JPS63228066A - 検出方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＤＮＡまたはＲＮＡおよび抗原あるいは抗体な
どの免疫物質を定性的または定量的に検出する方法およ
び装置に関する。

〔従来の技術〕

電気泳動はＤＮＡまたはＲＮＡの分離あるいは各種蛋白
質の分離などに広く利用されており、電場におけるそれ
ぞれの物質の易動度の差により分離するものである。こ
れはＤＮＡまたはＲＮＡあるいは蛋白質がその大きさと
それぞれが保持する電価に差がおることを利用したもの
であって、その電場における媒質として一般的に用いら
れる緩衝液を含んだポリアクリルアミドゲルあるいはア
ガロースゲルのゲル成分の濃度と緩衝液のｐＨの調節に
よる易動度の差によって様々の領域での分離を行なうの
である。なお、この場合板状のゲルにかなり長い領域で
帯状の分布として検出されるのが普通である。

本来、ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列はウィルス種およ
び生物種に固イｊであり、そのＤＮＡまたはＲＮＡはそ
れに相補なりＮＡまたはＲＮＡと特異的に２重鎖（ハイ
ブリッド〉を形成する。この性質を利用して近年ＤＮＡ
プローブと称されるＤＮＡまたはＲＮＡを検出するため
の試薬が開発され、キットが市販されている。実際にこ
れらの試薬あるいはキットを使用してＤＮＡまたはＲＮ
Ａを検出するために多くの場合、ニトロセルロース多孔
膜や、ナイロン多孔膜などのＤＮＡまたはＲＮＡの吸着
固定化材が用いられる。まず被検溶液を上記吸着固定化
材にスポットまたは通過させることにより、検出しよう
とするＤＮＡまたはＲＮＡを吸着させ、加熱により固定
化する。この吸着固定化材を検出しよう、とするＤＮＡ
またはＲＮＡと相補でないＤＮＡ、例えば鮭の精子のＤ
ＮＡで処理した後、標識されているかまたは標識が可能
であり、検出しようとするＤＮＡまたはＲＮＡと相補な
りＮＡ、つまりＤＮＡプローブと検出しようとする固定
化ＤＮＡまたはＲＮＡとの間でハイブリッドを形成させ
る。洗浄後プローブが標識されているならば標識物質を
検出するが、プローブがまだ標識されていない場合、使
用する標識剤が酵素などの蛋白質であるならば、あらか
じめそれとは異種の蛋白質、例えば牛血清アルブミンで
吸着固定化材の吸着可能な部分を塞いだ後、標識剤で処
理して洗浄し検出する。

一方、免疫物質を検出しようとする場合、検体中の抗原
を検出する場合の一般的な方法は、まず蛋白質などの吸
着性が大きいポリスチレンなどを材質とする容器に、検
出しようとする抗原に対する抗体の溶液を入れ、容器底
部器壁に抗体を吸着せしめ、残留する吸着可能な器壁面
を塞ぐために不活性な蛋白、例えば牛血清アルブミンな
どで処理し、洗浄の後この容器に検体溶液を採り、吸着
抗体と検体中の抗原を接触せしめて抗原・抗体反応によ
り抗原を捕捉する。次いでラジオアイソトープ、蛍光物
質、あるいは酵素等で標識された抗体で処理し、抗原・
抗体反応により標識した後、洗浄に続いて検出を行なう
。なお、このような検出法においては一般に、反応容器
としての小さな穴が縦横に整然と９６個列んだプレート
が用いられる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来の検出方法では吸着性の膜、プラスチックあるいは
それを素材とする容器の器壁などの支持体を使用するこ
とが多い。よって物質の吸着効率が良い程、標識物質な
どの非特異的な吸着も多くなる。そこで、これらの非特
異的な吸着を少なくするために、あらかじめ無害な異種
の物質でその非特異的な吸着が可能な部分を塞いでおく
必要がある上に、各処理段階毎に入念な洗浄が必要とな
る。このために操作が繁雑になり、所要時間も長くなる
。本発明は、このような従来の方法の欠点を解消し、非
特異的な吸着の可能性が少なく、操作が簡便で所要時間
の短い検出方法と、それに用いる装置を提供することを
目的とする。

