JPS60500651A - ポリヌクレオチド配列の検出方法およびそれに用いる標識ポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリヌクレオチド　の　出　ゝよびそれに　いる−　ポリヌクレオチド 灸朋］と九二 本発明は医療診断とバイオテクノロジーの分野に属するものである。発明は遺伝 子配列を検出する方法に関するものである。本発明の方法は唯一の塩基対を異に するに過ぎない配列を区別することができる。従って、本発明は遺伝子無秩序お よびウィルス感染の検出に、又抗生物質耐性に関しバクテリアの固定に用いるこ とができる。本発明には、本発明の方法に使用する標識ポリヌクレオチドおよび 該標識ポリヌクレオチドを含む診断用キットが含まれる。

Ｌ１改朱豆ＩＬ バイオ医学的研究および組換えＤＮＡテクノロジーに用いられる多くの操作は、 通常同位体水素（３Ｈ）、リン（３２Ｆ）、炭素（１４Ｃ）又はヨウ素（１２５ Ｉ）で放射能を標識されたポリヌクレオチドの使用に大きく依存している。この ような放射性化合物は、たとえ核酪又は他の科学的に又は臨床上興味ある分子が 極端に少量で存在しても、それらを検出し、監視し、局在化し、又は単離するこ とを可能にする有用な指示プローブと１７で使用者に役立つ。今日までのところ 、放射性物質は、多数の重要な分析試験を行うに最も鋭敏な手段であり、多くの 場合唯一の手段となっている。しかしながら、放射性物質の使用には重大な制限 があり重大な欠点が伴っている。第一に、放射性物質を取扱う人は放射線の潜在 的に危険なレベルに曝されかねないから、放射性同位体の製造、使用、後処置の 間念入すな安全策を維持しなければならない。第二に、放射性ヌクレオチドは買 うにも使用するにも極度に経費の高いものである。その大部分は、適当な防護装 置、製造者および使用者の健康監視サービス、廃棄物処理プログラムに必要な装 置および労力の経費によるものである。第三に、必要な感度をうるには、高い比 放射能の放射性物質を用いなければならない。このことは、それに相当して半減 期が短かく従って貯蔵寿命が限られることを意味し、経費は更に増加する。

放射性標識で遭遇する前記問題点に鑑みて、他の種類の標識が試みられた。この ような次第でエール大学のＩ］、Ｃ，Ｗａｒｄとその共同者はデオキシリボヌク レオチドにビオチン基を化学的に付着させ、このヌクレオチドをＤＮＡ中にニッ クトランスレーションで導入した。彼等はこのビオチン標識二重鎖ＤＮＡから、 検出すべきＤＮＡ配列に相補的な配列を持つ−・重鎮ＤＮＡを調整し、得られた ビオチン標識プローブＤＮＡをハイブリッド形成条件の下に検出すべきＤＮＡ配 列と接触させた。ハイブリッド形成を検出するには、ビオチン−アンチビオチン 相互作用又はビオチン−アビジン相互作用又は同様な相互作用を利用する。次い で、アビジン又はアンチビオチンが例えば蛍光により又は酵素的に標識される。

これに就いてＣす、ヨーロッパ特許明細書第８３８７８号（エール大学）　、　 Ｐ、Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ、　Ａ。

Ａ、Ｗａｌｄｒｏｐ　ａｎｄ　Ｄ、Ｃ：、Ｗａｒｄ、　Ｐｔｏｃ、　Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７９．８６３３−６８３７（１９８１）　、および　Ｓｉｎｇｅｒ 　ａｎｄＤ、Ｃ，Ｗａｒｄ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７９３３３１−７３３５　（１１３Ｂ２）が参照される。

この方法の一つの問題点は、導入しうるビオチン基の数が制限されていることで ある。前記ヨーロッパ特許明細書にはキロベースあたりに１０−・１００個のビ オチン基を含むものが引用されている。如何なる場合も、標識の好適方法は信号 の増幅を含む。家兎のアンチビオチンＩｇＧは１５乃至２０個のハプテン基（Ｄ 　Ｎ　Ｆ）に結合する。この場合こ抗体はＤＮＰ化合物になる。この抗体はビオ チン標識することができ、　“サンドイツチ法”は繰返される。最終のＩｇＧは 蛍光により又は酵素的に標識される。この方法の他の一つの問題点は、一つの配 列を検出するに適当な個々のプローブがビオチン基を導入し従って標識となるた めに、修飾されることである。

換言すれば、標識は最終用途に特異的なものであり　”普遍的”なものではない 。

英国特許出願第２．Ｏ１２，４０８号には、一つのポリヌクレオチド中の与えら れたヌクレオチド配列を検出する一般的技法であると主張する方法が公開されて いる。

この技法は、検出すべき配列に相補的な核酸配列を持ち一つの酸素と結合するた めに”化学的に修飾された″プローブと、ポリヌクレオチドをハイブリッド形成 させるにある。形成後に行われる前記酵素の付着と検出は、尿試料中の所与の配 列の有無を指摘するに用いられる。実際にプローブを化学的に修飾し酵素を付着 させる方法として公開された唯一のものはアビジン−ビオチン錯体を経由する方 法である；従って技術的な教えとしては、英国特許出願第２，０１９，４０８号 の方法はＷａｒｄその他によりヨーロッパ特許出願第００６３８７９号中で提案 されたものと同じである。

英国特許出Ｗ第２，０１９，４０８号に公開された技術は、例えば試料と化学的 に修飾されたプローブすなわちビオチンを付与されたポリヌクレオチドとからハ イブリッドを形成させ、次いでアビジン−酵素錯体の形で酵素を付着させること より成る試料の二段階標識法を含む普遍的と主張されている方法であるが、実際 に於いては、実施して何等かの成功をうるに困難な方法であり得られる結果は極 端に変動する。従ってこの方法は極度に信頼性に乏しく日常業務としてボーリヌ クレオチド配列の検出を行う基礎を与えるものではない。

染色体の遺伝子地図上に於ける位置の決定はＩ）ＮＡ配列が検出される蜆の一つ の分野である。最近の論文としては、Ｆ、Ｈ，Ｒｕｄｄｌｅによる概説Ｎａｔｕ ｒｅ、　２９４１＋５（１θ８１）及びＭ、Ｗｕと　Ｎ　、　Ｄａｖｉｌｉｓｏ ｎによるｌ　ｒ’）畏萄ｆ）ｙ＜ｘ染色体の遺伝子地図の記述、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ−Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８７７０５９−７０８３（１９８１）がある。電子顕微鏡で見 ることのできる金の球形粒子がコロイドゾルとして調製される。ウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）を該粒子の表面に吸着させる。ＤＮＡでＢＳＡＳ覆被１子を架橋 するために、ＢＳＡの基に光で賦活されうるニトレン基をアミド結合により共有 結合させる。ｐＨ４で正に帯電した一重鎖ＤＮＡは静電的に金粒子の方へ引き寄 せられる。ニトレン基の光分解によりＤＮＡはＢＳＡに共有結合しそれを介して 金粒子に結合される。末端デオキシヌクレオチシル・トランスフェラーゼ（以後 ”ＴｄＴ”と略称）を触奴とするチミジンヌクレオチドの付加反応により、ポリ （ｄＴ）尾部（ｔａｉｌ）がＤＮＡに付加される。別に、乙、久区□ｊ乙」遺伝 子配列を含むクローン化二重鎖ＤＮＡをつくり、３′末端にポリ（ｄ　Ａ、）尾 部をつけ、−重鎖ＤＮＡに変性する。このポリ（ｃｌＡ）の尾部を持つ”保存Ｄ ＮＡ’”を、スライドガラス上でｙ　ｆｙ９　ｆ）ｙ＜ｘ多糸染色体とノ＼イブ リッド形成させる。最後に、得られた多糸染色体−ポリ（ｄＡ）尾部を持つ保存 ＤＮＡ重複体がそのポリ（ｄＡ）尾部で、金球標識ＤＮＡのポリ（ｄＴ）尾部と ハイブリッド形成される。次いで金球標識を持った乙□文乏□ｊΔ三多糸染色体 の押しつぶし標本が電子顕微鏡の下で研究される。

