SE468816B - Saett och reagenskit foer kvantifiering av nukleinsyramolekyler - Google Patents

Description

468 816 2 ' approximativa resultat. Likaså mäts RNA med användning av Northern-blotting eller dot-blottingmetoden. Dessa metoder är kvantitativt sett mycket inexakta (Thomas, Metods in Enzymol" lO0,sid.255-266,l983L Kända metoder, såsom Southern- och Northern blottingmetoderna, är långsamma och svåra att utföra. Eftersom de endast ger approximativa resultat är deras diagnostiska värde tveksamt i fall då det är viktigt att känna till antalet av vissa nukleinsyramolekyler per given enhet, såsom en cell.

Sandwich- eller lösningshybridiseringsmetoderna, som beskrivs i amerikanska patentet 4,486,539 och i brittiska patentansökan GB 2 169 403 är kvantitativa (Virtanen et al., Lancet l, sid. 381-383, 1983). Vid metoden enligt föreliggande uppfinning krävs dessutom en standardnukleinsyra med konstant antal kopior, som möjliggör bestämning av antalet relevanta nukleinsyramolekyler per given enhet såsom en cell, kärna, ribosom eller kromosom.

Föreliggande uppfinnings syfte är att åstadkomma.en korrekt och snabb kvantitativ metod för bestämning av nuklein- syramolekyler, vilken dessutom är snabbare och lättare att utföra än de som används för närvarande. Metoden kan användas för cancer och prenatal diagnostik, för detektering av ämnen vilka orsakar amplifiering av gener och för påvisning av utvecklingen av t.ex. läkemedelsresistens såväl som för bestämning av uttrycksnivån av messenger RNA. Åtminstone två bestämningar behövs enligt föreliggande upp- finning. Den ena bestämmer nukleinsyramolekylen, som kan vara närvarande i ett flertal kopior, testnukleinsyran. Den andra bestämmer den grundläggande nukleinsyramolekylen som för- delaktigt nog är närvarande i ett konstant antal, standard- nukleinsyran. I metoden enligt uppfinningen, anger en nuklein- syramolekyl en viss nukleotidsekvens på 10-12 nukleotider eller en gen innehållande flera tusen nukleotider. Den kan också avse ett messenger RNA eller en nukleotidsekvens som är 3 -450 Q14 J Vi» betydligt längre än en enda gen, dans en amplikon.

Bestämningen av test- och standardnukleinsyrorna utförs med hjälp av en annars vanlig sandwichhybridiseringsmetod som beskrivs, till exempel, i amerikanska patentet nr 4,486,539 eller en lösningshybridiseringsmetod som beskrivs i brittiska patentansökan nr GB 2 169 403. Uppfinningen avser också ett reagenskit innehållande nukleinsyrareagens, som består av åt- minstone ett testprobepar och åtminstone ett standard probepar.

Reagensen, eller proberna, som används i metoden, prepareras med användning av hybrid-DNA tekniker, från nukleinsyror som i tillräcklig grad är homologa med test- och standardnuklein- syrorna. Dessutom kan nukleinsyror, som är tillräckligt homologa, prepareras syntetiskt och halvsyntetiskt.

Test- och standardnukleinsyrorna kan isoleras direkt från celler och identifieras med hjälp av olika hybridiserings- tekniker. Sådana test- och standardnukleinsyror är emellertid också kommersiellt tillgängliga och tillgängliga från olika genbanker. Test- och standardnukleinsyrorna kan vara antingen DNA eller RNA.

Probepar, som är lämpliga för sandwich- eller lösningshybridi- seringsmetoden, prepareras från nukleinsyror vilka i till- räcklig grad är homologa med test- och standardnukleinsyrorna, med hjälp av hybrid-DNA-tekniker. De relevanta nukleinsyrorna klyvs med hjälp av lämpliga restriktionsenzym; åtminstone två av de resulterande restriktionsfragmenten, som är belägna relativt nära varandra, klonas till åtminstone två lämpliga vektorer. Ett av fragmenten, detektorproben, märks med en lämplig detekterbar markör och det andra, infångningsproben, fixeras antingen till en lämplig bärare eller så fixeras en substans till infångningsproben, vilken substans möjliggör separation av den resulterande hybriden från hybridise- ringsblandningen med hjälp av en annan substans, t.ex. den komplementära komponenten av ett affinitetspar. 468 sis 4 - Test- och standardprobeparen kan förvaras i ett lämpligt reagenskit, i vilket test- och standardprobeparen båda är DNA eller RNA, eller så är testprobeparet DNA och standardprobe- paret RNA eller vice versa.Förbehandlingen och den ytterli- gare behandlingen av proven innan hybridiseringen och hybri- diseringsbetingelserna bör därför rättas efter de i testet använda probeparen.

