JP2012194015A - 電気泳動チップ及び分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡便かつ短時間に、高い精度で再現性良く測定対象物質を検出・定量することができる電気泳動チップ及びそれを用いてなる分析方法を提供する。
【解決手段】電解液と接触するとその内壁表面が正又は負に帯電する流路を内部に備えており、前記流路内で測定対象物質を電気泳動させるためのチップであって、前記流路内に、微粒子に担持され、かつ、ゲルによって移動を妨げられた状態で、前記測定対象物質に対して特異的結合能を有する特異的結合物質が設けられているようにした。
【選択図】図１

Description

この発明は、簡便かつ短時間に、高い精度で再現性良く測定対象物質を検出・定量することができる電気泳動チップ及びそれを用いてなる分析方法に関するものである。

従来、抗原抗体反応を用いて測定対象物質を検出する種々の分析法が開発されている。このうち、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）のうちサンドイッチ法では、まず、測定対象物質（抗原）に対する抗体（捕捉抗体）を固相に吸着させる。次いで、スキムミルク等で固相のブロッキングを行う。更に、固相に試料溶液及び予め酵素により標識された抗体（標識抗体）を加える。これにより、固相−捕捉抗体−抗原−標識抗体という複合体が固相表面に形成される。続いて、結合しなかった抗原及び標識抗体を洗い流す。最後に、酵素の基質（例えば、発色又は発光試薬）を加え、酵素反応の生成物を検出する、という一連の工程が行われる。このようなＥＬＩＳＡ法は、比較的高感度であるものの、洗浄工程が必要で、操作が煩雑であり、また、分析に時間を要する。

また、イムノクロマト法は、予め金属コロイド等で標識された抗体（標識抗体）が保持されたサンプルパッドに試料溶液を滴下して、試料溶液中の測定対象物質（抗原）に標識抗体との抗原抗体複合体を形成させた後、当該抗原抗体複合体に毛細管現象によりセルロース膜等のメンブレン上を移動させ、メンブレン上に予め設けられた捕捉抗体により捕捉させて、当該捕捉された抗原抗体複合体を目視で確認して、分析結果を判定するものである。このようなイムノクロマト法は、実施が簡単であるため、妊娠検査等に広くに用いられているものの、測定対象物質を定量することは難しく、また、目視により分析結果を判定するため作業者による誤差が生じやすい。

更に、電気泳動と抗原抗体反応を組み合わせた分析法として、ウェスタンブロット法が知られている。これは、被検試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動や二次元電極泳動によって分画した後、ニトルセルロース膜やＰＶＤＦ膜に転写し、次いで、免疫染色を行うことにより、測定対象物質を検出する方法であるが、電気泳動と膜転写の２段階の操作を行わなくてはならず、操作が煩雑であり、分析に時間を要する。

一方、電気泳動の一手法として、キャピラリー内部を電気泳動路として用いるキャピラリー電気泳動が知られており、この泳動法は泳動に要する時間が短いうえ、分離能が高いという利点を有する（特許文献１）。しかし、特許文献１に記載の方法やデバイスでは、光による固定化や洗浄、ブロッキング工程等が必要であり、分析には時間を要する。また、シリカ製の中空キャピラリーは壊れやすく、取り扱いに注意を要する。

特表２００８−５０６９７０号公報

そこで本発明は、簡便かつ短時間に、高い精度で再現性良く測定対象物質を検出・定量することができる電気泳動チップ及びそれを用いてなる分析方法を提供すべく図ったものである。

すなわち本発明に係る電気泳動チップは、電解液と接触するとその内壁表面が正又は負に帯電する流路を内部に備えており、前記流路内で測定対象物質を電気泳動させるためのチップであって、前記流路内に、微粒子に担持され、かつ、ゲルによって移動を妨げられた状態で、前記測定対象物質に対して特異的結合能を有する特異的結合物質が設けられていることを特徴とする。