細胞表面の特定受容体に結合し得るタンパク質にＤＮＡを連結させるための歩み は、Ｓ−Ｃｈｅｎｇ、　Ｇ、Ｔ、　Ｍｅｒｌ　ｉｎｏ及びＴ、Ｈ，Ｐａ５ｔａｎ によって試みられた、ＮｕｃｌｅｉＣＡｃｉｄｓ　Ｒａ５ｅａｒｃｈ　１１　Ｂ ｉＦ３−８８８　、これらの著者は次の（１）　、　（２）　、　（３）　、　 （４）の工程段階によりα２−マクログロブリンやタンパク質をＤＮＡに連結し た：（１）ＤＮＡにｄＧの尾部をつけ；（２）塩基対をつくっていないグアニン 塩基を、ホウ酸塩の存在の下にＮ−アセチル−Ｎ’　−（ｐ−グリオキシルベン ゾイル）−シスタミンと反応させて次の構造式の側鎖を生成させニーＧＯ−ＮＨ −（ＣＨ）　−３−３−（ＣＨ２）２−Ｎ）ＩＣＯＣ；Ｈ３２ （３）Ｓ−３結合をジチオトレイトールを用いて還元的に切断して次の構造式の スルフヒドリル基を持つ側鎖を生成させ； −ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）　２．−５Ｈ（４）α２−マクログロブリンの誘導体 をつくり、スルフヒトリル基を持つＤＮＡと反応させた。

１９８３年１月２６日に公告されたヨーロッパ特許出願第００７０８８５号（ス タンダード・オイル・カンパニー）は、例えば遺伝子中のポリヌクレオチド配列 を分析する方法の概略を述べている。該方法では一重鎖形にある試料ポリヌクレ オチドが、ハイブリッド形成条件の下に、試料ポリヌクレオチドの異った部分に 相補的な二つのポリヌクレオチド試薬と接触させられる。第一の試薬には化学ル ミネセンス反応に対する触媒が付着している。第二の試薬は、−っの吸光体を持 ち、それにより化学ルミネセンス反応により生じた光を吸収し、より長い波長の 光を発光する。触媒を過酸化水素によるルミノールの酸化に触媒作用をするペル オキシダーゼとし、吸光体−発光体をポリフィリンとすることが提案されている 。第−及び第二のポリヌクレオチド試薬を持った試料ポリヌクレオチド（試料が 予想された配列を実際に持っている場合には試薬と試料はハイブリッドを形成し ている）を、次に例えばルミノール−Ｈ２Ｏ２の如き化学ルミネセンス試薬と接 触させ、発光を測定する。この特許の明細書は異常な文書で何等の実施例をも含 んでいない。明細書の第１４頁には、第一の試薬の５“末端に短かいオリゴヌク レオチドのリンカ−セグメント　（Ｌｉｎｋｅｒ　ｓｅｇｍｅｎｔ　）を用いて ペルオキシダーゼの如き化学ルミネセンス触媒を結合すべきであると提案されて いる。該セグメントは、その５′末端にアミ、ノ・＼キサンーアデノシン核を含 みそれに続く４個乃至６個の７デノシンメクレオチド又はチミジンヌクレオチド が含まれるものになるであろう。リンカ−セグメントは、　“基本的な連結反応 の適当な使用”によって試薬の５′末端につけるべきである。

例えばペルオキシダーゼ又はルシフェラーゼの如き化学ルミネセンス触媒のよう な”光標識”で標識されたポリヌクレオチドを用いる他の分析法が、ヨーロッパ 特許明細書第７０８８７号（スタンダードオイルカンパニー）中で提案されてい る。この明細書では、試薬に化学ルミネセンス触媒をいかに付着させるかに就い てはより少ない情報しか与えられていない。第６頁に、光標識は試薬の任意の点 に付けることができるが末端の位置がより望ましいと漠然と記載されている。そ れ以上の情報はない、すなわち何を企図したものか説明する実施例もなければ先 行技術の引用もない。

ｉ更五厘上 本発明は、酵素を完全な化合結合によって一重鎖ポリヌクレオチドの塩基基と連 結することができ、得られた分枝、酵素残基はかなりの酵素活性を留保している ことの発見に、基礎を置くものである。加うるに、酵素で標識された一重鎖ポリ ヌクレオチドは、種々の他のポリヌクレオチド、特に検出すべきポリヌクレオチ ド配列に相補的なヌクレオチドの一重鎖配列を含むポリヌクレオチドに、容易に 付着するための手段を備えることができる。−列として、臨床試料がＤＮＡの異 常な配列”Ｗ”を含んでいるか否か検出することが望まれているものと想像せよ 。制限エンドヌクレアーゼによる消化でつくられたＤＮＡ断片を、ハイブリッド 形成条件の下で、′Ｗ″に相補的なポリヌクレオチド配列”ρＷ″“を含みポリ （ｄＴ）又はポリ（ｄＡ）尾部を備えたポリ蓑りレオチドボローブと、接触させ る。普通に得られる任意の一重鎖ＤＮＡでよい”マーカー（ｍａｒｋｅｙ）″ポ リヌクレオチドが、好適には西洋ワサビ・ペルオキシダーゼである酵素で標識さ れ、ポリ（ｃｌＡ）又はポリ（ｄＴ）尾部がつけられる。ポリヌクレオチドプロ ーブと酵素で標識されたマーカーポリヌクレオチドはハイブリッドを形成し、そ の際酵素標識されたマーカーポリヌクレオチドの尾部にあるポリ（ｄＡ）又はポ リ（ｄＴ）は、ポリヌクレオチドプローブの尾部にあるポリ（ｄＴ）又はポリ（ ｄＡ）とそれぞれハイブリッド形成する。検出すべきＤＮＡ配列”Ｗ”が実際に 試料中に存在するのであれば、　”Ｗ”はプローブの相補的な配列″９Ｗ”とハ イブリッドを形成するであろう。プローブはマーカーポリヌクレオチドとハイブ リッドを形成し、マーカーポリヌクレオチドは酵素で標識されているから、　” Ｗ″のハイブリッド形成は、洗浄された生成物中に酵素活性を見出すことにより 指摘されることになる。