Metoden enligt föreliggande uppfinning är speciellt lämplig för bestämning av antalet nukleinsyramolekyler direkt från cellulära homogenat. Metoden kan naturligtvis också användas för bestämning av renade eller rena nukleinsyror. Innan metoden enligt uppfinningen utförs, bör emellertid den lämpligaste förbehandlingen för nukleinsyraprovet väljas.

Det är möjligt att utföra både DNA och RNA bestämningar med användning av metoden enligt uppfinningen. Om så är nödvändigt görs en denaturering för att erhålla enkelsträngade deoxyribo- nukleinsyror. Enkelsträngade messenger RNA molekyler, som potentiellt stör hybridiseringstestet, kan hydrolyseras, t.ex. med hjälp av alkalisk kokning. Provet denatureras inte i samband med ribonukleinsyrabestämningar, eftersom den dubbel- strängade deoxyribonukleinsyran inte ingriper i RNA bestämning. Det är naturligtvis möjligt att hejda DNA:t med deoxyribonukleas eller ändra det antingen kemiskt eller mekaniskt så att det inte kan deltaga i hybridiserings- reaktionen. I samband med DNA och RNA bestämningar måste därför en lämplig metod för ytterligare behandling av provet väljas, eller alternativt, så kan denna ytterligare behandling uteslutas. Valet av lämplig metod för tillkommande behand- lingenëü'naturligtvis beroende på metoden som användes för den preliminära behandlingen av nukleinsyraprovet. Ett flertal metoder för för- och vidarebehandling av nukleinsyraprov har beskrivits i litteraturen, vilket medför att den mest lämpliga metoden kan väljas för varje fall.

Bestämningar i vilka både test- och standardnukleinsyrorna är antingen DNA eller RNA, kan utföras med ett odelat prov. 41 Bestämningar i vilka testnukleinsyrorna är DNA och standard- nukleinsyrorna RNA eller vice versa, måste utföras med ett delat prov, eftersom olika metoder krävs för vidarebehandling.

Provet kan naturligtvis delas även om test- och standard- nukleinsyrorna är av samma nukleinsyratyp.

Själva hybridiseringstestet utförs på så sätt att den odelade provlösningen bringas i samtidig kontakt med åtminstone ett testprobepar och ett standardprobepar. Om provlösningen har delats bringas den separat i kontakt med åtminstone ett test- probepar och ett standardprobepar. I det senare fallet, bestäms mängden testnukleinsyraprov i ett reaktionskärl och mängden standardnukleinsyraprov i ett annat.

Oberoende av om provet är delat eller inte får hybridisering- en äga rum under den tid och de betingelser som är mest för- delaktiga för varje enskilt fall. När reaktionen(erna) har ägt rum, separeras de resulterande test- och standardhybriderna från hybridiseringsblandningen(erna) med hjälp av bäraren, eller med hjälp av ett isoleringsämne såsom den komplementära delen av ett affinitetspar, och tvättas. Den vid test- och standardhybriderna fastsatta markören mäts och resultatet jämförs med standardkurvor. På detta sätt kan antalet nuklein- syremolekyler, som skall studeras, bestämmas per vald enhet.

Metoden enligt uppfinningen har praktiskt diagnostiskt värde, särskilt vid detektering av vissa typer av cancer. I små- celligt lungcarcinom, är c-myc genen ofta amplifierad och dess uttrycksnivå är väsentligen högre än i normal vävnad. Vid neuroblastom är N-myc genen amplifierad.

Metoden enligt föreliggande uppfinning kan också användas för påvisande av de mutagena eller carcinogena effekterna av vissa ämnen eller utvecklingen av läkemedelsresistens. Det är känt att selektion p g a yttre påverkan kan resultera i ökat ut- tryck av en viss gen. Vid behandling av cancer, utvecklar cellerna ett motstånd mot ett givet läkemedel genom amplifiering av den gen, vars uttrycksprodukt inaktiverar 468 sis 6 - läkemedlet. Exempel på detta är metotrexat, som inducerar amplifiering av genen för dihydrofolatreduktas (DHFR). Ett ytterligare exempel är amplifiering av genen för metallo- tionin under inflytande av kadmium.

En gens uttrycksnivå har betydelse med avseende på cellens fenotyp och funktion. Detta kan undersökas genom mätning av mängden messenger-RNA, som står i relation till den därav kodade mängden protein. Transkriptionsprodukten av en onkogen bestämmer på vilket sätt den slutligen kommer att uttryckas.

