HU201808B - Process for determining the amount of gene amplification and/or determining the number of nuclein acid molecules and reagent set for carrying out the pocess - Google Patents
Process for determining the amount of gene amplification and/or determining the number of nuclein acid molecules and reagent set for carrying out the pocess Download PDFInfo
- Publication number
- HU201808B HU201808B HU87750A HU75087A HU201808B HU 201808 B HU201808 B HU 201808B HU 87750 A HU87750 A HU 87750A HU 75087 A HU75087 A HU 75087A HU 201808 B HU201808 B HU 201808B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- fragment
- gene
- hindiii
- probe
- subcloned
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás bizonyos nukleinsav molekulák mennyiségének, főként a génmegsokszorozódás és/vagy a megfelelő hírvivő RNS molekulák felszaporodása mértékének a szendvicsmódszer vagy az oldatos hibridizáció alkalmazása 5 útján történő meghatározására. Az alkalmazott reagens-készlet is a találmány tárgyához tartozik.
Egy adott genomon belül az egyes gének kópiaszáma rendszerint állandó. Bizonyos esetekben egy haploid genom csak egy, máskor több gént tártál- 10 máz. Bizonyos körülmények között a kópiaszám változhat. Génamplifikációs eseteket például rák kialakulása során észleltek. Ismeretes, hogy génamplifikáció külső tényezők (gyógyszerek, fémek) hatására is előfordulhat. A betegség kialakulásában 15 a hibás vagy fokozott gén-kifejeződés, például az onkogén fokozott termelődése, azaz a hírvivő RNS mennyisége a sejtben, fontos szerepet játszhat.
Egyes örökletes betegségek és zavarok oka bizonyos kromoszómák számának megnövekedése, 20 más örökletes betesgégek egyetlen recesszív gén megduplázódásával járnak együtt. Minden ilyen esetben fontos a jelenlevő kromoszómák vagy gének számának meghatározása.
Egyes DNS-molekulák számát, például adott gé- 25 nek amplifikációjának mértékét jelenleg a tanulmányozni kívánt extrahált DNS emésztésével úgy határozzák meg, hogy az emésztést restrikciós enzimekkel végzik és a kapott nukleotid-fragmenseket azok hossza szerint agarózgél-elektroforézissel 30 elválasztják. Ezután az egyszálú DNS-t nitrocellulóz szűrőre itatják át és rögzítik, ahol is a tanulmányozni kívánt génnel vagy génrészlettel, mint szondával, hibridizáció játszódik le és az eredményt autoradiográfíás módszerrel értékelik [Southern: J. 35
Mól. Bioi. 98, 503-517 (1975)]. Az egyes parallel elemzéseknél a sejtes DNS mennyisége azonos.
A hibridizációs sávok, azaz ezek jelzései intenzitását összehasonlító módszerrel vizsgálják és a vizsgált mintákban levő gének kópiaszámát visszakö- 40 vetkeztetéssel állapítják meg. A módszerrel csak közelítő eredményt kapnak. Hasonlóképpen az RNS mennyiségét itatóspapíron hibridizálással (úgynevezett Northern-, vagy dot-blottin módszerrel) értékelik; ezeknek a módszereknek a pontos- 45 sága azonban nem kielégítő [Thomas: Methods in Enzymol., 100,255-266 (1983)].
Az ismert Southern-féle eljárás és a Northemhibridizálás itatóspapíron (northern blotting) azonban lassú és nehézkes módszerek. Tekintve, 50 hogy csak közelítő pontosságú eredményt adnak, diagnosztikai értékűk minden olyan esetben kétséges, ha egy adott egységen, például egy sejten belül egy adott nuklainsav-molekula pontos számát kívánjuk meghatározni. 55
A 4 486 539 számú amerikai egyesült államokbeli és a 2 169 403 számú nagy-britanniai szabadalmi lírásokban ismertetett szendvics- vagy oldószeres hibridizációs módszerek kvantitatívak annyiban, hogy lehetővé teszik a vizsgált nukleinsavak mintán- 60 kénti mennyiségének meghatározását [Virtanen és munkatársai: Láncét 1, 381-383 (1983)], nem mutatják azonban a mintában levő sejtek számát, és így nem megfelelőek az amplifikáció mértékének meghatározására. A jelen találmány szerinti eljáráshoz 65 ezért az ilyen módszeren túlmenően állandó kópiaszám standard nukleinsav is szükséges, hogy egy adott egységen (például sejten, sejtmagon, riboszómán vagy kromoszómán) belül a releváns nukleinsavmolekulák számát meg lehessen határozni.
A jelen találmány célja gyors és pontos kvantitatív módszer kidolgozása nukleinsavmolekulák számának meghatározására, amely módszer gyorsabb és egyszerűbben végrehajtható a jelenleg használatosnál. Az eljárást rákos megbetegedések, születés előtti állapotok diagnosztizálására, génamplifikáci6t okozó ágensek kimutatására, gyógyszer-rezisztencia kialakulásának megállapítására és a hírvivő RNS (messenger RNA) expressziós szintjének meghatározására használhatjuk.
A jelen találmány szerinti eljárás legalább két meghatározást tesz szükségessé. Az egyik a teszt nukleinsav meghatározása, amely nukleinsavmolekula nagy kópiaszámban lehet jelen. A másik a standard nukleinsav meghatározása, amely konstitutív nukleinsavmolekula előnyösen konstans számban van jelen. A leírásban a „nukleinsavmolekula” kifejezést 10-12 nukleotidból álló nukleotidszekvenciák, néhány ezer nukleotidot tartalmazó gének, a hírvivő RNS, vagy az egy génnél hosszabb nukleotid szekvenciák (azaz egy amplikon) megjelölésére használjuk.
A teszt- és standard nukleinsavak meghatározását az egyébként ismert szendvics hibridizációs módszerek valamelyikével (például a 4486 539 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi lírás szerint) vagy a 2 169 403 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett oldószeres hibridizációs módszerrel végezhetjük. A legalább egy standrad szonda-párt és legalább egy teszt szondaoárt tartalmazó nukleinsav-reagenssel működő reagens-készletek (kit-ek) is a találmány tárgyához tartoznak.
Az eljárásban használt reagenseket és szondákat a teszt-, illetve standard nukleinsavakkal kellő homológiát mutató nukleinsavakból rekombináns DNS-echnikával állíthatjuk elő. A megfelelően homológ nukleinsavakat szintetikusan vagy félszintetikusan is előállíthatjuk.
A teszt és srandard nukleinsavakat közvetlenül sejtekből izolálhatjuk és különböző hibridizációs módszerekkel azonosíthatjuk. Ilyen teszt és srandard nukleinsavak egyébként már forgalomban is vannak és gén-bankokban is hozzáférhetők. A teszt és standard nukleinsavak akár DNS, akár RNS-jellegűek lehetnek.
