FI71768C - Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. - Google Patents

Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. Download PDF

Info

Publication number
FI71768C
FI71768C FI840655A FI840655A FI71768C FI 71768 C FI71768 C FI 71768C FI 840655 A FI840655 A FI 840655A FI 840655 A FI840655 A FI 840655A FI 71768 C FI71768 C FI 71768C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
nucleic acid
fragments
reagents
dna
stripe
Prior art date
Application number
FI840655A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI71768B (fi
FI840655A0 (fi
FI840655A7 (fi
Inventor
Tuula Marjut Ranki
Hans Erik Soederlund
Airi Marjatta Palva
Original Assignee
Orion Yhtymae Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Yhtymae Oy filed Critical Orion Yhtymae Oy
Publication of FI840655A0 publication Critical patent/FI840655A0/fi
Priority to FI840655A priority Critical patent/FI71768C/fi
Priority to ZA85511A priority patent/ZA85511B/xx
Priority to US06/694,325 priority patent/US4731325A/en
Priority to IE202/85A priority patent/IE57652B1/en
Priority to AU38422/85A priority patent/AU577568B2/en
Priority to IT19432/85A priority patent/IT1183184B/it
Priority to BE214463A priority patent/BE901671A/fr
Priority to DK198500589A priority patent/DK174675B1/da
Priority to CA000474112A priority patent/CA1248895A/en
Priority to LU85768A priority patent/LU85768A1/fr
Priority to NO850554A priority patent/NO166543C/no
Priority to NL8500424A priority patent/NL193663C/nl
Priority to CH725/85A priority patent/CH671778A5/de
Priority to HU85570A priority patent/HU194938B/hu
Priority to FR858502188A priority patent/FR2559783B1/fr
Priority to SE8500733A priority patent/SE463103B/sv
Priority to JP60029207A priority patent/JPS60188100A/ja
Priority to DE3505287A priority patent/DE3505287C2/de
Priority to GB08503900A priority patent/GB2156074B/en
Priority to AT0044185A priority patent/AT394578B/de
Priority to SU853856877A priority patent/SU1523053A3/ru
Priority to RO117684A priority patent/RO92633B/ro
Publication of FI840655A7 publication Critical patent/FI840655A7/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI71768B publication Critical patent/FI71768B/fi
Publication of FI71768C publication Critical patent/FI71768C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