Uttrycksnivåerna av en onkogen varierar beroende på celltyp, differentieringsnivå och cellens utvecklingsfas. Vid vissa stadier i fostrets utveckling, kopieras exempelvis c-myc onkogenen snabbt, medan detta sker mycket långsamt vid ett annat stadium. Amplifieringsgraden står ofta i relation till genens uttrycksnivå, fastän den senare kan öka signifikant utan den förra. I sådana fall bestäms onkogenens roll på bästa sätt genom mätning av dess uttrycksnivå snarare än antalet kopior. I vissa fall kan kvantitativ bestämning av messenger RNA vara enklare och bekvämare än kvantifiering av själva genprodukten.Exempelvis kan c-myc onkogenen nämnas, som är ett labilt protein som snabbt koagulerar av värme.

Metoden enligt uppfinningen kan också användas för att identi- fiera ett flertal kromosomdefekter såsom Down's syndrom. Vid prenatal diagnostik är det också möjligt att bestämma huruvida fostret är defekt, dvs. homozygot med avseende på en viss recessiv gen.

Metoden enligt uppfinningen och nukleinsyrereagensen som används i metoden beskrivs närmare nedan.

EXEMPEL l Kvantifiering av en amplifierad onkogen 7 I J:- CN CO CO _ .x CH a) Nukleinsyrareagens och preparering av dessa STANDARDPROBER Cellstandardnukleinsyra. Genen c-Ki-rasl är närvarande i alla humana celler. Probeparen för sandwich-hybridisering preparerades genom subkloning av HindIII fragmentet av c-Ki- rasl genen, med en längd på 3¿3kb, vars restriktionsmönster har beskrivits av Chang et al” PNAS 79, sid.4848-52, 1982.

Fragmentet är'tillgängligt4 t.ex.klonat.i pBR322 plasmiden (ATCC 41032) och kan erhållas från t.ex. från ATCC culture collection.

Ytterligare behandling av cellstandardnukleinsyra. Ovan beskrivna pBR322 behandlades med restriktionsenzymerna BglII och HindIII och de resulterande fragmenten isolerades från agarosgelen; renade fragment belägna nära intill varandra subklonades i två lämpliga vektorer för preparering av detektor- och infångningsproberna.

Standarddetektorprobe. Ett BglII-BglII fragment med en längd på ca l.l kb, subklonades i restriktionsenzymstället för BamHI av pBR322 plasmiden och märktes med hjälp av nick-translation med l251-märkt dcTP.

Standardinfångningsprobe. BglII-HindIII fragmentet på ca 0.5 kb insattes i fagvektorernaMl3 mplO och mpll mellan restrik- tionsställena för restriktionsenzymerna BamHI och HindIII och fixerades till ett nitrocellulosafilter (150 ng DNA/dia l cm).

TESTPROBER ïestnukleinsyra. Ett probepar för sandwich-hybridisering preparerades från en klonad c-myc gen, som kan erhållas t.ex. från ATCC culture collection (ATCC 41010). Genens restrik- tionsmönster har beskrivits av Watt et al., PNAS 80, sid. 6307-6311, 1983. f , 8 4b8 Sšó - Ytterligare behandling av testnukleinszran. c-myc genen behandlades med restriktionsenzymerna HindIII, XbaI och Pstl och fragmenten isolerades från agarosgelen, renades och sub- klonades i lämpliga vektorer i syfte att preparera detektor- och ínfångningsproberna.

Testdetektorprobe. De enkelsträngade svansarna av HindIII-XbaI restriktionsfragmentet av c-myc genen, med en längd på 3.7 kb, gjordes dubbelsträngade med hjälp av DNA-polymeras. HindIII linkers insattes med hjälp av T4-DNA-ligas i de resulterande DNA-fragmenten med jämna ändar; efter fenolextraktion behandlades DNA:t med restriktionsenzymet HindIII. DNA- fragmentet klonades därefter i pBR322 plasmiden vid restrik- tionsstället för restriktionsenzymet HindIII och märktes med hjälp av nick-translation med 125I-märkt dCTP.

Testinfångningsprobe. Det 1.1 kb långa XbaI-PstI fragmentet av c-myc genen klonades i fagkloningsvektorernaMl3 mpl0 och mpll mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna Xbal och Pstl och fixerades till nitrocellulosafiltret (150 ng DNA/dia 1 cm). b) Bestämning av standardkurvan Provet som användes för bestämning av standardkurvan bestod av en alkaliskt-denaturerad pBR322 klon av c-myc genen. Sandwich- hybridiseringslösningen, till vilken ovan nämnda testprober tillsattes, bestod av 4 x SSC, 1 x Denhardtlösning, 200_pg/ml herring sperm DNA och O.2% SDS. Hybridiseringen ägde rum vid 650C under 17-19 timmar, varefter filtrena tvättades i tvättlösningen (0.l x SSC 0.2% SDS) vid 50°C. Den vid sandwich-hybriderna fästa markeringen räknades därefter i en gammaräknare. 17 Tabêll 1 Prov CEN molekyler/test c-myc-filter 0 40 106 vs s X 106 190 107 340 108 2200 c) Bestämning av antalet gener.

