンドに結ぞすることが
知られている生物学的結合対の一員舌意味する。核酸に
適用する場合、゛プローブ”に標的核酸鎖に相補的な塩
基配列を有する核酸鎖苓意味する。゛標識”という用語
は１例えば放射セ同位体；酵素；螢光体；化学発光体；
沈殿剤；または色素を含めた検出可能な分子を意味する
。

生細胞中の遺伝情報はＤＮＡまたはＲＮＡ０糸０分子に
記憶される。生体内において、ＤＮＡ分子分子型二重ん
構造をしており、各ＤＮＡ鎖はヌクレオチドゝの鎖から
成っている。各ヌクレオチドは４４類の塩基：すなわち
アデニン（Ａｌ、グアニン（Ｇ）、ラミン■およびシト
シン（Ｃ）のうちの１つによって生機づけられる。これ
らの塩基は、官能基の向きいよシ、一定の塩基対が互い
に引き付は合って水素結合を介して結合するという意味
において相補白であると言える。一方のＤＮＡ鎖中のア
デニンは作°　　方の相補鎖中のチミンと対を形成し、
また一方のＤＮＡ鎖中のグアニンは他方の相補鎖中のシ
トシンと対を形成する。

生物の遺伝暗号は塩基対の配列中のＤＮＡ鎖により伝達
される。ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチドの共有結合
した鎖から成り、そしてＲＮＡはリボヌクレオチドの共
有結合した鎖から成っている。そミ　　れぞれの核酸は
１つのヌクレオチドの糖の５′ヒドロキシル基と隣接ヌ
クレオチド９の糖の３′ヒト９０キシル基トの間でリン
酸ジエステル結合によって結合している。ＤＮＡまたは
ＲｌＪＡの各線状鎖は遊離の５′末端と３′末端を有す
る。

核酸ハイブリダイゼーション検定は、二本の核電　　酸
銀がそれらの相補領域で対合し且つ巻き戻されて二重ら
せん構造を形成しやすいという性質に基ト　　づいてい
る。これらの塩基配列の相補性の程度が大きくなればな
るほど、特定の核酸鎖同士が会合して二重鎖を形成する
傾向は大きくなる。

Ｊ　　　現在、核酸ハイブリダイゼーション検定は完全
１　　　なりＮＡまたはＲＮＡ分子、核酸の混合物また
は核酸フラグメントの混合物中の特定のＤＮＡ　または
ＲＮＡ塩基配列もしくは特異的遺伝子を検出し、同定す
るために主として用いられている。細菌から抽出された
ＤＮＡ−４たはＲＮＡに含まれる特定のＤＮＡまたはＲ
ＮＡ配列もしくは特異的遺伝子の同定は、抗生物質耐性
を伝達する酵素の遺伝子の存在を明らかにするかも知れ
ない。また、ヒトや動物の組織から抽出されたＤＮＡに
含まれる特定のＤＮＡ配列まだは特異的遺伝子の同定は
、ヒトや動物をがんあるいは餅状赤血球貧血のような遺
伝病にか＼りやすくする遺伝子の存在を示すかも知れな
い。

従って、核酸ハイブリダイゼーション検定は遺伝子まだ
は染色体の異常、伝染病における抗生物質耐性および組
織適合性を含めた疾患の診断まだは検出に大きな可能性
を有している。さらに、核酸ハイブリダイゼーション検
定は植物病原体または毒素産生菌を検出する際に使用さ
れ、農業や食品加工の分野においてもその可能性が期待
されている。

一般的なポリヌクレオチドハイブリダイゼーション試験
においては、２つのＤＮＡ試料を混合し、両者の解離温
度以上に加熱し、その後徐々に冷却する。もし２つのＤ
ＮＡ試料が相補的塩基配列を有するならば、それらは会
合してハイブリッド二重鎖を形成するであろう。この種
のハイブリッドが形成される程度は、ＤＮＡ試料の一方
をリンの放射性同位体（３２ｐ）で標識しておき他方の
試料を固体支持体上に固定することにより容易に測定す
ることができる。２つのＤＮＡ試料をハイブリダイズさ
せた後、ＤＮＡ鎖が固定されている表面を単に洗浄する
ことによシ、固定ＤＮＡ鎖からハイブリダイズされなか
ったＤＮＡ鎖を分離できる。

その後、この表面を他方のＤＮＡ鎖の放射性標識によっ
て示される放射能について試験する。

最も広く使用される方法の１つはサザン・プロット・フ
ィルター・ハイブリダイゼーション法または単にサチン
法として知られるものである（　５ｏｕｔ、ｈｅｒｎ、
Ｒ、Ｔ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、９８　、５０３　、１
９７５参照）。サチン法は標的ＤＮＡ配列を固定するた
めに使用される。この方法は、標的塩基配列を含むと思
われる生物由来のＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼ
で消化して、ＤＮＡフラグメントを作ることによシ実施
できる。このＤＮＡフラグメント試料は次にアガロース
またはポリアクリルアミドのようなゲルによる電気泳動
処理にかけ、これらのフラグメント試料を長さに応じて
分画する。

各フラグメント群は標的塩基配列の有無について試験さ
れる。ＤＮＡをゲルの内部で変性してニトロセルロース
シートへ移行させる。ＤＮＡフラクメン）試ｔ’）ｆ含
ｔｒケルはニトロセルロースフィルターシートまたはジ
アゾ化Ｆ紙と接触するように配置し、ＤＮＡフラグメン
ト試料をニトロセルロースシートまたはジアゾ化Ｆ紙へ
移行させ、結合させる。次に、ＤＮＡフラグメント試料
を含むニトロセルロースシートを約８５０に加熱してＤ
ＮＡを固定する。その後、変性した放射性標識ＤＮＡプ
ローブを含む溶液でこのニトロセルロースシートを処理
する。放射性標識ＤＮＡプローブは、標的塩基配列に相
補的な塩基配列を有し且つ検出可能な放射性成分を含む
ＤＮＡ鎖である。このプローブとＤＮＡフラグメント試
料の間でハイブリダイゼーションを行わせる。このハイ
ブリダイゼーション法により、ＤＮＡ試料が標識ＤＮＡ
プローブと組み合わされて再び二本鎖構造を形成する。