（問題点を解決するための手段） 上記の目的は以下に述べる本発明により達成される。す
なわち本発明は被検物質を標識物質との複合体として検
出する方法において、複合体を形成しなかった標識物質
を電気泳動により分離除去する工程、および残存する複
合体を形成した標識物質を検出する工程よりなる検出方
法およびそのための装置を提供するものである。

ここに被検物質とは、ウィルス、微生物および動植物由
来のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは抗原または抗体など
の免疫物質などである。また標識物質とは、ウィルス、
微生物、あるいは動植物由来のＤＮＡまたはＲＮＡと相
補なりＮＡまたはＲＮＡ、あるいは抗原または抗体など
の免疫物質等の、被検物質と特異的に結合し得る物質に
、蛍光剤、化学発光剤、ラジオアイソトープ、酵素等の
標識剤が結合した物質である。本発明の標識物質は、被
検物質と特異的に結合し得る物質に、上記標識剤が直接
結合したものでも良いし、リガンド等を介して標識剤が
結合されているものでも良い。

間接的に結合する場合は、被検物質と特異的に結合し得
る物質にビオチン、ジニトロフェニル基、スルホニル基
等のリガンドまたはハプテンが結合したものを、被検物
質と反応させた後、アビジンまたはハブテンに対する抗
体等に標識剤が結合されたものを反応させることにより
、被検物質と標識物質との複合体とすることができる。

本発明の特徴の一つは、被検物質を標識物質との複合体
とするにあたり、一つの容器中で被検物質を含む検体溶
液に標識物質を均−系で処理できる点にある。さらに他
の特徴として、得られた複合体と複合体を形成しなかっ
た標識物質が共存する系から、複合体を形成しなかった
標識物質を分離除去して、残留した複合体を形成した標
識物質のみを測定することにより被検物質を検出しよう
とする手段として電気泳動を用いる点である。

本発明方法において、複合体を形成しなかった標識物質
を電気泳動によら分離除去する具体的手段としては、次
のような方法を例示することができる。一つの方法は被
検物質を標識物質で処理した試料をゲル層上に重層して
電気泳動にかけるというものである。ゲル層の厚みは適
宜選択できるが、通常は泳動時間、強度等を考慮して、
１〜３闇の範囲に設定される。ゲル層は複合体が通過し
ないか、または通過し難く、しかも標識物質が容易に通
過可能な濃度の７ガロースあるいはポリアクリルアミド
等により構成されることが望ましい。

この方法は試料層よりゲル層に向って電気泳動させ、複
合体をゲル層の表面またはゲル層内部に留め、複合体を
形成しなかった標識物質はゲル層を通過させることによ
り除去しようとするものである。なお、試料層は試料液
の流動を抑えるために、複合体および標識物質が泳動可
能な濃度のアガロース等のゲル層とするのが好ましい。

ただし、媒質のｐＨを調節することにより複合体を形成
しなかった標識物質を複合体と逆の方向に泳動させても
かまわない。

他の方法は、上記ゲル層と試料層を同一層とする方法で
ある。つまり試料液を、複合体は通過しないか、または
ほとんど通過しないが標識物質は容易に通過が可能な濃
度のアガロースあるいはポリアクリルアミド等のゲル層
として電気泳動により複合体を形成しなかった標識物質
をゲル層外に除去するものである。

さて、これらの場合、複合体は標識物質と比較して十分
に大きいことが分離を容易にする要素である。そこで被
検物質がＤＮＡまたはＲＮＡなとの場合は、それ自体が
十分大きいので、それと相補でかつ標識された元来短い
か、または酵素あるいは超音波処理等によって短く切断
されたＤＮＡを標識物質として使用することｋより十分
分離が可能でおる。一方、被検物質が抗原あるいは抗体
などで、標識物質とほぼ同等の大きさである場合は、被
検物質としての抗原または抗体と捕捉可能で標識物質よ
りは十分大きな物質、例えばその抗原に対する抗体、ま
たはその抗体に対する抗原の重合体あるいはそれらを結
合した重合物等により被検物質を捕捉後、標識物質で処
理して複合体とすることにより分離可能となる。