Proven innefattade l) celler från human placenta ochífi Colo 320 celler, som kan erhållas t.ex. från ATCC culture collection (ATCC-CCC22OL DNA isolerades från båda proverna, och samma mängd cell-DNA, denaturerat genom alkalisk kokning, tillsattes till båda testerna. Alkalisk denaturering hydroly- serade allt tänkbart RNA närvarande i provet.

Testet utfördes genom att både c-myc och c-Ki-rasI filtrena och de två märkta reagensen tillsattes till varje prov, vilket möjliggjorde mätning av både standard- och test-DNA för varje prov.På basis av c-Ki-rasI bestämningar, fann man att varje test innehöll samma mängd DNA och man kan dra slutsatsen att c-myc genen i Colo 320 celler är närvarande i ett ca 16-20 gånger högre kopieantal än i den normala situationen. Resulta- ten visas i tabell 2.

Tabell 2 Prov c-Ki-rasï filter c-myc filter CPN* CPN* antal Humana placentaceller 486 340 107 cola 320 celler 432 3205 1.6 1 108 1% ä: i MM 468 816 10 - *) avläsningen som erhölls från det tomma filtret har dragits av från avläsningarna.

EXEMPEL 2 Kvantifiering av amplifierad gen a) Nukleinsyrareagens och preparering av dessa STANDARDPROBER Cellstandardnukleinsyra. Kontrollnukleinsyran togs från promoterarean av musens metallotioningen, dvs. MT genen, och DNA:t omedelbart uppströms därav. Strukturen av MT genen har beskrivits av Pavlakis och Hamer, PNAS 80, sid. 397-401, 1983. Referensnukleinsyrafragmentet är tillgängligt t.ex. klonat i pBPV-MMTneo (432-12) vektorn (ATCC 37224) och kan er- hållas, t.ex. från ATCC culture collection.

Ytterligare behandling av cellstandardnukleinsyra. Ovan beskrivna MT gen behandlades med restriktionsenzymerna Kpnl, BglII och EcoRI för subkloning i pATl53 plasmiden. Kpnl svansen omvandlades till en HindIII svans med en linker.

Standarddetektorprobe. EcoRI-Kpnl-(HindIII) fragmentet med längden cirka 1.2 kb och placerad uppströms av metallotionin- genens promotorarea, klonades till pATl53 plasmiden mellan restriktionsområdena för restriktionsenzymerna EcoRI och HindIII och märktes med hjälp av nick-translation med 32p- märkt nukleosidtrifosfat.

Standardinfångningsprobe. Det 0.8 kb långa Kpnl-BglII frag- mentet innefattande promotorarean av metallotioningenen och arean uppströms av denna klonades i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 mellan restriktionsområdena för restriktione- enzymerna Kpnl och BamHI och fixerades till nitrocellulosa- filtret. n ) ll 'bifi CN CX) OC --\ ON TESTPROBER Testnukleinszra. Probeparet för sandwich-hybridiseringstestet preparerades med användning av den kommersiellt tillgängliga pMTVdhfr plasmiden (Bethesda Research Laboratories, produkt nr. 5369SS), vars struktur beskrivs av Lee et al., Nature 294, sid. 228-232, 1981.

Ytterligare behandling av testnukleinsyra. Plasmiden pMTVdhfr innehållande cDNA av dihydrofolatreduktas (DHFR) genen behandlades med restriktionsenzymerna HindIII och BglII.

Testdetektorprobe. HindIII-BglII fragmentet, som var 0.75 kb långt och motsvarar arean som kodar för DHFR genen av pMTVdhfr plasmiden, insattes i plasmid vektorn pATl53 mellan restrik- tionsområdena för restriktionsenzymen HindIII och BamHI och märktes med hjälp av nick-translation med 32?-märkt nukleo- sidtrifosfat.

Testinfångningsprobe. Ett 1.4 kb långt HindIII fragment taget från MMTV genarean av pMTVdhfr plasmiden klonades i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9. b) Bestämning av standardkurvan Provet som användes för testet var renat DNA från pMTVdhfr plasmiden. Själva testet utfördes såsom beskrivits i exempel Ib förutom att en vätskescintillationsräknare användes för räkning. Den resulterande standardkurvan visas i tabell 3.