71768
Parannetut nukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistusmenetelmä
Keksinnön kohteena ovat raitasarjanukleiinihappofragmenteista 05 koostuvat parannetut nukleiinihapporeagenssit. Keksintö koskee myös raitasarjaklooneista koostuvien nukleiinihappo-reagenssien valmistusmenetelmää yhdistelmä-DNA-tekniikalla.
Nukleiinihappojen tunnistamisessa ja tutkimisessa on yleises-10 ti käytetty erilaisia hybridisaatiomenetelmiä. Esimerkkeinä voidaan mainita suorat hybridisaatiomenetelmät, joissa tunnistettavaa nukleiinihappoa sisältävä näyte on joko liuoksessa (Brautigam et ai., J.Clin.Microbiol., 1980, 12^, 226-234 ja patenttijulkaisu GB 2,019,408) tai kiinnitettynä kiinteään 15 kantajaan (patenttijulkaisut US 4,139,346, US 4,302,204, US 4,358,535, US 4,395,486, GB 2,034,323, GB 2,095,833, EP 62,286, EP 62,237 ja EP 61,740) ja osoitetaan yhdellä leimatulla nukleiinihapporeagenssilla, joka hybridisoituu osoitettavan nukleiinihapon kanssa.
20
Muita tunnettuja hybridisaatiomenetelmiä ovat Dunn ja Hassell' in julkaisussa Cell, 12^, 23-36, 1977 esittämä kaksivaiheinen kerroshybridisaatiomenetelmä ja patentissa FI 63,596 esitetty yksivaiheinen kerroshybridisaatiomenetelmä. Nämä 25 menetelmät poikkeavat suorista menetelmistä siinä, että nukleiinihapon tunnistamiseen tarvitaan kaksi erillistä nukle-iinihapporeagenssia, joilla osoitetaan näyteliuoksessa oleva nukleiinihappo. Toinen näistä reagensseista on kiinnitetty kiinteään kantajaan ja toinen on leimattu.
30
Nukleiinihapporeagensseille, sekä kiinteään kantajaan kiinnitetyille että leimatuille, on tunnusomaista, että niiden emäsjärjestys on tunnistettavaksi tarkoitetulle nukleiinihapolle komplementaarinen tai lähes komplementaarinen eli homo-35 loginen. Nukleiinihapporeagensseina on käytetty luonnossa esiintyviä nukleiinihappoja sellaisenaan tai fragmentteina. Fragmentit on aikaansaatu esimerkiksi restriktioentsyymien 2 71768 avulla. Nukleiinihapporeagensseja on valmistettu myös synteettisesti tai yhdistelmä DNA-tekniikkaa hyväksi käyttäen. Nukleiinihapporeagensseina on käytetty luonnossa esiintyviä plasmideja (patentti US 4,358,535), nukleiinihappoja bak-05 teriofaageista (patentti US 4,543,535), ribosomaalista RNA:ta ja lähetti-RNA:ta (patentti US 4,302,204) tai nukleiinihappoja eri viruksista (Stälhandske et ai., Curr.Top.Microbiol. Virol. 104, 1983). Koko virusgenomia on käytetty tunnistamaan esimerkiksi hybridiviruksen lähetti-RNA:n eri viruksiin 10 kuuluvia osia (Dunn ja Hassell, Cell, t2, 23-36, 1977). Nukleiinihapporeagensseja on valmistettu myös yhdistelmä-DNA-tekniikkaa hyväksi käyttäen (patentit US 4,395,486, US 4,359,535, FI 63,596, sekä patenttijulkaisut GB 2,034,323 ja EP 62,286). Yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaatuja 15 nukleiinihapporeagensseja on käytetty joko siten, että monistettu DNA-fragmentti on puhdistettu erilleen vektorin DNA:sta tai yhdistelmä-DNA-molekyyleinä erilaisiin vektoreihin liitettyinä. Aikaisemmin käytetyt yhdistelmä-DNA-tekniikalla aikaansaadut nukleiinihapporeagenssit koos-20 tuvat yhdestä yhtenäisestä tunnistavasta nukleiinihappofrag-mentista tai useista erillisistä klooneista.
Olemme kehittäneet uudet herkemmät nukleiinihapporeagenssit, jotka koostuvat kahdesta sarjasta pääasiallisesti vuorot-25 televia raitasarjanukleiinihappofragmentteja, jotka on valmistettu joko yhdestä tai useammasta tunnistettavalle nukleiinihapolle homologisesta segmentistä.
Nukleiinihapporeagenssit, jotka koostuvat tällaisista raita-30 sarjanukleiinihappofragmenteista ovat kerroshybridisaatio-testeissä vähintään kaksi kertaa herkemmät kuin aikaisemmin käytössä olleet nukleiinihapporeagenssit. Keksinnön mukaisilla nukleiinihapporeagensseilla ja niiden yhdistelmillä voidaan tunnistaa entistä pienempiä nukleiinihappomääriä, ja ne 35 soveltuvat erikoisen hyvin käytettäväksi kerroshybridisaatio-menetelmissä.
Keksinnön mukaisten nukleiinihapporeagenssien suurempi
II
3 717 6 8 herkkyys kerroshybridisaatiomenetelmissä perustuu osittain siihen, että useampien koettimien käyttö lisää leimattujen hybridien määrää kiinteällä kantajalla. Jokaisen hybridisoi-tuvan koettimen mukana voi olla leimattua vektoriperäistä 05 nukleiinihappoa (kuvat 1 ja 2). Kuvissa 1 ja 2 v esittää vektoriperäistä DNA:ta, x tunnistettavaa nukleiinihappoa, b leimattua koetinta, a kiinteään kantajaan kiinnitettyä tunnistavaa nukleiinihapporeagenssia ja F filtteriä. Kun käytetään useita koettimia, leimattujen vektoriperäisten nuk-10 leiinihappo-osien määrä kasvaa ja muodostuviin hybrideihin sitoutuu enemmän leimaa. Hybridit ovat siten helpommin osoitettavissa.
Kun käytetään keksinnön mukaisia raitasarjanukleiinihappo-15 fragmentteja kerroshybridisaatiomenetelmissä, kiinteään kantajaan on kiinnitetty vähintäin kaksi tai kuten kuvassa 1 on esitetty kolme tunnistavaa nukleiinihappofragmenttia. Tällöin osoitettava nukleiinihapposäie x saattaa hybridi-soitua eri alueistaan kiinteään kantajaan kiinnitettyihin 20 nukleiinihappofragmentteihin, esimerkiksi a^, a2 ja a^, joko yhdestä tai useammasta kohdasta reaktioasteesta riippuen. Reaktion saavuttaessa lopputilansa saattaa syntyä kuvan 1 mukainen tilanne, jossa näytesäie muodostaa silmukan tai silmukoita, joihin koetin tai koettimet esimerkiksi b^ ja b2 25 kuvassa 1 kiinnittyvät. Tällöin vektoriperäisten nukleiinihappo-osien etäisyys hybridisaatioliitoskohdasta (1) pienenee (kuva 1) ja hybridi on stabiilimpi kuin kuvassa 2 esitetty yhden reagenssiparin (tekniikan tasoon kuuluva) muodostama hybridi, joka on samankokoinen kuin raitasarja-alue yhteensä. 30 Yhdestä reagenssiparista muodostuneen hybridin vektoriperäi-set osat katkeavat helposti esimerkiksi mekaanisesta rasituksesta, kuten ravistelusta. Tällöin hybridiin jo sitoutunut leima karkaa. 1
Koska keksinnön mukaiset parannetut nukleiinihapporeagenssit ovat herkempiä kuin aikaisemmin käytetyt nukleiihapporeagens-sit, ne sopivat kromosomaalisten uudelleenjärjestelyjen osoittamiseksi ja perinnöllisten tautien osoittamiseksi.
71 768 4
Keksintömme kohteena ovat raitasarjanukleiinihappofragmen-teista koostuvat nukleiinihapporeagenssit nukleiinihappojen osoittamiseksi hybridsaatiomenetelmissä sekä kyseisten reagenssien valmistus.
05
Keksinnön tunnusomaiset seikat selviävät patenttivaatimusten tunnusmerkeistä ja keksintö selviää tarkemmin seuraavasta selityksestä ja oheisista piirustuksista, joissa kuva 1 esittää raitasarjakerroshybridiä, 10 kuva 2 esittää tekniikan tasoon kuuluvaa kerroshybridiä, kuva 3 esittää vuorottelevien raitasarjanukleiinihappo-fragmenttien paikat nukleiinihapossa, joka on valittu keksinnön mukaisten raitasarjanukleiinihapporeagenssien valmistamiseksi , 15 kuva 4 esittää pääasiallisesti vuorottelevien raitasarja-nukleiinihappofragmenttien vastaavat paikat, ts. tilanteen, jossa b-sarjan fragmentit jakaantuvat vierekkäisiin ali fragmentteihin kuva 5 esittää kuvan 3 mukaiset raitasarjanukleiinihappo-20 fragmentit erillisinä (a), yhteenliitettyinä (b) ja sekä erillisinä että yhteenliitettyinä (c), kuva 6 esittää raitasarjakerroshybridejä, kuva 6a esittää raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu, kun käytetään erillisiä fragmentteja, 25 kuva 6b esittää raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu, kun käytetään yhteenliitettyjä b-fragmentteja, kuva 6c esittää raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu, kun on käytetty sekä erillisiä että yhteenliitettyjä b-fragment-te ja, 30 kuva 7 esittää eri nukleiinihappoja tunnistavia raitasarja-nuklei inihapporeagensseja, kuva 8 esittää raitasarjakerroshybridejä, jotka muodostuvat, kun käytetään kuvan 7 mukaisia eri nukleiinihappoja tunnistavia raitasarjanukleiinihapporeagensseja, 35 kuva 9 esittää suorassa hybridisaatiomenetelmässä muodostuvaa raitasarjahybridiä, kuva 10 esittää rekombinanttiplasmidia pKTHl220, kuva 11 kuvaa raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu kun 71768 5 käytetään rekombinanttiplasmidista pKTHl220 valmistettuja raitasarjanuklei inihappofragmentteja, kuva 12 esittää rekombinanttiplasmidia pKTHl271, kuva 13 esittää raitasarjakerroshybridiä, joka muodostuu kun 05 käytetään rekombinanttiplasmidista pKTHl271 valmistettuja raitasarjanuklei inihappofragmentteja.
Keksintömme kohteena ovat raitasarjanukleiinihappofragmen-teista koostuvat nukleiinihapporeagenssit. Nämä raitasarja-10 nukleiinihapporeagenssit koostuvat vähintään kahdesta, mutta edullisesti useammasta pääasiallisesti vuorottelevasta nukleiinihappofragmentista, jopa 20 fragmentista, jotka ovat peräisin yhdestä tai useammasta nukleiinihaposta, joka on tunnistettavalle nukleiinihapolle riittävän homologinen.
15 Tällöin saadaan kaksi sarjaa pääasiallisesti vuorottelevia raitasarjanukleiinihappofragmentteja, jotka eivät saa olla toisilleen homologisia.
Keksinnön mukaiset nukleiinihapporeagenssit koostuvat joko 20 erillisistä, yhteenliitetyistä tai sekä erillisistä että yhteenliitetyistä raitasarjanukleiinihappofragmenteista.
Raitasarjanukleiinihappofragmentit voivat olla vektoriin liitettyjä, sisältää osia vektoreista tai olla täysin vapaita vektoriosista.
25 Käytetyt nukleiinihappofragmentit ovat vähintäin 15 nukleotidin pituisia. Varsinaista pituuden ylärajaa ei ole, mutta on edullista käyttää 20-5000 nukleotidin pituisia fragmentteja. Keksinnön mukaiset nukleiinihappofragmentit ovat peräisin 30 joko tunnistettavasta genomista tai yhdestä genomin osasta, esimerkiksi suhteellisen suuresta genomin määrättyä osaa edustavasta kloonista. Keksinnön mukaiset raitasarjanukleiinihappof ragmentit voidaan siis valmistaa useista riippumattomista genomialueista, jotka eivät ole välittömästi vierek-35 käin. Näin valmistetut raitasarjanukleiinihappofragmentit yhdistetään samaan reagenssiin. Raitasarjanukleiinihappo-fragmentit voidaan myös eristää DNArsta, joka ei ole tunnistettavan nukleiinihapon kanssa identtinen, mutta on 6 71 768 riittävän homologinen niin, että reagenssin ja tunnistettavan nukleiinihapon kesken syntyy stabiili hybridi.
Reagenssit eristetään siten, että saadaan kaksi sarjaa 05 pääasiallisesti vuorottelevia nukleiinihappofragmentteja jne* ja 3ne· Sarjaan a^,82,3^ jne. kuuluvat nukleiinihappofragmentit koostuvat lähellä toisiaan, edullisesti ei kuitenkaan vierekkäin sijaitsevista fragmenteista. Sarjaan b^,b2,bj, jne. kuuluvat nukleiinihappofragmentit 10 koostuvat myös lähellä toisiaan, edullisesti ei kuitenkaan vierekkäin sijaitsevista nukleiinihappofragmenteista. Sarjaan a^,82^3 jne. kuuluvat ja sarjaan b^,b2»b2 jne. kuuluvat nukleiinihappofragmentit eivät saa olla homologisia toisilleen. On edullista, että sarjaan a1#a2»a3 jne. ja sarjaan 15 b^,b2ibg jne. kuuluvat nukleiinihapot on eristetty niin, että joka toinen fragmentti kuuluu a-sarjaan ja joka toinen b-sar-jaan, kuten on esitetty kuvassa 3. Kuvassa 3 a^, a2 ja a^ sekä b^, b2 ja b^ ovat tunnistettavalle nukleiinihapolle riittävän homologisia raitasarjanukleiinihappofragmentteja.
20 On tietysti mahdollista valmistaa kunkin nukleiinihappo-fragmentin asemasta useampia ns. alifragmentteja, kuten on esitetty kuvassa 4. Aiifragmentit voivat olla vierekkäin ts. niiden ei tarvitse täysin vuorotella toisen sarjan fragmenttien kanssa. On edullista, että vuorottelevat kaksi nuk-25 leiinihapporeagenssia seuraavat toisiaan välittömästi, mutta tämä ei ole mikään välttämätön edellytys keksinnölle. Vastaavasti on edullista, että alifragmentit seuraavat toisiaan välittömästi, mutta tämäkään ei ole välttämätön edellytys keksinnölle.
30
Yllä kuvattuja nukleiinihappofragmenttisarjoja voidaan käyttää joko erillisinä fragmentteina a^,a2,a.j jne. ja b^,b2,b2 jne. (kuva 5a) tai toisiinsa liitettyinä nauhoina a^-a2-aj jne. ja b^-b2-bj jne. (kuva 5b). On tietysti 35 mahdollista valmistaa kaikenlaisia välimuotoja kuten esimerkiksi a-sarja, jossa a^ on erillisenä fragmenttina ja a2-a3 ovat yhteenliitettyjä ja b-sarjassa esimerkiksi ^^2 ovat yhteenliitettyinä ja b^ erillisenä jne., kuten on ti 7 71768 esitetty kuvassa 5c.
Kuvassa 6 on esitetty erilaisia raitasarjakerroshybrideja. Kuvassa 6a on esitetty raitasarjakerroshybridi, jossa raita-05 sarjanukleiinihappofragmentit ovat erillisiä. Kuvassa 6b on esitetty raitasarjahybridi, jossa leimatut raitasarjanukleiinihappof ragmentit ovat yhteenliitettyjä. Kuvassa 6c on esitetty tapaus, jossa sekä yhteenliitetyt että erilliset leimatut raitasarjanukleiinihappofragmentit muodostavat raitasar-10 jakerroshybridin. Kuvassa 6 x esittää tunnistettavaa nukleiinihappoa, b^, b2 ja b^ leimattua koetinta sekä a^, a2 ja a3 kiinteään kantajaan kiinnitettyjä raitasarjanukleiinihappo-fragmentteja.
15 Nukleiinihappofragmentit, jotka kuuluvat b-sarjaan voidaan esimerkiksi leimata niin, että saadaan leimattu nukleiini-happoreagenssi eli koetin B. Nukleiinihapporeagenssit, jotka kuuluvat a-sarjaan voidaan kiinnittää kiinteään kantajaan niin, että saadaan kiinteään kantajaan sidottu nukleiini-20 happoreagenssi A. Voidaan tietysti vaihtoehtoisesti tehdä leimattu nukleiinihapporeagenssi A ja vastaava kiinteään kantajaan sidottu nukleiinihapporeagenssi B.
Tällaisia leimattuja ja kiinteään kantajaan kiinnitettyjä 25 nukleiinihappopareja A ja B tai B ja A voidaan valmistaa useille eri tunnistettaville nukleiinihapoille ja yhdistää sopiviksi nukleiinihapporeagenssien yhdistelmiksi, jotka koostuvat eri nukleiinihapporeagenssipareista A^ ja B^, A2 ja B2' A3 -^a B3 ^ne· ta^ Bl Ai' B2 ^a A2' B3 ^a A3 jne· Er* 30 nukleiinihappoja tunnistavia raitasarjanukleiinihappofrag- mentteja sisältävät reagenssit voidaan myös liittää yhteen niin, että saadaan koetin A -A -A , joka koostuu esimerkiksi x y z raitasarjanukleiinihappofragmenteista (ai~a2-a3)χ-(ai_a2~ a2)y-(a^~a2-a3)z» kuten on esitetty kuvassa 7, jossa a^x, a2x 35 ja ajx ovat nukleiinihappoa x tunnistavia raitasarja-nukleiinihappofragmentteja Αχ; a^y, a2y 3a a3y ovat nukleiinihappoa y tunnistavia raitasarjanukleiinihappo-fragmentteja A; a^z, a2z 3a a3z ovat nukleiinihappoa z 71 768 8 tunnistavia raitasarjanukleiinihappofragmentteja A ja v on