従って、本発明により次のものが提供される。

（１）ポリヌクレオチドの一重鎖部分の塩基基に化学的に結合した酵素活性を持 つ基がある該−重鎖部分のポリヌクレオチド（以後、”マーカーポリヌクレオチ ド又は酵素標識ポリヌクレオチド”と呼ぶ）：（２）（１）に定義されたマーカ ーポリヌクレオチドで、さらにポリヌクレオチド尾部を好適には通常は第二のポ リヌクレオチド（以後“ポリヌクレオチドプローブと呼ぶ）上の相補的な配列に 例えばハイブリッド形成又はアニーリングにより付着しうる一重鎖ポリヌクレオ チド尾部を持つポリヌクレオチド；（３）（ａ）試料から検出すべき配列に相補 的な一重鎖ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブを、ハイブリ ッド形成条件の下に試料と接触させ、（ｂ）該ハイブリッド形成条件の下の接触 の前又は後に、前記ポリヌクレオチドプローブを前記（１）又は（２）に定義さ れた酵素標識マーカーポリヌクレオチドに付着させ、好適にはプローブの＝−重 鎖ポリヌクレオチドの尾部とマーカーの相補的な一重鎖ポリヌクレオチド尾郁の 間のハイブリッド形成により付着させ、　（Ｃ）得られた試料中に酵素に結びつ いた活性（以後、　”酵素活性”と呼ぶ）が存在するか否かを検出することを特 徴とする、ポリヌクレオチド配列、特にＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列、最も特異的 には試料中にその存否が問題となっている臨床試料から由来するＤＮＡ配列を検 出する方法： （４）（ａ）前記（３）に定義されたポリヌクレオチドプローブ、（ｂ）前記（ １）又は（２）に定義された酵素標識マーカーポリヌクレオチド、を含む診断用 キット。

本明細書に使用されている　”ポリヌクレオチド”なる述語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ 及び他の結合したヌクレオシド類を含むものとする。プローブの一般的条件とし て、鎖の最小の長さに関するファクターは、検出されるべき配列によって形成さ れるハイブリッドの安定性と、ゲノム中の検査している領域以外の若干の他の領 域（又は他のヌクレオチド）に同じ配列が存在する確立である。しかしながら一 般的に云うと、何等かの尾部のポリヌクレオチド配列を除いて、プローブは少く とも１２−１６個の塩基対（又は−重鎖塩基）の長さの鎖を持つものとなる。通 常の場合好適な範囲は１４ないし２０個である。従って尾部をつける前のポリヌ クレオチドプローブは典型的な”オリゴヌクレオチド”である（この術語は本明 細書の記載としては術語”ポリヌクレオチド”中に含まれる）。尾部に適用され る術語ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＧ）は、相補的な 尾部とハイブリッドを形成するに有効なすべての長さのものを包含している。２ ０ないし４００個のヌクレオチドの尾部の長さが典型的である。マーカーポリヌ クレオチドは原理的には短かい鎖の長さであってもよいが、普通は少くとも　２ ．５キロベ一ス以上、好適には少くとも５キロベースであることが望ましい、鎖 の最小の長さは、主として合体される酵素基の数と終りに酵素を検出するに用い る手段の鋭敏度によって定まる。

の−　な　゛ 上に要約した本発明の重要な好適特徴は次のようである。マーカーポリヌクレオ チドは、例えばポリ（ｄＴ）の如きホモポリマーの配列の一重鎖尾部を備え、プ ローブは、例えばポリ（ｄＡ）の如き相補的な一重鎖尾部を備え、それによりプ ローブの酵素標識ポリヌクレオチドへの付着はハイブリッド形成により行われる 。マーカーとプローブには互いに相補的なコポリマーの尾部を用いることもでき るが、ホモポリマーの尾部が好適であることは自明である。付着端を持った二重 鎖ＤＮＡ尾部及びプラント末端による連結の使用を包含する、他の付着方法も企 図することができる。

検出方法に於ては、好適には最初に試料を前記（２）に定義されたポリヌクレオ チドプローブと／＼イブリッド形成条件の下に接触させる。すなわち試料が検出 すべき配列を現実に含んでいればこの接ゑは／＼イブリッド形成をもたらすに有 効である。次に、得られた重積体生成物を酵素標識ポリヌクレオチドと／＼イブ リッド形成させる。目下のところ、この順序が好適である。その理由は、初めに 述べたハイブリッド形成が普通にはより厳格な条件を必要とし、この条件が標識 酵素に有害に使用することがありうるからである。しかしながら、前記（３）に 定義された方法は、（２）に定義されたポリヌクレオチドプローブを酵素標識ポ リヌクレオチドに最初に／＼イブリッド形成させて（又は他の方法で連結させて ）酵素標識プローブをつくり、次いでこの酵素標識プローブを／＼イブリッド形 成条件の下に試料と接触させる他の可使な順序をも包含している。

本発明は好適には、例えば西洋ワサビ・ペルオキシダーゼの如き糖タンパク質酵 素を用い、この酵素をポリスクレオチドの塩基基（特にｄＡ、ｄＣｌ又はｄＧ） のアミン基に結合して実施される。本発明は、（５）酵素を酸化してシス−グリ コール結合をアルデヒド基に転化させ、酸化された酵素をポリスクレオチド素の アルデヒド基の間にシフ塩基結合（−Ｎ＝ＣＨ−）を形成させ、該シフ塩基結合 を還元する（−ＮＨ−ＣＨ−結合又はＮ−ＣＨ２結合をうる）ことを特徴とする 、糖タンパク質、酵素、特に西洋ワサビ・ペルオキシダーゼでポリヌクレオチド を標識する方法を提供するものである。還元はホウ水素化塩又はシアノホウ水素 化塩還元剤で行うことができる。

全反応系列は次のようである： Ｌ庭膚誠 」二の図に於いて構造式（１）は、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ） を表わしその中のグリコール基の一つが示されている。構造式（３）はある長さ の一重鎖ポリヌクレオチド（ＰＮＵ）を表わしヌクレオチドの塩基基の一つが示 されている。この場合は単なる例示としてアデニル基が示されているが、グアニ ン残基又はシトシン残基でも同じである。加うるに、構造式（２）から見られる ように酵素の中のグリコール基の酸化により２個のアルデヒド基を生じ、両アル デヒド基はヌクレオチド塩基の中の遊離アミン基と反元される。′従って、反応 構成図には明瞭にするためにＰＮＵ塩基の一つにのみＨＲＰＯが結合することが 示されているが、ＨＲＰＯは同一・の又は異ったＰＮＵ鎖の中の２個のＰＮＵ塩 基に結合する可能性はある。