ここで、前記電解液と接触するとその内壁表面が正又は負に帯電する流路としては、例えば、流路内壁が石英ガラスからなり、電解液と接触すると内壁表面においてシラノール基が負の電荷を持ち、流路内壁表面と電解液との界面において電気二重層が形成されるものが挙げられるが、その他、電解液と接すると正又は負の電荷を持つ種々の官能基が内壁表面に導入されたものを用いることができる。このような官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基等が挙げられる。また、前記流路は、電解液と接触することにより、その内壁の全表面が正又は負に帯電するものであってもよいが、流路内に測定対象物質を電気泳動するのに充分な電気浸透流を発生させることができる限りにおいて、電解液と接触することにより流路の内壁表面が部分的に正又は負に帯電するものであってもよい。

前記測定対象物質としては特に限定されず、例えば、血液、血清、血漿、生体試料、食品等に含まれるタンパク質、ペプチド、遺伝子等が挙げられ、具体的には、例えば、インスリン、カゼイン、β―ラクトグロブリン、オボアルブミン、カルシトニン、Ｃ−ペプチド、レプチン、β−２−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク、α−１−ミクログロブリン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニン−Ｉ、グルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因子、上皮増殖因子；コルチゾール、トリヨードサイロニン、サイロキシン等のハプテンホルモン；ジゴキシン、テオフィリン等の薬物；細菌、ウイルス等の感染性物質；肝炎抗体、ＩｇＥ、ソバの主要タンパク質複合体、落花生のＡｒａｈ２等の可溶性タンパク質等が挙げられる。

前記微粒子としては特に限定されず、例えば、ポリスチレン、セファロース、ラテックス等からなる樹脂ビーズ；金コロイド等の貴金属コロイド；酸化チタン粒子等の無機酸化物粒子等が挙げられる。

前記ゲルとしては、前記微粒子の粒径よりもポアサイズが小さく、前記微粒子に担持された特異的結合物質の移動を妨げることが可能なものであれば特に限定されず、例えば、アガロースゲル、アクリルアミドゲル、寒天、セファロース等が挙げられる。当該ゲルは、前記微粒子に担持された特異的結合物質が混合された状態でゲル化されたものであってもよく、又は、前記微粒子に担持された特異的結合物質を取り囲むようにその周囲に形成されているものであってもよい。

前記特異的結合物質としては、測定対象物質に対して特異的結合能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、抗体とそれに対する抗原、リガンドとそれに対するレセプター、糖とそれに対するレクチン等が挙げられる。

このような本発明に係る電気泳動チップによれば、流路内に充填された泳動用緩衝液に電圧を印加することにより、流路内に電気浸透流を発生させることができ、これにより、測定対象物質の荷電状態の如何によらず、測定対象物質を流路内の特異的結合物質が設けられた位置まで泳動させることができる。そして、特異的結合物質に測定対象物質を捕捉させて、測定対象物質と特異的結合物質とを結合させ、形成された測定対象物質と特異的結合物質との複合体を検出することにより、被検試料に含まれる測定対象物質を検出・定量することが可能となる。

また、本発明においては、特異的結合物質がビーズ等の微粒子に担持されており、測定対象物質と特異的結合物質との結合等の反応が三次元で行なわれるため、イムノクロマト法等の平面上に抗体を固定化して二次元で反応が行なわれる従来法に比べて、反応効率を向上させることができる。

更に、本発明においては、流路内にゲルが設けられているので、ゲルを使用しない電気泳動よりも、流路内における被検試料の逆流が生じにくい。このため、逆流が生じた場合に起こる、被検試料の滞りや、ＢＦ分離効率の悪化等を良好に防ぐことができる。

当該測定対象物質と特異的結合物質との複合体の検出を容易にするためには、更に、前記流路内に、前記測定対象物質に対して特異的結合能を有し、標識された特異的結合物質が設けられていることが好ましい。このようなものであれば、いわゆるサンドイッチ法又はそれに類する機構を有する分析系を構築することができ、当該測定対象物質と特異的結合物質（以下、捕捉用特異的結合物質という。）との複合体に更に、標識された特異的結合物質（以下、標識用特異的結合物質という。）が結合して、これら３種の物質からなる複合体が形成される一方、未反応の標識用特異的結合物質は電気浸透流により分離されるので、ＢＦ分離が容易となる。この結果、これらの複合体を前記標識に基づき容易にかつ高い精度で検出することが可能となる。