Z
vektoriperäinen nukleiinihappo-osa. Yhteenliitettyjä raitasar janukleiinihappof ragmentte ja voidaan tietysti käyttää myös erillisinä fragmentteina sopivina seoksina.
05
Kuvassa 7 esitetyillä reagensseilla saadaan kuvan 8 mukaisia raitasarjakerroshybridejä. Jos halutaan tunnistaa useita eri nukleiinihappoja samanaikaisesti, on tietysti käytettävä erillisiä filttereitä kuten kuvassa 8 on esitetty. Kuvassa 8a 10 on esitetty nukleiinihappoa x tunnistava kiinteä kantaja, kuvassa 8b nukleiinihappoa y tunnistava kiinteä kantaja ja kuvassa 8c nukleiinihappoa z tunnistava kiinteä kantaja. Kuvissa 8a, 8b ja 8c b^x, b2x ja b^x ovat kiinteään kantajaan kiinnitettyjä, nukleiinihappoa x tunnistavia raitasarja-15 nukleiinihappofragmentteja, b^, &2y ^3y ovat kiinteään kantajaan sidottuja, nukleiinihappoa y tunnistavia raitasar janukleiinihappof ragmentte ja ja b^z, k>2z ja b3z ovat kiinteään kantajaan kiinnitettyjä, nukleiinihappoa z tunnistavia raitasarjanukleiinihappofragmentteja ja x, y ja z 20 ovat tunnistettavat nukleiinihapot. Fx, F^ ja Fz ovat vastaavat kiinteät kantajat tai filtterit, A -A -A on koetin, joka x y z tunnistaa kaikki kolme nukleiinihappoa samanaikaisesti, mikäli käytetään erillisiä kiinteitä kantajia.
25 Edellä kuvatut nukleiinihappofragmenttisarjät, reagenssit ja reagenssien yhdistelmät voidaan valmistaa sinänsä tunnettujen yhdistelmä-DNA-tekniikoiden avulla. Tunnistettavasta nukleiinihaposta tai sitä edustavasta osasta valmistetaan joukko eripituisia nukleiinihappofragmentteja restriktioentsyymien 30 avulla. Jos tunnistettavan genomin restriktiokartta on tunnettu, voidaan tästä suoraan valita sopivia vierekkäisiä restriktioentsyymien avulla pilkottuja fragmentteja, jotka eristetään ja monistetaan yhdistelmä-DNA-tekniikkaa hyväksi käyttäen.
Kun on kysymys tuntemattomasta genomista, voidaan reagenssien tuotannossa käyttää välivaihetta siten, että kloonataan kohtalaisen suuri restriktiofragmentti, joka kartoitetaan ja 35 71768 täten saadun tiedon perusteella aikaansaadaan raitasarja-nukleiinihappofragmenttisarjät a^,a2,a3 jne. ja b^,b2,b3 jne.
Luonnollisesti voidaan käyttää edellisten menetelmien yhdis-05 telmiä ja käyttää useita suuria erillisiä kloonattuja res-triktiofragmentteja lähtökohtana ja valmistaa useita erillisiä sarjoja, jotka kombinoidaan sopiviksi yhdistelmiksi.
Keksinnön mukaisia nukleiinihappofragmenttisarjoja a^,a2,a3 10 jne. sekä b^,b2,b3 jne. on edullisinta valmistaa yhdistelmä-DNA-tekniikkaa hyväksi käyttäen siten, että sarja a kloonataan yhdessä vektorissa, esimerkiksi plasmidissa pBR322, ja sarja b puolestaan kloonataan toisessa sopivassa vektorissa, jolla ei ole edellisen vektorin kanssa yhteisiä alueita. Täl-15 lainen toinen edullinen vektori on esimerkiksi bakteriofaagi M13. Sarjaan a kuuluvat fragmentit voidaan liittää toisiinsa ja yhdistetty sarja kloonata yhteen vektoriin. Esimerkiksi voidaan kloonata a^-a2 toisiinsa liitettynä yhtenäisenä in-serttinä samassa pBR322-vektorissa. Vastaavalla tavalla 20 voidaan valmistaa reagenssisarja b^-b2· Kloonauksessa voidaan edullisesti käyttää vektoreita, joihin voidaan liittää erittäin suuria vierasta DNA:ta sisältäviä inserttejä. Esimerkiksi lambdafaagi ja kosmidivektorit ovat tähän tarkoitukseen sopivia.
25
Keksinnön mukaisessa raitasarjakerroshybridisaatiomenetelmäs-sä tarvitaan siis kaksi reagenssia, tunnistettavalle merkkiaineelle leimattu reagenssi eli koetin ja kiinteään kantajaan kiinnitetty nk. filtterireagenssi.
30
Koettimien leimaamisessa on yleisimmin käytetty radioaktiivisia isotooppeja. Esimerkiksi patenttijulkaisussa GB 2,034,323, US 4,358,535 ja US 4,302,204 on käytetty 32 125 131 3 seuraavia isotooppeja P, J, J ja H. Patentissa 125 35 FI 63,596 on käytetty J isotooppia. Nukleiinihappo-koettimia on myös modifioitu eri tavoilla ja leimattu esimerkiksi fluoresoivilla leimoilla (patenttijulkaisu FR 2,518,755). Myös entsymaattisia tai entsymaattisesti 10 71 768 mitattavia leimoja on käytetty (patenttijulkaisu GB 2,019,408, EP 63,879 ja FR 2,519,005). Patenttijulkaisuissa EP 70,685 ja EP 70,687 on kuvattu valoa emittoiva leima ja leimausmenetelmä ja patenttijulkaisussa FR 2,518,755 05 immunologisesti mitattava leima. Patentissa US 4,374,120 kuvattuja lantaniidikelaatteja etenkin europiumia voidaan käyttää merkkiaineina. Leimaksi sopii myös Leary et ai.'in kuvaama biotiini-avidiinimerkkiaine (PNAS 130, 4045-4049, 1983). Edellä on mainittu muutamia esimerkkejä leimoista, 10 joita voidaan käyttää keksinnön mukaisten nukleiinihappo- reagenssien leimaamiseksi, mutta on selvää, että uusia entistä parempia merkkiaineita tullaan kehittämään, jotka myös soveltuvat keksinnön mukaisten raitasarjanukleiinihappofrag-menttien leimaamiseen.
15
Filtterireagensseiksi sopivia kantajia ovat erilaiset nitro-selluloosafiltterit (patentit US 4,358,535 ja GB 2,095,833). Patenttijulkaisussa DD 148,955 on kuvattu tapa sitoa nukleiinihappoja kantajaan (paperiin) kemiallisesti. Patenteissa 20 US 4,359,535 ja US 4,302,204 on kuvattu kemiallisesti modifioituja papereita, joita voidaan käyttää kiinteinä kantajina. Muita vaihtoehtoja ovat nylonmembraanit ja modifioidut nit-roselluloosafiltterit. Mutta on selvää, että uusia materiaaleja tullaan kehittämään, jotka sopivat entistä paremmin kek-25 sinnön mukaisiksi kiinteiksi kantajiksi. On tietysti mahdollista käyttää myös muita kiinteitä kantajia kuten erilaisia kromatografiamatrikseja kuten triatsiini- tai epoksiaktivoi-tua-selluloosaa, lateksia ym. Kiinteän kantajan valinnassa ei periaatteessa ole muita rajoituksia kuin seuraavassa se-30 lostettavat. Kiinteään kantajaan on voitava kiinnittää nukleiinihappoa yksisäikeisessä muodossa niin, että nämä yksisäi-keiset nukleiinihapot voivat hybridisoitua komplementaarisen nukleiinihapon kanssa. Kiinteän kantajan on myös oltava helposti poistettavissa hybridisaatioliuoksesta tai hybridisaa-35 tioliuoksen on oltava helposti poistettavissa kiinteästä kantajasta. Koetin ei myöskään saa tarttua itse kantajamateriaa-liin niin, ettei se ole poispestävissä.
H
71768
Edellä kuvatut, leimatut ja kiinteään kantajaan sidotut rai-tasarjanukleiinihapporeagenssiparien yhdistelmät A ja B tai B ja A ja tällaisista eri nukleiinihappojen tunnistamista varten tehdyistä nukleiinihappopareista voidaan koota yhdistelmä 05 Αχ ja Βχ, Α^ ja B^, Az ja Bz· Näitä yhdistelmiä voidaan käyttää nukleiinihappojen x, y ja z samanaikaiseksi tunnistamiseksi kerroshybridisaatiomeneteImillä.
Näyte käsitellään siten, että nukleiinihapot vapautuvat hyb-10 ridisaatioliuokseen ja ne saatetaan yksisäikeiseen muotoon. Hybridisaatio suoritetaan hybridisaatioliuoksessa, johon lisätään sekä kiinteään kantajaan kiinnitetyt että leimatut nukleiinihapporeagenssit. Kun hybridisaatio on tapahtunut, nostetaan filtterit hybridisaatioliuoksesta, jos kiinteinä 15 kantajina on käytetty filttereitä. Jos on käytetty kromato-grafiamatrikseja, lateksia tai vastaavaa, hybridisaatioliuos poistetaan. Kiinteät kantajat huuhdellaan sopivalla pesuliu-oksella. Muodostuneet raitasarjakerroshybridit (kuvat 8a, 8b, 8c) detektoidaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Radioak-20 tiivinen leima mitataan esimerkiksi autoradiografiällä tai tuike- tai ^-laskimella. Entsymaattinen leima tunnistetaan esimerkiksi värireaktion jälkeen fotometrialla tai sakan perusteella. Lantaniidikelaatit voidaan detektoida niin kutsutulla "time resolved fluorescence"-menetelmällä. Immunologi-25 nen leima osoitetaan tarkoitukseen sopivilla immunologisilla menetelmillä.
Hybridisaatioliuoksena voidaan käyttää useita erilaisia seoksia, joista esimerkkeinä mainittakoon patenteissa FI 63,596, 30 ja US 4,302,204 esitetyt vaihtoehdot. Myös muita hybridisaa-tioseoksia voidaan tietysti käyttää. Hybridisaatio tapahtuu lämpötilassa 0-80 °C, mutta on edullista käyttää esimerkiksi lämpötilaa 65 °C. Riittävä hybridisaatio saattaa tapahtua hyvin lyhyessä ajassa, mutta on edullista käyttää 35 esimerkiksi 12-20 tunnin hybridisaatioaikoja.
Kaksivaiheinen kerroshybridisaatiomenetelmä suoritetaan periaatteessa samalla tavalla, mutta tässä tapauksessa lisätään 12 71768 ensin kiinteään kantajaan kiinnitetty nukleiinihapporeagenssi hybridisaatioliuokseen. Kun hybridisaatio on tapahtunut, kiinteä kantaja pestään ja suoritetaan toinen hybridisaatio, jossa leimattu nukleiinihapporeagenssi on mukana.
05
Edellä kuvattuja leimattuja nukleiinihapporeagensseja tai reagenssien yhdistelmiä A ,A ,A jne. ja B ,B ,B jne. voi-
X y Z X y Z
daan tietysti käyttää suorissa hybridisaatiomenetelmissä. Tällöin jokaista tunnistettavaksi tarkoitettua nukleiinihap-10 poa x, y ja z varten liuoksessa oleva nukleiinihapponäyte on jaettava tai, jos näyte kiinnitetään kiinteään kantajaan, jokaista näytettä kohden on valmistettava oma kantajaan sidottu näyte. Muodostunut raitasarjahybridi (kuva 9) osoitetaan sinänsä tunnetuin menetelmin. Kuvissa 9 F esittää kiinteää kan-15 tajaa eli filtteriä, x tunnistettavaa nukleiinihappoa ja v vektoriperäisiä osia. Leimattuina koettimina on käytetty a^, a2 ja a^ (kuva 9a), b^ ja b2 (kuva 9b) ja a^, b^, a2, b2, a^ (kuva 9c ) .
20 Kuten jo edellä on kuvattu, keksinnön mukaisista raitasarja-nukleiinihapoista voidaan koota erilaisia nukleiinihapporea-genssien yhdistelmiä. Näillä yhdistelmillä voidaan tunnistaa useita eri nukleiinihappoja samanaikaisesti. Tunnistettaville eri nukleiinihapoille homologiset raitasarjanukleiinihappo-25 fragmentit voidaan käyttää erillisinä fragmentteina seoksissa tai liittää yhteen niin, että saadaan yksi monia eri nukleiinihappoja tunnistava koetin. Kiinteään kantajaan kiinnitetyt nukleiinihapporeagenssit on tietysti pidettävä erillään, jotta identifiointi onnistuisi.
30
Raitasarjahybridisaatiota voidaan käyttää eri ihmis-, eläin-tai kasvipatogeenisten mikro-organismien tunnistamiseksi. Menetelmällä voidaan tunnistaa ruoka-aineissa olevat mikro-organismit, kuten ruokamyrkytyksiä aiheuttavat klostridiat, 35 salmonellat, stafylokit jne. Menetelmä sopii vedessä esiintyvien kontaminanttien, kuten enterobakteerien ja enterovi-rusten tunnistamiseen. Koska raitasarjakerroshybridisaatio-testi on kvantitatiivinen menetelmä, se soveltuu esimerkiksi il 13 71 768 geeniamplifikaation havaitsemiseen ja mittaamiseen. Tämä piirre on merkityksellinen esimerkiksi syövän havaitsemisessa ja hoidossa. Jotta stabiili raitasarjahybridi muodostuisi, edellytetään, että koetin- ja filtterireagenssien kanssa 05 homologiset alueet sijaitsevat kohtuullisella, edullisesti alle 5 kb:n (kilobase) etäisyydellä toisistaan näytesäi-keessä. Muutokset tämän seikan suhteen ovat selvästi havaittavissa, joten menetelmä soveltuu myös muuttuneen mRNA:n, kromosomaalisten uudelleen järjestelyjen, immunoglobuliinin 10 geenien ekspressioon järjestäytymisen ja perinnöllisten tautien osoittamiseksi. Raitasarjanukleiinihappofragmenteista voidaan siis rakentaa erilaisia reagenssiyhdistelmiä. Esimerkiksi sukupuolitautien aiheuttajien tunnistamiseksi voidaan valmistaa kittejä, joissa on koetin, joka sisältää 15 sekä tippuria, syfilistä, herpestä että klamydiaa tunnistavia raitasarjanukleiinihappofragmentteja. Tunnistaminen on tällöin mahdollinen erillisten tippuri, syfilis-, herpes- ja klamydiafilttereiden avulla.
20 Keksinnön kohteena ovat erityisesti rekombinanttiplasmideista pKTHl220 ja pKTHl271 koostuvat raitasarjanukleiinihappo-fragmentit. Rekombinanttiplasmidi pKTHl220 sisältää Chlamydia trachomatis L2 bakteerin klamydioille spesifistä dna:ta plasmidissa pBR322. Tämä rekombinanttiplasmidi on transfor-25 moitu isäntään Escherichia coli K12 HB 101. Rekombinanttiplasmidi pKTHl271 sisältää cytomegaloviruksen AD169 DNA:ta plasmidissa pBR325. Tämä rekombinanttiplasmidi on transformoitu isäntään Escherichia coli K12 HB 101. Rekombinantti-plasmideja pKTHl220 ja pKTHl271 sisältävät isännät on 30 deponoitu kantakokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikro-organismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, Länsi-Saksa. Rekombinanttiplasmidia pKTHl220 sisältävän talletuksen numero on DSM 2825 ja rekombinanttiplasmidia pKTHl271 sisältävän talletuksen numero on DSM 2826.
35 Talletukset ovat vapaasti saatavissa kun patenttihakemus tulee julkiseksi.
Keksintö kuvataan tarkemmin seuraavissa esimerkeissä.
71768 14
Nukleiinihapon (DNA:n ja RNA:n) rakenne on samanlainen olipa kysymys eukaryoottisesta tai prokaryoottisesta solusta peräisin olevasta nukleiinihaposta. Tämän vuoksi samat periaatteet, jotka esitetään esimerkeissä soveltuvat myös 05 yhtä hyvin eläinten (ihminen mukaan luettuna), kasvien kuin mikrobien tai virusten nukleiinihappoihin. Siten keksinnön mukaisia reagensseja voidaan käyttää osoittamaan sekä ihmisten, eläinten, kasvien, mikrobien että virusten nukleiinihappoja.
10
Esimerkki 1 a) Chlamydia trachomatis-raitasarjanukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistus 15
Chlamydia trachomatis-ryhmän diagnostiikkaan sopivat DNA-fragmentit valmistettiin Chlamydia trachomatis L2 serotyypin DNA:sta. DNA eristettiin ja hajotettiin tunnetuin menetelmin ja syntyneet DNA-fragmentit kloonattiin pBR322-plasmidiin ja 20 siirrettiin isäntäorganismiin Escherichia coli K 12 HB 101 tunnettuja menetelmiä käyttäen. Kloonauksen seurauksena saatiin Chlamydia trachomatis L2-bakteerin geenipankki, ts. suuri joukko yhdistelmäplasmideja, joissa kussakin on erillinen BamHI-entsyymin avulla aikaansaatu klamydiasta peräisin oleva 25 DNA-fragmentti. Reagenssituotantoa varten geenipankista valittiin sellaisia yhdistelmäplasmideja, jotka sisälsivät mahdollisimman suuren klamydia-DNA:sta peräisin olevan DNA-pätkän. Eräs tällainen on pKTHl220-numeron saanut plasmidi, joka on tallennettu Deutsche Sammlung von Mikroorganismen 30 kantakokoelmaan numerolla (DSM 2825) ja jonka sopivuus reagenssikäyttöön osoitettiin suoralla hybridisaatiotestillä. Testistä kävi ilmi, että pKTHl220 tunnisti kaikki eri Chlamydia trachomatis-serotyypeistä peräisin olevat nukleiinihapot, muttei muita nukleiinihappoja.