本発明方法の電気泳動により分離除去を行うための装置
は、以下により構成される。すなわら本発明装置は、被
検物質と標識物質との反応混合物を含む電気泳動にかけ
られる試料を保持し泳動さぜる空間を与えるための、一
端が開口し他端がゲル層によって閉ざされる管状通路、
および前記試料に電気泳動をかけるための手段を備えて
なる被検物質を検出するための装置である。

本発明の装置の一例を第１図に示すが、必ずしもこれに
限定されない。同図に示す装置は、試料またはゲルを保
持させるための貫通した多数の穴２を有する平板１と、
試料層４およびゲル層３に電気泳動をかけるための導電
性溶液層５を備えてなるものである。導電性溶液層５は
、電気泳動をかけるべく相互に異極の電極６．６′を各
々有する２つの液層からなる。導電性溶液層５は第１図
に示す様に、その一方の液層を各々の穴２内に設けても
良いし、また穴の上に設けても良い。すなわち、試料層
４およびゲル層３に電気泳動をかけるべく両層に対向し
て２つの導電性溶液層を設りれば良く、その形態は問わ
ない。

相互に異種の電極６．６′も第１図の如く、その一方の
電極を６の様に各々の穴の液層に設けても良いし、また
６′の様に設置しても良い。また、平板１は、水平に設
置されるのが望ましいが垂直でも斜めでもかまわない。

平板の材質は特に限定されないが、たとえばポリスチレ
ン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリメチルメタ
クリレートなどのプラスチック、ガラス、あるいはアガ
ロース、ポリアクリルアミドなどのゲル等が挙げられる
。

第１図では、試料を保持し泳動させる空間を与えるため
の一端が開口し他端がゲル層によって閉ざされる管状通
路が、４通した多数の穴２を有する平板１により構成さ
れる。この場合、穴の形状は特に限定しないが、円型が
好ましく、第１図のような形状でも、第２図のようにテ
ーパー状の穴でも良い。穴の直径は３〜５簡、長さは１
〜２ｃＩＩＬが好ましい。ざらに各穴は整然と列んでい
るのが好ましく、理想的には、一般に免疫学的検出方法
に使用されている９６穴のプレートと同様の形のものが
よい。

ゲル層は第１図のように穴の中に保持させて、その上に
試料層を重層させて使用しても良いし、一方、穴の下端
に密着するように、穴の外にゲル層を存在させ、その上
に試料を入れて使用しても良い。こうすることによりゲ
ル層によって閉ざされる管状通路が形成される。

また管状通路は、上記の用に貫通した多数の穴を有する
平板でも良いが、たとえば第３図に示すように、プラス
チック等で成形された円筒状等のチューブ７でも良い。

この場合ゲル層３は、第３図に示すようにチューブ７の
一端に密着させても良いし、チューブ７の一端をゲル層
３に少し嵌めこ込む様にしても良い。また第１図に示す
ように、チューブ７内にゲル層３を保持させて、その上
に試料層を重層させて使用することももちろん可能でお
る。

ざらに本発明の装置は、第４図に示ずように、管状通路
とゲル層を一体化した複数のウェル８を有するゲル成形
体つとしても良い。

本発明の検出方法を以下に説明する。まず複数の反応容
器にそれぞれ試料を採り、標識物質を加えて複合体とす
べく反応を行なわせる。この間第１図に示す如く、平板
の穴にゲル層を調製する。