ここで、前記標識としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、ルシファーイエロー、カスケードブルー、フィコエリスリン、エオシン、ビオチン等の蛍光物質；^１２５Ｉ等の放射性同位元素；ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ等の酵素等が挙げられる。

本発明に係る電気泳動チップは、捕捉用特異的結合物質に代えて、測定対象物質を前記微粒子に担持して用いることにより、競合法又はそれに類する機構を有する分析系を備えたものとすることもできる。このような本発明に係る電気泳動チップは、電解液と接触するとその内壁表面が正又は負に帯電する流路を内部に備えており、前記流路内で測定対象物質を電気泳動させるためのチップであって、前記流路内に、微粒子に担持され、かつ、ゲルによって移動を妨げられた状態の前記測定対象物質と、前記測定対象物質に対して特異的結合能を有し、標識された特異的結合物質とが、互いに離れて設けられていることを特徴とする。

前記特異的結合物質としては、なかでも、前記測定対象物質を抗原とする抗体であることが好ましく、このように前記特異的結合物質として抗体を用いることにより、特異性に優れ信頼性の高い抗原抗体反応を利用して電気泳動チップを構成することができる。

本発明に係る電気泳動チップは、更に、前記流路内に供給するための泳動用緩衝液を貯留する液溜め部と、前記流路内に充填された泳動用緩衝液に電圧を印加する一対の電圧印加部と、を備えていてもよい。

本発明に係る電気泳動チップを用いて、被検試料中の測定対象物質を検出する分析方法もまた、本発明の１つである。すなわち本発明に係る分析方法は、本発明に係る電気泳動チップを用いて、被検試料中の測定対象物質を検出する分析方法であって、前記流路内に前記被検試料を導入する工程と、前記流路内に充填された泳動用緩衝液に電圧を印加して電気浸透流を発生させて、前記測定対象物質を電気泳動させ、前記測定対象物質と前記特異的結合物質との複合体を形成する工程と、前記複合体を検出する工程と、を備えていることを特徴とする。

本発明に係る分析方法において、前記測定対象物質の検出を容易にするためには、前記測定対象物質とともに、標識用特異的結合物質を電気泳動させ、前記測定対象物質と前記捕捉用特異的結合物質と前記標識用特異的結合物質との複合体を形成することが好ましい。

本発明に係る分析方法は、捕捉用特異的結合物質に代えて、測定対象物質を前記微粒子に担持して用い、競合法又はそれに類する機構を有する分析系が構築された本発明に係る電気泳動チップを用いてもよい。このような本発明に係る分析方法は、本発明に係る電気泳動チップを用いて、被検試料中の測定対象物質を検出する分析方法であって、前記流路内に前記被検試料を導入する工程と、前記流路内に充填された泳動用緩衝液に電圧を印加して電気浸透流を発生させて、前記測定対象物質を電気泳動させ、前記測定対象物質と前記標識された特異的結合物質との複合体を形成する工程と、前記複合体を検出する工程と、を備えていることを特徴とする。

本発明に係る分析方法において、前記標識が蛍光物質であれば、前記測定対象物質と前記捕捉用特異的結合物質と前記標識用特異的結合物質との複合体に励起光を照射して、生じた蛍光に基づき前記測定対象物質を検出することができる。

このように本発明によれば、簡便かつ短時間に、高い精度で再現性良く測定対象物質を検出することができる電気泳動チップ及びそれを用いてなる分析方法を提供することができる。

本発明の一実施形態に係る電気泳動チップの全体斜視図。 同実施形態に係る電気泳動チップの分解斜視図。 同実施形態に係る電気泳動チップに電極を設けた態様を示す全体斜視図。 同実施形態に係る電気泳動チップのサンプル導入部近辺を拡大した概念図。 同実施形態に係る電気泳動チップを用いた分析方法における各反応工程（ａ）〜（ｃ）を示す図。 同実施形態に係る電気泳動チップを用いた分析方法における各反応工程（ｄ）〜（ｅ）を示す図。