pKTHl220-plasmidi-DNA:sta valittiin soveltuvat, eri rest-riktioentsyymein aikaansaatavat fragmentit, joista osa siirrettiin jatkokloonauksen avulla edelleen pATl53-plasmidiin 35 15 71768 (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
Cold String Harbor Laboratory, p.6, 1982)ja osa Ml3mp8-faagiin. Kuvassa 10 on esitetty rekombinanttiplasmidi pKTHl220, jonka molekulaarinen pituus on 14 kb:tä. Kuvassa 10 05 BamHI, Sali ja Clal esittävät käytettyjä restriktioentsyymejä ja a^, a2, ^ι» kuvaavat restriktioentsyymeillä aikaansaatujen fragmenttien kokoa ja keskinäistä sijaintia. Sarjaan a kuuluvat fragmentit on käytetty filtterireagenssei-na ja sarjaan b kuuluvat leimattuina koettimina. Taulukossa 1 10 on lueteltu kyseisten fragmenttien koko ja jatkokloonaukseen käytetyt vektorit, yhdistelmäplasmidien nimet sekä käyttö.
Taulukko 1.
15 Fragmentti Koko Vektori Yhdistelmä- Käyttö _plasmidi_ a1 Clal-Sall 3.0kb pATl53 pKTHl252 Filtteri a2 Sall-Clal 2.9kb pATl53 pKTHl250 Filtteri 20 b^ Sall-BamHI 0.7kb Ml3mp8 mKTHl242 Leimattu koetin b2 BamHI-Sall 1.4kb Ml3mp8 mKTHl239 Leimattu koetin bj Clal-Clal 1.7kb Ml3mp8 mKTHl248 Leimattu koetin b^-b2 BamHI-BamHI 2.1kb Ml3mp8 mKTHl245 Leimattu koetin 25
Taulukossa 1 luetellut fragmentit eristettiin agaroosigee-listä elektroeluution avulla ja kloonattiin taulukossa 1 lueteltujen vektoreiden asianomaisiin restriktioentsyymien tunnistuskohtiin tunnettuja menetelmiä hyväksi käyttäen.
30
Fragmentti BamHI-BamHI 2.1kb saatiin aikaan seuraavasti: pKTHl220-plasmidin BamHI-Sall 1.4kb ja Sall-BamHI 0.7kb fragmentit eroteltiin geelielektroforeesin avulla agaroosi-geelissä, josta ne eristettiin. Puhdistetut fragmentit 35 liitettiin toisiinsa T4-ligaasientsyymin avulla ja reaktiossa syntyneistä 2.1kb:n mittaisista DNA-fragmenteista ne, joilla oli vapaat BamHI-entsyymin tunnistamat päät, liitettiin edelleen Ml3mp8-faagin kaksisäikeisen replikoituvan muodon 16 71768
BamHI-katkaisukohtaan. Näin tehtiin yhdistelmä-faagi-DNA-(mKTHl245), joka sisältää Chlamydia trachomatis DNA:ta, joka koostuu kahdesta erillisestä DNA-fragmentista, jotka genomis-sa eivät sijaitse vierekkäin. Ne kuitenkin sijaitsevat 05 filtterille kiinnitettävien DNA-reagenssien pKTHl250 ja pKTHl252 vieressä genomissa (kuva 11). Kuvassa 11 on esitetty raitasarjakerroshybridi, joka muodostuu kun käytetään taulukossa 1 lueteltuja rekombinanttiplasmideja ja -faageja raitasarjanuklei inihapporeagensseinä.
10 b) Chlamydia trachomatis-raitasarjanukleiinihapporeagenssien herkkyyden osoittaminen kerroshybridisaatiomenetelmällä
Raitasarjanukleiinihapporeagenssien herkkyys verrattuna 15 yhteen yhtenäiseen reagenssipariin tutkittiin kerroshybridisaatiomenetelmällä . Testissä käytettiin filttereitä, jotka kaikki sisälsivät 1011 molekyyliä sekä pKTHl250(a2)- että pKTHl252(a^)-DNA:ta yksisäikeiseen muotoon saatettuna. Tutkittava näyte oli plasmidi pKTHl220, joka testiä varten saa-20 tettiin yksisäikeiseen muotoon keittämällä 5 min 0.17 M
NaOH:ssa, jonka jälkeen se siirrettiin 0 °C:een ja neutraloitiin ekvimolaarisella määrällä etikkahappoa. Testissä käytettiin seuraavia taulukossa 1 lueteltuja koettimia mKTHl242-(b1), mKTHl239(b2), mKTHl248(b3) ja mKTHl245(b1~b2).
25
Hybridisaatio tapahtui +65 °C:ssa 17 tunnissa hybridisaatio-liuoksessa, jonka koostumus oli seuraava: 4 x SSC, 0.02 % Ficoll, 0.02 % polyvinyylipyrrolidoni, 0.2 % SDS ja 200 μg/ml sillin sperraa-DNA. Filttereitä pestiin 2 t 50 °C:lla pesu-30 liuoksella, jonka koostumus oli seuraava: 0.1 x SSC, 0.2 % SDS ja laskettiin ^-laskijalla. Tulokset on esitetty taulukossa 2 ja ovat viiden rinnakkaisen testin keskiarvoja.
17 71 768
Taulukko 2.
Hybridi soitunut radioaktiivisuus, 05 Näyte _koettimena (b)_ molek/testi b^ b2 b3 b1> b2 (b1~b2) (b1-b2),b3 0 37 37 33 49_39_52_ 10 106 48 44 48 9368140 107 226 236 232 396 416 686 108 1475 1415 1456 2912 2637 3580
15 b^ 380.000 cpm/testi; 5 x 107 cpm/ugDNA
b2 340.000 cpm/testi; 4 x 107 cpm/jugDNA
b3 350.000 cpm/testi; 5 x 107 cpm/ugDNA
b^-b2 310.000 cpm/testi; 7 x 107 cpm/jugDNA
b^,b2 700.000 cpm/testi; 20 (b1-b2),b3 700.000 cpm/testi;
Ilman näytettä tehtyjen testien ( negatiiviset kontrollit) tilastollisesti laskettuna 95 %:n luotettavuusrajaa pidet-25 tiin positiivisuuden alarajana. Nämä arvot olivat 52-54 cpm kun koetin oli b^, b2 tai b3, 58 cpm kun koetin oli b^,b2, 56 cpm kun koetin oli b^-b2 ja 65 cpm kun koetin oli b^-b2,b3.
c) Klamydiadiagnostiikka raitasarjakerroshybridisäätiön 30 avulla
Testaukseen valittiin 3 virtsaputken tulehdusta sairastavaa miestä, joiden virtsaputkesta otetusta näytteestä oli eristetty Chlamydia trachomatis, ja 3 kohdunkaulan tulehdusta 35 sairastavaa naista, joiden kohdunkaulasta otetusta näytteestä oli niinikään eristetty Chlamydia trachomatis. Lisäksi tutkittiin vastaava määrä samanlaisia potilasnäytteitä, joista ei klamydiaa ollut eristetty. Tutkittavat näytteet oli otettu 71 768 18 pumpulitikulla, joka oli upotettu klamydianäytteenottopus-kuriin, joka sisälsi 0.2 M sakkaroosia, 20 mM fosfaatti-puskuria, 3 % sikiövasikan seerumia, 10 pg/ml gentamysiiniä, 100 jug/ml vankomysiiniä ja 25 IU/ml nystatiinia.
05 Näytteistä oli tehty klamydiaviljelyt, jonka jälkeen ne tutkittiin raitasarjahybridisaation avulla. Näytteet konsentroitiin 2-butanolin avulla siten, että niistä poistui nestettä niin, että lopullinen volyymi oli noin 80 μΐ, jolloin kon-10 sentroituminen testausta varten oli noin 3-7 kertainen. Tämän jälkeen näytteeseen lisättiin liuosta, joka sisälsi 70 mM EDTAra, 0.7 % SDS:a, 200 jug/ml proteinaasi K-entsyymiä ja käsiteltiin 15 min 55 °C:ssa ja 45 min 37 °C:ssa. Tämän jälkeen näytettä keitettiin 5 min 0.175 M NaOH:ssa. Keitetty 15 näyte siirrettiin 0 °C ja neutraloitiin ekvimolaarisella määrällä etikkahappoa ja testattiin. Testissä käytettiin esimerkissä Ib esitettyjä filttereitä ja hybridisaatio-olosuhteita. Koettimena käytettiin mKTHl245(b^-bj)» 300.000 cpm/400 μΐ hybridisaatioreaktio. Tulokset on esitetty taulukossa 3.
Taulukko 3.
19 71768 05 Näyte Hybridisoitunut Klamydiaviljelytulos radioaktiivisuus
Mies 1. 151 + 10 Mies 2. 164 +
Mies 3. 154 +
Mies 4. 61
Mies 5. 76
Mies 6. 55 15
Nainen 1. 343 +
Nainen 2. 509 +
Nainen 3. 362 +
Nainen 4. 57 20 Nainen 5. 58
Nainen 6. 81
Puskuri, X^j 30-55 25 Chi, trachomatis L2 bakteeri,10^ 419 +
Testissä positiivisuuden raja oli 104 cpm.
30
Taulukossa 3 esitetty tulos osoittaa, että raitasarjaker-roshybridisaatio soveltuu sukupuolitautidiagnostiikkaan. Näytteet, jotka olivat negatiiviset viljelykokeissa, olivat 35 myös negatiivisia raitasarjakerroshybridisaatiotestissä.
71768 20
Esimerkki 2.
a) Cytomeqalovirus-raitasarjanukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistus 05
Cytomegaloviruksen diagnostiikkaan sopivat DNA-fragmentit valmistettiin Cytomegaloviruksesta (AD 169, ATCC VR-538)-(CMV). DNA eristettiin ja hajoitettiin tunnetuin menetelmin. Noin 9000 emäksen mittainen EcoRI-fragmentti I, joka on mää-10 ritelty julkaisussa Spector et ai., J.Virol. 42, 558-582, 1982, eristettiin agaroosigeelistä sähkökentässä eluoimalla senjälkeen, kun EcoRl-restriktiofragmentit oli eroteltu toisistaan kokonsa perusteella. Eluoitu DNA ekstrahoitiin fenolilla, jonka jälkeen se saostettiin etanolilla. Näin 15 puhdistettu DNA liitettiin T4-ligaasin avulla EcoRI-entsyymin avulla avattuun pBR325-plasmidivektoriin, ja syntyneet yhdistelmä-DNA:t siirrettiin E.coli K12 HB101 isäntäbaktee-reihin. Ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenteistä, mutta kloramfenikolille herkistä klooneista valittiin sellainen, 20 joka sisälsi oikean suuruisen cytomegalovirukselle spesifisen DNA-insertin. Kloonattu cytomegaloviruksen DNA:n luonne varmistettiin Southern blot-menetelmällä. Tämä testi varmisti, että kuvattu 9000 emäksen mittainen EcoRI-DNA-fragmentti oli cytomegaloviruksen DNA:sta peräisin ja tarkemmin sen 25 HindIII-D-fragmenttiin sisältyvä (Oram et ai., J. Gen.Virol., 59, 111-129, 1982). Näin kuvatulle yhdistelmäplasmidille annettiin nimeksi pKTH1271, ja se deponoitiin kantakokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen numerolla DSM 2826. Yhdistelmäplasmidi kasvatettiin ja puhdistettiin tunnettuja 30 menetelmiä hyväksi käyttäen.
Jatkokloonaukset suoritettiin tunnettujen menetelmien avulla käyttäen vektoreina pBR322-plasmidia ja Ml3mp7- ja Ml3mp8-faageja. Kuvassa 12 on esitetty hybridiplasmidi pKTHl271, 35 jonka molekulaarinen pituus on noin 9 kb:tä. Kuvassa 12 esitetyt raitasarjanukleiinihappofragmentit valmistettiin käyttäen restriktioentsyymejä EcoRI, BamHI, Clal ja Pstl. Kuvassa 12 on esitetty restriktioentsyymeillä aikaansaadut tl 21 71768 fragmentit ja niiden suhteellinen koko ja sijainti. Taulukossa 4 on lueteltu kyseisten fragmenttien koko ja jatkokloo-naukseen käytetyt vektorit näin aikaansaatujen yhdistelmä-plasmidien nimet ja niiden käyttö joko filtterireagensseina 05 tai leimattuina koettimina. Kuvassa 13 on esitetty raitasar-jakerroshybridi, joka muodostuu kun käytetään taulukossa 4 lueteltuja raitasarjanukleiinihappofragmentteja.
Taulukko 4.
10
Restriktiofragmentti Vektori Nimitys Käyttö 15 EcoRI-PstI (3.3kb) pBR322 PKTH1273 Filtteri a2 Clal-BamHl (3.0kb pBR322 pKTHl274 Filtteri b^ Pstl-PstI (0.6kb) Ml3mp7 mKTHl277 Leimattu koetin b2 Pstl-Clal (l.Okb) Ml3mp8 mKTHl278 Leimattu koetin bg BamHI-EcoRI (l.Okb) Ml3mp8 mKTHl279 Leimattu koetin 20 _ b) Cytomegaloviruksen raitasarjanukleiinihapporeagenssien herkkyyden osoittaminen kerroshybridisaatiomenetelmällä 25
Raitasarjanukleiinihapporeagenssien herkkyyttä verrattuna yhteen yhtenäiseen reagenssipariin tutkittiin kerroshybridi-saatiomenetelmällä. Näytteenä testeissä oli CMV-DNA, joka keitettiin 0.17 M NaOH:ssa 5 minuuttia ja sen jälkeen neut-30 raloitiin kuten esimerkissä Ib. Testissä käytettiin filttereitä, jotka kaikki sisälsivät 10^ molekyyliä sekä pKTH 1273(a^)- että pKTHl274(a2)-DNA:ta yksisäikeiseen muotoon saatettuna ja seuraavia taulukossa 4 lueteltuja koettimia mKTHl277(b1), mKTHl278(b2) ja mKTHl279(b3). Koettimet sisäl-35 sivät kukin 10® cpm/>ig DNArta. Hybridisaatio suoritettiin kuten esimerkissä Ib on kuvattu. Tulokset on esitetty taulukossa 5.
Taulukko 5.
22 71 768
Hybridi soitunut radioaktiivisuus, 05 Näyte _koettimena(b)__ molek/testi b^ b2 b3 b^,b2,b3 0 35 33 38 45_53_ 10 106 38 44 46 95 125 4xl06 85 135 142 205 292 1.6xl07 203 254 265 415 645 15 b^ 310.000 cpm/testi b2 320.000 cpm/testi b3 300.000 cpm/testi b^,b2 300.000 cpm kumpaakin/testi b^,b2,b3 300.000 cpm kutakin/testi 20_____
Testissä positiivisuuden alarajan arvo oli 51-55 cpm, kun koetin oli b^, b2 tai b3, 59 cpm kun koetin oli b^,b2 ja 63 cpm kun koetin oli b^,b2,b3· 25
Tulokset taulukossa 5 osoittavat, että kerroshybridisaatio, jossa on yksittäinen koetinreagenssi (b^,b2 tai b3), detektoi kussakin tapauksessa 4 x 106 CMV-DNA molekyyliä. Raitasarja-hybridisaatio b^,b2 tai b^,b2,b3 reagenssein detektoi sen 30 sijaan jo 10^ molekyyliä CMV-DNA:ta. Tulokset osoittavat, että raitasarjanukleiinihapporeagenssit ovat neljä kertaa herkemmät kuin yksittäiset nukleiinihapporeagenssit.
c) CMV-diagnostiikka raitasarjakerroshybridisaation avulla 35
Raitasarjahybridisaatioreagenssien avulla tutkittiin 71 768 23 kliinisiä näytteitä. Tällaisia olivat kaksi alle 1-vuotiaan lapsen virtsanäytettä. Näiden epäiltiin sairastavan synnynnäistä cytomegalotautia. Lisäksi tutkittiin yhden CMV-keuh-kotulehdusta sairastavan potilaan keuhkopala raitasarjaker-05 roshybridisaation avulla. Testissä käytettiin näytteenä myös cytomegaloviruksella infektoituja ihmisen sikiön soluja sekä infektoimattomia soluja.
10 ml virtsanäytteeseen lisättiin liuos, joka sisälsi 1 % 10 sarkosyyliä ja 5 mM EDTA:a ja 200 /ug vasikan thymuksen DNArta, jonka jälkeen viruksesta vapautunut DNA kantajan kera seostettiin 10 ml :11a isopropanolia huoneenlämmössä. DNA-sakka liuotettiin 200 /uljaan TE-puskuria ja saatettiin yk-sisäikeiseen muotoon keittämällä 5 min, jonka jälkeen DNA-15 liuos jäähdytettiin 0 °C:een ja lisättiin hybridisaatioliu-okseen.
3
Keuhkopala (muutama mm ) rikottiin mekaanisesti veitsen avulla, siihen lisättiin 200 /ui TE-puskuria, jossa oli 1 %:sta 20 SDS-liuosta ja 1 mg/ml proteinaasi K-entsyymiä. Digestio suoritettiin +37 °C:ssa 1 t, jonka jälkeen näyte vedettiin 2 kertaa ohuen neulan läpi ruiskuun. Näin homogenisoitu näyte keitettiin, jonka jälkeen se lisättiin testiin.
25 Cytomegaloviruksella infektoidut solut ja infektoimattomat solut hajotettiin SDS-, proteinaasi K-käsittelyllä, homogenisoitiin ja keitettiin kuten yllä.
Hybridisaatiotestissä reagensseina toimivat pKTHl273(a^) ja 30 pKTHl274(a2) filttereillä ja mKTHl277 ( bj_) , mKTHl278 ( b2 ) , mKTHl279(b3) koettimina, kutakin 200.000 cpm/reaktio. Muuten hybridisaatio, filttereiden pesu ja tulosten laskeminen tehtiin kuten on kuvattu esimerkissä Ib.
71 768 24
Raitasarjahybridisaatiotulokset käyvät ilmi taulukosta 6. Taulukko 6.
05 Hybridisoitunut Viruseristys Näyte_radioaktiivisuus_
Infektoidut 3521 Ei tehty solut (105) 10
Virtsa 1(10 ml) 243 CMV
Virtsa 2(10 ml) 3215 CMV
15 Terveen hlön virtsa (10 ml) 52 Ei tehty
Keuhkopala 535 CMV
20 Kontrolli- 5 solut 10 68 Ei tehty
Ei näytettä 65 Ei tehty 25
Tulokset taulukosta 6 osoittavat, että raitasarjanukleiini-happoreagenssien avulla on mahdollista osoittaa CMV erilaisista kliinisistä näytteistä kuten virtsasta, keuhkopaloista ja soluista.
30
Testi on spesifinen cytomegalovirukselle, se ei tunnista ihmisen DNA:ta. Sitä ei myöskään häiritse näytteen laatu.