A szendvics- vagy oldószeres hibridizációhoz alkalmazható szonda-párokat rekombináns DNStechnikával álhtjuk elő a teszt- és standard nukleinsavakkal megfelelő homogenitást mutató nukleinsavakból. A releváns nukelinsavakat megfelelő restrikciós enzimekkel emésztjük; a kapott, egymáshoz közel levő restrikciós fragmentumokból legalább kettőt klónozunk legalább két alkalmas vektorral. A fragmentumok közül az egyiket (a jelző szondát) alkalmas jelzőaanyaggal jelöljük, a másikat (a befogó szondát) pedig vagy alkalmas hordozón fixáljuk, vagy egy olyan anyaghoz kapcsoljuk, amely lehetővé teszi, hogy a hibridizációs elegyből a kapott hibridet egy másik anyag, péládul az affi-2HU 201808 Β nitás-pár komplementer komponense segítségével el lehessen különíteni.
A teszt és a srandard szonda-párból alkalmas reagens-készlet készíthető; ebben mind a teszt, mind a standard szonda-pár lehet DNS, vagy lehet mindkettő RNS, de lehet a teszt szonda-pár DNS és a standard szonda-pár RNS vagy fordítva. Ebből következik, hogy a hibridizációt megelőző, illetve a hibridizálás alatti körülményeket a tesztben használt szonda-pároknak megfelelően kell megválasztani.
A jelen találmány szerinti eljárás főként sejtes homogenizátumokból származó nukleinsav-molekulák számának közvetlen meghatározására alkalmas, de természetesen tisztított vagy tiszta nukleinsavak meghatározására is használható. Mielőtt azonban a találmány szerinti eljárást alkalmaznánk, megfelelő előkezelési módot kell az adott nukleinsav-mintához kiválasztani.
A találmány szerinti eljárással mind a DNS, mind az RNS meghatározása lefolytatható. Szükség esetén a dezoxi-ribonukleinsavakat egyszálúvá denaturáljuk. A hibridizációs tesztet az egyszálú hírvivő RNS-molekulák esetleg zavarhatják; ezeket például alkálikus közegben történő forralással elhidrolizálhatjuk. Ribonukleinsav meghatározásakor viszont a mintát nem kell denaturálni, mert a duplaszálú DNS nem zavarja az RNS meghatározást. Természetesen a DNS dezoxi-ribonukleázzal feldarabolható, vagy vegyi, vagy mechanikus úton úgy módosítható, hog a hibridizációban ne vegyen részt. Tehát a DNS és RNS meghatározásnál adott esetben egy további lépést kell beiktatni vagy elhagyni. Ennek az esetleges lépésnek a megválasztásánál azonban figyelembe kell venni, hogy a nukleinsav minta előkezelése hogyan történt. A szakirodalom számos előkezelési módot és olyan esetleges további kezelési lépést ismertet, amelyek alapján a legalkalmasabb módszer kiválasztható.
Ha mind a teszt és mind á standard nukleinsavak DNS-, illetve RNS-típusúak. akkor a meghatározás egyetlen osztatlan mintából végezhető el. Ha a teszt-nukleínsavak DNS-, és a standard nukleinsavak RNS-jellegűek, vagy fordítva, akkor a meghatározást osztott mintában kell végezni, mert bizonyos kezelési lépések különbözők. Természetesen a minta akkor is osztható, ha mind a teszt- és mind a standard nukleinsavak azonos típusúak.
A hibridizációt úgy hajtjuk végre, hogy az osztatlan minta oldatát legalább egy teszt szonda-párral és legalább egy standard szonda-párral egyidejűleg hozzuk érintkezőbe. Ha a minta oldatát elosztjuk, akkor az egyik oldat-részletet legalább egy teszt szonda-párral, a másik oldat-részletet legalább egy standard szonda-párral külön-külön hozzuk érintkezőbe. Az utóbbi esetben a teszt-nukleinsavat az egyik, a standard-nukleinsavat a másik reakcióedénybe határozzuk meg kvantitative.
Függetlenül attól, hogy osztott mintával dolgozunk-e vagy sem, a hibridizációt mindig a legelőnyösebb körülmények között folytatjuk le. A reakció lejátszódása után a hibridizációs elegyből a kapott teszt- és standard hibrideket valamely hordozó segítségével szétválasztjuk és mossuk, vagy az elegyből a hibrideket az affinitás-pár komplemen4 tér tagjával párosítva izoláljuk. A teszt és standard hibrid jelzőanyag tartalmát megmérjük és az eredményt a standard próbákkal felvett görbéről leolvassuk. Ily módon egy adott egységben a tanulmányozni kívánt nukleinsavak száma meghatározható.
A fentiek alapján a találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy
a) a mintában jelenlevő nukleinsavakat adott esetben hibridizációs reakcióba vihető formába hozzuk, és adott esetben a nukleinsavakat, amelyek a hibridizációs reakciót zavarhatják, olyan formában hozzuk, hogy a hibridizációs tesztben az ezekkel való interferencia kizárt legyen,
b) osztatlan vagy adott esetben osztott mintában legalább egy olyan - szendvics- vagy oldatos hibridizációra alkalmas - teszt-szondapárral hozzuk érintkezésbe, amelynek nukleinsayjai eléggé homológok a mintában várhatólag nagy kópiaszámban jelenlevő nukleinsawal, érintkeztetjük továbbá legalább egy olyan, szendvics vagy oldatos hibridizációhoz alkalmasan megválasztott standard szondapárral, amelynek nukleinsayjai eléggé homológok a mintában konstans számban jelenlevő nukleinsav molekulákkal,
c) a hibridizációs reakció(k) lezajlása után a teszt-hibridet és a standard hibridet elválasztjuk és adott esetben a jelzőanyag mennyiségét megmérjük, majd az adott egységben levő nukleinsav molekulák számát a teszt nukleinsavak és a standard nukleinsavak számának összehasonlítása útján meghatározzuk.
A találmány szerinti eljárás főként a rák bizonyos típusainak kimutatására diagnosztikai értékű, így például a kissejtes tüdőkarcinóma gyakran a c-myc gén amplifikációjával jár együtt, azaz ennek a génnek a megnyilvánulási szintje magasabb, mint normális szövetek esetében. Neuroblasztomás eseteknél az N-myc gén amplifikációja mérhető.
A találmány szerinti eljárás bizonyos szerek mutagén vagy karcinogén hatásának kimutatására, valamint gyógyszerrezisztencia kifejlődésének detektálására is alkalmas. Ismeretes például, hogy a külső beavatkozással kiváltott szelekció bizonyos gének fokozott kifejeződését eredményezi. Rák kezelésekor az adott gyógyszerrel szemben rezisztencia expressziós terméke a gyógyszert inaktiválja. Ilyen például a methotrexate, amely a dihidrofolát-reduktázért felelős gén amplifikációját idézi elő. A génamplifikáció egy másik ismert példája a metallotioninért felelős gén amplifikációja kadmium hatására.
A génexpresszió mértéke a sejtműködés és afenotípus szempontjából jelentős és oly módon vizsgálható, hogy a hírvivő RNS mennyiségét mérjük, amely érték korrelációban van az általa kódol fehérje mennyiségével.
Egy adott onkogén expressziós szintje a sejt típusától és differenciálódásának mértékétől, valamint a sejt fejlődési fázisától függően változhat. így például a c-myc onkogén az embrionális fejlődés bizonyos szakaszában gyorsa, egy másik fejlődési stádiumban lassan másolódik. Az amplifikáció mértéke gyakran korrelációban van e gén exp3
-3HU 201808 Β ressziós szintjével, bár az utóbbi szignifikánsan fokozódhat, anélkül, hogy az amplifikáció változna. Ilyen esetben az onkogén szerepét helyesebb az expressziós szint, mint a kópaszám alapján meghatározni. Bizonyos esetekben egyszerűbb az mRNS, mint a géntermék kvantitatív meghatározása. Erre példa a c-myc onkogén, amely egy labilis, hő hatására könnyen koaguláló protein.
A találmány szerinti eljárással kromoszómaszám rendellenességek, így például a Down-kór is azonosítható. A születés előtti diagnosztizálására példa, hogy kimutatható az olyan magzati defektus, amikor a magzat valamely recesszív génre homozigóta.
A találmány szerinti eljárás és az eljárásban alkalmazott nukleinsav reagenseket közelebbről a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk.
1. példa
Onkogén amplifikációjának meghatározása
a) Nukleinsavreagensek és ezek előállítása Standard szondák
Sejt-standard nukleinsav
A c-Ki-rasI gén minden emberi sejtben előfordul. A szendvics hibridizációhoz szükséges szondapárokat a c-Ki-rasI gén 3,8 kilobázis hosszúságú HindlII fragmensének szukbklónozásával állítottuk elő. A vonatkozó restrikciós térképet Chang és munkatársai [PNAS 48484-4852 (1982)] írták le. A fragmense pBR322 plazmidba klónozva például az ATCC-tól kérhető ki (ATCC 41032).
A sejt-standard nukleinsav további kezelése
A fenti leírt pBR 322 kiónt BglII és HindlII restrikciós enzimekkel kezeljük és a kapott fragmenseket agarózgélről izoláljuk. Két, egymáshoz közel elhelyezkedő fragmenst két alkalmas vektorba klónoztunk a detektor-szondák és a befogó szondák előállítása céljából.
Standard detektor szonda
Egy körülbelül 1,1 kilobázis hosszúságú BglIIBglII-fragmenst pBR 322 plazmidba klónoztunk a BamHI restrikciós enzimmel hasítható klónozó helyen és nick-transzlációval 125I-jelzett dCTP-vel (dezoxicitidinfoszfát) jelöltük.
Standard befogó szonda
Egy körülbelül 0,5 kilobázis hosszúságú BglIIHindlII fragmenst az M13 mplO és mpll fág-vektorokba a BamHI és HindlII enzimekkel hasítható helyek közé klónozunk, és a kapott objektumot nitrocellulóz filteren rögzítjük (150 ng DNS/1 cm átmérő).
Teszt szondák
Teszt nukleinsav
A szendvics hibridizációhoz szükséges valamely szonda-párt egy klónozott c-myc génből állítottuk elő. Ezt a gént például az ATCC-től lehet kikérni (ATCC 41010) és a gén restrikciós térképét Watt és munkatársai [PNAS 80,6307-6311 (1983)] írták le.
A teszt nukleinsav további kezelése
A c-myc gént HindlII, Xbal és PstI restrikciós enzimekkel kezeljük, a fragmenseket agarózgélről izoláljuk, tisztítjuk és alkalmas vektorokba klónozzuk detektor- és befogó-szondák előállítása céljából.
Teszt detektor szonda
A c-myc gén HindlII-Xbal enzimekkel előállított 3,7 kilobázis hosszúságú restrikciós fragmensnek egyszálú végeit DNS-polimerázzal kettős szálúvá alakítjuk. A kapott, ragadós végeket nem tartalmazó DNS-fragmensekbe T4 fág-DNS-ligáz segítségével HindlII linkereket építünk be; a DNS-t fenolos extrakció után HindlII restrikciós enzimmel kezeljük. A kapott DNS-fragmenst pBR 322 plazmidba klónozzuk a HndlII restrikciós enzimmel hasítható helyen, majd nick-transzlációval 1Z5Ijelzett dCTP-vei jelöljük.
Teszt befogó szonda
A c-myc gén 1,1 kilobázis hosszúságú Xbal-PstI fragmensét az M13 mplO és mpll fág klórnozó vektorokba klónozzuk az Xbal és PstI restrikciós enzimekkel hasítható hasító helyek közé, és a kapott szondát nitrocellulóz szűrőn rögzítjük (150 ng DNS/1 cm átmérő).
b) A standard görbe meghatározása
A standard görbét a c-myc gén alkálikusan denaturált pBR 322 kiónját tartalmazó minta segítségével vettük fel. A szendvics hibridizációs oldathoz hozzáadtuk a fenti teszt szondákat, s ezen kívül 4 x SSC, 1 x Denhardt oldat, 200 μg/ml hering sperma eredetű DNS és 0,2% nátrium-dodecil-szulfát volt az oldatban. A hibridizáció 65 °C-on 17-19 órát vett igénybe, ezután a szűrőket mosóoldattal (0,1 x SSC és 0,2% nátrium-dodecil-szulfát) 50 °C-on mostuk. A szendvics-hibridekbe beépült jelzőanyag mennyiségét gamma-számlálóval határoztuk meg. Az eredményt a következő 1. táblázat mutatja.
1. táblázat
A mintából származó beütésszám molekulák száma/teszt c-myc-filter
40
106 75
5xl06 190
107 340
108 2200
c) A gének számának meghatározása A minták egyrésze humán placentasejteket, más része C010 320 sejteket tartalmazott. Az utóbbiak például az ATCC-től kérhetők ki (ATCCCCC220). Mindkét mintából DNS-t izoláltunk, és az egyes tesztekben alkalikus forralással denturált azonos mennyiségű sejtes DNS-t alkalmaztunk. Az alkalikus denaturálás során a mintában levő RNS teljes mennyisége elhidrolizál.
Az egyes mintákhoz c-myc és c-Ki-rasI filtert,
-4HU 201808 Β valamint két jelzett reagent adunk, amelyek lehetővé teszik mind a standard-, mind a teszt-DNS meghatározását a mintákban. A tesztekben c-Ki-rasI meghatározás alapján minden esetben azonos mennyiségű DNS-t találtunk: ennek alapján a C010 320 sejtekben a c-myc gén 16-20-szoros kópiaszámban volt jelen a normális sejtekben levő génmennyiséghez képest. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja.
2. táblázat
A minta c-Ki-rasI filter c-myc filter beütésszáma* beütésszáma* és gének száma
Emberi placenta sejtek 486 340 107
Colo
320 sejtek 432 3205 l,6xl08 * A vakpróba beütésszámának levonásával kapott beütésszám
2. példa
Génamplifikáció meghatározása
a) Nukleinsavreagensek és ezek előállítása Standard szondák
Sejt-standard nukleinsav A kontroll nukleinsavat égés metallotionin gén (MT-gén) promoter szakaszából és az attól az 5’vég irányába eső (upstream) DNS-ből vettük. Az MT-gén szerkezetét Pavlakis és Hamer ismertette [PNAS 80,397-401 (1983)]. A referencia nukleinsav-fragmens pBPV-MMTneo432-12 vektorba klónozottan (ATCC 37224) hozzáférhető az ATCC-nél.
A sejt-standard nukleinsav további kezelése A fent ismertetett MT-gént Kpnl, BglII és EcoRl restrikciós enzimekkel kezeljük pAT153 plazmidba történő szukbklónozás djából. A Kpnl hasítási véget egy linkerrel Hindin véggé alakítjuk.
Standard detektor szonda AzEcoRI-KpnI-(HindIII) fragmenst, amely körülbelül l,2kilobázis hosszúságú és a metallotionin gén promoter szakaszától az 5’-vég irányában (upstream) helyezkedik el, pAT153 plazmidba klónozzuk az EcoRl és Hindin restrikciós enzimek hasítási helyei közé, majd nick-transzlációval 32Pjelzett nukleozid trifoszfáttal jelöltük.
Standard befogó szonda A Kpnl-BglII fragmenst, amely 0,8 kilobázis hosszúságú és a metallotionin gén promoter szakaszát és az attól 5*-vég felé eső részt tartalmazza, M13 és mpl8 és M13 mp 19 fág vektorokban klónozzuk a Kpnl és BamHI restrikciós enzimek hasítási helyei közé, majd nitrocellulóz filteren fixáljuk.
Teszt szondák Teszt nukleinsav
A szendvics hibridizációs módszerekhez szüksé8 ges szonda-párt a kereskedelmi forgalomban levő pMTVdhfr plazmid (Bethesda Research Laboratories, termékszám: 5369SS) felhasználásával állítjuk elő, amelynek szerkezetét Lee és munkatársai írták le [natúré, 294,228-232 (1981)].
A teszt nukleinsav további kezelése
A dihidrofolát-reduktáz (DHFR) gén cDNS-ét tartalmazó pMTVdhfr plazmidot HindlII és BglII restrikciós enzimekkel kezeljük.
Teszt detektor szonda
A HmdlII-BglII restrikciós fragmenst, amely 0,75 kilobázis hosszúságú és a pMTVdhfr plazmid DHFR génjét kódoló szakasznak felel meg, a pAT153 plazmid vektorba építjük be a Hindin és BamHI restrikciós enzimek hasítási helyei közé, majd nick-transzlációval 32P-jelzett nukleozid-trifoszfáttal jelöljük.
Teszt befogó szonda
A pMTVdhfr plazmid MMTV génnek megfelelő részéből származó és 1,4 kilobázis hosszúságú HindlII fragmenst M13 mpl8 és M13 mpl9 fágvektorokba klónozzuk.
b) A standard görbe meghatározása
A tesztben használt minta egy, a pMTVdhfr plazmidból tisztítással kinyert DNS volt. Magát a tesztet az l.b) példában leírt módon folytatjuk le, azzal az eltéréssel, hogy folyadék szcintillációs számlálót alkalmaztuk. A kapott standard görbe adatait a következő 3. táblázat összegezi.
3. táblázat
A mintából származó beütésszám molekulák száma/teszt DHFR filter
17
106 45
3xl06 79
107 _ _ 210
c) A gének számának meghatározása A DHFR gén mRNS-ének megfelelő cDNS különböző mennyiségei hatására transzfekción átesett sejtvonalakat sejttenyésztő tálcán növesztünk. Nátrium-dodecil-szulfáttal sejtlizist idézünk elő és a sejt-DNS-t vékony injekciós tűn való átpréseléssel vágjuk el. A homogenizátumból körülbelül 10° sejtnek megfelelő koncentrációjú 250 μΐ-es mintát veszünk és 50 μΐ nátrium-hidroxidot adunk hozzá. A mintát felforraljuk, majd ecetsavval és a hibridizációs eleggyel neutralizáljuk. Az össztérfogat 0,5 ml lett, amelyhez az összes fent leírt szondát egyidejűleg hozzáadjuk. Úgynevezett vak-filtert alkalmaztunk háttér-kontrollként. A hibridizációt, mosást és a jelzőanyag számlálását az l.b. példában leírt módon végeztük, azzal az eltéréssel, hogy folyadék szcintillációs számlálót használtunk. Az eredményeket a 4. táblázat mutatja.
-5HU 201808 Β
4. táblázat
| Alkalmazott | MT | A sejtek | DHFR | ||
| sejt | beütés | száma a | beütés- | molekulaszám a | kópia |
| szám* | mintáhan | szám* | mintában | szám |
| Kontroli-sejt | |||||
| (DHFR-CDNS nélkül) | 182 | 1,05 xlO6 | 21 | 106 | |
| I. sejtvonal | 138 | 0,9 xlO6 | 80 | 3 xlO6 | 3 |
| II. sejtvonal | 210 | 1,25 xlO6 | 732 | 5xl07 | 40 |
x A vak-filter leolvasási értékének levonása után kapott beütésszám.
Az alkalmazott MT gén egy belső marker, amely a mintákban jelen levő sejtek számának mércéjét. Az eredményekből látható, hogy ebben a tesztben a 106 sejt MT-specifikus beütésszáma 165 + 20. A DHFR reagens méri a DHFR-cDNS mennyiségét. A sejtek számát az MT-specifikus szignál kivonásával állapítottuk meg. Mint a 4. táblázat mutatja, lehetővé vált a DHFR-cDNS kópiaszámának különböző sejtvonalakban történő meghatározása.
3. példa
A hírvivő RNS mennyiségének kvantitatív meghatározása
a) Nukleinsavreagensek és ezek előállítása
A 2. példában ismertetett teszt-szondák alkalmazásával a DHFR-cDNS eredetű hírvivő RNS mennyisége is meghatározható. A pMTVdhfr plazmid szerkezete olyan, hogy a DHFR gén átíródása az NMTV promoternél kezdődik. A kapott messengerek körülbelül 1,0 kilobázis hosszúságúak, s ebből körülbelül 0,25 kilobázis hosszúságú szakasz az MMTV promoter-részéből, a többi pedig a DHR-cDNS-ből származik [Lee és munkatársai: Natúré, 294,228-232 (1981)].
Standard szondák
A sejt-standard nukleinsav, a standard detektor és standard befogó szonda ugyanaz, mint amelyeket a 2. példában leírtunk.
Teszt szondák
A teszt nukleinsav, a teszt detektor és teszt befogó szonda azonos a 2. példában leírttal.
b) A standard görbe meghatározása
A standard görbe felvételénél alkalmazott minta in vitro transzkripció útján keletkezett dihidrofolát-reduktáz génnek megfelelő hírvivő RNS. A transzkripcióhoz szükséges DNS-t úgy állítottuk elő, hogy a pMTVdhfr plazmid MMTV promoterének HindlII fragmensét - amely 1,4 kilobázis hosszúságú - és a DHFR-cDNS HindlII-BgUII fragmensét - amely 0,75 kilobázis hosszúságú egymás mellé pSP64 plazmidba (Promega Biotec) klónoztuk a HindlII és BamHI restrikciós enzimek hasítási helyei közé. Az RNS mintát 0,2%-os vizes nátrium-dodecil-szulfát oldatban tároltuk.
A szendvics hibridizációs tesztet az l.b. és 2.b.
példák szerint folytattuk le, azzal az eltéréssel, hogy a denaturálási műveletet elhagytuk. A görbe adatait az 5. táblázat mutatja.
5. táblázat
A mintából származó molekulák beütésszám száma/teszt DHFR filter
0 20 x 106 65
107 130
5xl07 390
108 _653
c) A hírvivő RNS molekulák számának meghatározása
A DHFR-génnek megfelelő mRNS molekulák számát a 2. példa szerinti sejtvonalak felhasználásával határoztuk meg.
A sejtlizist nátrium-dodecil-szulfáttal idézzük elő, majd a DNS-t vékony injekcióstűn való átpré45 seléssel daraboljuk fel. A homogenizátumból 250 μΐ mintát veszünk, amely körülbelül 5 x 106 sejtnek felel meg, majd a homogenizátumot denaturálás nélkül hozzáadjuk a szendvics hibridizációs elegyhez. A szendvics hibridizációt a 2.c. és l.b.
példa szerint folytatjuk le, azzal az eltéréssel, hogy csak a DHFR-szondákat adjuk hozzá a hibridizációs elegyhez. Egy párhuzaos kísérletben a 250 μΐ homogenizátumból álló mintában a sejtek számát MT-szonda alkalmazásával a 2.c. példában ismer55 tetett módon határozzuk meg. Az eredményeket a
6. táblázat mutatja.
-6HU 201808 Β
6.táblázat
| Alkalmazott sejt | MT beütésszám* | A sejtek száma a mintában | beütésszám* | DHFR a molekulák száma a mintában | mRNS/- /sejt |
| Lsejtvonal | 380 | 3,5x10® | 1465 | 3,45 x 108 2x10* | 100 |
| ILsejtvonal | 430 | 4,2x10° | 4800 | 500 |
* A vakfilterre leolvasott értéket levonva kapott beütésszám.
Az eredményekből látható, hogy az I. sejtvonal sejtenként körülbelül 100 molekula mRNS-t (DHFR-géneredetü), a II. sejtvonal pedig sejtenként körülbelül 500 molekula mRNS-t (DHFR-géneredetű) termelt.
4. példa
Oldatos hibridizációkor bekövetkező génamplifikáció meghatározása
a) Nukleinsav reagensek és előállításuk
Standard szondák
Az alkalmazott sejt-standard nukleinsav, standard detektor- és standard befogó-szonda azonos a 2. példában leírttal. A pAT153 plazmidba beépített 1,2 kilobázís hosszúságú EcoRI-KpnI-(HindIII) fragmenst 125I-jelzett dezoxi-citidinnel nicktranszlációs próbával jelöljük. Az M13 mpl8 és M13 mpl9 fág-vektorokba beépített 0,8 kilobázis hosszúságú KpnI-BglII fragmenseket PhotoprobeR reagens (Vector Laboratories, CA, USA, termékszám: SP-1000) segítségével biotinnal modifikáljuk.
Teszt szondák
Az alkalmazott teszt nukleinsav, a teszt detektor- és teszt befogó-szonda azonos a 2. példában leírttal. A pAT153 plazmidba beépített 0,75 kilobázis hosszúságú HindlII-BglII fragmenst I25I-jelzett dezoxi-citidinnel jelöljük. Az M13 mpl8 és M13 mpl9 fág-vektorokba beépített 1,4 kilobázis hosszúságú fragmenseket a fent ismertetett PhotoprobeR reagens alkalmazásával biotinezzük.
b) A standard görbék meghatározása A sejt-standard görbét a sejtek ismert mennyiségeinek alkalmazásával vettük fel oly módon, hogy az MT-gént felismerő standard szondák segítségével mértük a hibridizációs elegyben mérhető szignált. A teszt nukleinsav standard görbét pMTVdhfr plazmid, valamint az ezt a plazmidot felismerő teszt-szondák segítségével határoztuk meg. A hibridizációs kísérleteket 0,6 mól nátrium-kloridot, 20 mmól foszfát-puffért (pH 7,5), 1 mmól etiléndiamin-tetraecetsavat és 4% polietilén-glikolt (PEG 6000) tartalmazó 200 μΐ térfogatú oldatban, 70 ’C hőmérsékelten, 1,5 óra alatt folytattuk le. A hibridizáció lejátszódása után az elegyhez 50 μΐ sztreptavidin-agarózt (Bethesda Research Laboratories, USA, termékszám: 5942SA) és 1 mól nátrium-kloridot, 10 mmól nátrium-foszfátot (pH 7,5) és 1 mmól etiléndiamin-tetraecetsavat tartalmazó oldatot adunk 500 μΐ végtérfogat eléréséig. A hibrideket sztreptavidin-agarózon 37 °C-on, 15 percig fixáljuk, majd az agarózt 5 percig 37 ’C-on pufferolt mólos nátrium-ldoriddal, máj d kétszer 2-2 percig pufferolt 1 mólos nátrium-kloridot tartalmazó 1,5 mmólos nátrium-citráttal mossuk. Az agarózon megkötött hibridek mennyiségét gamma-számláló segítségével határozzuk meg [Syvánen és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 14., 5037-5048. (1986)]. Az eredményeket a 7. és 8. táblázat mutatja.
7. táblázat
A mintában levő sejtek beütésszám száma/teszt MT-szonda esetén
| 0,8 xlO6 | 162 | |
| 1,6 x 10® | 216 | |
| 3x10® | 298 | |
| 8. táblázat | ||
| A mintában levő sejtek | beütésszám | |
| száma/teszt | DHFR-szonda esetén | |
| 106 | 148 | |
| 5x10® | 394 | |
| 5 xlO7 | 2240 |
A gének számának meghatározása A 2. példa szerinti sejtvonalakat az ott leírtakkal analóg módon kezeljük, azzal a különbséggel, hogy a körülbelül 2 x 10° sejtet tartalmazó minta térfo50 gata: H125 μΐ volt. A sejtek számát és a teszt-nukleinsavak számát külön üvegcsében határoztuk meg, úgy hogy a sejt minta, a megfelelő detektor szonda, a befogó szonda és a hibridizációs elegy komponenseinek hozzáadása után a végtérfogat
200 μΐ volt. Kontroll kísérleteket is végeztünk, amelykeben sejt-standard-, illetve teszt-DNS-t nem alkalmaztunk. A hibridizációt, a hibridek rögzítését, a mosást és mérést a 4.b. példában leírt módon végeztük. Az eredményeket a standard görbékről olvastuk le, amelyeket a 4.b. példában ismertetett módon parallelben vettünk fel. Az eredményeket a 9. táblázat mutatja.
-7HU 201808 Β
9. táblázat
| Sejt | MT beütésszám* | A sejtek száma a mintában | beütésszám* | DHFR a molekulák száma a mintában | kópiaszám |
| Kontroll sejt | 253 | 2,3 xlO6 | 73 | 105 | — |
| Lsejtvonal | 210 | 1,5x10° | 233 | 3,8 xlO6 | 3 |
| n.sejtvonal | 237 | 2,1 xlO6 | 3059 | 8,8 xlO7 | 42 |
x A sejt-standard-, illetve teszt-nukleinsav nélkül készült kontroll kísérletek értékeinek levonása után kapott beütésszám
Claims (12)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának szendvics- vagy oldatos hibridizáció útján történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy adott egységen belül a nukleinsav molekulák számát az ebben az egységben 20 várhatólag nagy kópiaszámban jelenlevő teszt-nukleinsav molekulák számának az ugyanezen egységen belül előnyösen konstans számban jelenlevő, megfelelően megválasztott standard nukleinsav molekulák számával történő összehasonlítása útján 25 határozzuk meg, olyan módon, hogya) a mintában jelenlevő nukleinsavat adott esetben hibridizációs reakcióba vihető formában hozzuk és adott esetben azokat a nukleinsavakat, amelyek 30 a hibridizációs reakciót zavarhatják, olyan formába hozzuk, hogy a hibridizációs tesztben az ezekkel való interferencia kizárt legyen,b) osztatlan vagy adott esetben osztott mintában legalább egy olyan - szendvics- vagy oldatos hibri- 35 dizációra alkalmas - teszt-szondapárral hozzuk érintkezésbe, amelynek nukleinsavjai eléggé homológok a mintában várhatólag nagy kópiaszámban jelenlevő nukleinsawal, érintkeztetjük továbbá legalább egy olyan, szendvics- vagy oldatos hibrdizáci- 40 óhoz alkalmasan megválasztott standard szondapárral, amelynek nukleinsavjai eléggé homológok a mintában konstans számban jelenlevő mnukleinsav molekulákkal, ésc) a hibridizációs reakció(k) lezajlása után a 45 teszt-hibridet és a standard hibridet elválasztjuk, izoláljuk és adott esetben a jelzőanyag mennyiségét megmérjük, majd az adott egységben levő nukleinsav molekulák számát a teszt nukleinsavak és a standard nukleinsavak számának összehasonlítása 50 útján meghatározzuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy teszt- és standard nukleinsavként dezoxiribonukleinsavakat alkalmazunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 55 ve, hogy teszt-nukleinsavként ribonukleinsavat és standard nukleinsavként dezoxi-ribonukleinsavat alkalmazunk.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy teszt- és standard nukleinsavként ribonuk- 60 leinsavakat alkalmazunk.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy teszt-nukleinsavként dezoxi-ribonukleinsavat és standard nukleinsavként ribonukleinsavat alkalmazunk. 65
- 6. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a standard szondapár detektor szondáját - amely egy, az emberi c-Ki-rasI gén Hindin fragmentumának 1,1 kilobázis hosszúságú BglII-BglII fragmensét tartalmazó olyan rekombináns plazmid, amelyben a HindlII fragmens pBR322 plazmidba klónozottan, BglIIBglII fragmens pedig a pBR322 plazmid BamHI restrikciós enzimjére jellemző hasító helyen a pBR322-be szubklónozottan van jelen - és a befogó szondákat - amelyek az emberi c-Ki-rasI gén Hindin fragmensének 0,5 kilobázis hosszúságú BgUHindlII fragmensét tartalmazó olyan rekombináns fágok, amelyekben a HindlII fragmens pBR322 plazmidba klónozottan, a BglII-HindlII fragmens pedig az M13 mplO és M13 mpll fág vektorokba a BamHI és HindlII restrikciós enzimekre jellemző hasító helyek közé szubklónozottan van jelen -, akár egyenként, akár a teszt-szondapárral együtt, érintkezésbe hozzuk az osztatlan vagy adott esetben osztott mintákban levő nukleinsawal.
- 7. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a standard szodapár detektor szondáját - amely egy, az egér metallotionin gén promoter szakaszától az 5’-vég felé eső (upstream) részből származó, 1,2 kilobázis hosszúságú EcoRI-KpnI(HindIII) fragmenst tartalmazó olyan rekombináns plazmid, amelynek említett fragmense a pAT153-plazmidba az ÉcoRI és HindlII restrikciós enzimekre jellemző hasító helyek közé szubklónozottan van jelen -, és befogó szondáit - amelyek a metallotionon gén promoter szakaszából és az attól az 5’-vég felé (upstream) eső szakaszból származó, 0,8 kilobázis hosszúságú KpnI-BglII fragmenst tartalmazó olyan rekombináns fágok, amelyek említett fragmense az M13 mpl8 és M13 mpl9 fág vektorokba a KpnI és BamHI restrikciós enzimekkel hasítható restrikciós helyek közé szubklónozottan van jelen -, akár egyenként, akár a teszt-szondapárral együttesen, érintkezésbe hozzuk az osztatlan vagy adott esetben osztott nukleinsav-mintával.
- 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás a c-myc onkogén amplifikációja mértékének és/vagy az ennek a génnek megfelelő hírvivő RNS molekulák számának meghatározására, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben alkalmazott teszt-szondapár detektorszondája egy, a c-myc gén 3,7 kilobázis hosszúságú HindlII-Xbal fragmensét tartalmazó olyan rekombináns plazmid, amelynek említett fragmense a pBR322 plazmidba a HindlII restrikciós enzimre jellemző hasítóhelyen szubklónozva van jelen, és-8HU 201808 Β befogó szondái a c-myc gén 1,1 kilobázis hosszúságú Xbal-PstI fragmensét tartalmazó olyan rekombináns fágok, amelyekben az említett fragmens az M13 mplO és M13 mpll fágvektorokba az Xbal és PstI restrikciós enzimekre jellemző hasító helyek közé szubklónozottan van jelen, és a standard szondapár a 6. igénypont szerinti.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás a dihidrofolátreduktáz vagy DHFR gén amplifíkációja mértékének és/vagy az ennek a génnek megfelelő hírvivő RNS molekulák számának meghatározására, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben alkalmazott tesztszodapár detektor szondája egy, a pMTVdhfr plazmid DHFR génjét kódoló, 0,75 kilobázis hosszúságú Hindffl-BglII fragmenst tartalmazó olyan rekombináns plazmid, amelyben az említett fragmens a pAT153 plazmid vektorba a HindlII és BamHl restrikciós enzimekre jellemző hasító helyek közé szubklónozottan van jelen, és befogó szondái a pMTVdhfr plazmid MMTV gén szakaszában 1,4 kilobázis hosszúságú HindlII fragmensét tartalmazó olyan rekombináns fágok, amelyekben az említett fragmens az M13 mpl8 és M13 mpl9 fágvektorba a HindlII restrikciós enzimre jellemző hasító helyen szubklónozottan van jelen, és a standard szondapár a 7. igénypont szerinti.
- 10. Reagens készlet gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának meghatározáshoz, azzal jellemezve, hogy a készlet legalább egy teszt-szondapárt és legalább egy standard szondapárt tartalmaz, és mind a teszt-, mind a standard szondapár detektor szondája alkalmas jelzéssel van jelölve a befogó szondák pedig vagy alkalmas hordozón vannak rögzítve, vagy egy olyan anyag van a befogó szondákhoz kötve, amely a szendvics hibridek izolálását lehetővé teszi.
- 11. A 10. igénypont szerinti reagens készlet a c-myc onkogén amplifíkációja mértékének és/vagy az ennek a génnek megfelelő hírvivő RNS molekulák számának meghatározásához, azzal jellemezve, hogy alkalmazott teszt-szondapár detektor szondája egy olyan rekombináns plazmid a c-myc gén 3,7 kilobázis hosszúságú HindlII-Xbal restrikciós fragmensét a pBR322 plazmidba a HindlII restrikciós enzim hasítási helyén szubklónozva tartalmazza; befogó szondái olyan rekombináns fágok, amelyeka c-mycgén 1,1 kilobázis hosszúságú Xbal-PstI fragmensét az M13 mplO és M13 mpll fág vektorokba az Xbal és PstI restrikciós enzimek hasítási helyei közé szubklónozva tartalmazzák; a standard szondapár detektor-szondája a humán c-Ki-rasI gén HindlII fragmensének 1,1 kilobázis hosszúságú BglII-BgUII fragmense, ahol is a HindlII fragmens a pBR322 plazmidba klónozottan, a BglII-BglII fragmens pedig a pBR322 plazmidba a BamHl restrikciós enzimre jellemző hasítóhelyen szubklónozva van jelen; és a befogó szondák a c-Ki-rasI gén HindlII fragmensének 0,5 kilobázis hosszúságú BgHI-HindlII fragmensét tartalmazó olyan rekombináns fágok, amelyekben a HindlII fragmens a c-Ki-rasI gén pBR322 plazmidjába szubklónozotta, a BglII-HindlII fragmense pedig az M13 mplO és M13 mpll fág vektorokba a BamHl és Hindin resktrikciós enzimekre jellemző specifikus hasítóhelyek közé szubklónozottan van jelen.
- 12. A 10. igénypont szerinti reagens készlet a dihidrofolát-reduktáz vagy DHFR gén amplifikációja mértékének és/vagy az ennek a génnek megfelelő hírvivő RNS molekulák számának meghatározásához, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott tesztszondapár detektor szondája egy olyan rekombináns plazmid, amely a pMTVdhfr plazmid DHFR génjét kódoló 0,75 kilobázis hosszúságú HindlIIBglll fragmenst a pAT153 plazmid vektorba a Hindin és BamHl restrikciós enzimekre jellemző hasítási helyek közé szubklónozva tartalmazza; befogó szondái a pMTVdhfr plazmid MMTV génszakaszának 1,4 kilobázis hosszúságú HindlII fragmensét tartalmazó olyan rekombináns fágok, amelyekben a HindlII fragmens az M13 mpl8 és M13 mpl9 fág vektorokba a HindlII restrikciós enzimre specifikus hasító helyen szubklónozva van jelen; a standard szondapár detektor szondája egy olyan rekombináns plazmid, amely az egér metalloptionin gén promoter részének 5’-vége felé (upstram) eső 1,2 kilobázis hosszúságú EcoRI-Kpnl fragmenst a pAT153 plazmidba az EcoRI és HindlII restrikciós enzimekre jellemző specifikus hasító helyek közé szubklónozottan tartalmazza; és befogó szondái a metallotionin gén promoter szakaszából és az attól az 5’-vég felé (upstream) eső szakaszból kiadódó 0,8 kilobázis hosszúságú KpnI-Bgin fragmenst tartalmazó olyan rekombináns fágok, amelyekben a KpnI-BglII fragmens az M13 mpl8 és M13 mpl9 fág vektorokba a KpnI és BamHl restrikciós enzimekre jellemző hasítóhelyek közé szubklónozottan van jelen.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI860836A FI76119C (fi) | 1986-02-27 | 1986-02-27 | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT43647A HUT43647A (en) | 1987-11-30 |
| HU201808B true HU201808B (en) | 1990-12-28 |
Family
ID=8522222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU87750A HU201808B (en) | 1986-02-27 | 1987-02-26 | Process for determining the amount of gene amplification and/or determining the number of nuclein acid molecules and reagent set for carrying out the pocess |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62205800A (hu) |
| KR (1) | KR870008033A (hu) |
| AT (1) | AT393511B (hu) |
| AU (1) | AU603562B2 (hu) |
| BE (1) | BE1001168A4 (hu) |
| CA (1) | CA1287558C (hu) |
| CH (1) | CH675593A5 (hu) |
| DD (1) | DD270383A5 (hu) |
| DE (1) | DE3706285A1 (hu) |
| DK (1) | DK174784B1 (hu) |
| ES (1) | ES2061411A6 (hu) |
| FI (1) | FI76119C (hu) |
| FR (1) | FR2594849B1 (hu) |
| GB (1) | GB2187283B (hu) |
| HU (1) | HU201808B (hu) |
| IE (1) | IE66904B1 (hu) |
| IL (1) | IL81695A (hu) |
| IS (1) | IS3197A7 (hu) |
| IT (1) | IT1202581B (hu) |
| LU (1) | LU86792A1 (hu) |
| NL (1) | NL195097C (hu) |
| NO (1) | NO175380C (hu) |
| NZ (1) | NZ219421A (hu) |
| PT (1) | PT84368B (hu) |
| SE (1) | SE468816B (hu) |
| ZA (1) | ZA871401B (hu) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714380A (en) | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| EP0304845A3 (en) * | 1987-08-28 | 1991-03-06 | Profile Diagnostic Sciences Inc. | Method and kit for assaying gene expressions |
| DE68921918T2 (de) * | 1988-05-09 | 1995-09-07 | Univ Temple | Verfahren zur Voraussage der Wirksamkeit einer antineoplastichen Behandlung bei einzelnen Patienten. |
| AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| WO1990014440A1 (en) * | 1989-05-18 | 1990-11-29 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | RNA PROBE FOR DETECTING c-fes mRNA |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| DK138090D0 (da) * | 1990-06-06 | 1990-06-06 | Novo Nordisk As | Diagnostisk analysemetode |
| ATE143700T1 (de) * | 1991-09-23 | 1996-10-15 | Pfizer | Verfahren für die detektion von spezifische mrns und dns in zellen |
| US6300058B1 (en) | 1992-01-29 | 2001-10-09 | Hitachi Chemical Research Center, Inc. | Method for measuring messenger RNA |
| GB9210916D0 (en) * | 1992-05-21 | 1992-07-08 | Isis Innovation | Nucleic acid quantification |
| MX9300494A (es) * | 1992-07-28 | 1994-07-29 | Hitachi Chemical Co Ltd | Metodo para la deteccion genetica de organismos, agentes infecciosos o componentes de una celula u organismo en una muestra biologica. |
| US5580971A (en) * | 1992-07-28 | 1996-12-03 | Hitachi Chemical Company, Ltd. | Fungal detection system based on rRNA probes |
| ES2055661B1 (es) * | 1993-01-20 | 1995-03-01 | Univ Malaga | Determinacion de la expresion genica por captura especifica de arn y su cuantificacion directa por electroforesis capilar en zona libre. |
| GB9309966D0 (en) * | 1993-05-14 | 1993-06-30 | Nordion Int Inc | Detection of prostrate-specific antigen in breast tumors |
| GB9415489D0 (en) * | 1994-08-01 | 1994-09-21 | Nordion Int Inc | Detection of prostate-specific antigen in amniotic fluid |
| AT401062B (de) * | 1994-09-26 | 1996-06-25 | Immuno Ag | Verfahren zur quantifizierung von nukleinsäuren |
| WO2011122034A1 (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-06 | 有限会社山口ティー・エル・オー | 核酸クロマトグラフ法を利用した肺炎原因菌の検出方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4442203A (en) * | 1981-06-30 | 1984-04-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Gene amplification assay for detecting tumor promoters |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| AU555146B2 (en) * | 1982-03-15 | 1986-09-11 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Method for intorducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products materials |
| IE56509B1 (en) * | 1982-11-04 | 1991-08-28 | Univ California | Methods for oncogenic detection |
| FI71768C (fi) * | 1984-02-17 | 1987-02-09 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
| US4675283A (en) * | 1984-07-19 | 1987-06-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Detection and isolation of homologous, repeated and amplified nucleic acid sequences |
| FI72146C (fi) * | 1985-01-02 | 1987-04-13 | Orion Yhtymae Oy | Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror. |
| FR2583771B1 (fr) * | 1985-06-21 | 1988-12-09 | Centre Nat Rech Scient | Sequences d'adn d'archaebacteries homologues a l'oncogene v-myc, proteines codees par ces sequences, leurs procedes d'obtention et leurs applications immunologiques |
-
1986
- 1986-02-27 FI FI860836A patent/FI76119C/fi not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-02-25 JP JP62042442A patent/JPS62205800A/ja active Granted
- 1987-02-26 CH CH756/87A patent/CH675593A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 NL NL8700483A patent/NL195097C/nl not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 LU LU86792A patent/LU86792A1/fr unknown
- 1987-02-26 BE BE8700177A patent/BE1001168A4/fr not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 PT PT84368A patent/PT84368B/pt unknown
- 1987-02-26 IS IS3197A patent/IS3197A7/is unknown
- 1987-02-26 HU HU87750A patent/HU201808B/hu unknown
- 1987-02-26 DE DE19873706285 patent/DE3706285A1/de active Granted
- 1987-02-26 GB GB8704517A patent/GB2187283B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 IT IT19501/87A patent/IT1202581B/it active
- 1987-02-26 FR FR878702541A patent/FR2594849B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 ZA ZA871401A patent/ZA871401B/xx unknown
- 1987-02-26 DK DK198700993A patent/DK174784B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 AT AT431/87A patent/AT393511B/de not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 AU AU69275/87A patent/AU603562B2/en not_active Expired
- 1987-02-26 SE SE8700821A patent/SE468816B/sv not_active IP Right Cessation
- 1987-02-26 KR KR870001680A patent/KR870008033A/ko not_active Application Discontinuation
- 1987-02-26 NO NO870794A patent/NO175380C/no unknown
- 1987-02-26 NZ NZ219421A patent/NZ219421A/xx unknown
- 1987-02-26 CA CA000530691A patent/CA1287558C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-26 ES ES08700776A patent/ES2061411A6/es not_active Expired - Fee Related
- 1987-02-26 IE IE49687A patent/IE66904B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-02-27 IL IL81695A patent/IL81695A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-02-27 DD DD87300286A patent/DD270383A5/de unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU201808B (en) | Process for determining the amount of gene amplification and/or determining the number of nuclein acid molecules and reagent set for carrying out the pocess | |
| US5741677A (en) | Methods for measuring telomere length | |
| EP0726905B1 (en) | Single nucleotide polymorphisms and their use in genetic analysis | |
| US4946773A (en) | Detection of base pair mismatches using RNAase A | |
| US9868989B2 (en) | Mutation within the connexin 26 gene responsible for prelingual non-syndromic deafness and method of detection | |
| CA1339731C (en) | Multiplex genomic dna amplification for deletion detection | |
| EP0246864B2 (en) | Hybridisation probes | |
| JP3871066B2 (ja) | 正常部位抑制ハイブリダイゼーシヨンおよびその使用 | |
| CA2143428A1 (en) | Method of nucleic acid-differentiation and assay kit for nucleic acid-differentiation | |
| KR20180132603A (ko) | 클라미디아 트라코마티스 검출용 프라이머 세트 및 이것을 사용한 클라미디아 트라코마티스 검출 방법, 그리고 그것을 위한 시약 키트 | |
| CN110387411A (zh) | 用于检测狼疮性肾炎或评估狼疮性肾炎风险的方法及其应用 | |
| KR20170039918A (ko) | Dmr를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법 | |
| CN109762901B (zh) | 用于富集低频dna突变的dna探针应用于多种突变的同时检测 | |
| JP2982304B2 (ja) | 核酸の識別方法及び核酸の識別用検査セット | |
| EP0805212A1 (en) | Primer for gene amplification, method for nucleic acid discrimination with the use of the same, and nucleic acid discrimination kit | |
| Pejenaute et al. | Measurement of telomere length | |
| US5582973A (en) | Sensitive method for localizing chromosomal breakpoints | |
| Skrzypczak-Zielinska et al. | New analysis method of myotonic dystrophy 1 based on quantitative fluorescent polymerase chain reaction | |
| CN118064591A (zh) | 一种检测雄激素受体基因突变的多重pcr方法 | |
| RU1801210C (ru) | Способ вы влени мутаций 8-го кодона (-АА) бета-глобинового гена | |
| CN113943811A (zh) | 一种检测nras基因突变的引物和探针、试剂盒及检测方法 | |
| JP2007151409A (ja) | ゲノムｄｎａコピー数の測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SANGTEC MEDICAL AB, SE |
|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB, SE |