なおゲル層はめらかしめ調製されていても良い。

第１図に示す如く反応液（試料層）をゲル層上に重層、
好ましくは反応液に前述した濃度のゲル成分を添加して
重層した後、平板をその下面、つまりゲル層が導電性溶
液層の溶液面に接するように設置する。さらに平板の上
面の導電性溶液層に導電性溶液を注入した後、所定時間
、所定の電圧で通電する。しかる後にそれぞれの測定方
法で、ゲル層中に残存した複合体の標識物質を検出する
。

ゲル層は穴の中に存在したままで行なうのが好ましい。

標識物質の検出は通常の方法で行なう。たとえば標識剤
が酵素の場合には、基質による標識酵素の発色により、
また標識剤がラジオアイソトープの場合は、シンチレー
ションカウンターやガイガーカウンターなどで測定でき
るし、フィルムを感光させても測定できる。複合体の標
識物質としてビオチンまたはハプテンを使用している場
合は、酵素等の標識剤とアビジンまたは抗体とが結合し
たものをさらに反応させた後、常法により標識剤を測定
することで検出できる。

第１図の装置でゲル層を穴２の外に形成させた場合、ま
たは第３図のようにチューブ７の一端にゲル層を設けた
場合は、穴２およびチューブ７の中には試料を入れるだ
けで良い。また第４図のゲル成形体の場合にも、ゲル成
形体９の底部がゲル層に相当するため、ウェル８内には
試料を入れるだけで良い。以下は第１図の平板の場合と
同様に操作する。

〔実施例〕

以下、実施例を示して本発明をざらに詳細に説明する。

実施例１ （１）ビオチン標識φＸ−１７４ＲＦＤＮＡの調製；Ｂ
ＲＬ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ　２０８７７、　Ｕ。

Ｓ、八、）のニックトランスレーション試薬の溶液へ４
（各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）５μ
ｇ、φＸ−１７４ＲＦＤＮＡ溶液〈０゜５μｇ／μＮ＞
２μｇ、０．４７７？、Ｍビオチン−１１−ｄｔＪＴＰ
２．５μｍ１および溶液Ｅ（Ｈ２Ｏ）３５．５μｊを混
合後、さらに溶液Ｃ’（０，４Ｌ７／μｊ　ＤＮＡポリ
メラーゼ、４０μｇ／μｊデオキシリボヌクレアーゼ）
５μρを加えて混合し、１５℃で１．５時間インキュベ
ートした。この反応液に、溶液Ｄ　（３００ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ）５μ、ｆｆと５％ＳＤＳ水溶液１．２５μｇを
添加し、５ｄの５ｅｐｈａｄｅＸＧ　−５０カラムに０
．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＣ（０，１５Ｍ　　ＮａＣ
ｌ、１５ＴｒＬＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０＞
で流して留出液を１５０μｊづつ分取した。各留出液を
ニトロセルロース濾過膜に２μρづつスポットして８０
℃に３０分間加熱した。この濾過膜をＢｉｏｃｋｉｒｉ
ｇｂｕｆｆｅｒ　　（２％ＢＳＡ、０．０５％ｒｒｉｔ
ｏｎＸ　−１００，５ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ　
（０，１３Ｍ　　ＮａＣＩ　、７ｍＭ　　Ｎａ２　ＨＰ
Ｏ４、ａｍＭＮａＨ２ｐｏ４））に室温で３０分間浸漬
した。

さらにＥＮＺＯ社（３２５Ｈｕｄｓｏｎ　５ｔｒｅｅｔ
、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、　１００１３　）の
Ｄｅｔｅｋ−１−ａＣＩ）の［）ｅｔｅｃｔｉｏｎｃｏ
ｍｐｌｅｘ　＠そのＤｉｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒで
２００倍に希釈した溶液に室温で１時間浸漬した侵、Ｗ
ａＳｈｉｎ（Ｊｂｕｒｒｅｒ（０，５Ｍ　　　ＮａＣｌ
　　、　０．　５　％丁ｒｉ　ｔｏｎＸ−１００，１ｙ
ａＭ　　ＥＤＴＡ、２％ＢＳＡ、１０ｍＭ　　ＫＰＯ４
、ｐＨ＝６．５＞で５分間ツツ５回、Ｐｒｃｄｃｔｃｃ
ｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　　（０，２Ｍ酢酸ナトリウム
ｐＨ＝５．８＞で２分間づつ２回洗浄した。