以下に本発明の一実施形態について図面を参照して説明する。

本実施形態に係る電気泳動チップ１は、インスリンＸを測定対象物質とするものであり、図１に示すように、内部に形成された流路１１と、流路１１の上流側（陽極側）から順に設けられた上流側液溜め部１２と、第１サンプル導入部１３と、第２サンプル導入部１４と、下流側液溜め部１５とを備えており、上流側液溜め部１２と、第１サンプル導入部１３と、第２サンプル導入部１４と、下流側液溜め部１５とは、いずれも電気泳動チップ１の上面に開口し、かつ、流路１１に連通している。このような電気泳動チップ１は、図２に示すように、２枚の石英ガラス基板２、４と、当該石英ガラス基板２、４に挟まれたシリコーンシート３との積層体から構成されており、石英ガラス基板２には、それぞれ上流側液溜め部１２、第１サンプル導入部１３、第２サンプル導入部１４、下流側液溜め部１５に対応する、４つの貫通孔２１、２２、２３、２４が形成されており、また、シリコーンシート３には、流路１１の形状に従って切除された切欠部３１が形成されている。

以下に各部を説明する。
流路１１は、上下面が石英ガラスから構成され、両側面がシリコーンから構成されており、その横断面が幅１ｍｍ×高さ１００μｍである幅方向に対して高さ方向が充分に小さい矩形状のものである。上流側液溜め部１２と下流側液溜め部１５とに挟まれた流路１１内には、第１サンプル導入部１３と第２サンプル導入部１４とを除いて、アガロースゲル（１％アガロース、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ ８９ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、ポアサイズ約５００ｎｍ）が充填されている。石英ガラスから構成された上下面は泳動用緩衝液と接するとシラノール基が負の電荷を持ち、流路１１の上下面と泳動用緩衝液との界面に電気二重層が形成される。その状態で流路１１内に充填された泳動用緩衝液に高電圧が印加されると流路１１内に陽極から陰極に向けての液体移動である電気浸透流が発生する。この電気浸透流により、測定対象物質が流路１１内を泳動する。なお、流路１１の下流側（陰極側）端部は、図示しない栓により封止されている。

上流側液溜め部１２及び下流側液溜め部１５は、それぞれ泳動用緩衝液を貯留するためのものである。泳動用緩衝液としては、例えば、ＴＢＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ ８９ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ）が用いられる。上流側液溜め部１２及び下流側液溜め部１５には、図３に示すように、電極板５ａ、５ｂを設置して電圧印加部としても機能できるように、いずれにも電極板５ａ、５ｂを挿入するための溝１２ａ、１２ｂ、１５ａ、１５ｂが形成されている。

第１サンプル導入部１３と第２サンプル導入部１４には、図４に示すように、それぞれ、第１サンプル導入部１３には、蛍光物質で標識された抗インスリン抗体（以下、蛍光標識抗インスリン抗体ともいう。）Ａが収容されており、第２サンプル導入部１４には、抗インスリン抗体が担持されたセファロース製ビーズ（以下、抗インスリン抗体固定化ビーズともいう。）Ｂが収容されている。これら両サンプル導入部１３、１４はその中心間が１０ｍｍ離れて設けられている。抗インスリン抗体が担持されたセファロース製ビーズの直径はφ９０μｍであり、流路１１内に形成されたアガロースゲルのポアサイズよりも充分に大きいので、抗インスリン抗体固定化ビーズＢはアガロースゲルにより移動が妨げられて、第２サンプル導入部１４から流出することができないが、一方、蛍光標識抗インスリン抗体Ａのサイズは約１５ｎｍ程度であるので、アガロースゲルの網目構造内部に入り込んで、流路１１内を移動することができる。

なお、本実施形態における抗インスリン抗体としては、いずれもポリクローナル抗体が用いられているが、異なるエピトープを認識する２種のモノクローナル抗体が用いられてもよい。