Claims (6)

  1. 25 71 768
  2. 1. Nukleiinihappodiagnostiikassa käytettävät nukleiinihappo-reagenssit, tunnettu siitä, että ne koostuvat 05 kahdesta sarjasta pääasiallisesti vuorottelevia raitasarja-nukleiinihappofragmentteja, jotka eivät saa olla homologisia toisilleen ja jotka ovat peräisin yhdestä tai useammasta, tunnistettavalle nukleiinihapolle riittävän homologisesta nukleiinihaposta siten, että toinen sarjoista on leimattu ja 10 toinen on kiinnitetty kiinteään kantajaan ja kumpikin sarja sisältää vähintäin kaksi, edullisesti useampia fragmentteja.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset nukleiinihapporeagenssit, tunnettu siitä, että ne koostuvat joko erillisistä 15 tai yhteenliitetyistä raitasarjanukleiinihappofragmenteista.
  4. 3. Patenttivaatimusten 1-2 mukaiset nukleiinihapporeagenssit, tunnettu siitä, että ne koostuvat raitasarja-nukleiinihappofragmenteista, joissa joko on tai ei ole 20 vektoriperäisiä osia.
  5. 4. Patenttivaatimusten 1-3 mukaiset nukleiinihapporeagenssit käytettäväksi klamydiadiagnostiikassa, tunnettu siitä, että ne koostuvat rekombinanttiplasmidin pKTHl220 25 johdannaisista, jotka on jatkokloonattu pATl53-plasmidiin ja Ml3mp8-faagiin ja sisältävät Chlamydia trachomatis L2 bakteerin DNA:ta, jolloin rekombinanttiplasmidi pKTHl220 on transformoitu isäntään Escherichia coli K12 HB 101, ja rekombinanttiplasmidia pKTHl220 sisältävän isännän talletus-30 numero on DSM 2825. 1 Patenttivaatimusten 1-3 mukaiset nukleiinihapporeagenssit käytettäväksi Cytomegalovirus-diagnostiikassa, tunnettu siitä, että ne koostuvat rekombinantti- 35 plasmidin pKTHl271 johdannaisista, jotka on jatkokloonattu pBR322-plasmidiin ja faageihin Ml3mp7 ja Ml3mp8 ja sisältävät Cytomegaloviruksen AD169 DNA:ta, jolloin rekombinanttiplasmidi pKTHl271 on transformoitu isäntään Escherichia coli Kl2 71768 26 HB 101, ja rekombinanttiplasmidia pKTHl271 sisältävän isännän talletusnumero on DSM 2826.
  6. 6. Menetelmä patenttivaatimusten 1-5 mukaisten nukleiini-05 happoreagenssien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) eristetään valittu osoitettavaa nukleiinihappoa tunnistava, sopivan pituinen nukleiinihappo b) kloonataan näin valittu nukleiinihappo sopivaan vektoriin 10 c) hajotetaan näin saatu vektoriin kloonattu nukleiinihappo restriktioentsyymillä d) yhdistetään sopivat fragmentit kahdeksi raitasarjaksi sopivilla ligaaseilla e) jatkokloonataan raitasarjafragmentit, joko erillisinä tai 15 yhteenliitettyinä sopivissa vektoreissa, edullisesti eri sarjoihin kuuluvat fragmentit eri vektoreissa f) leimataan toiseen raitasarjaan kuuluvat joko erilliset tai yhteenliitetyt nukleiinihappofragmentit g) kiinnitetään toiseen raitasarjaan kuuluvat joko erilliset 20 tai yhteenliitetyt nukleiinihappofragmentit kiinteään kantajaan . tl 71 768 27
FI840655A 1984-02-17 1984-02-17 Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. FI71768C (fi)