Tabell 3 Prov cpm molekyler/test DHFR filter 0 17 105 45 3 x 105 79 107 210 468 816 12 - c) Bestämning av antalet gener Cellinjer avledda från musfibroblastcellen NIH 3T3 och tillgängliga från ATCC culture collection med numret CRL 1658, som har transfekterats med olika mängder av cDNA som motsvarar mRNA:t av DHFR genen, odlades på cellodlingsplattor och använ- des såsom prov. Cellerna lyserades med användning av natrium- dodecylsulfat och deras DNA sönderdelades genom att det trycktes igenom en fin injektionsnål från en spruta. Ett 250 pl prov motsvarande ca 105 celler togs från homogenatet och 50 pl NaOH tillsattes. Provet kokades och neutraliserades med ättiksyra och hybridiseringsblandningen. Totalvolymen var 0.5 ml. Alla ovan beskrivna prober tillsattes samtidigt och ett sik. blankfilter tillsattes såsom bakgrundskontroll. Hybridi- sering, tvättning och räkning av märkningen utfördes såsom i Exempel lb förutom att en vätskescintillationsräknare användes för räkning. Resultaten visas i tabell 4.

Tabell 4 Cell MT Antal celler DHFR cpm* 1 provet CPN* Antal mole- Antal kyler i 3 kopior provet Kontrollcell (utan ' 6 6 DHFR-CDNA) 182 1.05 X 10 21 < 106 - Lmje: 138 0.9 x 106 ao 3 x 1o 3 Linje n 21o 1.25 x 105 732 s x 107 40 * cpm: avläsningen från blankfiltret har dragits av MT-genen är en intern markör, som mäter antalet närvarande celler i ett prov. Resultaten visar att 106 celler i detta prov gav en MT-specifik signal på 165 + 20 cpm. DHFR-reagensen mäter mängden DHFR-cDNA. Antalet celler härleddes från den MT- specifika signalen. Det var således möjligt att bestämma antalet DHFR-cDNA kopior i olika cellinjer såsom visas i tabell 4.

II 13 _ 4 c fn cb ...i Tx EXEMPEL 3 Kvantifiering av messenger RNA a) Nukleinsyrareagens och preparering av dessa Med användning av de i Exempel 2 beskrivna testproberna är det också möjligt att mäta mängden mRNA som härstammar från DHFR- cDNA. Strukturen av pMTVdhfr plasmiden är beskaffad på så sätt att transkriptionen av DHFR genen börjar vid MMTV promotern.

Det resulterande MRNA:t är ca 1.0 kb långt. Av detta, här- stammar ca 0.25 kb från MMTV promotorarean och resten från DHFR-CDNA (Lee et al., Nature 294, sid. 228-232, 1981).

STANDARDPROBER Cellstandardnukleinsyran, standarddetektorn och standardin- fångningsproben var såsom beskrevs i Exempel 2.

TESTPROBER Testnukleinsyran, testdetektorn och testinfångningsproben var så beskaffade såsom beskrevs i Exempel 2. b) Bestämning av standardkurvan Provet som användes för bestämning av standardkurvan bestod av messenger RNA motsvarande dihydrofolatreduktasgenen producerad med hjälp av in vitro-transkription. Det för transkriptionen nödvändiga DNA:t preparerades genom subkloning av det 1.4 kb långa HindIII fragmentet av MMTV promotorn av pMTVdhfr plasmiden och det 0.75 kb långa HindIII-BglII fragmentet (DHFR-cDNA) bredvid varandra i pSP64 plasmiden (Promega Biotec) mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna HindIII och BamHI. RNA-provet förvarades i en o.2% SDS lösning (ag).

Sandwich-hybridiseringstestet utfördes såson1 beskrevs i 460 816 14 - Exemplen lb och 2b men denaturering uteslöts.

Tabell s ,Prov cpm molekyler/test DHFR filter 0 20 s X 106 ss 107 130 s x 107 390 108 ess c) Bestämning 32 antalet messenger RNA molekyler Antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar DHFR genen, bestämdes från de i Exempel 2 beskrivna cellinjerna.

Cellerna lyserades med användning av natriumdodecylsulfat och deras DNA sönderdelades något genom att de pressades från en spruta genom en fin injektionsnål. Ett 250_pl prov av homo- genatet togs, vilket motsvarade ca 5 x 106 celler. Homogenatet tillsattes därefter till sandwich-hybrídiseringstestet utan denaturering. Sandwich-hybridisering ägde rum såsom beskrevs i Exemplen 2c och lb, förutom att endast DHFR proberna tillsattes till hybridiseringslösningen. I ett likadant prov på 250 pl homogenat, bestämdes cellantalet med användning av den i Exempel 2c beskrivna MT-proben.

Resultaten visas i tabell 6. _Tabell 6 C811 HT Antal celler DHFR cpm* 1 Provet Cpm* Antal mole- Antal kyler i per provet cell Lies 1 300 3.5 X 106 1405 3.45 x 108 100 Liqp 11 430 4.2 1 105 4000 2 X 109 s00 V? W 463 316 *cmpz Avläsningen från blankfiltret har dragits av.