ハイブリダイゼーション法は非常に特異的である。

もし２つのＤＮＡ物質が相補的塩基機構を共有しない場
合には、標識ＤＮＡプローブがＤＮＡ試料と組み合わさ
れることはないであろう。ハイブリダイゼーションはそ
れぞれの条件に応じて３〜４８時間を要する。次に、ハ
イブリダイズされなかったＤＮＡプローブを洗いおとす
。その後、ニトロセルロースシートをＸ線フィルムのシ
ート上ニのせて感光させる。Ｘ線フィルムの感光面を現
像して、ＤＮＡプローブとハイブリダイズされたＤＮＡ
フラグメント（目的の塩基対配列を有する）を同定する
。

核酸ハイブリダイゼーション検定の使用は、Ｘ線フィル
ム上のバンドを視覚化するのに要する比較的長い感光時
間によって一部制限されている。

一般的なサチン法は感光だけのために１〜７日を要する
。さらに、この技術の多くは標識剤として放射性同位体
を必要とする。放射性標識剤を取シ扱うには特別の実験
室手段とライセンスが必要である。酵素、螢光体または
化学発光体の標識成分を利用する非放射性検定は信頼し
うるハイブリダイゼーション検定とみなすのに十分な感
度または特異性を有していない。

非放射性ハイブリダイゼーション検定の感度を増そうと
して、ニューヨークにあるバンド・バイオケム社（ＥＮ
ＺＯ）はパイオーブリッジ（ＢＩＯ−ＢＲＩＤＧＥ）と
いう商標名のＤＮＡ検定システムを市場化した。このＥ
　ＮＺＯシステムはポリニーテイルト（ｔａｉｌｅｄ）
プローブとして使用するために、ＤＮＡフラグメントの
デオキシリボース糖主鎖の末端３′ヒドロキシル位置に
チミジンの６テイル”（ポリＴ）を結合させるべくター
ミナルトランスフェラーゼ酵素を使用する。ポリＴ−テ
イルトプローブは標的ＤＮＡとハイブリダイスしてそれ
を固定化する。ハイブリダイズされないポリＴ−テイル
トプローブは洗いおとすか、その他の方法で除去する。

次に、少なくとも１つのビオチン分子を組み入れたアデ
ノシンの標識ホモポリマー鎖（ポリＡ）を、このプロー
ブのポリＴテイルとハイブリダイズさせる。ビオチンは
非放射性標識成分である。螢光色素まだは発色性酵素に
カップリングされるビオチン結合性タンパク質とビオチ
ンとの相互作用によって、ビオチンを検出することがで
きる。ハイブリダイズされないポリＡ鎖は洗いおとすか
、または除去する。標識上のビオチンの検出は標的ＤＮ
Ａの存在を示す。とのＥＮＺＯシステムのシグナル増強
能は限界があるように思われる。

特に、プローブセグメントに組み入れられるテイルセグ
メントの長さに実際上の限界がある。テイルセグメント
の長さが増すにつれて、ハイブリダイゼーションの効率
および感度は低下する。テイル部分の長さが制限される
と、標識成分をテイルに組み入れる能力、すなわちテイ
ルと別のポリヌクレオチド−標識セグメントをハイブリ
クズする能力が制限される。

発明の目的・構成 本発明の目的は、生物学的結合対の一員である対象分子
を検定するための方法、試薬組成物およびキットを提供
することである。その他の目的を以下に示すであろう。

簡単に述べれば１本発明の実施態様は生物学的結合対の
標的−員について試料を検定する方法を包含する。この
方法は生物学的結合対の標的リガンドを含む試料と試薬
とを結合条件下で接触させることを含む。試薬としては
受容体プローブ、アンプリフアイア鎖（ａｍｐｌｉｆｉ
ｅｒ　５ｔｒａｎｄ）および標識鎖が含まれる。受容体
プローブは結合条件下で標的リガンドと特異的に結合で
きる。受容体プローブはさらにアンプリフアイア鎖と結
合しうるポリヌクレオチドテイル部分を含む。アンプリ
フアイア鎖はテイル部分と、および標識鎖の少なくとも
１つと結合しうるポリヌクレオチド鎖を含む。

標識鎖は検出可能な標識成分を有するポリヌクレオチド
鎖を含む。非結合試薬を試料から除き、その後標識成分
の存在について試料を測定する。本発明は一本鎖標的分
子に一連のハイブリダイゼーションを開始させて、ポリ
ヌクレオチドアンプリフアイアと標識鎖の網状構造を形
成させる。この網状構造は一本鎖標的分子のシグナル発
生能を高める。

好ましくは、受容体プローブのテイル部分はポリＡやポ
リＴのようなりＮＡまたはＲＮＡのホモポリマーを含む
。アンプリフアイア鎖は好ましくはテイル部分と相補的
なりＮＡまたはＲＮＡのホモポリマーである。従って、
受容体プローブのテイル部分がＤＮＡやＲＮＡのポリＡ
ホモポリマーである場合、１つのアンプリフアイア鎖は
ポリＴホモポリマーを含むのが好ましい。同様に、受容
体プローブのテイル部分がＤＮＡやＲＮＡのポリＴホモ
ポリマーである場合、アンプリフアイア鎖はポリＡのホ
モポリマーを含むのが好ましいだろう。

好適には、標識鎖はアンプリフアイア鎖と相補的なりＮ
ＡまたはＲＮＡのホモポリマーである。さらに、標識鎖
は検出可能な標識成分を含む。標識成分には１例えば放
射性同位体もしくは酵素、螢光体、化学発光体。