当該電気泳動チップ１を用いて本実施形態における測定対象物質であるインスリンＸの分析を行うには、図５及び図６に示すように、まず、抗インスリン抗体固定化ビーズＢが収容されている第２サンプル導入部１４に被検試料を注入する（ａ）。すると、被検試料中にインスリンＸが含まれている場合は、当該インスリンＸは抗インスリン抗体固定化ビーズＢと結合して複合体を形成する（ｂ）。

次いで、上流側液溜め部１２及び下流側液溜め部１５にそれぞれ設けた一対の電極板５ａ、５ｂ間に電圧（本実施形態では１０００Ｖ）を印加し、電気泳動を行う（ｃ）。すると、被検試料中にインスリンＸが含まれている場合は、第１サンプル導入部１３に収容されている蛍光標識抗インスリン抗体Ａが、第２サンプル導入部１４に移動して、抗インスリン抗体固定化ビーズＢと複合体を形成しているインスリンＸに結合し、インスリンＸと抗インスリン抗体固定化ビーズＢと蛍光標識抗インスリン抗体Ａの３種の物質からなる複合体を形成する（ｄ）。なお、遊離のインスリンＸと蛍光標識抗インスリン抗体Ａとは、第２サンプル導入部１４から流出して陰極の方向へ泳動する。

そして、得られたインスリンＸと抗インスリン抗体固定化ビーズＢと蛍光標識抗インスリン抗体Ａの３種の物質からなる複合体に励起光を照射すると、蛍光が生じ（ｅ）、これを検出して、その光強度を予め作成された検量線等と比較することにより、被検試料中のインスリンＸの含有量を算出することができる。

したがって、このように構成した本実施形態に係る電気泳動チップ１によれば、ＥＬＩＳＡ法のような洗浄工程は不要であり、また、ウェスタンブロット法のような膜転写工程も不要である。また、得られた測定対象物質と捕捉抗体固定化ビーズと蛍光標識抗体の３種の物質からなる複合体に励起光を照射し、生じた蛍光の光強度に基づき測定対象物質の検出を行うことができるので、イムノクロマト法のように、目視で分析結果の判定を行う場合に比べて作業者による差が生じにくく再現性に優れており、また、イムノクロマト法とは異なり測定対象物質の定量が容易である。このため、本実施形態に係る電気泳動チップ１を用いることにより、従来の抗原抗体反応を利用した分析法に比べて、測定対象物質を簡便かつ短時間に、高い精度で再現性良く検出・定量することができる。

更に、本実施形態においては捕捉抗体がビーズに担持されており、このため、ビーズに担持された捕捉抗体と測定対象物質との結合や、捕捉抗体固定化ビーズと複合体を形成した測定対象物質への蛍光標識抗体の結合が、三次元で立体的に行なわれる。従って、本実施形態によれば、平面上に抗体を固定化して二次元で反応が行なわれるイムノクロマト法等の従来法に比べて、反応効率を向上させることができる。

また、本実施形態においては流路１１内にゲルが設けられているので、ゲルを使用しない電気泳動よりも、流路１１内における被検試料の逆流が生じにくい。このため、本実施形態によれば、逆流が生じた場合に起こる、被検試料の滞りや、ＢＦ分離効率の悪化等を良好に防ぐことができる。

更に、本実施形態に係る電気泳動チップ１は、流路１１の横断面形状が幅方向に対して高さ方向が充分に小さい矩形状のものであるが、流路１１の横断面が同一面積の矩形状である場合、幅と高さの差（比）が大きいほど内壁表面と泳動用緩衝液との接触面積が増えるので、本実施形態によれば、電気浸透流の速度を充分増大させることができ、その結果、泳動時間を短縮することが可能となる。

また、本実施形態に係る電気泳動チップ１は、流路１１の幅が大きいので、第２サンプル導入部１４から被検試料を直接流路１１内に導入することができ、また、導入した被検試料中の測定対象物質は電気浸透流により移動されるので、従来のマイクロ流路チップとは異なり、被検試料を流路１１内に導入するための送液ポンプが不要である。

また、本実施形態に係る電気泳動チップ１を使い捨てとすることにより、測定対象物質が有害物質であっても、周囲を汚染することなく安全に分析を行うことができる。

なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。

例えば、本発明に係る電気泳動チップは、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の樹脂製の基板に流路が形成され、当該流路内にガラスコーティングが施されたものであってもよい。

更に、抗インスリン抗体固定化ビーズＢはゲル中に埋設されていてもよい。

また、蛍光標識抗インスリン抗体Ａを第２サンプル導入部１４内に収容し、被検試料は第１サンプル導入部１３から導入するようにしてもよい。

更に、抗インスリン抗体固定化ビーズＢに代えて、測定対象物質が担持されたビーズが用いられてもよい。このような測定対象物質が担持されたビーズを用いることにより、競合法を利用して電気泳動チップを構成することができる。

その他、本発明は前述した実施形態や変形実施形態の一部又は全部を適宜組み合わせてもよく、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。

１・・・電気泳動チップ
１１・・・流路
Ｂ・・・抗インスリン抗体固定化ビーズ

Claims (9)

1. 電解液と接触するとその内壁表面が正又は負に帯電する流路を内部に備えており、前記流路内で測定対象物質を電気泳動させるためのチップであって、
   前記流路内に、微粒子に担持され、かつ、ゲルによって移動を妨げられた状態で、前記測定対象物質に対して特異的結合能を有する特異的結合物質が設けられていることを特徴とする電気泳動チップ。
2. 前記流路内に、前記測定対象物質に対して特異的結合能を有し、標識された特異的結合物質が設けられている請求項１記載の電気泳動チップ。
3. 電解液と接触するとその内壁表面が正又は負に帯電する流路を内部に備えており、前記流路内で測定対象物質を電気泳動させるためのチップであって、
   前記流路内に、微粒子に担持され、かつ、ゲルによって移動を妨げられた状態の前記測定対象物質と、前記測定対象物質に対して特異的結合能を有し、標識された特異的結合物質とが、互いに離れて設けられていることを特徴とする電気泳動チップ。
4. 前記特異的結合物質が、前記測定対象物質を抗原とする抗体である請求項１、２又は３記載の電気泳動チップ。
5. 前記流路内に充填するための泳動用緩衝液を貯留する液溜め部と、
   前記流路内に充填された泳動用緩衝液に電圧を印加する一対の電圧印加部と、
   を備えている請求項１、２、３又は４記載の電気泳動チップ。
6. 請求項１、２、４又は５記載の電気泳動チップを用いて、被検試料中の測定対象物質を検出する分析方法であって、
   前記流路内に前記被検試料を導入する工程と、
   前記流路内に充填された泳動用緩衝液に電圧を印加して電気浸透流を発生させて、前記測定対象物質を電気泳動させ、前記測定対象物質と前記特異的結合物質との複合体を形成する工程と、
   前記複合体を検出する工程と、を備えていることを特徴とする分析方法。
7. 前記測定対象物質とともに、前記測定対象物質に対して特異的結合能を有し、標識された特異的結合物質を電気泳動させて、前記測定対象物質と前記特異的結合物質と前記標識された特異的結合物質との複合体を形成する請求項６記載の分析方法。
8. 請求項３、４又は５記載の電気泳動チップを用いて、被検試料中の測定対象物質を検出する分析方法であって、
   前記流路内に前記被検試料を導入する工程と、
   前記流路内に充填された泳動用緩衝液に電圧を印加して電気浸透流を発生させて、前記測定対象物質を電気泳動させ、前記測定対象物質と前記標識された特異的結合物質との複合体を形成する工程と、
   前記複合体を検出する工程と、を備えていることを特徴とする分析方法。
9. 前記標識が、蛍光物質であり、
   前記特異的結合物質と前記測定対象物質と前記標識された特異的結合物質との複合体に励起光を照射して、生じた蛍光に基づき前記測定対象物質を検出する請求項６、７又は８記載の分析方法。