Priority Applications (22)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI840655A FI71768C (fi) 1984-02-17 1984-02-17 Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.
ZA85511A ZA85511B (en) 1984-02-17 1985-01-22 Nucleic acid reagents,a method for their preparation and their use
US06/694,325 US4731325A (en) 1984-02-17 1985-01-24 Arrays of alternating nucleic acid fragments for hybridization arrays
IE202/85A IE57652B1 (en) 1984-02-17 1985-01-29 Improved nucleic acid reagents and methods for their preparation
AU38422/85A AU577568B2 (en) 1984-02-17 1985-02-04 Preparation of nucleic acid reagents having arrays of alternating nucleic acid fragments
IT19432/85A IT1183184B (it) 1984-02-17 1985-02-07 Reagenti acidi nucleici perfezionati e procedimenti per laloro preparazione
BE214463A BE901671A (fr) 1984-02-17 1985-02-07 Reactifs d'acide nucleique perfectionnes et procedes pour leur preparation.
DK198500589A DK174675B1 (da) 1984-02-17 1985-02-08 Nukleinsyrereagenser og fremgangsmåde til fremstilling deraf
CA000474112A CA1248895A (en) 1984-02-17 1985-02-12 Nucleic acid reagents, a method for their preparation and their use
LU85768A LU85768A1 (fr) 1984-02-17 1985-02-12 Reactifs d'acide nucleique perfectionnes et procedes pour leur preparation
NO850554A NO166543C (no) 1984-02-17 1985-02-13 Nukleinsyrereagenser og fremgangsmaate til deres fremstilling.
NL8500424A NL193663C (nl) 1984-02-17 1985-02-14 Werkwijze en kit voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster.
CH725/85A CH671778A5 (fi) 1984-02-17 1985-02-15
AT0044185A AT394578B (de) 1984-02-17 1985-02-15 Verfahren zur herstellung von nucleinsaeure-reagenzien
FR858502188A FR2559783B1 (fr) 1984-02-17 1985-02-15 Reactifs d'acide nucleique perfectionnes et procedes pour leur preparation
SE8500733A SE463103B (sv) 1984-02-17 1985-02-15 Nukleinsyrareagens bestaaende av minst tvaa serier av minst tvaa uppsaettningar nukleinsyrafragment vilka inte aer homologa till varandra samt saett foer dessas framstaellning
JP60029207A JPS60188100A (ja) 1984-02-17 1985-02-15 核酸試薬
DE3505287A DE3505287C2 (de) 1984-02-17 1985-02-15 Verbesserte Nucleinsäure-Reagenzien und Verfahren zu ihrer Herstellung
GB08503900A GB2156074B (en) 1984-02-17 1985-02-15 Improved nucleic acid reagents and methods for their preparation
HU85570A HU194938B (en) 1984-02-17 1985-02-15 Process for preparing improved nucleinic acid reagents
SU853856877A SU1523053A3 (ru) 1984-02-17 1985-02-15 Способ идентификации вирусов и бактерий, основанный на сэндвич-гибридизации нуклеиновых кислот
RO117684A RO92633B (ro) 1984-02-17 1985-02-18 Metoda de preparare a unui reactiv pentru identificarea acizilor nucleici