沈殿剤または色素のような非放射性物質が含まれるが、
これらに限定されない。当技術分野で習熟した者は、そ
の他の試薬物質（例えばアンプリフアイア鎖、受容体プ
ローブのテイル部分および受容体プローブそれ自体）゛
もまた標識成分を保有し得ることも認めるであろう。

本発明の１つの実施態様は、一本領ポリヌクレオチド標
的セグメントについて試料を検定する方法を包含する。

この方法は一本鎖ポリヌクレオチド標的セグメントを含
むと思われる試料と試薬ポリヌクレオチド鎖とをハイブ
リダイゼーション条件下で接触させることを含む。試薬
ポリヌクレオチド鎖にはポリヌクレオチドプローブ鎖、
ポリヌクレオチド９アンプリフアイア鎖、およびポリヌ
クレオチド標識鎖が含まれる。プローブ鎖は標的セグメ
ントの代表的部分と相補的な塩基配列を含む。

プローブ鎖はさらにアンプリフアイア鎖と結合しうるボ
リヌクレオチドテイル部分を含む。アンプリフアイア鎖
は標識鎖と結合できる。標識鎖は検出可能々標識成分を
含む。ハイブリダイゼーションを行った後、ハイブリダ
イズされなかった試薬鎖を試料から除き、この試料を標
識成分の存在について検定する。標識応答の強度は、試
料中の標的一本領ポリヌクレオチドセグメントの濃度を
示している。

好適な実施態様は、標的ポリヌクレオチドセグメントと
ポリヌクレオチドプローブ鎖のシグナル発生能を考慮し
て、多数の標識鎖と結合しうるアンプリフアイア鎖を含
む。

本発明の実施態様はさらに、試料と第二組のアンプリフ
アイア鎖／標識鎖とを接触させる追加工程を含む。第二
アンプリフアイア鎖ハ先のアンプリフアイア鎖と結合す
ることができ、そして第二標識鋲は第二アンプリフアイ
ア鎖と結合することができる。この追加工程を繰シ返し
行って、受容されるシグナル水準に達するまでアンプリ
フアイア鎖と標識鎖の網状構造を構築する。

本発明の実施態様はさらに、ポリヌクレオチドテイル部
分を有するプローブ鎖と共に使用するための試薬組成物
を包含する。試薬組成物はホリヌ・　クレオチドアンプ
リフアイア鎖およびポリヌクレオチド標識鋲を含む。ア
ンプリフアイア鎖はプローブ鎖のテイル部分の代表的セ
グメントと相補的であシ、ホリヌクレオチド標識鎖はポ
リヌクレオチドアンプリフアイア鎖の代表的セグメント
と相補的である。この標識鋲は検出可能な標識成分を含
む。

さらに１本発明の実施態様はアンプリフアイア鎖および
標識鋲だけでなくポリヌクレオチドプローブ鎖を含む試
薬組成物を包含する。このホＩＪヌクレオチドプローブ
鎖もまたアンプリフアイア鎖の代表的セグメントと相補
的なテイル部分を有する。

さらに１本実施態様は試薬鎖が互いにハイブリダイズし
ている試薬組成物を包含する。この試薬鎖を一本領ポリ
ヌクレオチドセグメント試料と接触させて、試薬鎖の網
状構造を形成させる。

本発明の実施態様はさらに、試料中の標的−水銀ポリヌ
クレオチドセグメントを検定するためのキットを包含す
る。このキットは標的一本領ボリヌクレオチドセグメン
トの代表的部分と相補的な試薬一本領ポリヌクレオチド
プローブ鎖を含む。

各試薬プローブ鎖は相補的な試薬ポリヌクレオチドアン
プリフアイア鎖と結合しうるポリヌクレオチドテイル部
分を有する。このキットは試薬ポリヌクレオチドアンプ
リフアイア鎖と試薬ポリヌクレオチド標識鋲をさらに含
む。標識鋲はアンプリフアイア鎖と相補的であシ、検出
可能な標識成分を含む。ハイブリダイゼーション条件下
で、試薬プローブ鎖を標的セグメント試料とハイブリダ
イズさせる。アンプリフアイア鎖は試薬プローブ鎖のテ
イル部分とハイブリダイズさせ、そして試薬標識鎖をア
ンプリフアイア鎖とハイブリダイズさせる。それにより
、標的セグメントをハイブリダイズされた試薬鎖の網状
構造体が形成される。

本実施態様はさらに、第二アンプリフアイア鎖と第二標
識鋲を有するキットを包含する。第二アンプリフアイア
鎖は第一アンプリフアイア鎖と結合できる。第二標識鋲
は第二アンプリフアイア鎖と結合しうる。第一および第
二のアンプリフアイア鎖と標識鋲を繰シ返し使用して、
アンプリフアイア鎖と標識鋲の網状構造体を構築し、そ
れにより検出可能なシグナルを増強する。

本発明の方法、試薬組成物およびキットは通常の検定技
術およびキットの活性の５倍に近い改良された比活性を
提供する。本方法によシ形成された試薬網状構造体の高
い比活性は感光時間を最小限に抑える。

今や、好適な実施態様を例示する図面を参照すると、こ
＼には標的ポリヌクレオチド鎖を検定する方法が必要な
試薬組成物と共に模式図により例示されている。第１図
はニトロセルロース紙のような固体支持体上に固定され
た標的鎖（ＴＳ）を示す。通常の検定技術において、一
本より多い標的鎖が固定されるが、本発明を理解しやす
くするために、一本の標的鎖のみを図示する。標的鎖は
その代表的部分と相補的な塩基配列を有する試薬プロー
ブ（ＲＰ）と接触させる。ハイブリダイゼーション条件
下で、標的鎖とプローブ鎖とは支持体に固定された標的
−プローブニ重鎖（ＴＰ）を形成する。

プローブ鎖はアンプリフアイア鎖（相補的塩基配列のポ
リＡホモポリマーを含む）と結合しうるポリＴホモポリ
マーを含むテイル部分を有する。

テイル部分とアンプリフアイア鎖は１本発明を理解しや
すくするために、不特定数のヌクレオチドにより例示さ
れる。例示されたホモポリマーの結合部位も不特定でち
ることが認識されるであろう。