これに類似した、しかしながら）（ＲＰＯを抗体（工ｇＧ又はＦａｂ）に付着さ せる方法が、Ｍ、Ｂ、　Ｗｉｌｓｏｎ及びＰ、に、　Ｎａｋａｎｅにより、Ｗ、 Ｋｎａｐｐその細編Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　−Ｎｏｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏｍ ｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ社１９７８年刊行″Ｉ＋＊ｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃ ｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　５ｔａｉｎ　−ｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕ ｅｓ″第２１５−２２４頁に記載されている。しかしながら、重い標識をつけら れた抱合体中では抗体は特異的な抗体作用の大部分を失う、従って酵素の導入が 、例えばハイプリント麿成後に酵素活性を失う意味で、ＤＮＡ分子に慝影響を及 ぼすか否か不確かであった。特に酵素への基質の接近が甚だしく立体的な障害を 受ける可能性を念頭に置けばにれに対して充分な数の酵素分子をＤＮＡバックボ ーンに付着させてプローブに適当な酵素活性を与えうるか否かも予想できなかっ た。しかしながら幸いにもこの酵素標識法は成功であった。マーカーポリヌクレ オチドの１キロベースの長さあたり典型的には少くとも５個、好適には少くとも ２０個の酵素残基、特にＨＲＰＯ残基を導入できることが評価された。可能性と しては、−っの酵素残基はポリヌクレオチドの１個より多い分子に連結しうる。

前記ヨーロッパ特許明細書第７０８８５号及び同第７０６８７号で行われた末端 付着に関する提案と反対に、本発明では酵素はヌクレオチドの塩基を経てイ」着 される。

酵素活性の留保の程度が高く酵素合体の割合が大きいことは、本発明の方法によ り所要の配列の１０アットモル（１ａｔｔｏｍｏｌｅ＝１０　”’モル）の如き 少量が検出できることを意味する。この量は、１６個の胎児から羊水穿刺によっ て得られる又は成人の１０ｍ１の血液で得られる単一・のコピー遺伝子の量であ る。ＤＮＡは又絨毛膜から得ることができる。これに就いてはＲ，Ｗｉｌｌｉａ ｍｓｏｎその他、Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　？、１１２５　（１９８１）を見よ。

本発明の方法の他のすべての応用ではこれ程感度を必要としないように思われる 。

本発明は、ゲノムの特定の配列の検出。特にヒトの−・モグロビン遺伝子の無秩 序の診断にとって特に興味がある。ありふれた無秩序の一つは、主として西アフ リカ系の黒人に見出される鎌形赤梅球性貧血である。

この遺伝子無秩序は、β−グロビン遺伝子中の−っの点変異よりなる。β−グロ ビン遺伝子中の−っのアゾこン基がチミン基に代えられている。その結果、欠陥 遺伝子はグルタミン酸に相当するＧＡＧコードンの代りにバリンに相当するＧＪ Ｇコードンを持つ。この無秩序を同定する第一歩は適当なりＮＡ断片のプロット （ｂｌｏｔ）をつくるにある。次いで、該断片をハイブリッド形成条件の下に標 識ポリヌクレオチドと接触させると、ハイブリッド形成していれは断片は標識さ れたものとなる。

適当なりＮＡ断片を調製するーっの方法は、正常なβ−グロビン遺伝子には作用 し欠陥β−グロビン遺伝子には作用しない制限酵素の使用を含む。例えば酵素用 １は正常な遺伝子中の次の下線の配列を見分けるが、欠陥遺伝子中の対応する配 列は見分けることができない： Ｃ見Ｊ　免人Ｇ　ＧＡＧ　正常遺伝子 ＣＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　欠陥遺伝子 このようにして、β−グロビン遺伝子の断片は更に四且１によって制限されゲル 電気泳動にかけられ、ニトロセルロース紙又はジアゾベンジルオキシメチル紙の 如き吸取紙に移される。ある段階でＤＮＡは＝−重鎖形に変成される。完全に正 常なβ−グロビン遺伝子を持つ個体は、すべての適当なりＮＡの、便宜上”■” 及びＷ”と呼ぶことのできる二つのより小さな断片への分割を示す。一つのβ− グロビン遺伝子は正常でありその対立遺伝子は欠陥β−グロビン遺伝子である鎌 形赤血球形成傾向を持つ個体は、若干の”Ｗ”すなわち未分割のＤＮＡと共に個 別的に■及びＷであるＤＮＡを示す。鎌形赤血球を持つ個体は、ＶもＷも与えず 、全部ＶＷＤＮＡを与える。■断片に相補的でありＷ断片には相補的でないプロ ーブ、Ｗ断片には相補的でありＶ断片には相補的でないプローブを適宜に用いる ことにより、これらの種々の場合を区別することができる。ＲＪ、　Ｇｅｅｖｅ ｒその他はＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｔｌｓ、Ａ、、び、５０８１−５０８５（１９８１）に放射性で標識されたプロ ーブを用いてこのような方法を記載している。

最近、適当なりＮＡ断片をつくる他の方法がＢ、Ｊ、Ｃｏｎｎｅｒその他により 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

、む、２７８−２８２（１９８３）に記載された。正常なβ−グロビン遺伝子よ りのＤＮＡ断片が１９個のヌクレオチｌ・の長さの合成−重鎖ポリヌクレオチド プローブの共存の下にハイブリッド形成条件の下に置かれた。プローブの一つの 正常な遺伝子に整合する即ち相補的なものであり、他の一つの不整合な即ち欠陥 遺伝子に相補的なものである。適宜に厳密なｌ＼イブリント形成条件を選ぶこと により、不整合プローブはｌ＼イブリッドを形成しないことが見出された。同様 に、正常プローブは欠陥遺伝子から由来するＤＮＡ断片とは／Ｘイブリッド形成 を行わない。

前記二方法のいずれも、本発明に関しズ以上に記載してきたように、放射性標識 プローブの代りに酵素標識マーカーＤＮＡとポリヌクレオチドプローブを用いる 本発明での使用に、適合させることができる。

本発明の方法は、試験する配列を短かくすることができ、しかもなおプローブに 付着させるに長鎖の酵素標品マーカーＤＮＡを用いることにより′：＃當に″濃 し・”標識をつくることができる点で、ビオチン標識ヌクレオチドを用いる前記 方法より有利である。

本発明は又、血液細胞以外の他の細胞中のＤＮＡ配列の検出、特に腫瘍細胞中の 突然変異した遺伝子の検出に用いることができる。医療診断の外に、本発明Ｌ± 抗生物質耐性遺伝子を含めてバクテリア細胞にある遺伝子の診断に、又植物細胞 遺伝子に適用できる。本発明は又Ｒ，Ｎ　Ａ配列の検出にも利用できる。この目 的にき配列に相補的な配列を含むリボヌクレオチドから成る保存ＲＮＡを用いる ことができる。将来実施すべき遺伝子治療技術は、望ましからぬＲＮＡ又はＤＮ Ａ配夕昨の除去とそれに代えて、合成ポリヌクレオチド配＾の使用を包含するこ とも考えられる。本発明はそのようなポリヌクレオチド配列の検出を可能とし、 従って遺伝子治療の成功を支持することになるであろう。

ＨＲＰＯ残基を、上記のものと異なる他の手段でポリヌクレオチドに結合するこ とができる。例えば、ＨＲＰＯのアミン基とポリヌクレオチドを結合するに種々 の一官能基性架橋剤、特にＰｂａｒｍａｃｉａ’Ｆｉｎｅ　Ｃｂｅｍｉｃａｌｓ ＡＢ社から入手しうるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロ ピオナート（ＳＰＤＰ）を用いることができる。−重鎖ポリヌクレオチド塩基基 に酵素を直接結合させるこの第二の方法は、本明細書中後に反応構成りとして図 示される。

簡潔に云えば、別々の工程段階で酵素とポリヌクレオチドが５ＰＤＰと反応し、 それにより酵素の−Ｎｌ２基とポリヌクレオチドの−ＮＨ２基にそれぞれ３−（ ２−ピリジルジチオ）プロピオニル基が導入される。次にポリヌクレオチド」− の置換基はジチオトレイトールとの反応によりチオール基に転化する。最終工程 段階ではこのチオール基は酵素に導入された置換基と縮合し、酵素のアミン基と ポリヌクレオチド塩基のアミン基との間を架橋する次の構造式の架橋基となる。

本発明に於いて標識として用いられる酵素は糖タンパク質に限られるものではな く、例えばアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダ ーゼ、ウレアーゼ、又はルシフェラーゼを用いうる。またこのような酵素は、該 酵素を抗体に結合させるに用いる技術に類似した結合技術を用いて、−重鎖ポリ ヌクレオチドに共有結合で結合させることができる。例えば前記５ＰＤＰの如き 二官能基性試薬はこの目的に使用できるであろう７ 少くともある種の酵素では、検出手段が酵素信号又は酵素活性を増幅する手段を 包含することが非常に望ましい。そのような手段は、例えばアルカリ性ホスファ ターゼとリン酸ウンベリフェリルから検出できる蛍光発光を開始させる如き、又 はルシフェリンとＡＴＰと共にルシフェラーゼを用いて化学発光を開始させる如 き、酵素を用いることを含む。これに代わるものとして、検出できる生成物を与 え最初の反応ヘフイードパックすることを含む一連の反応又は単一の反応を開始 させる酵素を用いる−ことができ。このような方法は、ヨーロッパ特許出願第４ ９８０８号（Ｃ，Ｈ，Ｓｅ、Ｉｆ　）及び国際特許出願第ＷＯ／８１００７２５ 号（Ｔｈｅ　Ｐｒ１ｎｃｅ　ＣｈａｒｌｅｓＨｏｓｐｉｔａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｉ−’（）ｇｎｔｒｅ　Ｔｒｕｓｔ　、　Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ。

Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）から知られている。

マーカーポリヌクレオチドは普通はＤＮＡであり、すなわちＤＮＡヌクレオチド で任意の適当な長さを持ちうる。例えば制限によ−ってクローニングベクターか ら生ずる断片、又は合成ポリヌクレオチドでありうる。

原理的には、多くの酵素基の付着点を付して信号を強くするために、少くとも２ ．５キロベース、好適には５ないし１５キロベースの長さを用いることが望まし い。対をなしている塩基は普通は酵素基が付着することを許さないから　マーカ ーポリヌク１．・オチＶｔ士少くとも酵素を持つ領域では一重鎖であるべきであ る。

マーカーポリヌクレオチドを末端に二重鎖部分を持つポリヌクレオチドプローブ に７ニーリングにより付着させようと決めているときには、マーカーポリヌクレ オチドが末端に二重鎖部分を持つことも考えられるが、マーカーポリヌクレオチ ドは実質的に全長にわたって一重鎖であることが便利である。

酵素標識ポリヌクレオチド及びプローブにある尾部はそれぞれポリ（ｄＴ）とポ リ（ｄＡ）である又はその逆であることが普通であるが、それぞれポリ（ｄＣ） とポリ（ｄＧ）又はその逆であってもよい。酵素標識ポリヌクレオチドがｄＴ尾 部を持ちプローブがｄＡ尾部を持つときは、プローブが酵素標識ポリヌクレオチ ドより遥かに長い、好適には少くとも二倍の長さの尾部を持つべきことが提案さ れる。−例として、プローブに於ける約２００個のヌクレオチドのｄＡ尾部、酵 素標識ヌクレオチドに於ける約５０個のｄＴ尾部が提案される。より一般的に云 えば、プローブの尾部が可成り長い場合、単一のプローブ分子と数個の酵素標識 ポリヌクレオチドがハイブリッド形成することが可能であるべきである。それに よって酵素信号の強度は更に増加する。

プローブポリヌクレオチドは所望の相補的配列の一重鎖を含み、実質的にその全 長にわたり一重鎖であることが便利である。該相補的配列は検出すべき配列に特 異的であるに充分な長さを持つべきである。このことは、検出すべき配列が他の ありうる配列よりただ１個の点変異で異なっている場合にも、大多数のバクテリ アのゲノムでは少くとも１２個のヌクレオチド、大多数のヒ［のゲノムでは少く とも１４個のヌクレオチドが好適であることを意味する。好適には上限１９又は ２０個のヌクレオチドの長さである。尾部が好適には少くとも２０個のヌクレオ チドの長さを持つから、プローブのポリヌクレオチドの最少数は通常１２＋２０ ＝３２又は１４＋２０＝３４である。

本発明の方法は、同一の酵素標識マーカーポリヌクレオチドを種々の遺伝子無秩 序に特異的な種々のプローブに付着させるに用いうるから、内在的な融通性すな わち”普遍的な”本性を持つ。従って、それぞれ互いに特異的な一連の別々の操 作を行う場合に、いちいち標識をつける必要なく多数のプローブを用意しうる。

加うるに、マーカーポリペプチドの尾部を可成りの各分子に付着させて、酵素標 識の”濃度”を増加させることが企図される。

検出すべき遺伝子配列の２本の鎖と同じ配列の二重鎖ＤＮＡをプローブとするこ ともできる。二重鎖ＤＮＡを変性すると、２木の鎖は検出すべき遺伝子配列の２ 木の鎖とハイブリッド形成可能になる。

プローブの二重鎖前駆体のプローブ配列は、プラスミド又はファージ中で該配列 をクローン化して所望の配列を持つ小分子を単離することにより調製することが できる。これに代わる方法として、そのような分子は化学的に合成することがで きる、あるいは検出すべき種類のポリヌクレオチドから単離できる。

次の諸実施例は本発明を例示するものである。

支」Ｌ潰−一」 枦　−ｅの・ 。１．！Ｌｕ１ｌ二　初めに０．８ｍ　ｇの西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを０ ．２ｍｌの１６ｍＭの過よう素酸ナトリウム溶液で２０分間室温で酸化した。こ れにより糖タンパク質の糖側鎖中のシス−グリコール基はアルデヒドに酸化され た。次に酸化されたＨＲＰＯを４℃に於いて、１ｍＭのＰＨ４，４酢酸ナトリウ ム緩衝液２００厘ｌで−・夜透析した。

二五且１」：　−重鎖ファージＭ１３ＤＮＡを、Ｉｌｅｎｇａｎｄ　Ｗｕ、　Ｎ ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−９　４１７３．　（１８８１）記載の如き末端 ３“−デオキシヌクレオチジルートランスフェラーゼ（”ＴｄＴ”）で延長した 。−重鎖Ｍ１３ＤＮＡ７０ｐｉを、１８　ＪＬＭ１７）　ｄ　ＴＴ　Ｐに加え、 次にＴ　ｄ　Ｔ　（Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社より入手）３舊文を 加えた。３０℃に２時間保った後、これによりＭ１３ＤＮＡ３“　−末端に平均 ７０個のｄＴヌクレオチ１がＨＭされた。

Ｌ私立１匹：工程段階Ｂで得られたボ１，１（ｄＴ）尾部−重鎖ファージＤＮＡ ＭＩ　３を、ｐｍ９．５の０．２Ｍ酸性炭酸ナトリウム緩衝液中に溶解し、次い で工程段階Ａで得られた酸化ＨＲＰＯを加えた；（ルオキシダーゼとペルオキシ 、ダーゼの間の架橋を避けるために結果のｐＨ９と８．５の間に保つべきである 。混合液を２時間室温で攪拌した。その間にＨＲＰＯ中のアルデヒドはＤＮＡ塩 基のアミン基と反応してシック塩基を形成した。

２時間後に５ｍｇ／４１のホウ木素化ナトリウム溶液２０ＡＬ、ｌを加え２時間 ４０℃に保ってシッフ塩基のイミン結合を還元した。１０ｍｍ　ｘ　２００ｍｍ 　の　”旧ｏｇｅｌＡ−５Ｍ”カラムに通すゲルろ過により遊離酵素からＨＲＰ Ｏ−ＤＮＡ抱合体を分離した。カラムは０．１　Ｍリン酸ナトリウムと０．１Ｍ 塩化ナトリウムの溶液のｐＨ７，０のもので予め平衡させ溶出した。この方法に より少くとも４０分子のＨＲＰＯが尾部を持ったＤＮＡに結合し、その間結合前 の酵素比活性の８０％の活性が保たれた。

支」１班−一」 架橋剤として市販のＮ−スクシニミジル−３−（２〜ピリジルジチオ）プロビオ ナー）　（ＳＰＤＰ）を用いる、酵素標識ＤＮＡの製造法は次のようである＝二 互且１Ｊ：　西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）４ｍｇを、リン酸ナト リウム緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７，５）の塩化ナトリウム（０，１Ｍ　）を含む 液２１に溶解した。モル数で９倍過剰の５ＰＤＰを、かきまぜられているＨＲＰ Ｏ溶液に加え、室温で３０分間反応させた。ＨＲＰＯに対し９倍過剰のモル数の ＳＰＤ′Ｐを用いた結果、ＨＲＰＯＩ分子あたりに大体１個の５ＰＤＰ分子が置 換された。過剰の５ＰＤＰＤと副産物Ｎ−ヒトロキシースクシンイミトヲ、　” ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５″カラム（１０ｍｌＩ　ｘ　１５０ｍｍ）を通すゲ ルろ過により除去した。５ＰＤＰ置換ＨＲＰ○を含むピーク・フラクションを貯 えた。この段階で、５ＰＤＰ置換の程度は、Ｆ（ＲＰＯ−３ＰＤＰ溶液の一部２ ００用文を採取し、それをジチオトレイトール（最終濃度５０ｍ　Ｍ　）と２０ 分間室温で反応させた。結果として放たれたピリジン−２−チオンを分光計で３ ４３　ｎｍの吸収の増加に注目して追跡した。ピリジン−２−チオンの遊離は５ ＰＤＰ置換の程度に正比例する。

５［工程ＪＵ穀−エＷユＲＡＦ　１６ＤＮ　Ｆ　１００−２００　ｇ　ｇを２ｎ ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ　ＴＩＨ？、５）と塩化す肩　トリウム 　（０，１Ｍ）の溶液に溶解した。ＤＮＡに対して５０００倍過剰のモル数の５ ＰＤＰを、かきまぜているＤＮＡ溶液に加えて、室温で３０分間反応させた。Ｄ ＮＡに対して５０００倍過剰のモル数の５ＰＤＰを用いた結果、２０−３０個の 塩基ごとに１個分子の５ＰＤＰが置換された。過剰の５ＰＤＰと副産物Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドは、０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液ｐ）ｌ　４．５ 　と２．５容積のエタノールの混合液で一７０℃３０分間処理して５ＰＤＰ置換 ＤＮＡを沈殿させて、除いた。置換ＤＮＡを等容積の７０％エタノールで２回洗 い、真空中で乾燥し、最終にリン酸ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ　ｐＨ７，５） と塩化ナトリウム（０，１Ｍ）の溶液１１１文中に溶解した。次に５ＰＤＰの２ −ピリジルジスルフ。ド基で置換されたＤＮＡをジチオトレイトールの添加によ り還元して終りの濃度２０ｍＭ　とし、２０分間室温に保った。ここでもまた、 ピリジン−２−チオンの放出は分光計で追跡することができた。ＤＮＡの置換の 程度は還元５ＰＤＰによって計算することができた。前記のこと＜−７０°Ｃで エタノールで置換ＤＮＡを沈殿させて、ピリジン−２−チオンとジチオトレイト ールを除去した。得られたチオール置換ＤＮＡをリン酸ナトリウム緩衝液（０， １Ｍ　ｐＨ７，５）　と塩化ナトリウム（０，１Ｍ　）の溶液０．５−１ｎ＋文 中に溶解した。

工程段階Ｂで調製されたチオール含有ＤＮＡと、工程段階Ａで得られた５ＰＤＦ 置換ＨＲＰＯを混合し、１５℃で２４−３８時間保った。ここでもまた、反応の 架橋の程度は、ピリジン−２−チオンの放出による３４３　ｎｍにおける吸収の 増加から評価することができた。ＨＲＰＯ−ＤＮＡ抱合体をＢｉｏｇｅｌ　Ａ− ５Ｍ”カラム（１５０ＩＩＩＩＩｌｘ　２２０　ｍｍ）を通すゲルろ過により遊 離の酵素から分離した。カラムはリン酸ナトリウム緩衝液（０，ＩＮ　ｐＨ７， ５）と塩化ナトリウム（０，’ｌ　Ｍ）の溶液で予め平衡させ又溶出した。

最終段階で、工程段階Ｃで得られたＨＲＰＯ−ＤＮＡ抱合体に、実施例１と同様 に末端３′−デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼを用いて、ポリ（ｄ Ａ）又はポリ（ｄＴ）の尾部をつけて延長した。これに代わる操作として、特に ポリ（ｄＴ）尾部を用いるとき、工程段階Ｂの５ＰＤＰとの反応に先立って尾部 をＤＮＡに、つけることができる。

−災１１１−Ｊ− ポリ　ｄＡ　ｏポリヌクレオチドの・ 実施例１の工程段階ＢでｄＴＴＰの代りに１８ＪＬＭのｄＡＴＦを用いた点と、 工程段階ＢとＣを逆の順序で実施した、すなわちポリ（ｄＡ）を付着させる前の 一重鎖ポリヌクレオチドＭ　１３と工程段階Ａでつくられた酸化ＨＲＰＯを反応 させて、ＨＲＰＯ−Ｍｌ　３ＤＮＡ抱合体を形成させた点と、を除いて実施例１ を繰返した。このように順序を逆にすることは、ＨＲＰＯのＭ１３ＤＮＡの塩基 基への付着を確実にし、ポリ（ｄＡ）尾部の塩基基を、後のポリ（ｄＴ）尾部ポ リヌクレオチド・プローブとのハイブリッド形成まで、遊離状態にして置くに、 必要である。本実施例では、１８．ＭのｄＡＴＰをＨＲＰＯ−Ｍｌ　３ＤＮＡ抱 合体と共に末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼの存在の下に、３０ °Ｃに３０−４０分間保つと、ＨＲＰＯ−Ｍｌ　３ＤＮＡ抱合体の３゛末端に付 着した、約２７０４１！！のｄＡヌクレオチド塩基のポリ（ｄＡ）尾部が得られ た。

＝’　４ ポリヌクレオチド・プローブの調 実験の目的で、検出すべきＤＮＡを、よく知られた大腸菌プラスミドｐＡＴ１５ ３から得られた線状化プラスミドにある配列に相補的な配列と仮定する。この検 出すべき配列は、簡単な例示のためには、β−グロビン遺伝子に起こる”Ｗ”配 列に類似したものと見なしうる。従って、ｐＡＴはｐＷ”、すなわち塩基対形成 によって、Ｗとハイブリッド形成をしうる相補的な配列に類似した配列を含むも のと見なすことができる。５０ｍＭのｐＨ８のトリス−ＨＣ文緩衝液、１０ｍＭ の塩化マグネシウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、２００　ＩＬｇ／ｍｕのウシ 血清アルブミンを含む溶液２０ル文に市販のプラスミドｐＡＴ１５３を５終ｇ含 むものに、Ｌｌの５単位を加えた、ＰｓｔｌはｐＡＴ１５３を単一の制限の座に 於いて分割し、長さが正に４００塩基対より小さい二重鎖線状ＤＮＡ分子をつく る。制限は１時間にわたり３７°Ｃで実施され、ＤＮＡは前記の如くエタノール から沈殿されて精製された。ｄＴＴＰの代りにｄＡＴＰ（１８ＪＬＭ）を用いた 点を除いて、実施例１の工程段階Ｂに記載したようにして３’　−ＴｄＴを用い 二重鎖ＤＮＡに尾部をつけた。

３０°Ｃで２時間後に平均の尾部の長さは２００個ｄＡヌクレオチドに達した。

次いで、二重鎖ｐＡＴ１５３−ポリ（ｄＡ）尾部ＤＮＡプローブを、１％アガロ ースやゲルに通して５０Ｖで１２時間電気泳動させ、ゲルをアルカリで処理して ＤＮＡを変成させ、次いで変性ＤＮＡはサチン法により硝酸セルロースフィルタ ーに移した。次いで８０℃で２時間乾燥して一重鎖ＤＮＡを固定した。このよう にして、２５０ｎｇから１５ｐｇまでの一重鎖ＤＮＡの量を、すなわち最小値０ ．６４アットモルまでのポリ（ｄＡ）尾部プラスミド１５３ＤＮＡの量を用いる ことができ、硝酸セルロースフィルター」二に固定化される。

支」１貫−一」 ｄＡＴＰの代りに１８ルＭのｄＴＴＰを用いた点を除いて実施例４を繰返し一重 鎖ポリ（ｄＴ）尾部ｐＡＴ１５３ＤＮＡプローブを調製した。

支　６ ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド・プローブのハイブリッドｌ 実施例４で得られたポリ（ｄＡ）尾部ｐＡＴ　１５３ＤＮＡ含有フイルターを次 のようにノーイブリッド形成させた：　最初にフィルターを、０．４５Ｍ　Ｎ　 ａ　Ｃｌと０．０６Ｍのクエン酸ナトリウムのｐＨ７，５の緩衝液の水溶液（３ ｘＳＳＣ）で３７℃で３０分間洗い１次いで３ｘＳＳＣに加うるに０．１ｚの硫 酸ドデシルナトリウム（Ｓｎ２）　、　Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬（Ｇ、２％　Ｆｉ ｃｏｌ、０．２％　ポリビニルピロリジオン、０．２ｚ　ウシ血清アルブミン） 約２−５ｍＭ、及び１　国文あたり５０８１．ｇの変成ニシン精子ＤＮＡを含む 液で４０℃に於いて３時間洗った。前ハイプリント形成処理（ｐｒｅｈｙｂｒｉ ｄｉｓａｔｉｏｎ）の後、フィルターを、前ハイブリット形成処理の最後に用い た液に更に実施例１でつくられたＭｌ　３−　ｄＴ尾部−ＨＲＰＯ試薬を１　ｍ ｌあたりｏ、ｉ　８Ｌｇ含む液９０ｍ文中に移した。ハイブリッド形成は４０° Ｃで３時間行われた。次いでフィルターを、２ｘＳＳＣ（０，３Ｍの塩化ナトリ ウムと０．０４Ｍクエン酸三ナトリウムを含む水溶液）とＯ，Ｉ＄ＳＤＳで室温 に於いて５分間ずつ４回洗った。

フィルターを放置して乾燥させ、次に０．０５Ｍ　ＨＣ１３１液中２．５ｍＭの テトラメチルベンジジンと０．７５ｍＭ　Ｈ２Ｏ２を含む液で発色させた。１５ 分以内に、ＰＡＴ、１５３ＤＮＡを施したすべての場所のスポ−／　）が明瞭に 認められ、酵素標識ポリヌクレオチドとポリ（ｄＡ）尾部ｐＡＴ１５３ＤＮＡが ハイブリッドを形成したことを示した。酵素標識ポリヌクレオチドはＭｌ３−ポ リｄＴ分子あたり３００個のＨＲＰＯ残基を持ったものであった。従ってｄＡ尾 部ｐＡＴ１５３の０．６４アットモルとハイブリッド形成できる最大のＨＲＰＯ の量は１９２アットモルとなる。

定量的試験により、２５０アットモルのＨＲＰＯが５分間以内に肉眼に認めうる 充分な着色の強度を与えることが確証された。Ｍｌ３の１分子に少くとも４０分 子のＨＲＰＯが結合できるから、このことは本発明の方法がＭｌ３の８アットモ ルを検出できる（Ｍｌ３に結合したＨＲＰＯ分子は８０％活性であると仮定して ）ことを意味する。

以との操作を繰返すに、実施例５のポリ（ｄＴ）尾部ｐＡＴ１５３ＤＮＡプロー ブと実施例３のＨＲＰＯ標識ポリ（ｄＡ）尾部Ｍ１３ＤＮＡを用いて同様な結果 が得られた。

木ＪＪＬ茎」二（差−４１跋辺亙蓬 例えばヒトの患者から採取され検出すべきヌクレオチド配列を含む１０ＪＬｇの 試料ＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化させ、アガロースゲルを通し て電気泳動させる。ＤＮＡ断片を”吸取”によりニトロセルロースに移す；ポリ （ｄＡ）又はポリ　（ｄＴ）の尾部を持ち相補的配列を含んだ一重鎖ポリメクレ オチドープローブの過剰とハイブリッド形成（６５℃）きせる。過剰なプローブ は洗浄によって除く。次いで、得られた重複体をそのポリ（ｄＡ）尾部又はポリ （ｄＴ）尾部により、過剰のＨＲＰＯ−Ｍｌ　３−ポリ（ｄＴ）試薬と（実施例 １）、或いは過剰のＨＲＰＯ−Ｍｌ３−ポリ（ｄＡ）試薬と（実施例３）、適当 には４０°Ｃで、ハイブリッド形成させる。これによって、ＤＮＡは酵素で標識 される。次に生成物から過剰のＨＲＰＯ標識試薬が洗浄によって除去され、試料 に酵素標識があるかないかが上記の如く検出される。

この原案、すなわち酵素標識ポリヌクレオチドとプローブのハイブリッド形成を 行う前に、プローブと試料の間にハイブリッド形成を行わせる原案は、試料とプ ローブの間のハイブリッド形成が、通常苛酷な条件、特に必ずしも酵素標識が抵 抗できるとは限らないような高温を必要とするが故に、好適である。従って、プ ローブを試料に付着させ、次いで酵素標識とプローブの間に、通常は酵素がより 容易に抵抗できるようなより緩和な条件の下にハイブリット形成をさせることが 好適である。

本明細書に記載した発明の方法は酵素標識として特にＨＲＰＯを用い、それに続 く標識試料に活性を与えている酵素の検出は、テトラメチルベンジジンとＡｍ化 水素を用いる発色によっているが、特許請求の範囲記載の本発明の範囲を逸脱す ることなく、他の酵素標識を用い他の検出方法を用いることができる。

Ｉｎｔ＃ｒｎａｌ　ａｎａｌ　ＡｐｐＨｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、　ｐＣＴ／ＧＢ　 （３４／　Ｑ　ＱＱ　７６に・ＩＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨニ　Ｉ　Ｎ　Ｔ　Ｅ　Ｒ， Ｎ　ｒζＴ■○Ｉぐｌ’ｌＬ　ＳＥ八へＣ！ｉ　Ｒ三Ｐ○ＲＴ　○工・ＩＩＮＴ ＥＲＮ；１ＴＩＯＮＡＬＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＮｏ、ＰＣＴ／にＢ８４１００ ０７６（ＳＡ６７６８）第１頁の続き ｏ発　明　者　ニコラス　ジーン　レスリーイギリス国、ニスエム４４エツチビ ー　サリー、モーデン、チェリーララド　レーン　１０２

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリヌクレオチドの中の所与のヌクレオチド配列を検出する方法に於いて、 ハイブリッド形成条件の下に該ポリヌクレオチドを、検出すべき配列に相補的な 一重鎖ヌクレオチド配列を含み酵素標識マーカーと結合を行うことのできる反応 性尾部を含むポリヌクレオチド・プローブと接触させ、前記ポリヌクレオチドの 中に所与のヌクレオチド配列があるものと仮定して起こる該ポリヌクレオチドと プローブの間のハイブリッド形成の前又は後に、前記尾部に前記マーカーを結合 させ、プローブとの前記ハイブリッド形成およびプローブへのマーカーの結合後 の試料中に酵素と結び付いた活性が存在するか否かを測定することを含み；前記 マーカーが、酵素が化学結合により一重鎖部分の１個以上の塩基基に結合しうる 該−重鎖部分とポリヌクレオチドの尾部を含むポリヌクレオチドであり；前記プ ローブが同様にポリヌクレオチド尾部を含み；プローブとマーカーの反応性尾部 が共に、前記相補的配列とも前記検出すべき配列とも異ったヌクレオチド配列で あり；プローブのポリヌクレオチド尾部がマーカーのポリヌクレオチド尾部に結 合することによりプローブがマーカーに結合することを特徴とするポリヌクレオ チド中の所与のヌクレオチド配列の検出方法。 ２、プローブとマーカーのポリヌクレオチド尾部が、互いに相補的な一重鎖ヌク レオチド配列であるが、両用部共に検出すべき配列に対しては相補的ではなく、 プローブのマーカーへの結合はマーカーの尾部とプローブの尾部のハイブリッド 形成によって行われることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、プローブとマーカーのポリヌクレオチド尾部が共にホモポリマーヌクレオチ ド配列であり、互いに相補的であることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載 の方法。 ４、前記二つのポリヌクレオチド尾部の一つがポリ（ｄＡ）尾部であり、他がポ リ（ｄＴ）尾部であることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、マーカーが、ポリヌクレオチドの一重鎖部分の塩基基に直接に結合した糖タ ンパク質酵素を含み、該直接結合が、糖タンパク質のグリコール基とヌクレオチ ド塩基基のアミン基の化学結合によるものであることを特徴とする特許請求の範 囲第１ないし４項のいずれかに記載の方法。 ６、酵素が西洋ワサビ番ペルオキシダーゼであることを特徴とする特許請求の範 囲第５項記載の方法。 ７、マーカーが、ＨＲＰＯで標識された一重鎖ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ） 尾部ファージＭｌ　３ＤＮＡであることを特徴とする特許請求の範囲第６項記載 の方法。 ８、−重鎖ポリヌクレオチド配列を含み、該−重鎖ポリヌクレオチド配列の塩基 基に化学的に結合した酵素活性原子団を１個以上持つことを特徴とする酵素含有 ポリヌクレオチド・マーカー。 ９、さらに、ポリヌクレオチドの尾部を含むことを特徴とする特許請求の範囲第 ８項記載のマーカー。 ｊＯ１前記尾部が、−重鎖ポリヌクレオチド尾部であり、該尾部の配列と相補的 な一重鎖ヌクレオチド配列を持つ他のポリヌクレオチドとハイブリッド形成をな しうるものであることを特徴とする特許請求の範囲第９項記載のマーカー。 １１、ポリヌクレオチド尾部が、ホモポリマーのポリ核酸配列を含む、または該 配列より成ることを特徴とする特許請求の範囲第１Ｏ項記載のマーカー。 １２、ポリヌクレオチド尾部がポリ（ｄＡ）尾部またはポリ（ｄＴ）尾部である ことを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載のマーカー。 １３、酵素活性原子団が糖タンパク質酵素から由来したものであり、各酵素活性 原子団が、前記ポリヌクレオチド配列の塩基基中のアミノ基と糖タンパク質のグ リコール基の間の化学結合により、−重鎖ポリヌクレオチド配列に付着したもの であることを特徴とする特許請求の範囲第８ないし１２項のいずれかに記載のマ ーカー。 １４、酵素活性原子団が、西洋ワサビ・ベルオキシターゼ残基であることを特徴 とする特許請求の範囲第８ないし１３項のいずれかに記載のマーカー。 １５、ＨＲＰｏで標識された一重鎖ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）尾部、ファ ージＭ１３ＤＮＡ。 １６、第一の成分としての、検出すべき配列に相補的な一重鎖ポリヌクレオチド 配列とポリヌクレオチド尾部を含むポリヌクレオチド・プローブと、第二の成分 としての、１個以上の酵素活性原子団が塩基基に付着している一重鎖部分とポリ ヌクレオチド尾部を持つポリヌクレオチドであるマーカーと、を含み、前記二つ の尾部がプローブと試料のハイブリット形成の前または後に互いに結合すること ができるものであることを特徴とするポリヌクレオチド試料中の所与のヌクレオ チド配列を検出するためのキット。 １７、プローブとマーカーの両者が、−・重鎮ポリヌクレオチド尾部を持ち、プ ローブの尾部がマーカーの尾部と相補的であることを特徴とする特許請求の範囲 第１６項記載のキット。 １８、マーカーが、特許請求の範囲第１１ないし１５項のいずれかに記載の酵素 マーカーであることを特徴とする特許請求の範囲第１６または１７項記載のキッ ト。