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI840655A FI71768C (fi) 1984-02-17 1984-02-17 Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.
FI840655 1984-02-17

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI840655A0 FI840655A0 (fi) 1984-02-17
FI840655A7 FI840655A7 (fi) 1985-08-18
FI71768B FI71768B (fi) 1986-10-31
FI71768C true FI71768C (fi) 1987-02-09

Family

ID=8518568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI840655A FI71768C (fi) 1984-02-17 1984-02-17 Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.

Country Status (22)

Country Link
US (1) US4731325A (fi)
JP (1) JPS60188100A (fi)
AT (1) AT394578B (fi)
AU (1) AU577568B2 (fi)
BE (1) BE901671A (fi)
CA (1) CA1248895A (fi)
CH (1) CH671778A5 (fi)
DE (1) DE3505287C2 (fi)
DK (1) DK174675B1 (fi)
FI (1) FI71768C (fi)
FR (1) FR2559783B1 (fi)
GB (1) GB2156074B (fi)
HU (1) HU194938B (fi)
IE (1) IE57652B1 (fi)
IT (1) IT1183184B (fi)
LU (1) LU85768A1 (fi)
NL (1) NL193663C (fi)
NO (1) NO166543C (fi)
RO (1) RO92633B (fi)
SE (1) SE463103B (fi)
SU (1) SU1523053A3 (fi)
ZA (1) ZA85511B (fi)