今や第２図を参照すると、アンプリフアイア鎖（Ａ）が
ハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドプロ
ーブのテイル部分と接触される。テイル部分とアンプリ
フアイア鎖は標的−プローブ−アンプリフアイア複合体
（ＴＰＡ）をすみやかに形成する。

テイルーアンプリファイア鎖はアンプリフアイア鎖に相
補的な塩基配列（４リＴのホモポリマー）を含む標識鋲
−〇ための複数の結合部位を有する。

標識鋲（Ｌ）はヌクレオチドを表わす大文字の上の点に
よシ示される検出可能な標識成分を含む。ハイブリダイ
ゼーション条件下で、化学量論量以下の標識鋲（Ｌ）が
アンプリフアイア鎖（Ａ）の一部に結合して、第３図に
示すように標的−プローブ−アンプリフアイア−標識複
合体（ＴＰＡＬ）を形成する。結合されない試薬プロー
ブ鎖、アンプリフアイア鎖および標識鎖は洗いおとすこ
とができ、試料は標識の存在について測定される。標識
の存在は標的鎖の存在を表わす。

いくつかの場合、特に非放射性標識成分を含む場合には
、標的−プローブ−アンプリフアイア−標識複合体（Ｔ
ＰＡＬ）のシグナル発生能をさらに増幅または増強する
ことが望ましい。従って、第一のアンプリフアイア領内
および標識鎖（Ｌ）を、第一アンプリフアイア鎖の非ノ
ヘイブリツド部分と結合しうるＴホモポリマーのような
第二アンプリフアイア鎖〆と接触させる。・・イブリダ
イゼーション条件下で、第二アンプリフアイア鎖（Ａつ
は第一アンプリフアイア鎖に沿った遊離領域と二重鎖を
形成して、第４図に示すような構造体（ＴＰＡＬＡつを
形成する。

第二アンプリフアイア鎖（八りと結合しうる第二標識鎖
（Ｌ′）を、ノ・イブリダイゼーション条件下で第二ア
ンプリフアイア鎖（Ｎ）と接触させる。第二標識鎖（Ｌ
／）は第二アンプリフアイア鎖（Ａ′）の一部と共に二
重鎖をすみやかに形成して、第５図に最もよく示すよう
な複合体（ＴＰＡＬＡ／Ｌ／）を形成する。

好ましくは、それぞれのハイブリダイゼーション工程後
に、ノ・イブリダイズされない試薬鎖を試料から除く。

最終ハイブリダイゼーション工程および最終洗浄の後、
試料は標識の存在について測定される。

第二アンプリフアイア鎖および第二標識鎖の後に追加の
アンプリフアイア鎖と標識鎖の組合せが続くことは理解
されるであろう。さらに、自技術分野で習熟した者は、
標識鎖とアンプリフアイア鎖の組合せを単一物質として
標的鎖および試薬プローブ鎖と接触させることによシ、
工程数を減らし得ることも認識するであろう。

従って、第６ａ図において、第一アンプリフアイア鎖（
Ａ）と化学量論量以下の標識鎖（Ｌ）とを接触させるこ
とによシ、第一のアンプリフアイア−標識複合体（ＡＬ
）が形成される。同様に、第二アンプリフアイア鎖（Ａ
′）と化学量論量以下の第二標識鎖（Ｌ’）とを接触さ
せることによシ、第６ｂ図に示すように第二のアンプリ
フアイア−標識複合体（Ａ′Ｌ′）が形成される。

第１図の標的−プローブ二重鎖を第一のアンプリフアイ
ア−標識複合体（ＡＬ）とノ・イブリダイゼーション条
件下で接触させると、第７図に示すように複合体（ＴＰ
ＡＬ）が形成される。次に、第二のアンプリフアイア−
標識複合体（Ａ／　Ｌ／　）を複合体ＴＰＡＬと・・イ
ブリダイゼーション条件下で接触させると、第８図に示
すようにアンプリフアイア−標識鎖のよシ大きな網状構
造体（ＴＰＡＬＡ／Ｌつが形成される。

再び、各ハイブリダイゼーション工程後に、ハイブリダ
イズされない試薬鎖を試料から取シ除く。

最終ハイブリダイゼーション工程および最終洗浄の後に
、試料は標識の存在について測定される。

ホモポリマー試薬鎖のハイブリダイゼーションはすみや
かに起こる。塩基対は相補的配列を見つけ出すように配
置する必要がない。１つの塩基対が互いに引き付は合う
位置に来ると、互いは容易に整列する。

律速段階である標的鎖とプローブ鎖との）−イブリダイ
ゼーションは、テイル部分の大きな標識成分により、ま
たはプローブ鎖のきわめて大きいテイル部分によシ妨げ
られる。ホモポリマー銀量のその他のハイブリダイゼー
ション工程はすみやかに進行し、比較的短時間で本検定
法を行うことができる。

放射性標識を利用する本発明の実施態様において１本発
明は通常の方法よシ一層優れた比活性を提供する。放射
能に暴露されたフィルムはその強いシグナルに速やかに
反応して、感光時間を短縮させる。また、比較的低濃度
の標的鎖を検出することができる。

酵素、化学発光体または螢光体のような非放射性標識成
分を利用する本発明の実施態様において。

シグナル発生反応のための標識成分と補的因子（コファ
クター）は試薬ポリヌクレオチド鎖に互いに接近して結
合される。本明細書中で用いる”補助因子”という用語
は、検出可能な応答を生ずる反応に関与する全ての分子
を包含する。例えば、化学発光体と螢光体とが組み合わ
されるとエネルギー転移が生じ、また化学発光体標識成
分が反応体と組み合わされると発光反応がおこる。補助
因子と他の標識成分を別々の試薬鎖に分布させ、網状構
造体の形成の際にこれらの試薬鎖を一緒にすると検出可
納反応の可能性が増大する。