Resultaten visade att cellinje I producerade per cell ca 100 messenger RNA molekyler från DHFR generna och cellinje II producerade ca 500 messenger RNA molekyler från DHFR-generna.

EXEMPEL 4 Kvantifiering av amplifierad gen med hjälp av lösningshybridi- sering a) Nukleinsyrareagens och preparering av dessa STANDARDPROBER Cellstandardnukleinsyra, standarddetektor, standardinfång- ningsprobe var så beskaffade såsom beskrivits i Exempel 2. Det 1.2 kb långa EcoRI-KpnI-(HindIII) fragmentet i pATl53 märktes med hjälp av nick-translation med l25I-märkt deoxycytidin. De 0.8 kb långa KpnI-BglII fragmenten i Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 modifierades med biotin med användning av Phot0probeTM reagenset (Vector laboratories, CA, USA, produkt nr SP-1000).

TESTPROBER Testnukleinsyran, testdetektorn och testinfångningsproben var så beskaffade såsom beskrivits i Exempel 2. Det 0.75 kb långa HindIII-BglII fragmentet i pATl53 var märkt med l25I-märkt deoxycytidin. Det 1.4 kg långa HindIII fragmentet i Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 biotinylerades med användning av PhotoprobeTM såsom ovan. b) Bestämning av standardkurvorna En cellstandardkurva preparerades med användning av en känd mängd celler, från vilka hybridiseringssignalen mättes med an- vändning av standardproberna för igenkänning av MT-genen. En standardkurva för testnukleinsyra preparerades med pMTVdhfr 468 ere 16 - plasmiden och testproberna som känner igen denna plasmid.

Hybridiseringarna utfördes i 200,ul av en lösning innehållande 0.6 M NaCl, 20 mM fosfatbuffert, pH 7.5, l mM EDTA, 4% polyetylenglykol (PEG 6000) i 1.5 timmar vid 700C. Efter reaktionen tillsattes 50¿U.streptavidin-agarose(Betheseda Research Laboratories, Maryland, USA, produktnr. 5942SA), och 1 M NaCl, l0mM natriumfosfat, pH 7.5, 1 mM EDTA tillsattes till en slutlig volym på 500_pl. Hybriderna uppsamlades på streptavidin-agarosen vid 37°C i 15 min. Agarosen tvättades en gång i 5 minuter med den buffrade l M NaCl-lösningen vid 37°C och två gånger i 2 minuter med 15 mM NaCl, 1.5 mM natrium- citrat vid 55°C. Mängden bundna hybrider bestämdes genom att agarosen mättes i en gammaräknare.(Syvänen et al” Nucleic Acids Res. 14, 5037-5048, 1986). Resultaten visas i tabell 7 och 8.

Tabell 7 .Prov CEN celler/test MT prober o,a X 106 162 1,6 x 106 216 3 x 106 zss Tabell 8 PIOV 52111 molekyler/test DHFR prober 106 148 s x 106 394 s x 1o7 2240 fi* J:- CN CO 'D .a J\ 17 c) Bestämning av antalet gener Prov av de i Exempel 2 beskrivna cellinjerna behandlades på liknande sätt, förutom att volymen per prov, motsvarande approximativt 2 x 106 celler, var 125;11. Bestämningen av antalet celler och antalet testnukleinsyramolekyler utfördes i separata kärl genom tillsats av cellprovet, lämpliga detektor- och infångningsprober, och komponenterna i hybridi- seringsblandningen till en slutlig volym på 200141. Kontroll- analyser utan cellstandard eller test-DNA inkluderades.

Hybridisering, uppsamling av hybrider, tvättning och mätning utfördes såsom i exempel 4. Resultaten avlästes från standard- kurvor, som preparerades parallellt såsom beskrevs i Exempel 4b. Resultaten visas i tabell 9.

Tabell 9 Cell HT DHFR cpm* Antal celler cpm* Antal Antal i provet molekyler kopior ' ' - i provet 6 5 Kbntrollcell 253 2.3 x 10 73 < 10 - . . 6 6 Liqp I 210 1.5 x 10 233 3.8 x 10 3 _ . 6 7 Liqp II 237 2.1 x 10 3059 8.8 x 10 42 * cpm: värden från kontrollanalyser utan cellstandard eller testnukleinsyra har dragits av.

Claims (13)

4> O\ :n OT ...<- O | 18 PATENTKRAV

1. Kvantitativt sätt för bestämninganrnukleinsyramolekyler med en sandwich- eller lösningshybridiseringsmetod, k ä n n e - t e c k n a t av att antalet av en given nukleinsyramolekyl per given biologisk enhet bestäms genom jämförelse mellan antalet testnukleinsyramolekyler, som potentiellt är närvarande i flera kopior i den biologiska enheten, och antalet valda standardnuk- leinsyramolekylery som fördelaktigt nog är närvarande i ett konstant antal per samma biologiska enhet.