Families Citing this family (155)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US4725536A (en) * 1985-09-19 1988-02-16 Genetics Institute, Inc. Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods
US4876187A (en) * 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US4910300A (en) * 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
FI76119C (fi) * 1986-02-27 1988-09-09 Orion Yhtymae Oy Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.
US4925785A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5281518A (en) * 1986-05-01 1994-01-25 Washington Research Foundation Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease
DE3789597T3 (de) * 1986-05-01 2006-10-26 Washington Research Foundation, Seattle Nachweis eines mit atmungskrankheiten verbundenen einzelstammes von chlamydia.
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US5202231A (en) * 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
CA1339351C (en) * 1987-10-15 1997-08-26 Michael S. Urdea Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
CA1323293C (en) * 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
GB8810400D0 (en) * 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US7811751B2 (en) * 1988-05-03 2010-10-12 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
JP2801051B2 (ja) * 1988-06-24 1998-09-21 アムジエン・インコーポレーテツド 核酸塩基配列を検出するための方法及び試薬
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
JPH0638758B2 (ja) * 1989-02-03 1994-05-25 イーストマン コダック カンパニー 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用
US6406844B1 (en) 1989-06-07 2002-06-18 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US6955915B2 (en) * 1989-06-07 2005-10-18 Affymetrix, Inc. Apparatus comprising polymers
US6919211B1 (en) * 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5925525A (en) * 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US6379895B1 (en) 1989-06-07 2002-04-30 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
US6506558B1 (en) 1990-03-07 2003-01-14 Affymetrix Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
CA2039517C (en) * 1990-04-03 2006-11-07 David Segev Dna probe signal amplification
US5071962A (en) * 1990-05-31 1991-12-10 The United State Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide, deduced amino acid sequence, isolation and purification of heat-shock chlamydial proteins
EP0466367B1 (en) * 1990-06-28 1995-08-23 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for detecting nucleic acid
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
GB2262987A (en) * 1990-09-21 1993-07-07 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
GB9020621D0 (en) * 1990-09-21 1990-10-31 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
EP0834576B1 (en) 1990-12-06 2002-01-16 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Detection of nucleic acid sequences
US5437976A (en) * 1991-08-08 1995-08-01 Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA
US6569382B1 (en) * 1991-11-07 2003-05-27 Nanogen, Inc. Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices
US6017696A (en) 1993-11-01 2000-01-25 Nanogen, Inc. Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics
US6048690A (en) * 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US5605662A (en) * 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US6652808B1 (en) * 1991-11-07 2003-11-25 Nanotronics, Inc. Methods for the electronic assembly and fabrication of devices
US5849486A (en) 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5556961A (en) * 1991-11-15 1996-09-17 Foote; Robert S. Nucleosides with 5'-O-photolabile protecting groups
US6864101B1 (en) 1991-11-22 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US6468740B1 (en) 1992-11-05 2002-10-22 Affymetrix, Inc. Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis
DE69233087T2 (de) 1991-11-22 2003-12-24 Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) Verfahren zur Herstellung von Polymerarrays
US6943034B1 (en) * 1991-11-22 2005-09-13 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
JPH07502414A (ja) * 1991-12-23 1995-03-16 バイエル　コーポレイション 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのクラミジアプローブ
JPH07502655A (ja) * 1991-12-23 1995-03-23 バイエル　コーポレイション 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｃｍｖプローブ
US5583211A (en) * 1992-10-29 1996-12-10 Beckman Instruments, Inc. Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides
US7713528B1 (en) 1993-02-18 2010-05-11 Enzo Therapeutics, Inc. Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate
AU7551094A (en) 1993-07-23 1995-02-20 Hyseq, Inc. Method for screening unknown organisms
FR2710075B1 (fr) * 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US6254827B1 (en) 1993-11-01 2001-07-03 Nanogen, Inc. Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6319472B1 (en) 1993-11-01 2001-11-20 Nanogen, Inc. System including functionally separated regions in electrophoretic system
US20040077074A1 (en) * 1993-11-01 2004-04-22 Nanogen, Inc. Multi-chambered analysis device
US6726880B1 (en) 1993-11-01 2004-04-27 Nanogen, Inc. Electronic device for performing active biological operations and method of using same
US7314708B1 (en) 1998-08-04 2008-01-01 Nanogen, Inc. Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures
US7172864B1 (en) 1993-11-01 2007-02-06 Nanogen Methods for electronically-controlled enzymatic reactions
US6638482B1 (en) 1993-11-01 2003-10-28 Nanogen, Inc. Reconfigurable detection and analysis apparatus and method
US6287517B1 (en) 1993-11-01 2001-09-11 Nanogen, Inc. Laminated assembly for active bioelectronic devices
US6331274B1 (en) 1993-11-01 2001-12-18 Nanogen, Inc. Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics
US7101661B1 (en) 1993-11-01 2006-09-05 Nanogen, Inc. Apparatus for active programmable matrix devices
US6068818A (en) 1993-11-01 2000-05-30 Nanogen, Inc. Multicomponent devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6375899B1 (en) 1993-11-01 2002-04-23 Nanogen, Inc. Electrophoretic buss for transport of charged materials in a multi-chamber system
US6309602B1 (en) 1993-11-01 2001-10-30 Nanogen, Inc. Stacked, reconfigurable system for electrophoretic transport of charged materials
US6315953B1 (en) 1993-11-01 2001-11-13 Nanogen, Inc. Devices for molecular biological analysis and diagnostics including waveguides
US6225059B1 (en) 1993-11-01 2001-05-01 Nanogen, Inc. Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics
US7582421B2 (en) * 1993-11-01 2009-09-01 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip
US6287850B1 (en) * 1995-06-07 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture
DE69527585T2 (de) * 1994-06-08 2003-04-03 Affymetrix, Inc. Verfahren und Vorrichtung zum Verpacken von Chips
US7378236B1 (en) 1994-06-17 2008-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for analyzing gene expression patterns
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US7625697B2 (en) 1994-06-17 2009-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby
US7323298B1 (en) 1994-06-17 2008-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences
US6306657B1 (en) * 1994-06-28 2001-10-23 Kalyx Biosciences, Inc. Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays
US6403367B1 (en) 1994-07-07 2002-06-11 Nanogen, Inc. Integrated portable biological detection system
US7857957B2 (en) * 1994-07-07 2010-12-28 Gamida For Life B.V. Integrated portable biological detection system
US6121048A (en) * 1994-10-18 2000-09-19 Zaffaroni; Alejandro C. Method of conducting a plurality of reactions
US8236493B2 (en) * 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US6720149B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Affymetrix, Inc. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays
US20040086917A1 (en) * 1995-09-27 2004-05-06 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6706473B1 (en) 1996-12-06 2004-03-16 Nanogen, Inc. Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US20020042048A1 (en) 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6326489B1 (en) 1997-08-05 2001-12-04 Howard Hughes Medical Institute Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays
DE19741715A1 (de) 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
WO1999019510A1 (en) 1997-10-10 1999-04-22 President And Fellows Of Harvard College Surface-bound, double-stranded dna protein arrays
US6432360B1 (en) 1997-10-10 2002-08-13 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6511803B1 (en) 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
PT1038022E (pt) * 1997-12-12 2005-11-30 Digene Corp Avaliacao de doencas relacionadas com o virus papiloma humano
US6355419B1 (en) 1998-04-27 2002-03-12 Hyseq, Inc. Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample
US6232067B1 (en) 1998-08-17 2001-05-15 The Perkin-Elmer Corporation Adapter directed expression analysis
US6545264B1 (en) 1998-10-30 2003-04-08 Affymetrix, Inc. Systems and methods for high performance scanning
US7510841B2 (en) * 1998-12-28 2009-03-31 Illumina, Inc. Methods of making and using composite arrays for the detection of a plurality of target analytes
US6656692B2 (en) * 1999-12-21 2003-12-02 Ingeneus Corporation Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes
AU4025300A (en) * 1999-03-24 2000-10-09 Packard Bioscience Company Continuous porous matrix arrays
WO2000058522A1 (en) * 1999-03-30 2000-10-05 Nanogen, Inc. Single nucleotide polymorphic discrimination by electronic dot blot assay on semiconductor microchips
DE60045816D1 (de) 1999-04-27 2011-05-19 Bio Rad Laboratories Probenhalter für ein gasphaseionenspektrometer
EP1054259A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-22 Remacle, José Method for the identification of a target compound
US20030096321A1 (en) * 1999-05-19 2003-05-22 Jose Remacle Method for the identification and/or the quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips
US6465183B2 (en) * 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
JP2001017166A (ja) * 1999-07-02 2001-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａチップ、ｄｎａチップの検定キットおよびｄｎａチップの検定法
US6428957B1 (en) 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
US6927027B2 (en) * 1999-12-21 2005-08-09 Ingeneus Corporation Nucleic acid multiplex formation
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6455007B1 (en) * 2000-06-13 2002-09-24 Symyx Technologies, Inc. Apparatus and method for testing compositions in contact with a porous medium
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US6905816B2 (en) 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
WO2002073158A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Apollo Biotechnology, Inc. Conjugate probes and optical detection of analytes
EP1481076A4 (en) 2001-07-12 2005-05-11 Illumina Inc MULTIPLEX NUCLEIC REACTIONS
US6893822B2 (en) 2001-07-19 2005-05-17 Nanogen Recognomics Gmbh Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate
US7601493B2 (en) * 2002-07-26 2009-10-13 Nanogen, Inc. Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations
US20040241659A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-02 Applera Corporation Apparatus and method for hybridization and SPR detection
US7622281B2 (en) 2004-05-20 2009-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid
US7828954B2 (en) * 2004-09-21 2010-11-09 Gamida For Life B.V. Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles
US7314542B2 (en) * 2004-09-23 2008-01-01 Nanogen, Inc. Methods and materials for optimization of electronic transportation and hybridization reactions
US20060246576A1 (en) 2005-04-06 2006-11-02 Affymetrix, Inc. Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation
ES2381279T3 (es) 2005-05-06 2012-05-24 Gen-Probe Incorporated Métodos y productos para la captura de ácido nucleico diana
WO2007070553A2 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 The Johns Hopkins University Double-tiled and multi-tiled arrays and methods thereof
JP2009522281A (ja) 2005-12-28 2009-06-11 トランスレーショナル セラピューティクス，インク． 翻訳機能障害に基づく治療法
US20080003667A1 (en) * 2006-05-19 2008-01-03 Affymetrix, Inc. Consumable elements for use with fluid processing and detection systems
JP2010505123A (ja) 2006-09-29 2010-02-18 トランスレーショナル セラピューティクス，インク． ｅＩＦ４Ｅレギュロン・ベースの診断薬
EP1912067A1 (en) * 2006-10-12 2008-04-16 Eppendorf Array Technologies S.A. Method for quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
WO2008085777A2 (en) * 2007-01-03 2008-07-17 Xgenetics Inc. A method for early detection of cancer
JP2012506705A (ja) 2008-10-27 2012-03-22 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 迅速に結果を得るハイブリッドキャプチャー法による分析およびシステム
CA2750338C (en) * 2009-01-28 2019-06-25 Qiagen Gaithersburg, Inc. Sequence-specific large volume sample preparation method and assay
CN102414327B (zh) * 2009-05-01 2015-04-08 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 用于在样品中检测rna剪接形式的非靶向扩增方法
WO2011032124A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
JP6103941B2 (ja) 2010-01-29 2017-03-29 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物
JP2013517803A (ja) 2010-01-29 2013-05-20 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド サンプル中のｈｐｖの存在を決定および確認する方法
CA2799200A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Qiagen Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
US9376727B2 (en) 2010-05-25 2016-06-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes
WO2012116220A2 (en) 2011-02-24 2012-08-30 Qiagen Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acid

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) * 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
US4293652A (en) * 1979-05-25 1981-10-06 Cetus Corporation Method for synthesizing DNA sequentially
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
GB8306426D0 (en) * 1983-03-09 1983-04-13 Malcolm A D B Detecting polynucleotide sequence
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes

Also Published As

Publication number Publication date
GB2156074B (en) 1988-03-16
DE3505287C2 (de) 1994-01-20
HUT37459A (en) 1985-12-28
JPS60188100A (ja) 1985-09-25
SE8500733L (sv) 1985-08-18
ZA85511B (en) 1985-11-27
AU3842285A (en) 1985-08-22
DK58985A (da) 1985-08-18
BE901671A (fr) 1985-05-29
GB2156074A (en) 1985-10-02
JPH0463679B2 (fi) 1992-10-12
NL8500424A (nl) 1985-09-16
NO850554L (no) 1985-08-19
DK58985D0 (da) 1985-02-08
LU85768A1 (fr) 1985-07-24
FR2559783B1 (fr) 1990-03-02
GB8503900D0 (en) 1985-03-20
NO166543B (no) 1991-04-29
RO92633A (ro) 1987-10-30
NL193663C (nl) 2000-06-06
IT8519432A0 (it) 1985-02-07
FI71768B (fi) 1986-10-31
DK174675B1 (da) 2003-08-25
FI840655A0 (fi) 1984-02-17
SE8500733D0 (sv) 1985-02-15
AU577568B2 (en) 1988-09-29
CH671778A5 (fi) 1989-09-29
NO166543C (no) 1991-08-07
FI840655A7 (fi) 1985-08-18
CA1248895A (en) 1989-01-17
HU194938B (en) 1988-03-28
IE57652B1 (en) 1993-02-10
US4731325A (en) 1988-03-15
SU1523053A3 (ru) 1989-11-15
AT394578B (de) 1992-05-11
SE463103B (sv) 1990-10-08
ATA44185A (de) 1991-10-15
IT1183184B (it) 1987-10-05
DE3505287A1 (de) 1985-09-05
IE850202L (en) 1985-08-17
NL193663B (nl) 2000-02-01
FR2559783A1 (fr) 1985-08-23
RO92633B (ro) 1987-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI71768C (fi) Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.
US4563419A (en) Detection of microbial nucleic acids by a one-step sandwich hybridization test
US4900659A (en) Nucleotide sequence composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae and method for screening for a nucleotide sequence that is specific for a genetically distinct group
US4992364A (en) Probe for DNA and a process for the detection of "Shigellae" and entero-invasive strains of Escherichia coli
EP0232085B1 (en) Campylobacter probe
US4866167A (en) Detection of human oral cells by nucleic acid hybridization
US5691138A (en) Nucleotide sequences which hybridize specifically with a Campylobacter jejuni genomic nucleic sequence
US5489513A (en) Specific gene probes and processes for the diagnostic investigation of Candida albicans
CA2147618C (en) Probe for diagnosing of infectious diseases
Pettersson et al. Nucleic acid hybridization—an alternative tool in diagnostic microbiology
CN102719519B (zh) 用于检测Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶基因的组合物和试剂盒
Casebolt et al. Monoclonal antibody solution hybridization assay for detection of mouse hepatitis virus infection
US5693530A (en) Marek's disease virus nucleotide sequence and methods of use
CA1340100C (en) Polynucleotide commposition and method
Zhou et al. Application of a biotin-labelled DNA probe to detect Campylobacter
KR20230085763A (ko) 랄스토니아 시지키의 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 랄스토니아 시지키의 검출방법
Mathiopoulos Constructing and screening cosmid
JPS61158792A (ja) ブル−タングウイルス検出用ｄｎａプロ−ブ

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: SANGTEC MEDICAL AB

MA Patent expired

Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB