FI76119C - Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. - Google Patents

Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. Download PDF

Info

Publication number
FI76119C
FI76119C FI860836A FI860836A FI76119C FI 76119 C FI76119 C FI 76119C FI 860836 A FI860836 A FI 860836A FI 860836 A FI860836 A FI 860836A FI 76119 C FI76119 C FI 76119C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
fragment
nucleic acid
hindiii
gene
test
Prior art date
Application number
FI860836A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI860836A0 (fi
FI860836A (fi
FI76119B (fi
Inventor
Tuula Marjut Ranki
Hans Erik Soederlund
Original Assignee
Orion Yhtymae Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Yhtymae Oy filed Critical Orion Yhtymae Oy
Publication of FI860836A0 publication Critical patent/FI860836A0/fi
Priority to FI860836A priority Critical patent/FI76119C/fi
Priority to JP62042442A priority patent/JPS62205800A/ja
Priority to GB8704517A priority patent/GB2187283B/en
Priority to LU86792A priority patent/LU86792A1/fr
Priority to ZA871401A priority patent/ZA871401B/xx
Priority to ES08700776A priority patent/ES2061411A6/es
Priority to HU87750A priority patent/HU201808B/hu
Priority to IT19501/87A priority patent/IT1202581B/it
Priority to NO870794A priority patent/NO175380C/no
Priority to DK198700993A priority patent/DK174784B1/da
Priority to AU69275/87A priority patent/AU603562B2/en
Priority to NL8700483A priority patent/NL195097C/nl
Priority to AT431/87A priority patent/AT393511B/de
Priority to IE49687A priority patent/IE66904B1/en
Priority to BE8700177A priority patent/BE1001168A4/fr
Priority to CH756/87A priority patent/CH675593A5/de
Priority to CA000530691A priority patent/CA1287558C/en
Priority to KR870001680A priority patent/KR870008033A/ko
Priority to NZ219421A priority patent/NZ219421A/xx
Priority to FR878702541A priority patent/FR2594849B1/fr
Priority to IS3197A priority patent/IS3197A7/is
Priority to DE19873706285 priority patent/DE3706285A1/de
Priority to SE8700821A priority patent/SE468816B/sv
Priority to PT84368A priority patent/PT84368B/pt
Priority to DD87300286A priority patent/DD270383A5/de
Priority to IL81695A priority patent/IL81695A/xx
Publication of FI860836A publication Critical patent/FI860836A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI76119B publication Critical patent/FI76119B/fi
Publication of FI76119C publication Critical patent/FI76119C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

1 76119
Nukleiinihappomolekyylien kvantitatiivinen määrittäminen ja menetelmässä käytettävä reagenssipakkaus
Keksinnön kohteena on määrättyjen nukleiinihappomolekyylien, 05 erikoisesti geenien monistumisasteen ja/tai niitä vastaavien lähetti-RNA-molekyylien kvantitatiivinen määrittäminen kerros- tai liuoshybridisaatiomenetelmällä ja menetelmässä käytettävä reagenssipakkaus.
10 Yksittäisten geenien kopiolukumäärä genomissa on yleensä vakio. Toisia geenejä on vain yksi haploidista genomia kohti, toisia taas useita. Erityistilanteissa kopiolukumäärä saattaa muuttua. Eräiden geenien monistumisella on todettu olevan yhteyttä syövän syntymiseen. On myös havaittu, että eräiden 15 ulkoisten tekijöiden kuten lääkeaineiden, metallien ym.
vaikutuksesta geenit monistuvat eli amplifioituvat. Taudin syntymisen kannalta jonkin geenin esim. onkogeenin väärä/ ylikorostunut ilmenemistaso, ts. lähetti-RNA:n määrä solussa on merkityksellinen. Eräiden kromosomien esiintyminen 20 useampana kappaleena aiheuttaa tiettyjä perinnöllisiä tauteja tai muita häiriötiloja. Toiset perinnölliset taudit ilmenevät ainoastaan silloin kun sairautta aiheuttava geeni esiintyy kahtena kappaleena, ts. kyseessä on resessiivinen ominaisuus. Kaikissa näissä tapauksissa on tärkeätä osoittaa kromosomi-25 en/geenien lukumäärä.
Määrättyjen DNA-molekyylien lukumäärä, esim. geenien monis-tumisaste, mitataan nykyään pilkkomalla soluista eristetty tutkittava DNA restriktioentsyymien avulla, jonka jälkeen 30 DNA-pätkät erotellaan toisistaan kokonsa perusteella agaroosi-geelissä elektroforeesin avulla. Tämän jälkeen DNA siirretään nitroselluloosapaperille, kiinnitetään siihen yksisäikeisessä muodossa ja lopuksi suoritetaan hybridisaatio käyttäen koettimena tutkittavaa geeniä tai sen osaa. Tulokset 35 saadaan autoradiografiän avulla (Southern, J. Mol. Biol. 98, ss. 503-517, 1975). Testissä kussakin rinnakkaisessa analyysissä on sama määrä solu-DNA:ta. Hybridisoituvan/ien 2 761 1 9 viivojen voimakkuutta verrataan toisiinsa. Voimakkuuserojen perusteella päätellään tutkittavien geenien kopiolukujen suhteet tutkituissa näytteissä. Tutkimuksella saadaan ainoastaan likimääräisiä tuloksia. RNA:ta mitataan vastaavasti 05 Northern-blotting- tai dot-blotting-menetelmillä. Nämä menetelmät ovat kvantitatiivisessa mielessä erittäin epätarkkoja (Thomas, Methods in Enzymol., 100, ss. 255-266, 1983).
Tunnetut menetelmät, kuten Southern- ja Nothern-blotting-10 menetelmät ovat hitaita ja hankalia suorittaa. Koska niillä saadaan vain likimääräisiä tuloksia, niiden diagnostinen merkitys on kyseenalainen sellaisissa tapauksissa, joissa on tiedettävä määrättyjen nukleiinihappomolekyylien lukumäärä määrättyä yksikköä, esimerkiksi solua kohden.
15
Kerros- ja liuoshybridisaatiomenetelmät, joita on kuvattu mm. suomalaisessa patentissa 63.596 ja suomalaisessa patenttihakemuksessa 85 0004, ovat kvantitatiivisia menetelmiä (Virtanen et ai., Lancet, 1, ss. 381-383, 1983). Keksinnön 20 mukaisessa menetelmässä tarvitaan lisäksi standardinukleiini-happo, jonka molekyylien lukumäärän avulla saadaan selville määritettävien nukleiinihappomolekyylien lukumäärä määrättyä, kulloinkin sopivaa yksikköä, esimerkiksi solua, tumaa, ribosomia tai kromosomia kohden.
25
Keksinnön tarkoituksena on aikaansaada syöpädiagnostiikkaan, prenataalidiagnostiikkaan ja geeniamplifikaatiota aiheuttavien aineiden toteamiseen ja näitä aineita vastaan syntyvän resistenssin diagnostisoimiseen sekä lähetti-RNA:n ilmene-30 mistason osoittamiseen soveltuva nukleiinihappomolekyylien täsmällinen kvantitatiivinen määritysmenetelmä, joka lisäksi on nopea ja yksinkertainen suorittaa verrattuna käytössä oleviin menetelmiin.
35 Keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi tarvitaan vähintään kaksi määritystä. Toinen määrittää osoitettavaa, mahdollisesti useana kappaleena esiintyvää 3 761 1 9 nukleiinihappomolekyyliä, nk. testinukleiinihappoa. Toinen määrittää konstitutiivista, edullisesti vakiolukumääräisenä esiintyvää nukleiinihappomolekyyliä, nk. standardinukleiini-happoa. Keksinnön mukaisessa menetelmässä nukleiinihappo-05 molekyylillä tarkoitetaan määrättyä nukleiinihappojaksoa.
Nukleiinihappomolekyyli voi olla 10-12 nukleotidia sisältävä nukleiinihappojakso, mutta myöskin useita tuhansia nukleotideja sisältävä geeni tai lähetti-RNA tai yksittäistä geeniä huomattavasti pidempi nukleiinihappojakso nk. amplikoni.
10
Testi- ja standardinukleiinihappojen määrittämisessä käytetään muuten normaalia kerroshybridisaatiomenetelmää, joka on kuvattu mm. suomalaisessa patentissa 63.596 tai liuoshybridisaatiomenetelmää, joka on kuvattu suomalaisessa 15 patenttihakemuksessa 850004. Keksinnön kohteena on myös reagenssipakkaus, joka sisältää menetelmässä käytettävät nukleiinihapporeagenssit, vähintään yhden testikoetinparin ja vähintään yhden standardikoetinparin.
20 Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät reagenssit, koettimet, valmistetaan rekombinantti-DNA-tekniikalla, testi-nukleiinihapolle riittävän homologisesta ja standardinukleii-nihapolle riittävän homologisesta nukleiinihaposta. Testi- ja standardinukleiinihapoille voidaan myös valmistaa riittävän 25 homologiset nukleiinihapot synteettisesti tai puolisynteetti-sesti.
Tarvittavat testi- ja standardinukleiinihapot voidaan eristää suoraan soluista ja tunnistaa monilla hybridisaatiomenetel-30 millä. Toisaalta tällaisia testi- ja standardinukleiinihappo-ja testikoettimien valmistusta varten on saatavissa sekä kaupallisesti että erilaisista geenipankeista. Testi- ja standardinukleiinihapot voivat olla joko DNA:ta tai RNArta.
35 Testi- ja standardinukleiinihapoille riittävän homologisista nukleiinihapoista valmistetaan kerros- tai liuoshybridisaa-tiomenetelmään soveltuvat koetinparit rekombinantti-DNA- 4 76119 tekniikalla, pilkkomalla kyseiset nukleiinihapot sopivilla restriktioentsyymeillä ja siirtämällä vähintään kaksi näin valmistettua suhteellisen lähellä toisiaan sijaitsevaa restriktio-fragmenttia vähintään kahteen sopivaan vektoriin. 05 Toinen näin saaduista fragmenteista, nk. detektorikoetin leimataan jollakin sopivalla osoitettavalla leimalla ja toinen, nk. kiinnitinkoetin kiinnitetään sopivaan kantajaan tai siihen kiinnitetään aine, joka mahdollistaa muodostuneen hybridin erottamisen hybridisaatioliuoksesta toisen aineen 10 avulla, esimerkiksi affiniteettiparin toisen osapuolen avulla.
Testi- ja standardikoetinparit voidaan koota sopiviksi reagenssipakkauksiksi siten, että sekä testi- että standardi-15 koetinparit ovat kumpikin DNA:ta tai RNA:ta tai niin että testikoetinpari on DNA:ta ja standardikoetinpari on RNA:ta tai päinvastoin. Tällöin hybridisaatiotestiä edeltävät näytteen esi- ja jatkokäsittelyt ja hybridisaatio-olosuh-teet on valittava siten, että ne sopivat testissä käytet-20 tyihin koetinpareihin.
Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu erikoisen hyvin nukle-iinihappomolekyylien lukumäärän määrittämiseksi suoraan solu-homogenaateista. Menetelmää voidaan tietysti käyttää myös 25 puhdistetun tai puhtaan nukleiinihapon määrittämiseksi. Ennen keksinnön mukaisen menetelmän suorittamista on vain valittava nukleiinihapponäytteelle sopivin esikäsittelymenettely.
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan suorittaa sekä DNA-30 että RNA-määrityksiä. Deoksiribonukleiinihapot denaturoidaan tarvittaessa yksisäikeiseen muotoon. Hybridisaatiotestiä mahdollisesti häiritsevät yksisäikeiset lähetti-RNA-molekyy-lit voidaan hydrolysoida esim. alkalikeiton avulla. Ribo-nukleiinihappoja määritettäessä näytettä ei denaturoida.
35 Tällöin läsnäoleva kaksisäikeinen deoksiribonukleiinihappo ei häiritse RNA:n määritystä. On tietysti mahdollista tuhota DNA DNA:aasi-käsittelyllä tai saattamalla DNA kemiallisesti tai 5 761 1 9 mekaanisesti ym. sellaiseen muotoon, että se on kykenemätön osallistumaan hybridisaatiotestiin. DNA:ta tai RNA:ta määritettäessä on siis valittava jokin sopiva näytteen jatkokäsittelymenettely tai vaihtoehtoisesti voidaan jättää 05 tämä jatkokäsittely suorittamatta. Sopivan jatkokäsittelyme-nettelyn valinta on tietysti riippuvainen nukleiinihapponäyt-teen esikäsittelymenettelystä. Lukemattomia nukleiinihappo-näytteiden esi- ja jatkokäsittelymenetelmiä on kuvattu kirjallisuudessa, joten alan ammattimiehelle löytynee 10 jokaiseen tilanteeseen sopiva menettelytapa.
Määritykset, joissa testi- ja standardinukleiinihapot ovat molemmat DNA:ta tai RNA:ta, voidaan suorittaa jakamattomasta näytteestä. Määritykset, joissa testinukleiinihapot ovat 15 DNA:ta ja standardinukleiinihapot ovat RNA:ta tai päinvastoin on suoritettava jaetusta näytteestä, koska jatkokäsittelyme-nettelyt ovat erilaisia. Näyte voidaan tietysti haluttaessa jakaa, vaikka testi- ja standardinukleiinihapot ovat samaa nukleiinihappotyyppiä.
20
Itse hybridisaatiotesti suoritetaan siten, että jakamaton näyteliuos saatetaan samanaikaisesti kosketukseen vähintään yhden testikoetinparin ja yhden standardikoetinparin kanssa. Jos näyteliuos on jaettu, se saatetaan erikseen kosketukseen 25 vähintään yhden testikoetinparin ja yhden standardikoetinparin kanssa. Tällöin toisessa reaktioastiassa määritetään testinukleiinihapon määrä ja toisessa standardinukleiiniha-pon määrä.
30 Riippumatta siitä onko näyte jakamaton tai jaettu, hybridi-saatioreaktion annetaan tapahtua edullisissa hybridisaatio-olosuhteissa ja kulloinkin edullisen ajan. Kun reaktio tai reaktiot ovat tapahtuneet, muodostuneet testi- ja standardi-hybridit erotetaan hybridisaatioliuoksesta tai -liuoksista 35 kantajan avulla ja huuhdotaan tai erotetaan hybridisaatioliuoksesta eristämisen mahdollistavan aineen esimerkiksi affiniteettiparin toisen osapuolen avulla. Testi- ja 6 7611 9 standardihybrideihin sitoutunut leima mitataan ja tulosta verrataan standardikäyriin. Tällä tavalla saadaan määritettävien nukleiinihappomolekyylien lukumäärä määrättyä sopivasti valittua yksikköä kohden.
05
Keksinnön mukaisella menetelmällä on käytännön diagnostinen merkitys erikoisesti eräiden syöpäkasvaimien osoittamisessa. Keuhkojen mikrosellulaarisessa karsinoomassa c-myc-geeni on usein monistunut ja myös sen ilmenemistaso on huomattavasti 10 korkeampi kuin normaalissa kudoksessa. Neuroblastomatapauk-sissa taas löytyy monistunut N-myc-geeni.
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan myös osoittaa tiettyjen aineiden mutageeninen tai karsinogeeninen vaikutus 15 tai lääkeresistenssin kehittyminen. On tunnettua, että tietty ulkoinen valintapaine johtaa tietyn geenin normaalia tehokkaampaan ilmenemiseen. Syöpälääkehoidon yhteydessä solut kehittävät vastustuskyvyn lääkettä vastaan. Tämä tapahtuu monistamalla sitä geeniä, jonka tuote tekee lääkkeen tehotto-20 maksi. Esimerkkinä voidaan mainita dihydrofolaattireduktaasi (DHFR)-geenin monistuminen metotreksaatin vaikutuksesta. Toinen esimerkki on metallotioneiinia ekspressoivan geenin monistuminen esimerkiksi kadmiumin vaikutuksesta.
25 Solun fenotyypin ja toiminnan kannalta geenin ilmenemistaso on merkityksellinen. Ilmenemistasoa voidaan tutkia mittaamalla lähetti-RNA:n määrä, joka puolestaan korreloi siitä tuotettavan proteiinin määrään. Onkogeenin tuote viime kädessä määrää, miten onkogeenin vaikutus ilmenee.
30
Onkogeenin ilmenemistasot vaihtelevat riippuen solulajista ja sen erilaistumisasteesta ja -vaiheesta. Esimerkiksi tietyssä sikiön kehitysvaiheessa c-myc-onkogeeniä kopioidaan vilkkaasti, toisessa vaiheessa hyvin vähän. Geenin monistumisaste 35 korreloi usein geenin ilmenemistasoon, mutta ilmenemistaso saattaa merkittävästi kohota ilman geenin monistumista.
7 76119 Tällöin saadaan onkogeenin merkityksestä parhaiten tietoa mittaamalla sen ilmenemistaso kopiolukumäärän asemasta. Joissain tapauksissa lähetti-RNA:n kvantitatiivinen määrittäminen voi olla kätevämpää/helpompaa kuin itse 05 geenituotteen kvantitaatio. Esimerkkinä voidaan mainita c-myc-onkogeenin tuote, joka on labiili, helposti lämmössä saostuva proteiini.
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan osoittaa myös 10 kromosomilukumäärässä ilmenevät häiriöt kuten Downin oireyhtymä. Prenataalidiagnostiikassa on lisäksi mahdollista osoittaa onko sikiö sairas, ts. homotsygootti jonkin resessiivisen geenin suhteen.
15 Keksinnön mukainen menetelmä ja menetelmässä käytettävät nukleiinihapporeagenssit kuvataan tarkemmin seuraavissa esimerkeissä.
Esimerkki 1 20
Monistuneen onkogeenin kvantitatiivinen määritys kerroshyb-ridisaation avulla a) Nukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistus 25
STANDARDIKOETTIMET
Solustandardinukleiinihappo. c-Ki-rasI on humaani geeni, joka esiintyy kaikissa soluissa. Koetinparit kerroshybridi-saatiota varten valmistettiin subkloonauksien avulla 3.8 kb:n 31 mittaisen c-Ki-rasl-geenin Hindlll-fragmentista, jonka res-triktiokartta on kuvattu julkaisussa Chang et ai., PNAS 79, ss. 4848-52, 1982. Fragmentti on saatavissa mm. kloonattuna pBR322-plasmidiin esim. ATCC-kantakokoelmista (ATCC 41032).
36 Solustandardinukleiinihapon jatkokäsittely. Yllä kuvattu pBR322-klooni käsiteltiin Bglll- ja Hindlll-restriktioentsyy-mein ja syntyneet fragmentit eristettiin agaroosigeelistä ja 76119 puhdistetut lähellä toisiaan sijaitsevat fragmentit subkloo-nattiin kahteen sopivaan vektoriin detektori- ja kiinnitin-koettimen valmistamiseksi.
05 Standardidetektorikoetin. Noin 1,1 kb:n pituinen Bglll-Bglll- fragmentti kloonattiin uudelleen pBR322-plasmidiin sen BamHI- restriktioentsyymin katkaisukohtaan ja leimattiin nick- 125 translaatiomenetelmällä käyttäen I:lla leimattua dCTP:tä.
10 Standardikiinnitinkoetin. Noin 0,5 kb:n pituinen Bglll-
HindIII-fragmentti siirrettiin faagivektoreihin M13 mplO ja mpll näiden BamHI- ja Hindlll-restriktioentsyymien katkaisu-kohtien väliin ja kiinnitettiin nitroselluloosafiltterille (150 ng DNA:ta/halkaisija 1 cm).
15
TESTIKOETTIMET
Testinukleiinihappo. Koetinpari kerroshybridisaatiota varten valmistettiin kloonatusta c-myc-geenistä, joka on saatavissa 20 esim. ATCC:n kantakokoelmasta (ATCC 41010), jonka restriktio-kartta on kuvattu julkaisussa Watt et ai., PNAS iM), ss. 6307-6311, 1983.
Testinukleiinihapon jatkokäsittely, c-myc-geeni käsiteltiin 25 Hindlll-, Xbal- ja Pstl-restriktioentsyymien avulla ja fragmentit eristettiin agaroosigeelistä ja puhdistettiin sekä jatkokloonattiin sopiviin vektoreihin detektori- ja kiinni-tinkoettimen valmistamiseksi.
30 Testidetektorikoetin, c-myc-geenin 3,7 kb:n pituisen Hindlll-Xbal-restriktiofragmentin yksisäikeiset hännät saatettiin kaksisäikeiseksi DNA-polymeraasin avulla. Syntyneisiin tasapäisiin (blunt-end) DNA-fragmentteihin liitettiin Hindlll-linkkerit T4-DNA-ligaasin avulla ja fenoliekstraktion 35 jälkeen DNA käsiteltiin Hindlll-restriktioentsyymin avulla. Tämän jälkeen DNA-fragmentti oli kloonattavissa pBR322-plasmidin Hindlll-restriktioentsyymin katkaisukohtaan ja 9 76119 125 leimattiin nick-translaation avulla käyttäen I:lla leimattua dCTP:tä.
Testikiinnitinkoetin. c-myc-geenin 1,1 kb:n pituinen Xbal-05 Pstl-fragmentti kloonattiin M13 mplO- ja mpll-faagikloonaus-vektoreihin Xbal- ja Pstl-restriktioentsyymien katkaisu-kohtien väliin ja kiinnitettiin nitroselluloosafiltterille (150 ng DNA:ta/halkaisija 1 cm).
10 b) Standardikäyrän määrittäminen
Standardikäyrän määrittämisessä käytettiin alkalidenaturoitua c-myc-geenin pBR322-kloonia näytteenä. Kerroshybridisaatio-liuoksena käytettiin 4 x SSC, 1 x Denhardtin liuosta ja 15 200 ug/ml sillin sperman DNA:ta ja 0,2 % SDS:ta, johon lisät tiin edellä kuvatut testikoettimet. Hybridisaatioreaktio suoritettiin 65°C lämpötilassa 17-19 t. Hybridisaatioreaktion jälkeen filtterit pestiin pesuliuoksessa (0,1 x SSC 0,2 %: SDS:ssä) 50°C:ssa. Tämän jälkeen kerroshybrideihin sitoutu-20 nut leima laskettiin -laskijassa.
Taulukko 1 25 Näytemäärä cpm_ molek/testi c-myc-filtteri 0 40 106 75 30 5xl06 190 107 340 108 2200 10 761 1 9 c) Geenilukumäärän määrittäminen Näytteinä toimivat 1) ihmisen istukasta peräisin olevat solut; 2) Colo 320-solut, jotka ovat saatavissa esim. ATCC:n 05 kantakokoelmista (ATCC-CCC220). Molemmista eristettiin DNA ja kumpaankin testiin laitettiin sama määrä solu-DNA:ta denaturoituna alkalikeiton avulla. Alkalidenaturaatio hydrolysoi myös näytteessä mahdollisesti esiintyvän RNA:n.
10 Testi tehtiin siten, että kumpaankin näytteeseen lisättiin sekä c-myc- että c-Ki-rasI-filtterit sekä molemmat leimatut reagenssit. Tällöin yhdestä näytteestä saadaan mitatuksi sekä standardi- että testi-DNA. C-Ki-rasl-määritysten perusteella testeissä oli sama määrä DNA:ta. Tämän perusteella voidaan 15 päätellä, että c-myc-geeni on Colo 320-soluissa monistunut noin 16-20-kertaisesti verrattuna normaalitilanteeseen. Tulokset on esitetty taulukossa 2.
Taulukko 2 20 _Sisäinen standardi Testi__ Näyte c-Ki-rasI- c-myc- filtterillä filtterillä cpm* cpm* lukumäärä 25 --_- ihmisen istukan solut 486 340 10
Colo 320-solut 432 3205 1,6.10® f 30 Luvuista on vähennetty nollafiltterin antama luku.
Esimerkki 2 35 Amplifioidun geenin kvantitatiivinen määritys kerroshybridi-saation avulla a) Nukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistus 11 76119
STANDARDIKOETTIMET
Solustandardinukleiinihappo. Vertailunukleiinihappona käytettiin hiiren metallotioneiinigeenin promoottorialuetta ja 05 DNA-aluetta kyseisen geenin yläpuolelta, nk. MT-geeniä.
MT-geenin rakenne on kuvattu julkaisussa Pavlakis ja Hamer, PNAS 80, ss. 397-401, 1983. Vertailunukleiinihappofragmentti on saatavissa mm. ATCC:n kantakokoelmasta vektorista pBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224).
10
Solustandardinukleiinihapon jatkokäsittely. Edellä kuvattu MT-geeni käsiteltiin Kpnl-, Bglll- ja EcoRI-restriktioentsyy-meillä pATl53-plasmidiin tehtävää jatkokloonausta varten. Kpnl-pää muutettiin Hindlll-pääksi linkkeriä käyttäen.
15
Standardidetektorikoetin. Metallotioneiinigeenin yläpuolinen noin 1,2 kb:n mittainen EcoRI-KpnI-(Hindlll)-fragmentti kloonattiin pATl53-plasmidiin EcoRl- ja Hindlll-restriktio-entsyymien katkaisukohtien väliin ja leimattiin nick-trans-20 laatiomenetelmällä käyttäen P:lla leimattuja nukleosiditri-fosfaatteja.
Standardikiinnitinkoetin. Metallotioneiinigeenin promoottorialueen ja tämän yläpuolisen alueen muodostama 0,8 kb:n 25 mittainen Kpnl-BglII-fragmentti kloonattiin M13 mpl8- ja M13 mpl9-faagivektoreihin Kpnl- ja BamHl-restriktioentsyymien katkaisukohtien väliin ja kiinnitettiin nitroselluloosa-filtterille.
30 TESTIKOETTIMET
Testinukleiinihappo. Koetinpari kerroshybridisaatiotestiä varten on valmistettu kaupallisesti saatavasta plasmidista pMTVdhfr (Bethesda Research Laboratories, tuote no. 5369SS), 35 jonka rakenne on kuvattu julkaisussa Lee et ai., Nature 294, ss. 228-232, 1981.
12 761 1 9
Testinukleiinihapon jatkokäsittely. pMTVdhfr-plasmidi, joka sisältää dihydrofolaattireduktaasigeenin (DHFR) cDNA:ta, käsiteltiin Hindlll- ja Bglll-restriktioentsyymeillä.
05 Testidetektorikoetin. pMTVdhfr-plasmidin DHFR-geeniä koodaa- vaa aluetta vastaava 0,75 kb:n pituinen Hindlll-Bglll- fragmentti siirrettiin plasmidivektoriin pATl53 Hindlll- ja
BamHI-restriktioentsyymien katkaisukohtien väliin ja leimat- 32 tiin nick-translaatiomenetelmää käyttäen P:lla leimattuja 10 nukleosiditrifosfaatteja.
Testikiinnitinkoetin. pMTVdhfr-plasmidin MMTV-geenialue kloonattiin 1,4 kb:n HindlII-fragmenttina faagivektoreihin M13 mpl8 ja M13 mpl9.
15 b) Standardikäyrän määrittäminen.
Näytteenä testissä käytettiin puhdistettua pMTVdhfr-plasmidin DNA:ta. Itse testi suoritettiin kuten on kuvattu esimerkissä 20 Ib lukuunottamatta sitä, että laskenta suoritettiin neste-tuikelaskijaa käyttäen. Tuloksena saatu standardikäyrä on esitetty taulukossa 3.
Taulukko 3 25 Näytemäärä cpm_ molek./testi DHFR-filtteri 30 0 17 106 45 3xl06 79 107 210 13 761 1 9 c) Geenilukumäärän määrittäminen
Solulinjat, joihin oli keinotekoisesti viety DHFR-geenin lähetti-RNA:ta vastaavaa cDNA:ta eri määriä, viljeltiin solu-05 viljelymaljoissa ja käytettiin näytteenä. Solut irrotettiin natriumdodekyylisulfaattia käyttäen ja niiden DNA:ta pilkottiin jonkin verran työntämällä ruiskusta kapean neulan läpi. Homogenaatista otettiin 250 ui, joka vastasi noin 10^ solua, ja siihen lisättiin 50 ui NaOH:ta, näytettä keitettiin 10 ja neutraloitiin etikkahapolla ja hybridisaatioliuoksella.
Kokonaistilavuus oli 0.5 ml. Tähän liuokseen lisättiin samanaikaisesti kaikki edellä kuvatut koettimet. Lisäksi siihen lisättiin ns. nollafiltteri taustakontrolliksi. Hybridisaatio, pesu ja laskenta suoritettiin kuten esimerkissä Ib 15 lukuunottamatta sitä, että laskenta suoritettiin nestetuike-laskijaa käyttäen. Tulokset on esitetty taulukossa 4.
Taulukko 4 20 _Sisäinen standardi_Testi_
Solu MT Solumäärä _PH FR_ cpm näytteessä cpm molekyylien kopioluku- lukumäärä määrä/solua _näytteessä_kohden 25 Kontrolli-solu (ei DHFR-cDNA) 182 l,05xl06 21 <106 linja I 138 0,9 xlO6 80 3xl06 3 linja II 210 l,25xl06 732 5xl07 40 30 _ * cpm: Luvuista on vähennetty nollafiltterin antama luku· MT-geeni toimii testissä sisäisenä markkerina, joka mittaa 35 solujen määrää. Tuloksemme osoitti, että 10^ solua tässä kokeessa antoi 165 + 20 cpm MT-spesifistä signaalia. DHFR-reagenssit mittaavat DHFR-cDNA:n määrää. MT-geenin 14 76119 signaaliroäärän perusteella solujen määrä oli tiedossa. Näin DHFR-cDNA:n kopioluvun määrä eri solulinjoista oli mitattavissa kuten taulukosta 4 käy ilmi.
05 Esimerkki 3 Lähetti-RNA;n kvantitatiivinen määritys kerrohybridisaation avulla 10 a) Nukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistus
Esimerkissä 2 kuvattujen testikoettimien avulla voidaan myös mitata DHFR-cDNA:sta tuotetun lähetti-RNA:n määrä. pMTVdhfr-plasmidi on konstruoitu siten, että DHFR-geenin transkriptio 15 alkaa MMTV-promoottorista. Tuotetut lähetit ovat noin 1,0 kb:n pituisia. Tästä noin 0,25 kb on peräisin MMTV-promoot-torialueelta ja loput ovat DHFR-cDNA:sta (Lee et ai., Nature 294, ss. 228-232, 1981).
20 STANDARDIKOETTIMET
Solustandardinukleiinihappo, standardidetektori- ja standar-dikiinnitinkoetin olivat samat kuin esimerkissä 2.
25 TESTIKOETTIMET
Testinukleiinihappo, testidetektori- ja testikiinnitinkoetin olivat samat kuin esimerkissä 2.
30 b) Standardikäyrän määrittäminen
Standardikäyrän määrittämisessä käytettiin näytteenä in vitro-transkription avulla tuotettua dihydrofolaattireduk-taasigeeniä vastaavaa lähetti-RNA:ta. Transkriptiossa 35 tarvittava DNA valmistettiin jatkokloonaamalla plasmidin pMTVdhfr 1,4 kb:n pituinen MMTV-promoottorista peräisin oleva HindIII-fragmentti ja 0,75 kb:n pituinen Hindlll-Bglll-fragmentti (DHFR-cDNA) peräkkäin plasmidiin pSP64 (Promega 15 761 1 9
Biotec) Hindm- ja BamHl-restriktioentsyymien katkaisukoh-tien väliin. Näyte-RNA säilytettiin 0,2 % SDS-vesiliuoksessa.
Itse kerroshybridisaatiotesti suoritettiin kuten esimerkeissä 05 lb ja 2b on esitetty lukuunottamatta sitä, että denaturaati-ota ei suoritettu.
Taulukko 5 10 _ Näytemäärä cpm_ molek./testi DHFR-filtteri 0 20 15 5xl06 65 107 130 5xl07 390 108 653 20 c) Lähetti-RNA-molekyylien lukumäärän määrittäminen DHFR-geeniä vastaavien lähetti-RNA-molekyylien lukumäärä määritettiin solulinjoista, jotka on kuvattu esimerkissä 2.
25
Solut irrotettiin natriumdodekyylisulfaattia käyttäen ja niiden DNA:ta pilkottiin jonkin verran työntämällä ruiskusta kapean neulan läpi. Homogenaatista otettiin 250 ui, joka vastasi noin 5xl08 solua. Homogenaatti lisättiin ilman 30 denaturaatiota kerroshybridisaatiotestiin. Kerroshybridi-saatiotesti tehtiin kuten esimerkeissä 2c ja Ib on kuvattu lukuunottamatta sitä, että hybridisaatioliuokseen lisättiin ainoastaan DHFR-koettimet. Rinnakkaisesta 250 ui homogenaatista määritettiin näytteen solumäärä MT-koettimen avulla 35 kuten esimerkissä 2c on kuvattu.
Tulokset on esitetty taulukossa 6.
16 761 1 9
Taulukko 6 _Sisäinen standardi_Testi__
Solu MT Solumäärä _DHFR_ 05 cpm* näytteessä cpm* molek.lukum. lukumäärä näytteessä solua kohden linja I 380 3,5xl06 1465 3,45xl08 100 10 linja II 430 4,2xl06 4800 2xl09 500 *cpm: Luvuista on vähennetty nollafiltterin antama luku.
15 Tuloksemme osoitti, että solulinjassa I tuotettiin noin 100 DHFR-geeniä vastaavaa lähetti-RNA-molekyyliä ja solulinjassa II noin 500 DHFR-geeniä vastaavaa lähetti-RNA-molekyyliä solua kohden.
20 Esimerkki 4
Monistuneen geenin kvantitatiivinen määritys liuoshybridi-saation avulla
25 a) Nukleiinihapporeagenssit ja niiden valmistus STANDARDIKOETTIMET
Solustandardinukleiinihappo, standardidetektori- ja standar- 30 dikiinnitinkoetin olivat samat kuin esimerkissä 2. Plasmidiin pATl53 kloonattu 1.2 kb:n EcoRI-KpnI-(Hindlll)-fragmentti 125 leimattiin nick-translaation avulla käyttäen lilla leimattua deoksisytidiiniä. Faageihin M13 mpl8 ja M13 mpl9 kloonatut 0.8 kb:n pituiset Kpnl-Bglll-fragmentit modifioi-
TM
35 tiin biotiinilla käyttäen Photoprobe -reagenssia (Vector Laboratories, CA, USA, product No SP-1000).
17 761 1 9
TESTIKOETTIMET
Testinukleiinihappo, testidetektori- ja testikiinnitinkoetin olivat samat kuin esimerkissä 2. Plasmidiin pATl53 kloonattu 05 0.75 kb:n pituinen Hindlll-Bglll-fragmentti leimattiin 125 I:lla leimatulla deoksisytidiinillä. Faageihin M13 mpl8 ja
M13 mpl9 kloonatut 1,4 kb:n HindIII-fragmentit biotinyloitiin TM
Photoprobe -reagenssia käyttäen kuten edellä.
10 b) Standardikäyrien määrittäminen
Solustandardikäyrä valmistettiin käyttäen tunnettua solu-määrää, jonka hybridisaatiosignaali mitattiin käyttäen MT-geenin tunnistavia standardikoettimia. Testinukleiinihap-15 postandardikäyrä valmistettiin pMTVdhfr-plasmidin ja tämän plasmidin tunnistavien testikoettimien avulla.
Hybridisaatiot suoritettiin 200 μΐ-.ssa liuosta, jonka koostumus oli seuraava: 0.6 M NaCl, 20 mM fosfaattipuskuria, 20 pH 7.5, 1 mM EDTA, 4 % polyetyleeniglykolia (PEG 6000).
Hybridisaatioaika oli 1,5 tuntia ja -lämpötila 70°C. Hybridi-saatioreaktion jälkeen 50 μΐ streptavidiini-agaroosia (Bethesda Research Laboratories, Maryland, USA, tuoteno. 5942SA) lisättiin liuokseen, jossa oli 1 M NaCl, 10 mM 25 natriumfosfaattia, pH 7,5, 1 mM EDTA siten että lopputila-vuudeksi saatiin 500 μΐ. Hybridejä kerättiin streptavidiini-agaroosiin 37°C lämpötilassa 15 minuutin ajan. Agaroosia pestiin kerran viisi minuuttia puskuroidulla 1 M NaCl-liuoksella 37°C:ssa ja kahdesti kahden minuutin ajan 30 liuoksessa, jossa oli 15 mM NaCl ja 1,5 mM natriumsitraattia lämpötilan ollessa 55°C. Hybridien määrä mitattiin agaroosis-ta gamma-laskimella (Syvänen et ai., Nucleic Acids Res. 14, 5037-5048, 1986). Tulokset on esitetty taulukoissa 7 ja 8.
Taulukko 7 76119 18 Näytemäärä cpm_ 05 solua/testi MT-filtteri 0,8 x 106162 0,6 x 106 216 3 x 106 298 10
Taulukko 8 15__ Näytemäärä cpm_ molek./testi DHFR-filtteri ΰβ 20 5 x 106 394 5 x 107 2240 c) Geenien lukumäärän määrittäminen 25
Esimerkissä 2 kuvatut solulinjanäytteet käsiteltiin samalla tavalla kuin ko. esimerkissä on kuvattu, lukuunottamatta sitä, että tilavuus oli 125 μΐ näytettä kohden vastaten noin 2 x 10® solua. Solujen ja testinukleiinihappomolekyylien 30 lukumäärä määritettiin eri astioissa lisäämällä solunäyte, kyseiset detektori- ja kiinitinkoettimet, ja hybridisaatio-seoksen komponentit siten että lopputilavuus oli 200 μΐ. Samalla lisättiin kontrollikoettimet ilman solustandardi- ja testinukleiinihappoa. Hybridisaatio, hybridien keräys, pesu 35 ja mittaus tehtiin kuten esimerkissä 4b on kuvattu. Tulokset luettiin standardikäyriltä, jotka valmistettiin kuten esimerkissä 4 b on kuvattu. Tulokset on esitetty taulukossa 9.
19 761 1 9
Taulukko 9 _Sisäinen standardi_Testi_
Solu MT_ DHFR_ 05 cpm* Solumäärä cpm* Molek. lukum. Kopio- näytteessä näytteesssä lukumäärä
Kontrollisolu 253 2.3 x 10^ 73 < 10^ 10 Linja I 210 1.5 x 106 233 3.8 x 106 3
Linja II 237 2.1 x 106 3059 8.8 x 107 42 * cpm: Luvuista on vähennetty nollafilterin antama luku

Claims (16)

  1. 76119
  2. 1. Menetelmä nukleiinihappomolekyylien kvantitatiiviseksi määrittämiseksi kerros- tai liuoshybridisaatiomenetelmällä, 05 tunnettu siitä, että määrättyjen nukleiinihappomolekyylien lukumäärä tutkittavassa organismissa esiintyvää määrättyä biologista yksikköä kohden määritetään vertaamalla yksikössä mahdollisesti useana kappaleena esiintyvien testinukleiinihappomolekyylien lukumäärää valittujen, samassa 10 yksikössä edullisesti vakiolukumääräisinä esiintyvien standardinukleiinihappomolekyylien lukumäärään siten, että nukleiinihapponäyte saatetaan jakamattomana tai tarvittaessa jaettuna kosketukseen vähintään yhden määritettävälle nukleiinihapolle riittävän homologisen nk. testikoetinparin 15 kanssa ja vähintään yhden valitun tarkoitukseen sopivan edullisesti vakiolukumääräisenä esiintyvälle nukleiinihap-pomolekyylille riittävän homologisen nk. standardikoetinparin kanssa, jolloin sekä testikoetinparin että standardikoetinparin nk. detektorikoettimet on varustettu osoitettavalla 20 leimalla ja nk. kiinnitinkoettimet on kiinnitetty sopivaan kantajaan tai niihin on kiinnitetty aine, joka mahdollistaa muodostuneiden hybridien eristämisen, ja hybridisaatio-reaktion tai -reaktioiden tapahduttua testihybridi ja standardihybridi erotetaan tarvittaessa ja sitoutunut Leima 25 mitataan, jolloin nukleiinihappomolekyylien lukumäärä tutkittavassa organismissa esiintyvää määrättyä biologista yksikköä kohden saadaan vertaamalla testi- ja standardi-nukleiinihappomolekyylien lukumääriä toisiinsa.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että testi- ja standardinukleiinihappo ovat deoksiribonukleiinihappoja.
  4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -35 n e t t u siitä, että testinukleiinihappo on ribonukleiini-happo ja standardinukleiinihappo on deoksiribonukleiinihappo. 21 76119
  5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että testi- ja standardinukleiinihappo ovat ribonukleiinihappoja.
  6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että testinukleiinihappo on deoksiribo-nukleiinihappo ja standardinukleiinihappo on ribonukleiini-happo.
  7. 6. Patenttivaatimuksen 1, 2 ja 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että standardikoetinparin detektori-koetin, rekombinanttiplasmidi, joka koostuu ihmisen c-Ki-rasI-geenin pBR322-plasmidiin kloonatun Hindlll-fragmentin 1,1 kb:n pituisesta Bglll-Bglll-fragmentista, joka 15 on subkloonattu pBR322-plasmidin BamHl-restriktioentsyymin katkaisukohtaan ja kiinnitinkoettimet, rekombinanttifaagit, jotka koostuvat c-Ki-rasI-geenin pBR322-plasmidiin subkloona-tun HindIII-fragmentin 0,5 kb:n pituisesta Bglll-Hindlll-fragmentista, joka on subkloonattu faagivektoreihin M13 mplO 20 ja M13 mpll BamHI- ja Hindlll-restriktioentsyymien katkai-sukohtien väliin, saatetaan erikseen tai yhdessä testikoe-tinparin kanssa kosketukseen jakamattoman tai tarvittaessa jaetun nukleiinihapponäytteen kanssa.
  8. 7. Patenttivaatimusten 1, 2, ja 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että standardikoetinparin detektorikoetin, rekombinanttiplasmidi, joka koostuu hiiren metallotioneiinigeenin promoottorialueen yläpuolisesta 1,2 kb:n pituisesta EcoRI-Kpnl(Hindlll)-fragmentista, joka on 30 subkloonattu pATl53-plasmidin EcoRI- ja Hindlll-restriktio-entsyymien katkaisukohtien väliin ja kiinnitinkoettimet, rekombinanttifaagit, jotka koostuvat metallotioneiinigeenin promoottorialueen ja tämän yläpuolisen alueen muodostamasta 0,8 kb:n pituisesta KpnI-BglII-fragmentista, joka on 35 subkloonattu faagivektoreihin M13 mpl8 ja M13 mpl9 Kpnl- ja BamHI-restriktioentsyymien katkaisukohtien väliin, saatetaan 22 7 61 1 9 erikseen tai yhdessä testikoetinparin kanssa kosketukseen jakamattoman tai tarvittaessa jaetun nukleiinihapponäytteen kanssa.
  9. 8. Patenttivaatimusten 1, 2, 5, 6 ja 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että c-myc-onkogeenin monistumis-asteen ja/tai tätä geeniä vastaavien lähetti-RNA-molekyylien lukumäärän määrittämiseksi testikoetinparin detektorikoetin, rekombinanttiplasmidi, joka koostuu c-myc-geenin 3,7 kb:n 10 pituisesta HindIII-Xbal-fragmentista, joka on subkloonattu pBR322-plasmidin Hindlll-restriktioentsyymin katkaisukohtaan ja kiinnitinkoettimet, rekombinanttifaagit, jotka koostuvat c-myc-geenin 1,1 kb:n mittaisesta Xbal-Pstl-fragmentista, joka on subkloonattu faagivektoreihin M13 mplO ja M13 mpll 15 Xbal- ja Pstl-restriktioentsyymien katkaisukohtien väliin, saatetaan erikseen tai yhdessä standardikoetinparin kanssa kosketukseen jakamattoman tai tarvittaessa jaetun nukleiinihapponäytteen kanssa.
  10. 9. Patenttivaatimusten 1, 2, 5, 6 ja 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dihydrofolaattireduktaasi- eli DHFR-geenin monistumisasteen ja/tai tätä geeniä vastaavien lähetti-RNA-molekyylien lukumäärän määrittämiseksi testikoetinparin detektorikoetin, rekombinanttiplasmidi, joka 25 koostuu plasmidin pMTVdhfr DHFR-geeniä koodaavasta 0,75 kb:n HindIII-BglIl-fragmentista, joka on subkloonattu plasmidi-vektoriin pATl53 Hindlll- ja BamHI-restriktioentsyymien katkaisukohtien väliin ja kiinnitinkoettimet, rekombinanttifaagit, jotka koostuvat pMTVdhfr-plasmidin MMTV-geenialueen 30 1,4 kb:n HindIII-fragmentista, joka on subkloonattu faagivektoreihin M13 mpl8 ja M13 mpl9 restriktioentsyymin Hindlll katkaisukohtaan, saatetaan erikseen tai yhdessä standardikoetinparin kanssa kosketukseen jakamattoman tai tarvittaessa jaetun nukleiinihapponäytteen kanssa. 76119
  11. 10. Reagenssipakkaus nukleiinihappomolekyylien kvantitatiiviseksi määrittämiseksi vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, tunnettu siitä, että pakkaus sisältää vähintään yhden testikoetinparin ja vähintään yhden 05 standardikoetinparin, jolloin sekä testikoetinparin että standardikoetinparin detektorikoettimet on varustettu osoitettavalla leimalla ja kiinnitinkoettimet ovat kiinnitettyjä sopivaan kantajaan tai niihin on kiinnitetty aine, joka mahdollistaa kerroshybridien eristämisen. 10
  12. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että c-myc-onkogeenin monistumis-asteen ja/tai tätä geeniä vastaavien lähetti-RNA-molekyylien lukumäärän määrittämisessä testikoetinparin detektorikoetin 15 on rekombinanttiplasmidi, joka koostuu c-myc-geenin 3,7 kb:n pituisesta Hindm-Xbal-restriktiofragmentista, joka on subkloonattu pBR322-plasmidin Hindlll-restriktioentsyymin katkaisukohtaan ja kiinnitinkoettimet ovat rekombinantti-faagit, jotka koostuvat c-myc-geenin 1,1 kb:n mittaisesta
  13. 20 Xbal-Pstl-fragmentista, joka on subkloonattu faagivektoreihin M13 mplO ja M13 mpll Xbal- ja Pstl-restriktioentsyymien katkaisukohtien väliin ja standardikoetinparin detektorikoetin on ihmisen c-Ki-rasI-geenin pBR322-plasmidiin kloonatun HindIII-fragmentin 1,1 kb:n pituinen Bglll-
  14. 25 Bglll-fragmentti, joka on subkloonattu pBR322-plasmidin BamHI-restriktioentsyymin katkaisukohtaan ja kiinnitinkoettimet ovat rekombinanttifaagit, jotka koostuvat c-Ki-rasI-geenin pBR322-plasmidiin subkloonatun HindIII-fragmentin 0,5 kb:n pituisesta BgllI-HindIII-fragmentista, joka on 30 subkloonattu faagivektoreihin M13 mplO ja M13 mpll BamHl- ja Hindlll-restriktioentsyymien katkaisukohtien väliin.
  15. 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että dihydrofolaattireduktaasi- eli
  16. 35 DHFR-geenin monistumisasteen ja/tai tätä geeniä vastaavien 76119 lähetti-RNA-molekyylien lukumäärän määrittämisessä testi-koetinparin detektorikoetin on rekombinanttiplasmidi, joka koostuu plasmidin pMTVdhfr DHFR-geeniä koodaavasta 0,75 kb:n HindIII-BglII-fragmentista, joka on subkloonattu plasmidi-05 vektoriin pATl53 Hindlll- ja BamHl-restriktioentsyymien katkaisukohtien väliin ja kiinnitinkoettimet ovat rekombi-nanttifaagit, jotka koostuvat pMTVdhfr-plasmidin MMTV-geenialueen 1,4 kb:n Hindlll-fragmentista, joka on subkloonattu faagivektoreihin M13 mpl8 ja M13 mpl9 restriktio-10 entsyymin Hindlll katkaisukohtaan ja standardikoetinparin detektorikoetin on rekombinanttiplasmidi, joka koostuu hiiren metallotioneiinigeenin promoottorialueen yläpuolisesta 1,2 kb:n pituisesta EcoRl-Kpnl-fragmentista ja on subkloonattu pAT153-plasmidin EcoRI- ja Hindlll-restriktioentsyymien 15 katkaisukohtien väliin ja kiinnitinkoettimet ovat rekombi-nanttifaagit, jotka koostuvat metallotioneiinigeenin promoottorialueen ja tämän yläpuolisen alueen muodostamasta 0,8 kb:n pituisesta Kpnl-Bglll-fragmentista, joka on subkloonattu faagivektoreihin M13 mpl8 ja M13 mpl9 Kpnl- ja 20 BamHl-restriktioentsyymien katkaisukohtien väliin. 761 1 9
FI860836A 1986-02-27 1986-02-27 Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. FI76119C (fi)

Priority Applications (26)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI860836A FI76119C (fi) 1986-02-27 1986-02-27 Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.
JP62042442A JPS62205800A (ja) 1986-02-27 1987-02-25 核酸分子の定量法およびそれに用いる試薬
BE8700177A BE1001168A4 (fr) 1986-02-27 1987-02-26 Quantification de molecules d'acide nucleique et trousse de reactifs mise en oeuvre.
CH756/87A CH675593A5 (fi) 1986-02-27 1987-02-26
ZA871401A ZA871401B (en) 1986-02-27 1987-02-26 Quantitative determination of necleic acid molecules and the regent kit used
ES08700776A ES2061411A6 (es) 1986-02-27 1987-02-26 Un metodo cuantitativo para la determinacion de moleculas de acido nucleico
HU87750A HU201808B (en) 1986-02-27 1987-02-26 Process for determining the amount of gene amplification and/or determining the number of nuclein acid molecules and reagent set for carrying out the pocess
IT19501/87A IT1202581B (it) 1986-02-27 1987-02-26 Quantificazione di molecole di acido nucleico e il kit reattivo impiegato
NO870794A NO175380C (no) 1986-02-27 1987-02-26 Fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av nukleinsyremolekyler og reagenspakke til bruk ved utförelse av fremgangsmåten
DK198700993A DK174784B1 (da) 1986-02-27 1987-02-26 Kvantificering af nukleinsyremolekyler og reagenssæt dertil
AU69275/87A AU603562B2 (en) 1986-02-27 1987-02-26 Quantitative determination of nucleic acid molecules and the reagent kit used
NL8700483A NL195097C (nl) 1986-02-27 1987-02-26 Kwantificering van nucleinezuur moleculen en de daarbij gebruikte reagens set.
AT431/87A AT393511B (de) 1986-02-27 1987-02-26 Verfahren zur quantitativen bestimmung von nucleinsaeure-molekuelen und reagenziensatz hierfuer
IE49687A IE66904B1 (en) 1986-02-27 1987-02-26 Qantification of nucleic acid molecules and the reagent Kit Used
GB8704517A GB2187283B (en) 1986-02-27 1987-02-26 Quantification of nucleic acid molecules and the reagent kit used
LU86792A LU86792A1 (fr) 1986-02-27 1987-02-26 Quantification de molecules d'acide nucleique et trousse de reactifs utilisee
CA000530691A CA1287558C (en) 1986-02-27 1987-02-26 Quantitative determination of nucleic acid molecules and the reagent kitused
KR870001680A KR870008033A (ko) 1986-02-27 1987-02-26 핵산분자의 정량과 정량에 사용되는 시약키트
NZ219421A NZ219421A (en) 1986-02-27 1987-02-26 Nucleic acid quantification method & kit
FR878702541A FR2594849B1 (fr) 1986-02-27 1987-02-26 Quantification de molecules d'acide nucleique et trousse de reactifs utilisee
IS3197A IS3197A7 (is) 1986-02-27 1987-02-26 Magnbundin ákvörðun kjarnasýrusameinda og samstæðefni notuð við hana
DE19873706285 DE3706285A1 (de) 1986-02-27 1987-02-26 Verfahren zur quantitativen bestimmung von nucleinsaeure-molekuelen und reagenziensatz hierfuer
SE8700821A SE468816B (sv) 1986-02-27 1987-02-26 Saett och reagenskit foer kvantifiering av nukleinsyramolekyler
PT84368A PT84368B (pt) 1986-02-27 1987-02-26 Quantificacao de moleculas de acido nucleico e kit (equipamanto) de reagentes usado
DD87300286A DD270383A5 (de) 1986-02-27 1987-02-27 Verfahren zur quantitativen bestimmung von nucleinsaeure-molekuelen und reagenziensatz hierfuer
IL81695A IL81695A (en) 1986-02-27 1987-02-27 Quantitative determination of the degree of amplification of genes and/or corresponding messenger rna and reagent kit for performing the determination

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI860836A FI76119C (fi) 1986-02-27 1986-02-27 Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.
FI860836 1986-02-27

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI860836A0 FI860836A0 (fi) 1986-02-27
FI860836A FI860836A (fi) 1987-08-28
FI76119B FI76119B (fi) 1988-05-31
FI76119C true FI76119C (fi) 1988-09-09

Family

ID=8522222

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI860836A FI76119C (fi) 1986-02-27 1986-02-27 Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.

Country Status (26)

Country Link
JP (1) JPS62205800A (fi)
KR (1) KR870008033A (fi)
AT (1) AT393511B (fi)
AU (1) AU603562B2 (fi)
BE (1) BE1001168A4 (fi)
CA (1) CA1287558C (fi)
CH (1) CH675593A5 (fi)
DD (1) DD270383A5 (fi)
DE (1) DE3706285A1 (fi)
DK (1) DK174784B1 (fi)
ES (1) ES2061411A6 (fi)
FI (1) FI76119C (fi)
FR (1) FR2594849B1 (fi)
GB (1) GB2187283B (fi)
HU (1) HU201808B (fi)
IE (1) IE66904B1 (fi)
IL (1) IL81695A (fi)
IS (1) IS3197A7 (fi)
IT (1) IT1202581B (fi)
LU (1) LU86792A1 (fi)
NL (1) NL195097C (fi)
NO (1) NO175380C (fi)
NZ (1) NZ219421A (fi)
PT (1) PT84368B (fi)
SE (1) SE468816B (fi)
ZA (1) ZA871401B (fi)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
EP0304845A3 (en) * 1987-08-28 1991-03-06 Profile Diagnostic Sciences Inc. Method and kit for assaying gene expressions
ATE120497T1 (de) * 1988-05-09 1995-04-15 Univ Temple Verfahren zur voraussage der wirksamkeit einer antineoplastichen behandlung bei einzelnen patienten.
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
WO1990014440A1 (en) * 1989-05-18 1990-11-29 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce RNA PROBE FOR DETECTING c-fes mRNA
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
DK138090D0 (da) * 1990-06-06 1990-06-06 Novo Nordisk As Diagnostisk analysemetode
EP0534640B1 (en) * 1991-09-23 1996-10-02 Pfizer Inc. Process for detecting specific mRNA and DNA in cells
US6300058B1 (en) 1992-01-29 2001-10-09 Hitachi Chemical Research Center, Inc. Method for measuring messenger RNA
GB9210916D0 (en) * 1992-05-21 1992-07-08 Isis Innovation Nucleic acid quantification
MX9300494A (es) * 1992-07-28 1994-07-29 Hitachi Chemical Co Ltd Metodo para la deteccion genetica de organismos, agentes infecciosos o componentes de una celula u organismo en una muestra biologica.
US5580971A (en) * 1992-07-28 1996-12-03 Hitachi Chemical Company, Ltd. Fungal detection system based on rRNA probes
ES2055661B1 (es) * 1993-01-20 1995-03-01 Univ Malaga Determinacion de la expresion genica por captura especifica de arn y su cuantificacion directa por electroforesis capilar en zona libre.
GB9309966D0 (en) * 1993-05-14 1993-06-30 Nordion Int Inc Detection of prostrate-specific antigen in breast tumors
GB9415489D0 (en) * 1994-08-01 1994-09-21 Nordion Int Inc Detection of prostate-specific antigen in amniotic fluid
AT401062B (de) * 1994-09-26 1996-06-25 Immuno Ag Verfahren zur quantifizierung von nukleinsäuren
EP2557178B1 (en) * 2010-03-31 2014-11-26 Yamaguchi Technology Licensing Organization, Ltd. Method for detecting pneumonia causative bacteria using nucleic acid chromatography

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4442203A (en) * 1981-06-30 1984-04-10 Massachusetts Institute Of Technology Gene amplification assay for detecting tumor promoters
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
DE3382068D1 (de) * 1982-03-15 1991-01-31 Univ Columbia Verfahren zum einbringen von klonierten amplifizierbaren genen in eukaryotische zellen und zur herstellung von proteinprodukten.
CA1252046A (en) * 1982-11-04 1989-04-04 Martin J. Cline Methods for oncogenic detection
FI71768C (fi) * 1984-02-17 1987-02-09 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.
US4675283A (en) * 1984-07-19 1987-06-23 Massachusetts Institute Of Technology Detection and isolation of homologous, repeated and amplified nucleic acid sequences
FI72146C (fi) * 1985-01-02 1987-04-13 Orion Yhtymae Oy Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror.
FR2583771B1 (fr) * 1985-06-21 1988-12-09 Centre Nat Rech Scient Sequences d'adn d'archaebacteries homologues a l'oncogene v-myc, proteines codees par ces sequences, leurs procedes d'obtention et leurs applications immunologiques

Also Published As

Publication number Publication date
IE870496L (en) 1987-08-27
CH675593A5 (fi) 1990-10-15
NO870794D0 (no) 1987-02-26
KR870008033A (ko) 1987-09-23
AT393511B (de) 1991-11-11
ZA871401B (en) 1987-10-28
DD270383A5 (de) 1989-07-26
IL81695A0 (en) 1987-09-16
DK99387D0 (da) 1987-02-26
FI860836A0 (fi) 1986-02-27
PT84368B (pt) 1989-10-04
SE468816B (sv) 1993-03-22
GB2187283A (en) 1987-09-03
ES2061411A6 (es) 1994-12-01
NO175380C (no) 1994-10-05
DK174784B1 (da) 2003-11-10
FI860836A (fi) 1987-08-28
GB2187283B (en) 1990-05-30
BE1001168A4 (fr) 1989-08-08
NL8700483A (nl) 1987-09-16
NO870794L (no) 1987-08-28
NZ219421A (en) 1988-11-29
DK99387A (da) 1987-08-28
HUT43647A (en) 1987-11-30
JPS62205800A (ja) 1987-09-10
PT84368A (en) 1987-03-01
AU603562B2 (en) 1990-11-22
IT8719501A0 (it) 1987-02-26
AU6927587A (en) 1987-09-03
NL195097C (nl) 2004-03-17
JPH0561920B2 (fi) 1993-09-07
CA1287558C (en) 1991-08-13
FR2594849B1 (fr) 1990-04-20
GB8704517D0 (en) 1987-04-01
DE3706285A1 (de) 1987-11-12
SE8700821D0 (sv) 1987-02-26
SE8700821L (sv) 1987-08-28
IE66904B1 (en) 1996-02-07
IT1202581B (it) 1989-02-09
HU201808B (en) 1990-12-28
IL81695A (en) 1991-04-15
FR2594849A1 (fr) 1987-08-28
FI76119B (fi) 1988-05-31
ATA43187A (de) 1991-04-15
NO175380B (no) 1994-06-27
IS3197A7 (is) 1987-08-28
LU86792A1 (fr) 1987-07-24
DE3706285C2 (fi) 1993-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI76119C (fi) Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.
US5741677A (en) Methods for measuring telomere length
Hirose et al. A rapid, useful and quantitative method to measure telomerase activity by hybridization protection assay connected with a telomeric repeat amplification protocol
CN103667514B (zh) 一种人白介素28b基因多态性荧光pcr检测试剂盒
Tarkowski et al. Improved detection of viral RNA isolated from liquid-based cytology samples
CN113481286B (zh) 基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物对及其检测试剂盒
JP7569828B2 (ja) ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法
CN108048552A (zh) 一种用于检测y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用
Kashani-Sabet et al. Detection of drug resistance in human tumors by in vitro enzymatic amplification
Matsunaga et al. Expression of N-myc and c-src protooncogenes correlating to the undifferentiated phenotype and prognosis of primary neuroblastomas
CN101107367A (zh) 癌症标记物和检测方法
CN105132571B (zh) 利用微滴式数字化pcr检测外周血游离线粒体dna含量的方法
CN108148896A (zh) 一种人y染色体微缺失检测试剂盒及其应用
CN101215604B (zh) 一种检测人乳腺球蛋白mRNA表达量的试剂盒及其应用
CN111411152A (zh) 人源环状rna在制备心脏疾病相关产品中的应用
CN102344970B (zh) 同时检测人cmv和bk病毒dna的引物序列及定量检测试剂盒
CN105255865A (zh) Tyms基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
CN105177156A (zh) 人egfr基因突变检测试剂盒及其应用
CN116790760B (zh) 结肠癌特异性环状rna标记物及其检测引物与应用
JP7357063B2 (ja) ニューモシスチス・イロベチイ検出用プライマー対、これを用いたニューモシスチス・イロベチイの検出方法及びそのための試薬キット
CN117385083A (zh) 用于检测三唑类药物耐药烟曲霉的组合物、方法及应用
CN102002524B (zh) 一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法
CN101671728A (zh) 一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒
CN117248017A (zh) 人nras基因突变检测试剂盒及其应用
CN105483209A (zh) 循环癌细胞的kras致癌基因检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: SANGTEC MEDICAL AB

FG Patent granted

Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB

MA Patent expired