2. Sätt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att de i provet närvarande nukleinsyramolekylerna a) omvandlas, om så är nödvändigt, till en form så att de kan deltaga i hybridiseringsreaktionen, b) alla tänkbara nukleinsyror, som potentiellt stör hybridiseringsreaktionen, om så är nödvändigt omvandlas till en form så att de inte kan inverka på hybridiseringstestet, c) bringas i kontakt, antingen odelade, eller om så är nödvändigt delade, med åtminstone ett testprobepar som i tillräcklig grad är homologt med den potentiellt i flera kopior närvarande nukleinsyran och med åtminstone ett valt och lämpligt standardprobepar som i tillräcklig grad är homologt med nuklein- syramolekylen, som fördelaktigt nog är närvarande i ett konstant antal, varvid detektorproberna av nämnda testprobepar och nämnda standardprobepar märks med en lämplig, detekterbar markör och infångningsproberna har fixerats till en lämplig bärare eller så fixeras en substans till nämnda infàngningsprober, vilket möjliggör isolering av de resulterande hybriderna, d) efteratthybridiseringsreaktionen,ellerreaktionerna, har ägt rum separeras testhybriden och standardhybriden, om så är nödvändigt, och nämnda fastsatta markör mäts, varvid antalet nukleinsyramolekyler per given enhet erhålls genom att antalet test och standardnukleinsyror jämförs. 19 '468 SHS

3. Sätt enligt krav 1 och 2, k ä n n e t e c k n a t av att test- och standardnukleinsyrorna är deoxyribonukleinsyror.

4. Sätt enligt krav l och 2, k ä n n e t e c k n a t av att testnukleinsyran är ribonukleinsyra och standardnukleinsyran är deoxyribonukleinsyra.

5. Sätt enligt krav l och 2, k ä n n e t e c k n a t av att test- och standardnukleinsyrorna är ribonukleinsyror.

6. Sätt enligt krav l och 2, k ä n n e t e c k n a t av att testnukleinsyran är deoxyribonukleinsyra och standardnuklein- syran är ribonukleinsyra.

7. Sätt enligt krav 1, 2, 3 och4, k ä n n e t e c k n a t av att detektorproben av standardprobeparet - en hybridplasmid innefattande ett l.l kb BglII-BglII fragment av HindIII fragmentet av den humana c-Ki-rasl genen, varvid nämnda HindIII fragment klonats i pBR322 plasmiden och nämnda BglII- BglII fragment är subklonats i restriktionsstället för restriktionsenzymet BamHI i pBR322 plasmiden - och infång- ningsproberna - hybridfager innefattande ett 0.5 kb BglII- HindIII fragment av HindIII fragmentet av den humana c-Ki-rasI genen, varvid nämnda HindIII fragment klonats j. pBR322 plasmiden och nämnda BglII-HindIII fragment subklonas i fagvektorerna Ml3 mplO och Ml3 mpll mellan restriktione- ställena för restriktionsenzymerna BamHI och HindIII - bringas, antingen individuellt eller tillsammans med testprobeparet, i kontakt med ett odelat, eller om så är nödvändigt delat, nukleinsyraprov.

8. Sätt enligt krav 1, 2, 3 och 4, k ä n n e t e c k n a t av att detektorproben och standardprobeparet - en hybrid- plasmid innefattande ett 1.2 kb EcoRI-KpnI(HindIII) fragment uppströms från promotorarean av musens metallotioningen, vilket fragment har har subklonats i pATl53 plasmiden mellan 4f58 8¶ 6 20 ' restriktionsställena för restriktionsenzyrnerna EcoRI och HindIII - och infångningsproberna - hybridfager innefattande ett 0.8 kb KpnI-BglII fragment från promotorarean av metall- lotioningenen och arean uppströms av denna, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna Kpnl och BamHI - bringas, antingen individuellt eller tillsammans med test- probeparet,í.kontakt med ett odelat, eller om så är nödvän- digt delat nukleinsyraprov.

9. Sätt enligt krav l, 2, 3, 6, 7 och 8, k ä n n e t e c k- n atzav att,i.syfte att bestämma amplifieringsgraden av c- myc onkogenen och/eller antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar denna gen, detektorproben av testprobeparet - en hybridplasmid innefattande ett 3.7 kb HindIII-Xbal fragment av c-myc genen, vilket fragmentet har subklonats i pBR322 plasmiden vid restriktionsstället för restriktionsenzymet HindIII - och infångningsproberna - hybridfager innefattande ett 1.1 kb XbaI-PstI fragment av c-myc genen, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mplO och Ml3 mpll mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna XbaI och PstI - bringas, antingen individuellt eller tillsammans med standard- probeparet, i kontakt med ett odelat, eller om så är nödvän- digt ett delat, nukleinsyraprov.

10. Sätt enligt krav 1, 2, 3, 6, 7 och 8, k ä n n e t e c k- n a t av att, i syfte att bestämma amplifieringsgraden av di- hydrofolatreduktas eller DHFR-genen och/eller antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar denna gen, detektor- proben av testprobeparet, en hybridplasmid innefattande ett 0.75 kb HindIII-BglII fragment som kodar för DHFR-genen av pMTVdhfr plasmiden, vilket fragment har subklonats i pATl532 plasmidvektorn mellan restriktionsställena för restriktions- enzymerna HindIII och BamHI - och infångningsproberna - hybridfager innefattande ett 1.4 kb HindIII fragment av MMTV- genarean av pMTVdhfr-plasmiden, vilket fragment har sub- klonats i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 vid restrik- tionsstället för restriktionsenzymet HindIII - bringas, w 21 468 Efiu antingen individuellt eller tillsammans med standardprobe- paret, i kontakt med ett odelat, eller om så är nödvändig: delat, nukleinsyraprov.

11. ll. Reagenskit för kvantitativ bestämning av nukleinsyra- molekyler, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda kit innehåller åtminstone ett testprobepar och åtminstone ett standardprobepar, varvid detektorproberna av både testprobe- paret och standardprobeparet är märkta med en lämplig markör, och varvid infångningsproberna har fixerats till en lämplig bärare eller också har en substans fixerats till nämnda infångningsprober,_vilket möjliggör isolering av sandwichhybrider.

12. Reagenskit enligt krav ll, k ä n n e t ecrk n a t av att detektorproben av testprobeparet, som används för bestämning av amplifieringsgraden av c-myconkogenen och/eller antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar denna gen, är en hybridplasmid innefattande ett 3.7 kb HindIII-Xbal restriktionsfragment av c-myc genen, vilket fragment har sub- klonats i pBR322 plasmiden vid restriktionsstället för restriktionsenzymet HindIII, och infångningsproberna är hybridfager innefattande ett l.l kb XbaI-PstI fragment av c~ myc genen, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mplO och H13 mpll mellan restriktionsställena för restrik- tionsenzymerna XbaI och PstI, och detektorproben av standard- probeparet är ett l.l kb BglII-BglII fragment av HindIII fragmentet av den humana c-Ki-rasI genen, vilket HindIII fragmentet har klonats i pBR322 plasmiden och nämnda BglII- BglII fragment har subklonats i pBR322 plasmiden vid restrik~ tionsstället för restriktionsenzymet BamHI, och infångnings- proberna är hybridfager innefattande ett 0.5 kb BglII-HindIII fragment av HindIII-fragmentet av c-Ki-rasl genen, varvid nämnda HindIII fragment har subklonats i pBR322 plasmiden av c-Ki-rasI genen, och nämnda BglII-HindIII fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mplO och Ml3 mpll mellan restriktionsställena för restrik-tionsenzymerna BamHI och HindIII. 468 816 22 -

13. Reagenskit enligt krav ll, k ä n n e t e c k n a t av att detektorproben av testprobeparet, som används vid bestämning av amplifieringsgraden av dehydrofolatreduktaset eller DHFR- genen och/eller antalet messenger RNA molekyler, som motsvarar denna gen, är en hybridplasmid innefattande ett Ö.75 kb HindIII-BglII fragment, som kodar för DHFR-genen av pMTVdhfr plasmiden, vilket fragment har subklonats i pATl53 plasmid- vektorna mellan restriktionsställena för restriktione- enzymerna Hindlll och BamHI, och infångningsproberna är hybridfager innefattande ett l.4 kb HindIII fragment av MMTV genarean av pMTVdhfr-plasmiden, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 vid restriktionsstället för restriktionsenzymet HindIII, och detektorproberna av standardprobeparet är en hybridplasmid innefattande ett 1.2 EcoRI-Kpnl fragment uppströms från promotorarean av musens metallotioningen, vilket fragment har subklonats i pATl53 plasmiden mellan restriktionsställena för restriktionsenzy- merna EcoRI och HindIII, och infångningsproberna är hybrid- fager innefattande ett 0.8 kb KpnI-BglII fragment av metallo- tioningenen från promotorarean och arean uppströms av denna, vilket fragment har subklonats i fagvektorerna Ml3 mpl8 och Ml3 mpl9 mellan restriktionsställena för restriktionsenzymerna KpnI och BamHI.