この濾過膜を１ｍＭ　　Ｎａｐｈｔｈｏｌ　Ａｓ−ＨＸ
ｐｈｏｓｐｈａｔｃおよびＦａｓｔ　ｖｉｏｌｅｔ　Ｂ
　ｓａ１℃　４／ｌ！ｇ／ｄのＰｒｅｄｅｔｅＣＬｉｏ
ｎ　ｂｕｙｅｒ溶液を１００　：　１で混合した溶液に
浸漬して室温で１５時間インキュベートした。発色した
留出分画を集めて、ビオチン標識φＸ−１７４ＲＦＤＮ
Ａの約１μｇ／ｄ溶液を得た。

（２）ビオチン標識φＸ−１７４ＲＦＤＮへの検出：（
１）で得られたごオチン標識φＸ−１７４ＲＦＤＮＡ溶
液を１ｘＴＢＥ（８９μＭ　　Ｔｒｉｓｂａｓｅ、８９
１Ｍ　　ｂｏｒｉｃａｃｉｄ　、　２ＴｒＬＭ　　ＥＤ
ＴＡ、　ｐＨ−８，０）中で一晩透析してビオチン標識
φＸ−１７４ＲＦＤＮＡの１Ｍｇ／ｍｌ、１ｘＴＢＥ溶
液とした。この溶液を１ＸＴＢＥで希釈して１μ７／ｉ
、１００ｎ９／ｒｎｌ、１０μｇ／ｄ、１　ｎＶ／ｄお
よびＩＸＴＢＥのみの５つの試料をサンプルチューブに
５０μ、ｆｆづつ採り、ＥＮＺＯ社　［）ｅｔｅｋ−１
−ａｃｐのＤｅｔｅＣｔｉＯｒｌ　ＣＯｍｐｌｅＸの２
０倍希釈液５μｊづつを加えて４２℃で１０分間インキ
ュベートした。この間アガロース（ＢＨ３社）を３％含
む１ｘＴＢＥの加熱溶液５０μｇを第１図に示す如き電
気泳動装置の多孔板の一方を粘着テープで塞いだ穴に注
入して冷やし、ゲル化させた。一方アガロースを１．２
％含む１Ｘ丁ＢＥ加熱溶液を４２°Ｃに保ちつつ、試料
液に５０μｐつづ加えてよく混合後、その５０μｊづつ
を前もって調製したゲル層上に重層してゲル化させた。

多孔板の粘着テープを除き、その面が導電性溶液層に入
れた１ＸＴＢＥの液面に接するように設置して、多孔板
の導電性溶液層にも１ＸＴＢＥを入れた俊、多孔板側を
陰極として７０Ｖの電圧で１５分間通電した。ゲル層を
１　ｍＭ　　Ｎａｐｈｔｈｏｌ　Ａｓ　）ｆＸｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅおよびＦａｓｔ　ｖｉｏｌｅｔ　Ｂ　５ａｌ
ｔ　　４！ｎ！ｉ／ｌｄのｐｒｅｂｅｔｅｃｔｉｏｎ　
ｂｕｆｆｅｒ溶液の１００：１混合液に室温で１５時間
浸漬して発色させたところ、ゲル層と試料層の境界面で
１ｎ９／ｄ溶液まで発色が認められた。

実施例２ （１）ビオチン標識のφＸ−１７４ＲＦＤＮＡの切断：
ビオチン標識φＸ−１７４ＲＦＤＮＡ　　’１μ７／ｍ
ｌｌ　　１ｘＳＳＣ（０，１５Ｍ　　ＮａＣｌ、１５Ｔ
ｒｔＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０）溶液を超音
波破砕機（海上電機４２８０）で処理（１△で１０秒間
６回）した。

（２）φＸ−１７４単鎖ＤＮＡの検出：φＸ−１７４単
鎖ＤＮＡ　（ＢＨ３社）の１μ９／ｄ、１１００ｎ／ｄ
、１０ｒｌ／Ｉｎ！、　１　ｎｑ／ｍｌ　　ｌＸ５ＳＣ
：？？ｌＪ液とｌＸ５ＳＣをそれぞれ２５μｇづつサン
プルチューブに採り、超音波処理ごオチン標識φＸ−１
７４ＲＦＤＮ八（１μ９／ｄ）を、２５μｇづつ加えて
、５分間煮沸した後、６０℃で３０分間、さらに４２℃
で１０分間インキュベートした。ＥＮＺＯ社ｎｅｔｅｋ
−１−ａｃｔ）のＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ
の２０倍希釈液５μ、Ｑを加えて４２°Ｃで１０分間イ
ンキュベート俊、アガロースを１゜２％含む１ＸＴＢＥ
加熱）８液を４２°Ｃで５０μｇづつ加えてよく混合し
、その５０μｍを実施例１と同様必らかじめ調製した３
％アガロースゲル層に重層してゲル化させた。実施例１
と同様に７０Ｖで２０分間通電した後、ゲル層を１　ｍ
Ｍ　　Ｎａｐｈｔｈｏｌ　Ａｓ−）ｌＸｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅおよびＦａｓｔ　ｖｉｏｌｅｔ　Ｂ　５ａｌｔのＰ
ｒｅｄｅｔｅｅｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ□溶液の１００
　：　１混合液に室温で１５時間浸漬したところφＸ−
１７４単鎖ＤＮＡのＩｎ７／ｄｉＵ液まで発色を認めた
。

〔発明の効果〕

本発明による検出方法では被検物質を標識物質との複合
体とする際、１つの容器における均一系での処理が可能
であり、従来法で必要とされた非特異吸着を抑制するた
めの処理行程および洗浄行程が省略でき、所要時間も短
縮できる。ざらに前述したニトロセルロース多孔膜おる
いはナイロン多孔膜による濾過吸着法などでみられるよ
うな目詰りもなく、大ｉの試料処理が可能となる。

【図面の簡単な説明】 第１図は本発明の装置の１例を示すものでおり、（ａ＞
は電気泳動をかけている状態の断面図を、（ｂ）は平面
図を各々示す。 第２図は本発明装置の穴の形状の他の態様を示す。 第３図は、本発明装置の他の態様である、管状通路がチ
ューブである例を示す。 第４図は本発明装置の他の態様である、複数のウェルを
有するゲル成形体の例を示すものでおり、（ａ）は斜視
図を、（ｂ）は断面図を各々示す。 １・・・・・・平板 ２・・・・・・穴 ３・・・・・・ゲル層 ４・・・・・・試料層 ５・・・・・・電気導電性溶液 ６．６′・・・・・・相互に異極の電極７・・・・・・
チューブ ８・・・・・・ウェル ９・・・・・・ゲル成形体 特許出願人　　東　し　株　式　会　社（ｂ） 第１図 第　２　図 ｂｌ 第４図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）、被検物質を標識物質との複合体として検出する
   方法において、複合体を形成しなかった標識物質を電気
   泳動により分離除去する工程、および残存する複合体を
   形成した標識物質を検出する工程よりなる検出方法。
2. （２）、被検物質と標識物質との反応混合物を含む電気
   泳動にかけられる試料を保持し泳動させる空間を与える
   ための、一端が開口し他端がゲル層によって閉ざされる
   管状通路、および前記試料に電気泳動をかけるための手
   段を備えてなる被検物質を検出するための装置。
3. （３）、管状通路が、貫通した多数の穴を有する平板か
   ら構成されてなる特許請求の範囲第（２）項記載の装置
   。
4. （４）、ゲル層によって閉ざされた管状通路が、複数の
   ウエルを有するゲル成形体である特許請求の範囲第（２
   ）項記載の装置。