本発明は好適な実施態様の特徴を例示する次の実施例に
より詳しく説明される。

実施例 本実施例において、標識ヌクレオチドはすべて二ニー・
インクランド・ヌクレアー（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮ
ｕｃｌｅａｒ）から入手した。プラスミドｐＢＦｔ３２
２はベナスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌ＋ａｂｓ　；　ＢＲＬ）か
ら入手した。このプラスミドｐＢＲ３２２をＢＲＬから
入手した酵素Ｈｈａ　Ｉで制限消化して、このプラスミ
ドの多数の制限フラグメントを作った。ターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼ酵素をフロリダ
州はテルブルグのライフ・サイエンス社（Ｌｉｆｅ　５
ｃｉｅｎｃｅｓ。

Ｉｎｃ、）から入手した。ウシ血清アルブミンはメリー
ランド州がイサースバーグのベナスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズから入手した。本実施例のクロマトグラフィ
ーで用いたポリデキストランはニューシャーシー州ピス
カタウェーのファーマシアーＰＬバイオケミカル社（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

Ｉｎｃ、）からセファデックスＧ−２５という商標名で
市販されている。本実施例で使用したニトロセルロース
フィルターおよびプロット装置は、シュライチャー及シ
ュエル（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ
ｌ）からフィルターについてはＢＡ３５という商標名で
、また装置についてはミニホールドＩ　（Ｍｉｎｉｆｏ
ｌｄ　Ｉ）という商標名で市場化されている。その他の
試薬類はすべて分析縁のものを使用した。

本実施例において、ＳＤＳ緩衝液は０．１Ｍ塩化ナトリ
ウム、１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン塩酸塩（ｐＨ７，４）、５ｍＭエチレンジアミン四酢
酸酢酸ＤＴＡ′）！？よび０．５％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）を含有する。フェノールとクロロホルム
の等容量混合物は１％イソアミルアルコールを含んでい
た。本実施例で用いたクロロホルムもまた１チイソアミ
ルアルコールを含んでいた。

本実施例のＩ×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩
衝液（ＳＳＣ）はｏ、１５の塩化ナトリウム石０．０１
５のクエン酸ナトリウムを含んでいた（１）Ｈ７，３）
。

ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
はｐＢＲ３２２の制限フラグメントにテイルを結合して
、ホモポリマーチイルを有する試薬ポリヌクレオチドプ
ローブ鎖を形成するのに使用した。６０μｌの反応容量
において、制限フラグメント１００ｎｙ−を１００ｍＭ
カコジル酸カリウム（ｐＨ７，０）。

１　ｍＭ塩化コバルト、　　１００ｍＭβ−メルカプト
エタノール、２５μＣｉのトリチウム−標識チミジン三
リン酸（ｄＴＴＰ）　（１００Ｃｉ／ミリモル）、０．
１　ｍ９／ｍｌ　’）　’／　血清アルブミンおよび１
００単位のターミナルデオキシヌクレオデジルトランス
フェラーゼ中３７Ｃで６０分インキュベートした。ター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼはＤ
ＮＡ鎖の３′末端に遊離ヌクレオチドを順次付加してい
く。こうして、プラスミｒｐＢＦ？３２２０部分に相補
的なプローブ部分と、ポリデオキシアデノシン（ポリＡ
）の相補鎖に結合しうるポリデオキシチミジン（ポリＴ
）のテイル部分とを有する試薬プローブ鎖を作製した。

本明細書中で後述する計算によシ測定して、平均８５個
のデオキシチミジン残基が反応フラグメントに付加した
。

試薬ポリヌクレオチドプローブ鎖のテイル部分に相補的
なポリヌクレオチド鎖の試薬アンプリフアイア鎖は、ラ
イフ・サイエンス社のような生物学の分野を専門とする
いくつかの会社から入手することができ、あるいは試薬
標識鎖の合成に関する実験記録によシ示唆されるように
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
酵素を用いて合成することができる。本実施例の試薬ア
ンプリフアイア鎖は平均して４０００個のヌクレオチド
を有するポリＡホモポリマーで６る。

試薬標識鎖はターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフエラーゼを利用して合成した。ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼを用いて、トリチウ
ム−標識デオキシチミジン三リン酸（３Ｈ−ｄＴＴＰ）
を１６個のヌクレオチドから成るポリＴホモポリマー鎖
（ｄｐＴ）ｔａに酵素的に付加して、放射性標識成分を
有する６５個のヌクレオチドから成るポリＴホモポリマ
ー鎖（ｄＰＴ）６ｓを作製した。

従って、６０μ１反応容量において、１６個のヌクレオ
チドから成るポリＴのホモポリマー鎖１０　ｎ　Ｓ’を
。

１００ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ７，ｏ）、１ｍＭ
塩化コバルト、１ｍＭβ−メルカプトエタノール、２５
μＣｉのトリチウム−標識デオキシチミジン三リン酸（
１００Ｃｉ／ミリモル）、１００ｐ　Ｐ／ｍｌウシ血清
アルブミン、および１００単位のターミナルデオキシヌ
クレオチクルトランスフェラーゼ中３７Ｃで６０分間イ
ンキュベートした。

得られた試薬標識鎖を試薬アンプリフアイア鎖とハイブ
リダイズさせて、試薬アンプリフアイア−標識複合体を
形成し、これを使用するまで保存した。従って、３３ｎ
５’の放射性標識ポリデオキシチミジン（６５個のヌク
レオチドから成る長さ）を２×塩化ナトリウム−クエン
酸ナトリウム緩衝液中５０ｎ！？のポリデオキシアデノ
シン（４０００個のヌクレオチドから成る長さ）と共に
５５Ｃで６０分間インキュ×−トした。

試薬プローブ鎖および試薬アンプリフアイア−標識複合
体は標準方法を使って精製した。従って、それぞれの試
薬プローブ鎖およびアンプリフアイア−標識複合体を含
む反応容器に、１０倍容量のＳＤＳ緩衝液を加えた。そ
れぞれの試薬プローブ鎖およびアンプリフアイア−標識
複合体をフェノール／りｐロホルムの等容量混合物で２
回、クロロホルムで１回抽出した。有機残留物および残
留ヌクレオチドは、１０〜１５倍容量のセファデックス
Ｇ−２５ブランドポリデキストランを充填し且つ１０　
ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７，０）で平衡化したカラム連続
して２回通すことにより、それぞれの試薬プローブ鎖お
よびアンプリフアイア−標識複合体から除去した。

ポリデキストランはスパンカラムクロマトグラフィーで
使用する前に３７Ｃに加熱してガス抜きした。

セファデックスＧ−２５プランドポリデキストラン微粒
子をベレット化し、十分量のＳＤＳを加えて、それぞれ
のプローブを０．２％の濃度で含む上澄み液を調製した
。この上澄み液は使用するまで４Ｃで保存した。一般に
、上澄み液はそれぞれの試薬プローブ鎖およびアンプリ
フアイア−標識複合体を理論収量の５０チ含有していた
。本明細書中で述べたように、試薬プローブ鎖のテイル
は放射性標識を有する。しかしながら、テイルに組み込
まれた標識は試薬アンプリフアイア鎖または試薬標識鎖
の操作にとって必要でないと気付くであろう。

しかし、この標識はプローブ鎖のテイルの平均長さを計
算する上で必要である。

プローブ鎖および標識鎖の平均テイル長さＬは次式によ
シ計算された： Ｌ　＝　（ＴＣＡｃＩＩＸｎＸ　３２５　Ｘ　ｍ　）／
　（ｃ　Ｘ　２．２Ｘ１０３ＸＳａＸＭ）上記式中、Ｔ
　Ｇ　Ａ　ｃｐｍはトリクロル酢酸の添加によって沈殿
しうる試料中の全放射能に等しい。本実施例において、
プローブ鎖は６×１０６のＴＣＡｃｐｍを有し、標識鎖
は３Ｘ１０６のＴ　ＣＡ　ｃｐｍを有していた。

数字３２５はダルトンで測定されたデオキシリボヌクレ
オチドナトリウムのおおよその平均質量に等しい。鎖１
本あたシのヌクレオチドの数はｍで表わされる。本実施
例において、プローブ鎖は１４１の平均ヌクレオチド９
数を有し、標識鎖は１６の平均ヌクレオチド数を有して
いた。標識鎖の場合、この値は合成オリゴヌクレオチド
出発物質の使用によシ知ることができる。プローブ鎖の
場合、平均ヌクレオチド数はｐＢＲ３２２，４３６２お
よび既知ＨｈａＩ部位、３１における塩基対の既知数か
ら計算される。

続いて、Ｃはヌクレオチドの計数効率を表わす。

シンチレーション液体、シンチパースｌｌ　（Ｓｃｉｎ
ｔ、１ｖｅｒｓｅ■；フィッシャー・サイエンティフィ
ック）はトリチウム−標識プローブに対して３５％の計
数効率を示した。数字２．２　Ｘ　１０’は１ナノキユ
リーのアイソトープにおける１分あたシの崩壊数を表わ
す。

質量（Ｍ）はピコグラム（ｐ？）で測定される。標識鎖
およびプローブ鎖のそれぞれの質量は、濃厚原液の光学
密度を測定することによシピコグラムで概算される。こ
の計算により　１０Ｄ２６０は４０μｆ−／ｍｌの標的
プローブに大体等しいと推定された。本実施例では、プ
ローブ鎖の質量は１００ｎ５４であり、標識鎖の質量は
１０ｎ１であった。

この計算において、比活性の値は反応混合物に加エラれ
たプローブ１フエムトグラムに対する１分間あたりの崩
壊数（ｄｐｍ／ｆＰ）で測定された。この方法では、テ
イルの質量が試薬プローブの質量の一部であるとみなさ
れない。テイルは標識であるとみなされる。この方法は
見掛けのハイブリダイゼーション効率（Ｅ）を概算する
際に有利であるので使用された。本実施例において、試
薬プローブ鎖は０．４　ｄｍｐ／　ｆ５１ｆｌ比活性を
有し、標識鎖は０、５−ｄｐｍ／　ｆ　ｆの比活性を有
していた。見掛けのハイブリダイゼーション効率は次式
のようにして計算することができる： Ｅ＝（ハイブリダイズされたｄｐＩ１１１／ｓａ）／（
ｆｙ＠補的配列）ハイブリダイゼーション効率の値は、
実際にハイブリダイズされたプローブの比活性が全体と
してのプローブの比活性よシかなシ低いので見掛けの値
であるとみなされる。ハイブリダイゼーション効率を決
定するだめにこの方法を使用する場合。

平均テイル長さＬがプローブのもとの長さよシ長いとき
はいつでも、試薬プローブの比活性が標識の比活性（ｄ
ｐｍ／ｆ５’標識）よシ大きい。

この計算を完了した際に、試薬プローブは８５残基から
成るトリチウム−標識ａＴＭＰのテイルを有すると決定
された。また、試薬標識銀は平均の長さが６５デオキシ
チミン残基であると決定された。

プローブ鎖の標的鎖に対する見掛けのハイブリダイゼー
ション効率は１％であり、そして標識鎖のアンプリフア
イア鎖に対する見掛けのハイブリダイゼーション効率は
１００チであった。

標的ＤＮＡのプラスミドｐＢＲ３２２は、このプラスミ
ド１ｎ５’を０．１Ｍ氷水酸化ナトリウム中００Ｃで５
分間加熱変性することによシ固定した。次に、プラスミ
ド−水酸化ナトリウム混合物を２５倍容量の氷冷した２
Ｍ塩化ナトリウムに徐々に加え、ドツト・プロット（ａ
ｏｔ、　ｂｌｏｔ）装置のニトロセルロースフィルター
（Ｂｉ１２）を通してゆつくシ濾過した。

変性した標的ＤＮＡを含むドツトはＩＯＸ塩化ナトリウ
ム／クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣ）中で中和し、
赤外線ランプのもとで乾かし、そして減圧下に８５Ｃで
少なくとも２時間ベーキンクした。

ニトロセルロースフィルターに固定されたドツトはプレ
ハイブリダイゼーションを２回行った。

プレハイブリダイゼーション法はニトロセルロースフィ
ルター上の残存するＤＮＡ結合部位を飽和する。それ故
、試薬ポリヌクレオチド鎖はニトロセルロースフィルタ
ーに結合せず、相補的塩基配列の固定されたＤＮＡにの
み結合するだろう。

第一プレハイブリダイゼーション工程は、　２ｘＳＳＣ
１０，５％ＳＤＳ、０．２％ポリビニルビ０１Ｊトン、
０．２％フィコール、および０．１■／ｍｌプロティナ
ーゼＫ（ベーリンガー・マンハイム）を含むプレハイブ
リダイゼーション緩衝液中６５Ｃで少なくとも２時間実
施した。第二プレハイブリダイゼーション工程は、上記
のプレハイブリダイゼーション緩衝液中、下記に示すよ
うな試薬プローブ鎖の標的鎖に対する解離温度よシ１０
〜２０Ｇ低い温度で少なくとも２時間実施した。

テイル部分を有する試薬プローブ鎖は、ニトロセルロー
スフィルターに固定したプラスミドと６５Ｃにおいてハ
イブリダイズさせた。この温度はｐＢＲ３２２プラスミ
ドのＨｈａ１フラグメントの推定上の解離温度よシ１０
〜２０Ｃ低い。ハイブリダイゼーションは上記のプレハ
イブリダイゼーション緩衝液中で実施した。

プロットのいくつかをワットマンフィルター上に乾いた
状態でプロッティングし、赤外線ランプのもとで乾かし
、シンチレーションカウンターで計数した。プラスミド
ＤＮＡとハイブリダイズした試薬プローブ鎖は、標的Ｄ
ＮＡを含まないフィルターのシグナル強度よシ９５０〜
１６００ｃｐｍ高いシグナル強度を示しだ。

計数しなかったプロットはアンプリフアイア−標識複合
体を用いて次のハイブリダイゼーション工程にかけた。

アンプリフアイア−標識複合体と試薬プローブのテイル
部分とは、０．５％ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ緩衝液中５
５０で３０分間ハイブリダイズさせた。このアンプリフ
アイア−標識複合体は長さが６５塩基のポリデオキシチ
ミジン３３ｎ１とポリデオキシアデノシン５０ｎｊｉｌ
−の等個物である。

試薬アンプリフアイア鎖および試薬標識鎖にハイブリダ
イズさせたプロットは、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳ
Ｃ緩衝液で５５ｔＺ’、１０分間洗浄した（数回くり返
しだ）。

このプロットをワットマンフィルター上に乾いた状態で
プロッティングし、赤外線ランプのもとで乾燥し、そし
てシンチレーションカウンターで計数した。シンチレー
ションカウントは、アンプリフアイア−標識複合体に結
合したプロットが標的ＤＮＡを含まないフィルターよシ
も７５００ｃｐｍ高い比活性を有することを示した。プ
ローブ鎖に結合したプロットは１６００ｃｐｍの比活性
を有していたに過ぎない。プローブ鎖に結合したとき９
５０ｃｐｍの比活性をあらかじめ示していたプロットは
、アンプリフアイア−標識複合体に結合したとき、今や
３８００ｃｐｍの比活性を示した。従って、アンプリフ
アイア−標識複合体とのハイブリダイゼーションは、単
純な放射性テイルトプローブを使用したときよシもその
シグナルを４〜４，５倍に増強した。アンプリフアイア
−標識複合体をさらに使用すれば、そのシグナルが２倍
まで増強されるであろう。

発明の効果 こうして、本発明は有機化学を詳述することなしに、分
析用プローブの弱い比活性を増幅する手段を提供する。

さらに、本実施例は放射性標識手段と特徴とするが、本
発明の実施態様は低いシグナルが重要な問題となってい
る非放射性標識技術に対しても使用することができる。

例えば、標識鎖はミクロＲルオキシダーゼ、鉄ポルフイ
リン誘導Ｌ　細ｉルシフェラーゼ、ホタルルシフェラー
ゼ、フラビンモノヌクレオチドゝ、アデニン三リン酸お
よびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドならびにそ
の誘導体のような化学発光体を含みうる。適当な螢光標
識にはエテノ−アデノシンヌクレオチドまたはエテノ−
シチジンヌクレオチドのような各種の螢光ヌクレオチド
９、もしくはアミン−ヘキサンアデノシンヌクレオチド
またはメルクリヌクレオチドのような官能化ヌクレオチ
ドが含まれる。

さらに、改善された感度ゆえに、ハイブリダイゼーショ
ンの結果は検出可能なシグナルが比較的短時間で得られ
るので一層速やかに達成される。

律速段階、すなわち標的鎖とプローブ鎖との最初のハイ
ブリダイゼーションは大きな標識成分または長いオリゴ
ヌクレオチド鎖によって妨げられない。ホモホリマーを
使用する増幅または増強段階は速やかに進行して、迅速
な結果をもたらす。

しかして、本発明は、その好適な実施態様について説明
してきたが、変更および修飾が可能であって、前述の明
確な細部に限定されず、特許請求の範囲内に入る変更お
よび改変を含むものであると理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図は固体支持体上に固定された標的鎖（ＴＳ）と試
薬プローブ鎖（ＲＰ）がハイブリダイゼーション条件下
で接触して標的−プローブ二重鎖（ＴＰ）を形成する模
式図であシ； 第２図はアンプリフアイア鎖（Ａ）がポリヌクレオチド
プローブのテイル部分と接触して、標的−プローブ−ア
ンプリフアイア複合体（ＴＰＡ）を形成する模式図であ
り； 第３図は標識鎖（Ｌ）がアンプリフアイア鎖（Ａ）と結
合して標的−プローブ−アンプリフアイア−標識複合体
（ＴＰＡＬ）を形成する模式図であり；第４図および第
５図は第二アンプリフアイア鎖（Ａ’）および第二標識
鎖（Ｌ／）が順次結合して、より大きな複合体を形成す
る模式図であり；第６ａ図および第６ｂ図はそれぞれ第
一アンプリファイア−標識複合体（ＡＬ）および第二ア
ンプリフアイア−標識複合体（Ａ’　Ｌ’　）を形成す
る模式％式％ 第７図および第８図は標的−プローブ二重鎖（ＴＰ）に
第一および第二のアンプリフアイア−標識複合体が順次
結合して、よυ大きな複合体ＦＩＧ、　　Ｉ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　４

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物学的対の標的リガンドについて試料を検定す
   る方法であつて、 試料と試薬とを結合条件下で接触させ、この場合上記試
   薬プローブ、アンプリフアイア鎖および標識鎖を含み、
   該試薬プローブは標的リガンドと結合でき且つポリヌク
   レオチドテール部分を有し該アンプリフアイア鎖はテイ
   ル部分および多数の標識鎖と結合しうるポリヌクレオチ
   ド鎖を含み、そして該標識鎖は検出可能な標識成分を有
   するポリヌクレオチド鎖を含み、上記試薬は標的リガン
   ドと結合したポリヌクレオチド鎖の網状構造を形成させ
   るためのものであり； 非結合試薬を試料から除き；そして 標識成分の存在について試料を測定する； 各工程から成る上記検定方法。
2. （２）上記試薬は第二アンプリフアイア鎖および第二標
   識鎖を含み、該第二アンプリフアイア鎖が第一アンプリ
   フアイア鎖と結合でき、該第二標識鎖が第二アンプリフ
   アイア鎖と結合でき且つ標識成分を含み、そして上記方
   法は試料と試薬（試薬プローブ、アンプリフアイア鎖お
   よび標識鎖）とを接触させた後、標識成分の測定前に、
   該試料を第二アンプリフアイア鎖および第二標識鎖と結
   合条件下で接触させてポリヌクレオチド鎖の網状構造を
   形成させることから成る追加工程をさらに含む、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）アンプリフアイア鎖は多数の標識鎖と結合できる
   、特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）アンプリフアイア鎖およびプローブ鎖の少なくと
   も一方は標識成分を含む、特許請求の範囲第１項記載の
   方法。
5. （５）試薬プローブは標的リガンドに相補的なポリヌク
   レオチドプローブ部分を含む、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。
6. （６）試薬プローブのテイル部分、アンプリフアイア鎖
   および標識鎖はホモポリマーを含む特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
7. （７）最初に試料と試薬プローブと接触させて、標的リ
   ガンドを該試薬プローブに結合させることによりリガン
   ド−受容体複合体を形成させ、その後該リガンド−受容
   体複合体を試薬アンプリフアイア鎖および試薬標識鎖と
   接触させ、その際アンプリフアイア鎖と標識鎖とが互い
   に結合してアンプリフアイア−標識複合体を形成してい
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）標識成分は非放射性である特許請求の範囲第１項
   記載の方法。
9. （９）ポリヌクレオチドアンプリフアイア鎖およびそれ
   に結合した多数の標識鎖を含む試薬アンプリフアイア−
   標識複合体からなる、ポリヌクレオチドテイル部分を有
   する試薬プローブのシグナル発生能を増強するための試
   薬組成物であつて、該アンプリフアイア鎖が試薬プロー
   ブと結合でき、該標識鎖が検出可能な標識成分を有し、
   該アンプリフアイア−標識複合体が試薬プローブと結合
   して検出可能なポリヌクレオチド鎖の網状構造を形成さ
   せるためのものである上記試薬組成物。
10. （１０）アンプリフアイア鎖およびプローブ鎖の少なく
    とも一方は標識成分を含む、特許請求の範囲第８項記載
    の試薬組成物。
11. （１１）アンプリフアイア鎖および標識鎖は相補的ホモ
    ポリマーである、特許請求の範囲第８項記載の試薬組成
    物。
12. （１２）試薬プローブ、アンプリフアイア鎖および標識
    鎖を含む試薬からなる、生物学的対の標的リガンドにつ
    いて試料を検定するためのキツトであつて、該試薬プロ
    ーブが標的リガンドと結合でき且つポリヌクレオチドテ
    イル部分を有し、該アンプリフアイア鎖が試薬プローブ
    のポリヌクレオチドテイルと結合しうるポリヌクレオチ
    ド鎖を含み、そして該標識鎖がアンプリフアイア鎖と結
    合でき且つ検出可能な標識成分を有し、該試薬が標的リ
    ガンドに結合した検出可能なポリヌクレオチド鎖の網状
    構造を形成させるためのものである上記キツト。
13. （１３）第二アンプリフアイア鎖および第二標識鎖をさ
    らに含み、該第二アンプリフアイア鎖が第一アンプリフ
    アイア鎖と結合でき、そして該第二標識鎖が第二アンプ
    リフアイア鎖と結合できる、特許請求の範囲第１２項記
    載のキツト。
14. （１４）試薬プローブは標的リガンドに相補的なポリヌ
    クレオチドプローブ部分を含む、特許請求の範囲第１２
    項記載のキツト。
15. （１５）試薬プローブのテイル部分、アンプリフアイア
    鎖および標識鎖はホモポリマーを含む特許請求の範囲第
    １２項記載のキツト。
16. （１６）アンプリフアイア鎖および標識鎖は互いに結合
    してアンプリフアイア−標識複合体を形成する、特許請
    求の範囲第１２項記載のキツト。
17. （１７）標識成分は非放射性である特許請求の範囲第１
    ２項記載のキツト。